Kesan Pencegahan Phenylethanol Glycosides Daripada Cistanche Tubulosa

Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com

Shu-Ping You, et al

Abstrak

latar belakang:Cistanchetubulosaadalah ubat herba tradisional Cina yang digunakan secara meluas untuk mengawal imuniti.Phenylethanoidglikosida(CPhGs) daripada tumbuhan ini adalah bahan yang paling berkesan. Matlamat kajian ini adalah untuk menilai kesan pencegahan dan terapeutik CPhG pada fibrosis hepatik yang disebabkan oleh BSA dalam tikus dan mekanisme molekul berkaitan yang melibatkan sel stellate hepatik. Biejiarangan (BJRG), satu lagi ubat herba tradisional Cina, digunakan sebagai kawalan positif.

Kaedah:Dalam eksperimen in vivo, 75 tikus SD dibahagikan secara rawak kepada 6 kumpulan: normal (dirawat air suling), model (dirawat BSA), ubat positif (dirawat BSA ditambah BJRG 600 mg/kg/hari), dan dirawat BSA ditambah kumpulan CPhGs (125, 250, dan 500 mg/kg/hari). Indeks hati dan limpa, paras serum aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), asid heksadesenoik (HA), laminin (LN), jenis III procollagen (PCIII), jenis IVcollagen (IV-C), hydroxyproline (Hyp). ), dan faktor pertumbuhan mengubah 1 (TGF- 1) diukur dalam hati tikus. Gred histopatologi untuk fibrosis hati dinilai untuk setiap kumpulan menggunakan pewarnaan trichrome H&E dan Masson. Ungkapan TGF- 1, kolagen I (Col-I) dan kolagen III (Col-III) ditentukan oleh kaedah pewarnaan imunohistokimia. Kesan ini selanjutnya dinilai secara in vitro dengan menentukan tahap ekspresi NF-κB p65 dan Col-I melalui analisis PCR masa nyata kuantitatif. Ekspresi protein Col-I juga diperiksa oleh western blotting.

Keputusan: Semua kumpulan dos (125, 250, dan 500 mg/kg/hari) CPhG dengan ketara mengurangkan indeks hati dan limpa, menurunkan ALT, AST, HA, LN , PCIII, paras serum IV-C, kandungan TGF- 1 (P < 0.01,="" p="">< 0.01="" dan="" p="">< 0.01),="" dan="" hyp="" kandungan.="" cphgs="" juga="" mengurangkan="" pembengkakan="" sel="" hati="" dengan="" ketara="" dan="" berkesan="" menghalang="" nekrosis="" hepatosit="" dan="" penyusupan="" sel="" radang.="" keputusan="" imunohistokimia="" menunjukkan="" bahawa="" cphg="" mengurangkan="" ekspresi="" tgf-="" 1="" dengan="" ketara="" (p=""><0.01, p=""><0.01 dan="" p=""><0.01), col-="" i="" dan="" col-iii.="" kesan="" in="" vitro="" cphgs="" (100,="" 75,="" 50,="" dan="" 25="" ug/ml)="" pada="" hsc-t6="" menunjukkan="" bahawa="" cphgs="" secara="" signifikan="" mengurangkan="" ekspresi="" mrna="" nf-κb="" p65="" dan="" col-i,="" dan="" cphg="" juga="" menurunkan="" ekspresi="" protein="">

Kesimpulan:CPhG mempunyai kesan fibrosis anti-hepatik yang ketara, dan boleh digunakan sebagai agen pelindung hepatik untuk rawatan fibrosis hepatik.

Kata kunci:Fibrosis hepatik,Cistanche tubulosa,Phenylethanoidglikosida,Chemokine BSA, Pencegahan dan terapi

PhenylethanoidglikosidadalamCistanchetubulosa

Latar belakang

Fibrosis hepatik adalah tindak balas penyembuhan luka kepada kecederaan hati yang teruk yang berlaku dalam patogenesis hepatitis kronik yang disebabkan oleh pelbagai faktor. Faktor-faktor ini adalah jangkitan virus, penyalahgunaan alkohol, kolestasis, dan penyakit metabolik dan autoimun [1-3]. Pengumpulan progresif matriks ekstraselular (ECM) dan penurunan pembentukan semula mengganggu seni bina normal hati, mengakibatkan fibrosis hepatik [4]. Fibrosis hepatik adalah kritikal dalam penyakit hati kronik dan selalunya berkembang menjadi sirosis dan karsinogenesis yang tidak dapat dipulihkan. Pada masa ini, tiada kaedah atau ubat yang berkesan untuk rawatan fibrosis hepatik. Oleh itu, adalah mendesak untuk mencari ubat fibrosis anti-hepatik yang akan melemahkan perkembangan kecederaan hati kepada fibrosis dan kanser.

CistanchetubulosaW (dari keluarga Orobanchaceae) ialah tumbuhan parasit yang banyak ditanam di wilayah selatan Xinjiang di China [5]. Orang biasanya menggunakannya untuk mencergaskan buah pinggang, menyuburkan darah, melegakan usus, dan melambatkan penuaan. Ia secara rasmi disenaraikan dalam Pharmacopoeia Cina [6].Cistanchetubulosamengandungi pelbagai komponen aktif. Ini termasukPhenylethanoidglikosida(CPhGs), iridoid, dan polisakarida. Asone daripada banyak komponen aktif dalamCistanchetubulosa, CPhGshave mempamerkan kesan antioksidan, anti-keletihan, neuroprotektif, dan anti-radang yang meyakinkan dalam kedua-dua kajian in vivo dan in vitro [7]. Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, telah dilaporkan bahawa CPhG mempunyai kesan hepatoprotektif. Mekanisme berpotensi yang mendasari kesan ini ialah penghapusan radikal bebas, perlindungan membran hepatik, imunoregulasi, perencatan apoptosis, perencatan ekspresi HBsAg dan HBeAg, dan perencatan replikasi DNA HBV dan lain-lain [8-11]. Walau bagaimanapun, beberapa kajian dalam kesusasteraan menangani kesan fibrosis anti-hepatik GPhCs. Oleh itu, kajian ini bertujuan untuk menyiasat kesan fibrosis anti-hepatik GPhCs dengan menggunakan model albumin serum lembu (BSA) yang disebabkan oleh hepatikfibrosis dalam tikus. Mekanisme molekul yang berkaitan telah disiasat dalam sel HSC-T6.

Kaedah

Bahan kimia dan reagen

Kit Hydroxyproline (Hidrolisis beralkali) (Lot:20140616) telah dibeli daripada Institut Bioengineering Nanjing Jiancheng (China). Kit sandwic TGF{1}} tikus ELISA (Lot: 238240615) telah dibeli daripada Lianke Biotech Co., Ltd. (China). Antibodi Anti-KolagenI Arnab (Lot: 140619), antibodi Anti-Kolagen III Arnab (Lot: 980788 W) dan antibodi Anti-TGF- 1 Arnab (Lot: 140619) disediakan oleh Beijing BiosynthesisBiotechnology Co., LTD ( China). Disertakan dengan serum biri-biri biasa (cecair berfungsi) (Lot: WP141214), PV-6000(Lot: WK141225) dan kit DAB (Lot: K136621D) telah dibeli daripada Zhongshan Golden Bridge BiotechCo., Ltd. (China). Pengesanan antibodi primer dilakukan dengan menggunakan 2. Larutan antibodi (Alk-Phos.Conjugated, Anti-arnab) dan 2. Larutan antibodi(Alk-Phos. Conjugated, Anti-tikus) (lot: 272387) yang dibeli daripada Invitrogen Company (USA) .

Bovine serum albumin (BSA) (Lot: SLBG8239V) dibeli dari Sigma (AS). Sebelum digunakan, BSA disediakan pada 18 g/L dalam garam biasa, bakteria disingkirkan melalui penapisan, dan BSA disimpan pada 4 darjah . Pembantu tidak lengkap Freund yang mengandungi 1 g lipid daripada bulu biri-biri(Lot: AF0220LA14, Shanghai yuan ye Bio-Technology Co.,Ltd. (China,) dicampur dengan 2 g parafin cecair (Lot:20130815, Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd. (China,), disterilkan dalam autoklaf wap, dan disimpan pada 4 darjah. Ubat positif BJRG diperoleh sebagai tablet Biejiarangan daripada Inner Mongolia Furui Medical Science Co., Ltd.(China). Stok ubat BJRG disediakan dengan melarutkan tablet BJRG dalam air suling pada kepekatan 600 mg/kg.

Phenylethanoid glikosidadalamCistanchemempunyai kesan pencegahan

Bahan tumbuhan

Cistanche tubulosa(keluarga Orobanchaceae) dibeli dari wilayah Minfeng di Xinjiang, China. Bahan tersebut telah disahkan oleh penyelidik Jun Zhao, Makmal Utama Perubatan Uighur, Institut Materia Medica Xinjiang. Spesimen baucar telah disimpan di Institut Materia Medica Xinjiang.

Penyediaan CPhG

Rimpang kering dan dihiris daripadaCistanchetubulosa(6.0 kg) telah diekstrak berturut-turut di bawah refluks tiga kali dengan 70 peratus etanol, dan pelarut dikeluarkan untuk menghasilkan ekstrak etanol. Ekstrak etanol telah ditulenkan dengan menggunakan resin AB-8 untuk mendapatkanphenylethanoidglikosida(CPhGs). Penyelesaian stok CPhG yang digunakan untuk kumpulan dos yang berbeza dalam kajian haiwan (masing-masing 500 mg/kg, 250 mg/kg dan 125 mg/kg) telah dilarutkan dalam 0.5 peratus (5 g/L) karboksimetil selulosa ( garam natrium).

Kuantifikasi CPhGs

Kandungan dua komponen (echinacoside dan acteoside) dalam CPhG ditentukan oleh HPLCmenggunakan kaedah yang dilaporkan sebelum ini (Zhang et al. 2004)[12]. HPLC dilakukan dengan menggunakan Shimadzu LC-10AHPLC yang dilengkapi dengan pengesan UV. Lajur HPLC ialah lajur Phenomenex Gemini ODS (250 × 4.6 mm, 5 μm). Fasa mudah alih isokratik terdiri daripada metanol-acetonitrile-1 peratus asid asetik (15:10:75, v/v/v). Elusi adalah selama 40 minit dan kadar alir dikekalkan pada 0.6 mL/min. Suhu lajur dikekalkan malar pada 30 darjah. Pengesanan UV adalah pada 334 nm.

Haiwan dan talian sel HSC-T6

[Gred SPF] tikus Sprague–Dawley (SD) jantan dewasa yang sihat (180–220 g) telah dibeli daripada Pusat Haiwan Universiti Perubatan Xinjiang, No. Lesen: SCXK (Baru)2011–0004. Tikus diberi makan ayam bebas patogen khusus (SPF). Semua prosedur yang berkaitan dengan eksperimen haiwan telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Haiwan Hospital Gabungan Pertama Universiti Perubatan Xinjiang. Tikus ditempatkan di dalam sangkar di bawah keadaan persekitaran terkawal (25 darjah dan kitaran cahaya/gelap 12 jam) dan mempunyai akses percuma kepada makanan pelet tikus standard dan air paip. Tikus telah disesuaikan sebelum rawatan.

Barisan sel stellate hepatik tikus yang diabadikan, HSC-T6, diperoleh daripada Wuhan Procell Gene BiotechnologyCo., LTD. (Wuhan, China). Sel HSC-T6 telah dikultur dalam Medium Helang Modified Dulbecco (Glukosa Tinggi)(DMEM, Beijing, China) ditambah dengan 10 peratus serum janin (Gibco, Amerika Selatan), 100 IU/ml penisilin, dan 100 ug/ml streptomycin (Beijing, China). ) dalam inkubator terlembap pada 37 darjah dengan 5 peratus CO2.

Kecederaan dan rawatan hati yang disebabkan oleh BSA

Tujuh puluh lima tikus SD dibahagikan secara rawak kepada enam kumpulan: Normal (dirawat dengan air suling), model (dirawat BSA), ubat positif (dirawat BSA ditambah BJRG 600 mg/kg/hari) , dan kumpulan CPhG yang dirawat BSA (125, 250, 500 mg/kg/hari). Kumpulan CPhG yang dirawat BSA (125, 250, 500 mg/kg/hari) mempunyai 13 tikus dalam setiap kumpulan dan kumpulan lain mempunyai 12 tikus dalam setiap kumpulan. Model kecederaan hati yang disebabkan oleh BSA dibahagikan kepada pemekaan primer diikuti dengan serangan imunologi) [13]. Kecuali untuk kumpulan biasa, kumpulan lain diberikan suntikan subkutaneus berganda dengan 0.5 ml (9 mg/ml) bahan pembantu tidak lengkap BSAFreund pada hari 1, hari 15, hari 22, hari29, dan hari 36 untuk pemekaan primer. Tujuh hari selepas suntikan kelima, darah diperoleh melalui plexus vena ratretinal dan diuji untuk antibodi albumin serum. Antibodi BSA dalam serum tikus dikesan melalui kaedah penyebaran agar adouble. Suntikan serangan dilakukan dengan mentadbir 0.4 ml BSA dalam normalsaline adalah melalui vena ekor pada tikus BSA antibodi-positif dua kali seminggu selama sepuluh kali. Kepekatan dan masa suntikan ialah 5.00, 5.50, 6.00, 6.50,7.00, 7.50, 8.50, 9.00, 9.50 dan 10.00 g/L pada hari ke-46 , hari ke-50, hari ke-53, hari ke-57, hari ke-60, ke-64, ke-67, ke-71, ke-74 dan ke-78. Dalam kumpulan normal, garam biasa digunakan untuk suntikan primer (pemekaan) dan sekunder (serangan) imunologi dan bukannya BSA, dan keadaan lain adalah sama seperti dalam kumpulan model.

Kumpulan biasa diberi air suling secara lisan dengan dos 10 ml/kg/hari. Kumpulan model diberikan secara lisan 10 ml/kg/hari 0.5 peratus larutan CMC-Na. Kumpulan ubat positif diberikan secara lisan 600 mg/kg/hari BJRG. Kumpulan CPhGs (125,250, dan 500 mg/kg/hari) yang dirawat BSA telah diberikan secara lisan masing-masing 125, 250, dan 500 mg/kg/hari CPhGs. Tikus dos harian diteruskan selama dua minggu selepas suntikan terakhir.

Selepas tempoh percubaan, tikus dipuasakan selama 12 jam sebelum 10 peratus kloral hidrat dan kemudian segera dicuci. Sampel serum dikumpul dari setiap ratand yang digunakan dengan segera. Hati dituai untuk dua tujuan: (1) pemeliharaan dalam nitrogen cecair untuk kit Hyp dan (2) penetapan dalam 10 peratus formaldehid untuk pemeriksaan histologi dan imunohistokimia. Tempoh keseluruhan kajian haiwan adalah 93 hari.

Phenylethanoid glikosidadalamCistanchemempunyai kesan pencegahan

Indeks hati dan limpa

Hati dan limpa dibedah dengan laparotomi dan dibasuh dengan garam biasa 4 darjah. Selepas menyerap lebihan air dengan kertas turas, hati dan limpa ditimbang untuk mengira indeks yang sepadan:Berat organ relatif=jisim organ (g)/jisim badan individu (g) ​​× 100 peratus [14].

Analisis penanda fibrosis hati

Kesan perlindungan CPhG terhadap kecederaan hati yang disebabkan oleh BSA dinilai dengan mengukur ALT dan AST (Penganalisis biokimia automatik sinar minda, A086A0182). Perkembangan fibrosis hati dan kesan rawatan ditentukan dengan memeriksa HA, LN, PC III, dan IV-C (Chemiluminescence analyzer, TaiGeKeXin, MP2808).

Analisis kandungan hyp dan TGF- 1.

Tahap Hyp dalam tisu hati ditentukan dengan kaedah spektrofotometri mengikut arahan kit. Tahap Hyp dinyatakan sebagai Hyp (ug)/protein (mg). Hyp (ug/mg)=(OD Diukur - OD kosong)/(OD kosong standard OD)×5 (ug/ml) × 10/berat basah tisu (ml/mg). Kepekatan hepatik TGF- 1 telah dikesan dengan menggunakan kit ELISA mengikut arahan pengilang. Kesan perencatan CPhG pada fibrosis telah disahkan oleh tahap ekspresi TGF- 1.

Pemeriksaan histopatologi

Tisu hati di bahagian yang sama pada lobus kiri dipotong dan difikatkan dalam larutan formaldehid 10 peratus. Tisu telah diwarnakan dengan pewarnaan H&E dan Masson'strichrome konvensional untuk melihat perubahan histopatologi di bawah mikroskop cahaya. Ekspresi kolagen jenis I, kolagen jenis III dan TGF{1}} dalam tisu hati telah dianalisis dengan pewarnaan imunohistokimia [15].

Imunohistokimia separa kuantitatif dilakukan mengikut kaedah yang dilaporkan [16, 17]. Pengelasan berikut telah digunakan untuk sel positif TGF- 1: "-" menunjukkan hampir tiada ungkapan, 20=l; " tambah " menunjukkan sel positif berkumpul secara individu di kawasan lesi, 21=2; " tambah tambah " menunjukkan sel positif dalam kumpulan kecil berkumpul di sekitar kawasan lesi, 22=4; " tambah tambah tambah " menunjukkan sel positif tersebar yang dinyatakan, sebagai 23=8. Hasilnya mewakili integrasi hierarki. Ijazah dan skop kromogenik jenis kolagen I dan jenis III kolagen ditukar kepada CRI untuk analisis statistik (darjah kromogenik × julat kromogenik). Darjah kromogenik dibahagikan kepada lemah " tambah ", sederhana " tambah tambah ", dan kuat " tambah tambah ". Julat kromogenik dibahagikan kepada " tambah ", julat kromogeniknya < paparan="" 1/4;="" "="" tambah="" tambah="" ",="" julat="" penglihatan="" kromogeniknya/4-2/4;="" "="" tambah="" tambah="" tambah="" ",="" julat="" penglihatan="" kromogeniknya="" 2/4-3/4;="" "="" tambah="" tambah="" tambah="" tambah="" ",="" julat="" kromogennya=""> 3/4. Blindedscoring dilakukan oleh dua orang dengan " tambah " ialah 1; " tambah tambah "adalah 2, " tambah tambah tambah " ialah 3 dan " tambah tambah tambah tambah " ialah 4. Tiga medan pemerhatian mikroskop (pembesaran × 200) dipilih secara rawak untuk setiap bahagian, dengan tahap purata sampel digunakan sebagai tahap separa kuantitatif.

Eksperimen sel

Sel HSC-T6 disalut dalam 96-plat perigi. Pada mulanya, sel telah dikultur dengan DMEM yang mengandungi 10 peratus FBS selama 48 jam. Medium itu kemudiannya digantikan dengan DMEMtanpa FBS untuk menghilangkan sel-sel selama 12 jam. Sel-sel tersebut kemudiannya dikultur dengan DMEM yang mengandungi 5.0 ng/mLTGF- 1 (tanpa FBS) selama 24 jam. Akhir sekali, kepekatan CPhG yang berbeza (100ug/ml, 50ug/ml, dan 25ug/ml), acteoside (6 ug/ml, 3 ug/ml, dan 1.5 ug/ml), andechinacoside (500ug/ml, 250ug/ml, dan 125ug/ml) telah dijalankan di dalam pinggan dalam telaga empat kali ganda dan diinkubasi selama 48 jam.

Analisis PCR masa nyata

Tahap ekspresi mRNA NF-κB, p65, dan kolagenI ditentukan oleh PCR masa nyata. Untuk menentukan ekspresi mRNA dalam sel HSC-T6, sel (4 × 105sel) telah disemai dalam plat enam sumur dengan 3 mL DMEMdengan 10 peratus FBS dan diinkubasi semalaman pada 37 darjah dan 5 peratus CO2, selepas itu media kultur sel telah ditukar DMEM bebas toserum. Seterusnya, CPhGs (100 ug/ml, 50 ug/ml, dan 25 ug/ml), acteoside (6 ug/ml, 3 ug/ml dan 1.5 ug/ml), dan echinacoside (500 ug/ml, 250 ug /ml, dan 125ug/ml) telah ditambah ke dalam telaga. Selepas 48 jam pengeraman dengan CPhGs atau komposisi monomerik, jumlah RNA telah diekstrak menggunakan reagen TRIzol (Invitrogen, USA) dan digigit kuat dengan kloroform selama 15 saat. Selepas duduk pada suhu bilik selama 3 minit, lisat diempar pada 12,000 × g selama 15 minit pada 4 darjah . RNA dalam fasa akueus dimendakkan dengan isopropanol, dan fasa akueus atas dipindahkan ke tiub mikrosentrifuge baru. RNA dimendakkan dengan menambah 0.75 peratus etanol, selepas itu tiub mikrosentrifuge dan disentrifugasi pada 12,000 × g pada 4 darjah selama tidak lebih daripada 5 minit. Supernatan dikeluarkan dan RNA dikeringkan pada suhu bilik selama 5-10 minit. Set primer khusus (Sangon, Shanghai, China) yang digunakan untuk penguatan rat -actin [GenBank: NM_031144.3],Collagen I [GenBank: NM_ 053304.1] dan NF- Gen κB p65[GenBank: NM_199267.2] direka menggunakan Primer Batch 3. Primer hadapan (FW) dan reverse (RV) adalah seperti berikut: Kolagen I (FW: GGA GAGAGC ATG ACC GAT GG, RV: GGG ACT TCT TGAGGT TGC CA), NF-κB p65 (FW: CAT ACG CTG ACCCTA GCC TG, RV: TTT CTT CAA TCC GGT GGCGA), -actin (FW: TAA GGC CAA CCG TGA AAA GATG, RV: AGA GGC ATA CAG GGA CAA CAC A). Keputusan telah dinormalisasi kepada mRNA housekeepinggene -actin sebagai kawalan dalaman dan dibentangkan sebagai tahap mRNA relatif

Tindak balas dilakukan dengan 8 μL IQ SYBR GreenSupermix, 1 μL 10 pM pasangan primer, 8.5 μL air suling, dan 2.5 μL cDNA. Setiap tindak balas rantai polimerase dilakukan di bawah keadaan berikut: 95 darjah selama 3 minit, kemudian 40 kitaran 10 saat pada 95 darjah, 30 saat pada 55 darjah, dan 10 saat pada 55 darjah – 95 darjah untuk lanjutan, diikuti dengan pengukuran pendarfluor tunggal. Keputusan akhir diterangkan dengan nilai relatif (2-ΔΔCt). Pengiraan dan analisis telah dilakukan oleh Sistem Pengesanan PCR Masa Nyata iQ5.

Analisis Western blot

Kolagen I (Abcam, Cambridge, UK, No. Seni: ab34710) tahap ekspresi protein ditentukan oleh Westernblotting [dengan -actin (Lot: 60008-1-lg; Proteintech,China) sebagai kawalan pengemasan. Ekstrak sel keseluruhan telah disediakan menggunakan ujian Radioimmunoprecipitation(RIPA) (Thermo Scientific, USA) dengan 1 peratus koktel perencat Haltprotease (Thermo Scientific, USA) dan 1 peratus koktel perencat Halt phosphatase (Thermo Scientific, USA). Kepekatan protein diukur dan dikira dengan kaedah Bradford [18]. Protein(10–50 ug) diasingkan pada gel SDS-PAGE 10 peratus dan dipindahkan ke membran PVDF (Millipore, USA). Membran disekat selama 1 jam pada suhu bilik dengan 5 peratus BSA, dan antibodi utama (Anti-Colla gen I antibodi, pencairan 1:200 atau mAb tetikus -actin, 1:5000 pencairan) telah diinkubasi pada 4 darjah semalaman. Alk-Phos yang sepadan. antibodi sekunder terkonjugasi diinkubasi pada suhu bilik. Akhirnya, membran tema telah dibasuh tiga kali dengan 1 × Tris-HClsaline dengan 0.1 peratus Tween 20, dan isyarat telah diimbas dan divisualisasikan oleh Sistem Pengimejan GEL DOC XR (Bio-Rad). Analisis densitometrik dilakukan pada protein yang diminati dan dinormalisasi kepada -actin oleh perisian GEL DOCImage Studio (Bio-Rad). -aktin digunakan sebagai kawalan dalaman.

Analisis statistik

Ujian kenormalan Shapiro-Wilk dan ujian kehomogenan varian Levene digunakan untuk mengesahkan kenormalan dan kehomogenan varians. Analisis varians (ANOVA) diikuti dengan ujian post hoc Tukey digunakan untuk mengenal pasti perbezaan statistik tidak homogen, data taburan normal. Ujian bukan parametrik Kruskal-Wallis digunakan untuk menganalisis data yang tidak bertaburan normal atau homogen. Keputusan dinyatakan sebagai min ± SD. Kepentingan ditetapkan pada P < 0.05.="" semua="" data="" dianalisis="" oleh="" perisian="" spss="" 16.0="" (universiti="" perubatan="">

Keputusan

Penentuan kuantitatif CPhGsCPhGs dalamCistanchetubulosamengandungi duaPhenylethanoidglikosida, echinacoside, dan acteoside, dan kandungannya dalam CPhGs ditentukan oleh analisis HPLC (Rajah 1) menjadi 42.71 ± 0.42 peratus dan 14.27 ± 0.18 peratus, masing-masing.

Indeks hati dan limpa

Seperti Jadual 1 ditunjukkan, indeks hati dan limpa bagi kumpulan model telah dinaikkan dengan ketara [P < 0.01,p="">< 0.05].="" indeks="" hati="" dan="" limpa="" bjrg="" dan="" cphg="" ubat="" positif="" pada="" kumpulan="" dos="" yang="" berbeza="" telah="" dikurangkan="" dengan="" ketara="" berbanding="" dengan="" kumpulan="" model[pliver="0.004," plliver="0.003," plliver="0.004," pliver="0.005;" pspleen="0.017," pspleen="0.027," pspleen="0.024,PSpleen=0.070," masing-masing].="" indeks="" hati="" dan="" limpa="" adalah="" lebih="" rendah="" daripada="" kumpulan="">

Kesan CPhG pada aktiviti ALT, AST, dan penanda fibrosis hati

Dalam kajian ini, paras serum enzim hepatik AST dan ALT telah meningkat dengan ketara dalam kumpulan model, mencerminkan kerosakan hepatoselular dalam tikus fibrosis hati yang disebabkan oleh BSA. Walau bagaimanapun, eksperimen menunjukkan bahawa rawatan dengan BJRG (600 mg/kg) dan CPhGs(125, 250 dan 500 mg/kg) berkurangan dengan ketara AST[PAST < 0.001,="" past="">< 0.001,="" past="">< 0.001,="" past="">< 0.001,="" re="" spectively]="" dan="" alt="" [palt="0.117," palt="0.139," palt="0.189" ,="" palt="0.255," masing-masing]="" tahap="" dalam="" fibrosisrat="" hepatik.="" (jadual="">

Tahap HA, LN, PC dan IV-C dalam tikus model telah meningkat dengan ketara [PHA < 0.001,="" pln="">< 0.{{39}="" }01,="" ppciii="0.002," piv-c="">< 0.001,="" masing-masing].="" berbanding="" dengan="" kumpulan="" model,="" tahap="" ha="" [pha="0.009," pha="0.007,PHA=0.009," pha="0.023," masing-masing],="" ln="" [pln="0.011," pln="0.004," p="" ln="0.026," p="" ln="0.069," masing-masing],="" pc="" iii[p="" pciii="" {{26="" }}.006,="" p="" pciii="0.067," p="" pciii="0.136," p="" pciii="0.296," masing-masing]="" dan="" iv-c="" [p="" iv-c="">< 0.001,="" p="" iv-c="">< 0.001,="" p="" iv-c="">< 0.001,="" p="" iv-c="">< 0.001,="" masing-masing]="" pada="" tikus="" telah="" menurun="" dengan="" ketara="" oleh="" bjrg="" (600="" mg/kg)="" dan="" cphgs="" pada="" kumpulan="" dos="" yang="" berbeza="" (125,="" 250,="" dan="" 500="" mg/kg="" )="" (jadual="">

Kandungan hyp dan TGF- 1

Kandungan kolagen juga dikesan dengan mengukur Hyplevels dalam tisu hati. Seperti yang ditunjukkan dalam Jadual 4, purata tahap Hyp dalam kumpulan model adalah jauh lebih tinggi daripada kumpulan normal, tetapi ia telah menurun dengan ketara dalam kumpulan BJRG dan kumpulan dos CPhG yang berbeza.

Kepekatan hepatik TGF{{0}} kumpulan model dalam tikus meningkat dengan ketara [P < 0.00}1].berbanding="" dengan="" kumpulan="" model,="" tahap="" tgf-="" 1="" ubat="" positif="" dan="" kumpulan="" dos="" cphg="" yang="" berbeza="" telah="" menurun="" dengan="" ketara="" [p="" tgf-="" 1="">< 0.001,="" p="" tgf-="" 1="">< 0.001,p="" tgf{{10="" }}="">< 0.001,="" ptgf-="" 1="">< 0.001,="" masing-masing].="" keputusan="" diringkaskan="" dalam="" jadual="">

Pemeriksaan histopatologi

Pemerhatian bahagian tisu hati normal yang diwarnai dengan H&E dan trichrome Masson mempamerkan hepaticlobules dan sinusoid hepatik yang berbeza. Struktur tisu hati dalam model tikus tidak teratur, dan tisu hati dan sinusoid hepatik telah digantikan dengan sejumlah besar tisu penghubung. Walau bagaimanapun, lebih banyak seni bina cyto normal dan kurang tisu penghubung dikesan dalam kumpulan rawatan berbanding kumpulan model.

pewarnaan H&E

Dalam kumpulan normal, integriti struktur lobul hepatik tanpa kawasan portal abnormal dan sinusoid hepatik diperhatikan. Kord hepatik disusun dengan teratur, dengan inti bulat dan jelas. Nukleus terletak di tengah-tengah sel, dengan sitoplasma yang banyak. Hanya kawasan portal mempunyai sejumlah kecil tisu berserabut (Rajah 2a).

Dalam kumpulan model, struktur lobular rosak teruk. Sel-sel hati menunjukkan degenerasi berair ringan, kebanyakannya degenerasi belon dan/atau degenerasi lemak. Pembentukan penyusupan sel radang, hiperplasia tisu berserabut yang meluas, pembentukan bilangan besar septum berserabut, lobul berpecah, dan percambahan sel hati yang ketara juga diperhatikan. Pemerhatian ini mengesahkan kejayaan penubuhan model haiwan kecederaan imun tikus fibrosis hepatik (Rajah 2b).

Berbanding dengan kumpulan model, terdapat pengurangan dalam penyusupan sel radang dalam CPhG yang berbeza. Turut diperhatikan adalah kurang nekrosis dan degenerasi lemak sel hati serta pengurangan fibrosis. CPhG secara signifikan mengurangkan patologi fibrosis alahan BSA dalam tikus, mengurangkan pembengkakan sel hati, dan berkesan menghalang nekrosis hepatosit dan penyusupan sel radang, menunjukkan bahawa CPhGsexert memberikan kesan perlindungan pada hepaticfibrosis tikus yang disebabkan oleh BSA. (Gamb. 2c–f ).

Pewarnaan trichrome Masson

Dalam kumpulan normal, tisu hati adalah normal. Kawasan portal hepatik menunjukkan sebilangan kecil gentian kolagen biru, dan tisu hati biasanya berstruktur (Rajah 3a). Berbanding dengan tisu hati kumpulan normal, tisu berserabut membiak oleh risalah pusat dan mengembang ke dalam parenkim hati. Gentian kolagen memanjang dan menghubungkan dan menyelubungi seluruh lobul dan mengelilingi vena pusat. Kesan ini, bersama-sama dengan fibrosis hepatosit, kerosakan struktur lobular, fibrosis periportal, dan pembentukan pseudolobule (Rajah 3b) memberikan bukti bahawa model itu telah ditubuhkan.

Berbanding dengan kumpulan model, gentian kolagen dalam kumpulan kawalan ubat positif sedikit dipanjangkan keluar dari kawasan portal persisian (Rajah 3c). Dibandingkan dengan kumpulan model, gentian kolagen dalam kumpulan dos CPhG yang berbeza telah dikurangkan dengan ketara, percambahan gentian telah dihalang, dan percambahan tisu berserabut dalam parenkim hati berkurangan dengan ketara. Keputusan ini mencadangkan bahawa tikus dilindungi CPhG daripada fibrosis hepatik yang disebabkan oleh BSA (Rajah 3d–f).

Pewarnaan imunohistokimia

Yang penting, ekspresi kolagen jenis I dan kolagen jenis III memainkan peranan penting dalam pembangunan fibrosis hepatik, dan penjanaan dan pemendapan mereka dalam tisu hati boleh berfungsi sebagai penentu penting keberkesanan fibrosis anti-hepatik. Keputusan diringkaskan dalam Jadual 5.

Kolagen jenis I

Kumpulan normal menyatakan kolagen jenis I terutamanya saluran darah dalam dan kawasan portal. Kumpulan model fibrosis vaskular jenis I kolagen yang sangat tertekan di kawasan portal. Dalam ruang Disse, pewarnaan kolagen jenis I diperhatikan sebagai coretan atau sebagai taburan bertompok. Kolagen berselubung fibroussepta untuk membentuk pseudolobule. Dalam eksperimen ini, lebih sedikit septa berserabut telah dibentuk untuk BJRJ (600 mg/kg) dan kumpulan dos berbeza CPhGs s (125, 250, dan 500 mg/kg) [PCol I= 0.002, PCol I {{6 }}.001, PCol I=0.023, dan PCol I=0.044, secara spesifik]. Keputusan separa kuantitatif mendedahkan bahawa ekspresi kolagen jenis I mereka adalah jauh lebih rendah berbanding dengan kumpulan model (Rajah 4).

Kolagen jenis III

Kolagen jenis III diekspresikan dengan lemah dalam kumpulan normal, dan kawasan pinggir yang mengelilingi portal dan vena hepatik menunjukkan sejumlah kecil kuning halus dan bukannya gentian berterusan (Rajah 5a). Dalam kumpulan model, gentian kolagen mempamerkan kord lebar dan tebal, menunjukkan ekspresi kuat, terutamanya terletak di kawasan portal dan tisu berserabut (Rajah 5b).

Gentian kolagen BJRJ (600 mg/kg) dan kumpulan dos berbeza CPhGs (125, 250, dan 500 mg/kg) adalah berfilamen dan diedarkan di sekitar vena pusat dan kawasan portal. Berbanding dengan kumpulan model, gentian kolagen berkurangan dengan ketara, pewarnaan pucat dan nipis, dan pewarnaan imunohistokimia adalah lemah positif (Rajah 5c–f). Keputusan separa kuantitatif ini menunjukkan bahawa sel yang dinyatakan secara positif dalam kumpulan dos positif dan berbeza [PCol III=0.015, PCol III=0.001, PColIII=0.010 dan PCol III=0.037, masing-masing] berbeza daripada kumpulan model.

TGF- 1

Terdapat sedikit ekspresi TGIF- 1 dalam sel hati tikus biasa. Ungkapan dihadkan kepada sebilangan kecil sel interstisial (Rajah 6a). Dalam kumpulan model, ungkapan TGF- 1 diedarkan secara meluas di kawasan portal, ruang gentian, sel stellate hepatik, sel radang, dinding sinusoidal dan sitoplasma. Kawasan portal tertentu menunjukkan ekspresi yang sangat positif dengan pewarnaan kuning kecoklatan (Rajah 6b)

Terdapat sedikit ekspresi di kawasan portal dan septa berserabut BJRJ (600 mg/kg) dan kumpulan dos CPhG yang berbeza (125, 250, dan 500 mg/kg). Tahap pewarnaan positif dalam kumpulan ini berkurangan dengan ketara berbanding dengan kumpulan model. Pewarnaan dalam sel interstisial dalam septa berserabut dan sitoplasma sel radang telah berkurangan (Rajah 6c–f). Keputusan separa kuantitatif mendedahkan bahawa BJRJ dan kumpulan dos berbeza bagiCPhG [P TGF- 1=0.001, P TGF- 1 < 0.001,="" p="" tgf-="" 1="0.009," ptgf-="" 1="0." 004,="" masing-masing]="" adalah="" signifikan="" dibandingkan="" dengan="" kumpulan="">

Seperti yang dinyatakan sebelum ini dalam artikel, TGF- 1 ialah sitokin penting dalam patofisiologi fibrosis hati, merangsang pengeluaran matriks ekstraselular [19]. Kami menunjukkan bahawa tahap TGF- 1 meningkat dalam kumpulan model dengan cara yang konsisten dengan keterukan fibrosis hati. Tahap ekspresi TGF- 1 dalam hati adalah konsisten dengan tahap serumTGF- 1. Ini menunjukkan bahawa CPhG dapat mengurangkan fibrosis hati dengan ketara disebabkan oleh ekspresi TGF- 1 dengan mengambil bahagian dalam sintesis dan degradasi ECM.

Ekspresi kolagen jenis I, kolagen jenis III, dan TGF- 1 boleh mengesan proses patologi fibrosis hepatik. Tahap ekspresi mereka dalam kumpulan rawatan telah menurun dengan ketara dan menggambarkan bahawa CPhG boleh meningkatkan aktiviti kolagenase, mengekalkan keseimbangan dinamik sintesis dan degradasi ECM hati, dengan itu melambatkan dan menghalang pembentukan fibrosis hati.

Ekspresi NF-κB p65 dan kolagen I selepas campur tangan dadah dalam sel HSC-T6

Untuk mencirikan isyarat fibrosis hepatik, dua gen pengawalseliaan utama dalam hati ditentukan melalui ujian RT-PCR. Data menunjukkan bahawa sel tHSC-T6 daripada kumpulan kawalan mempunyai tahap NF κB dan kolagen jenis I mRNA yang lebih rendah. Sebaliknya, TGF- 1 mendorong sel HSC-T6 untuk mengawal selia NF-κB (P < 0)="" dengan="" ketara.01)="" dan="" mrna="" col-i="" (p="">< 0.01),="" dengan="" tahap="" yang="" lebih="" tinggi="" daripada="" mereka="" dalam="" kumpulan="" kawalan.="" dengan="" kehadiran="" kepekatan="" cphg="" yang="" berbeza,="" keputusan="" nf-κb="" p65="" [p="" nf-κb="0.001" untuk="" 100="" ug/ml,="" p="" nf-κb="0.002" untuk="" 75="" ug/ml="" ,="" p="" nf-κb="0.007" untuk="" 50="" ug/="" ml,="" dan="" p="" nf-κb="0.012" untuk="" 25="" ug/ml,="" masing-masing]="" dan="" col-i="" [p="" col-i="" {{32="" }}.006,="" p="" col-i="0.009," p="" col-i="0.014," p="" col-i="0.019," masing-masing]="" menunjukkan="" ekspresi="" berkurangan="" mrna="" ini="" (="" rajah="">

Analisis Western blot tahap kolagen I selepas campur tangan ubat dalam sel HSC-T6

Rajah 8 menunjukkan tahap ekspresi protein kolagen I dalam sel HSC-T6 kumpulan eksperimen yang berbeza. Tahap ekspresi protein kolagen I telah menurun dengan ketara dalam pelbagai kumpulan dos CPhGs (100 ug/ml, 75 ug/ml, 50 ug/ml, dan 25 ug/ml) berbanding dengan kumpulan TGF- 1.

Perbincangan

CPhGs ialah glikosida phenylethanoid yang diasingkan dan disucikan daripada rizom Cistanche, yang digunakan sebagai ubat herba tradisional Cina. Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, CPhGshad telah ditunjukkan mempunyai keupayaan yang kuat untuk mencegah kecederaan hati [20]. Oleh itu, kami berhasrat untuk menyiasat sama ada CPhG mempunyai kesan perencatan pada hepatitis fibrosis oleh fibrosis hepatik yang disebabkan oleh BSA dalam tikus. BJRG biasanya digunakan sebagai ubat terapeutik untuk fibrosis hepatik China. Ia diperbuat daripada kulit penyu. Radix PaeoniaRubra, Cordyceps Sinensis, Radix isatidis, dll. mempunyai kesan menambah Qi dan darah, melegakan keletihan, melembutkan nod. Di samping itu, kajian terdahulu menunjukkan bahawa ia mempunyai fungsi yang jelas untuk menyekat fibrosis hati awal, menghalang percambahan sel penyimpan lemak, dan mengurangkan sintesis kolagen [21]. Oleh itu, BJRG digunakan sebagai ubat positif dalam kajian ini.

Perubahan patologi fibrosis hepatik pada tikus yang disebabkan oleh suntikan BSA adalah serupa dengan sirosis humanportal [22]. Bergantung kepada dos CPhG mengurangkan tahap fibrosis hati dan menghalang transformasi HSC menjadi sel seperti myofibroblast, mengurangkan tahap tinggi serum ALT, AST, HA, LN, CIV, TGF- 1, dan indeks hati, dan mengekspresi kolagen dengan ketara. I, kolagen III dan TGF- 1 dalam tisu hati.

Peringkat fibrosis hepatik dikaitkan dengan tahap HA, LN, dan IV-C ini, yang sebagai penanda mungkin memainkan peranan dalam mengesan tahap fibrosis hepatik [23]. Telah dilaporkan bahawa HA ialah sumber utama matriks ekstraselular. IV-C sebagai unsur penting membran bawah tanah akan disintesis dengan banyaknya dan dimendapkan dengan banyak dalam fasa awal sirosis hati. Tahap serum LN dan IV-C adalah indeks kadar pusing ganti membran bawah tanah dan menunjukkan tahap fibrosis di kawasan portal dan kapilari sinus [24]. PC III adalah penanda dalam diagnosis fibrosis hepatik dan sirosis awal, tetapi sensitiviti dan kekhususannya tidak tinggi, dan tiada perbezaan yang ketara antara pelbagai peringkat fibrosis dalam banyak rujukan [24, 25]. Kajian ini memperoleh keputusan yang sama.

Selain itu, pemerhatian bahagian bernoda trichrome H&E dan Masson mempamerkan tisu hati yang normal dengan lobul hepatik yang berbeza dan sinusoid hepatik. Struktur tisu hati dalam kumpulan model adalah tidak teratur, dan tisu hati dan sinusoid hepatik digantikan dengan sejumlah besar tisu penghubung. Walau bagaimanapun, peningkatan yang ketara diperhatikan dalam kumpulan rawatan berbanding dengan kumpulan model.

Yang penting, ekspresi kolagen jenis I dan kolagen jenis III memainkan peranan penting dalam perkembangan fibrosis hepatik, penyekatan yang boleh menghalang dan merawat fibrosis hepatik. Oleh itu, penjanaan dan pemendapan dalam tisu hati jenis kolagen I dan kolagen jenis III boleh berfungsi sebagai penentu penting keberkesanan fibrosis anti-hepatik. TGF- 1 juga merupakan sitokin profibrogenik yang penting dalam kecederaan hati dan ia aktif secara biologi dengan pelbagai tindakan farmakologi[26]. Keseimbangan antara tindakan ini diperlukan untuk mengekalkan homeostasis tisu. Ekspresi menyimpang TGF 1 terlibat dalam patogenesis penyakit hati [27, 28]. Diketahui bahawa TGF- 1 ialah sitokin penting yang terlibat dalam peringkat awal fibrosis hati. Tekanan oksidatif mencetuskan TGF- 1, menghasilkan ECM yang merangsang pengeluaran dan pemendapan [29]. Oleh itu, salah satu strategi yang berkesan untuk menghasilkan ubat fibrosis anti-hepatik ialah mengenal pasti agen anti-TGF- 1. Analisis imunohistokimia menunjukkan bahawa ekspresi kolagen jenis I, kolagen jenis III dan TGF{12}} boleh mengesan proses patologi fibrosis hepatik. Ekspresi kolagen jenis I, kolagen jenis III dan TGF{13}} dalam kumpulan rawatan dikurangkan, yang jauh lebih rendah dalam kumpulan rawatan CPhG dos tinggi khususnya dan mencadangkan bahawa CPhG ialah kolagen jenis I, kolagen jenis III yang berkesan. , dan perencat TGF{14}}. Mungkin, CPhGscan meningkatkan aktiviti kolagenase, mengekalkan keseimbangan dinamik sintesis dan degradasi ECM, dengan itu melambatkan dan menghalang pembentukan fibrosis hati.

CPhGs bukan sahaja boleh memperbaiki hepaticfibrosis yang disebabkan oleh BSA pada tikus tetapi juga mungkin dikaitkan dengan menghalang pengaktifan HSC secara in vitro. Pengaktifan HSC difikirkan mewakili langkah penting fibrogenesis. Dalam kajian ini, keputusan menggambarkan bahawa pentadbiran CPhG dari 25 hingga 100 ug/ml dengan ketara melemahkan penurunan NF-κB p65, ekspresi mRNA kolagen I, dan ekspresi protein kolagen I dalam HSC.

NF-κB memainkan peranan penting dalam memodulasi tindak balas imun terhadap jangkitan atau rangsangan [30]. Pembentukan NF-κB dalam sel hati boleh mengakibatkan pengambilan sitokin/mediator radang, sekali gus mendorong perkembangan fibrosis [31, 32]. Selain itu, kolagen juga merupakan indeks sensitif yang mencerminkan tahap fibrosis dan menyumbang kira-kira 50 peratus daripada jumlah protein dalam hati berserabut [33]. Akibatnya, kami mengandaikan bahawa mekanisme molekul terhadap fibrosis hepatik dikaitkan dengan ketidakaktifan pengantaraan CPhGs bagi ekspresi NF-κB, di mana manfaatnya menyumbang kepada peranan sinergistik melemahkan imunotoksisiti dan tekanan keradangan dalam tisu hati yang berlesi BSA, seterusnya membetulkan dismetabolisme kepada ameliorate.

Kesimpulan

Kesimpulannya, kajian kami menunjukkan bahawa CPhGs secara signifikan melemahkan tahap fibrosis hepatik yang disebabkan oleh BSA pada tikus. Mekanismenya mungkin sekurang-kurangnya sebahagiannya disebabkan oleh kesan perencatan CPhG pada komposisi ECM dan rangsangan kemerosotan ECM, dan/atau melalui perencatan langsung sintesis kolagen jenisI, kolagen jenis III dan ekspresi TGF{{0 }}. Oleh itu, kami menjangkakan bahawa CPhG boleh digunakan dalam produk penjagaan kesihatan atau dalam ubat klinikal untuk pencegahan fibrosis hati manusia. Kajian masa depan diperlukan untuk mewujudkan keberkesanan CPhG sebagai ubat anti-hepaticfibrosis yang kuat.

Singkatan

CPhGs: anol glikosida daripada cistanche;

BSA: albumin serum lembu;

HSC-T6: Sel stellate hepatik;

Hyp: Hydroxyproline;

BJRG: Tablet CompoundBiejiarangan;

TGF- 1: Mengubah faktor pertumbuhan 1;

ALT: Alanineaminotransferase;

AST: Aspartate aminotransferase;

HA: Asid hyaluronik;

LN: Laminin; PC III: Prokolagen Jenis III;

IV-C: Kolagen jenis IV;

NF-κB: Penambah rantai-cahaya-nuklear kappa bagi sel B yang diaktifkan;

RT-PCR: Tindak balas rantai Reversetranscriptase-polimerase;

SDS-PAGE: Elektroforesis gel Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide.

Kepentingan yang bersaing

Penulis mengisytiharkan bahawa mereka tidak mempunyai kepentingan bersaing

Sumbangan penulis

TL, JZ, SPY, LM, MT dan SLZ menyusun dan mereka bentuk eksperimen. SPY, TL dan JZ menganalisis data. SPY dan JZ menulis manuskrip. TL, LM dan JZ menyemak manuskrip. Semua pengarang membaca dan meluluskan manuskrip akhir.

Pengakuan

Penyelidikan ini disokong oleh National Natural Science Foundationof China (81260624). Penulis ingin mengucapkan ribuan terima kasih kepada Profesor Tao Liu atas cadangan penambahbaikannya untuk penulisan kertas kerja ini.

Butiran Pengarang

1Jabatan Toksikologi, Pusat Pengajian Kesihatan Awam, Universiti Perubatan Xinjiang, No. 393 Xinyi Road, Urumqi 830011Wilayah Autonomi Uyghur Xinjiang, China. 2Makmal Utama untuk Perubatan Uighur, Institut MateriaMedica Xinjiang, Urumqi 830004, China. 3No. 140 Xinhua South Road, Daerah Tianshan, Urumqi 830000Wilayah Autonomi Uyghur Xinjiang, China.

Klik di sini untuk menyemakCistanchetubulosaproduk

Rujukan
1. Cohen-Naftaly M, Friedman SL. Status semasa terapi antifibrotik novel pada pesakit dengan penyakit hati kronik. Ther Adv Gastroenterol. 2011;4(6):391–417.
2. Puche JE, Saiman Y, Friedman SL. Sel stellate hepatik dan fibrosis hati. Compr Physiol. 2013;3(4):1473–92.
3. Hernandez-Gea V, Friedman SL. Patogenesis fibrosis hati. Annu Rev Pathol. 2011;6:425–56.
4. Sohrabpour AA, Mohamadnejad M, Malekzadeh R. Artikel ulasan: keterbalikan sirosis. Aliment Pharmacol Ther. 2012;36(9):824–32.
5. Raven PH, Zhang LB, Ventenat O. akademi sains Cina. ed ke-23 China: Jawatankuasa Editorial Flora China; 2013. hlm. 1–16.
6. Suruhanjaya Farmakope China Kementerian Kebersihan Republik Rakyat China. Farmakope China, Bahagian 1. China: Chemical Industry Publishing House; 2010. hlm. 126.
7. Yan GH, Tian JH, Long BW, Li N. Kemajuan penyelidikanphenylethanoidglikosidadaripadaCistanchetubulosa. Central South Pharm. 2012;10:692–5.
8. Li J, Huang D, He L. Kesan Rou Cong Rong (Herba Cistanches Deserticolae) terhadap ketoksikan pembiakan pada tikus yang disebabkan oleh glikosida Leigongteng (Radix et Rhizoma Tripterygii). J Tradit Chin Med. 2014;34(3):324–32.
9. Xing Y, Liao J, Tang Y, Zhang P, Tan C, Ni H, et al. ACE, dan perencat agregasi platelet daripada Tamarix hohenackeri Bunge (tumbuhan hos bagiHerbaCistanches) berkembang di Xinjiang. Pharmacogn Mag. 2014;10(38):111–7.
10. Jia Y, Guan Q, Jiang Y, Salh B, Guo Y, Tu P, et al. Peningkatan kolitis akibat natrium dekstran sulfat pada tikus oleh ekstrak yang diperkaya echinacosideCistanchetubulosa. Phytother Res. 2014;28(1):110–9.
11. Wong HS, Ko KM. Herba Cistanches merangsang kitaran redoks glutathione selular oleh spesies oksigen reaktif yang dihasilkan daripada respirasi mitokondria dalam kardiomiosit H9c2. Pharm Biol. 2013;51(1):64–73.
12. Zhang SJ, Liu L, Yu JY. ARP: Kaedah RP-HPLC untuk penentuan serentak echinacoside dan acteoside dalam Herbie Cistanches. Chin Pharm J 2004; 39(10): 740-741.
13. Zhu QG, Fang BW, Zhu QN, Wu HS, Fu QL. Kajian model haiwan fibrosis hati imuniti yang disebabkan oleh albumin serum lembu. Chin J Pathol. 1993;22:121–2.
14. Qin DM, Wen ZP, Nie YR, Yao GM. Kesan ekstrak Cichorium glandulosum pada CCl4-fibrosis hepatik yang disebabkan. Bulan Sabit Merah Iran Med J. 2013;15, e10908.
15. Niu HM, Zeng DQ, Long CL, Peng YH, Wang YH, Luo JF, et al. Diterpenoid Clerodane dan flavonoid terprenilasi daripada Dodonaea viscosa. J Asian Nat Prod Res. 2010;12(1):7–14.
16. Li WW, Song XW, Wang HW, Shen BS, Wang QC. Korelasi NF-κB dan pementasan patologi fibrosis hati pada pesakit dengan hepatitis B kronik. Chin J Immunol. 2013;29(3):251–4.
17. Zhang GL, Shi XF, Ran CQ, Xu M, Zhu ZJ. Kesan jumlah saponin Panax notoginseng terhadap fibrosis hati pada tikus. Acta Academiae Medicinae Militaris Tertiary. 2007;29:2212–4.
18. Rossi O, Maggiore L, Necci F, Koberling O, MacLennan CA, et al. Perbandingan ujian kolorimetrik dengan analisis asid amino kuantitatif untuk kuantifikasi protein modul umum untuk antigen membran (GMMA). Bioteknol Mol. 2015;57(1):84–93.
19. Dang SS, Li YP. Kemajuan dalam memahami peranan mengubah faktor pertumbuhan- 1 dalam patogenesis fibrosis hati. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi. 2010;18:1631–6.
20. Zhao J, Liu T, Ma L, Yan M, Zhao Y, Gu Z, et al. Kesan perlindungan acteoside pada kecederaan hati imunologi yang disebabkan oleh Bacillus Calmette-Guerin ditambah lipopolysaccharide. Planta Med. 2009;75(14):1463–9.
21. Yang FR, Fang BW, Lou JS. Kesan pil Fufang Biejia Ruangan pada fibrosis hepatik secara in vivo dan in vitro. Dunia J Gastroenterol. 2013;19(32):5326–33.

22. Liu P, Fang BW, Liu C. Peranan mengubah faktor pertumbuhan 1 dan reseptornya dalam fibrogenesis hati akibat imunologi dalam tikus dan kesan polisakarida cordyceps pada mereka. Chin J Hepatol. 1998;6:232–3.

23. Xu GG, Luo CY, Wu SM, Wang CL. Hubungan antara peringkat hepatikfibrosis dan tahap biokimia serum. HBPD INT. 2002;1:246–8.Anda et al. Jurnal Sains Farmaseutikal DARU (2015) 23:52 Halaman 12 daripada 13

24. Liu J, Wang JY, Lu Y. Penanda fibrosis serum dalam mendiagnosis fibrosis hati. DaguJ Intern Med. 2006;145:475–7.

25. Li CZ, Wan MB, Zeng MD, Mao YM, Fan ZP, Cao AP, et al. Kajian awal gabungan parameter bukan invasif dalam diagnosis fibrosis hati. Chin J Hepatol. 2001;9:261–3.

26. Chen YL, Li ZY. Hubungan antara TGF- 1, PDGF-BB, CTGF dan hepatitis B kronik dengan fibrosis. Chin J Diffic Compl Cas. 2010;9:19–20.

27. Sferra R, Vetuschi A, Catitti V, Ammanniti S, Pompili S, Melideo D, et al. Ekstrak Boswellia serrata dan Salvia miltiorrhiza mengurangkan fibrosis hepatik yang disebabkan oleh DMN pada tikus oleh TGF-beta1 downregulation. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2012;16(11):1484–98.
28. Liu L, Li XM, Chen L, Feng Q, Xu LL, Hu YY, et al. Kesan Gypenosides pada laluan TGF- 1/Smad dalam fibrosis hati yang disebabkan oleh karbon tetraklorida dalam tikus. Pelatih J Integr Med. 2013;1:1–6.
29. Zhang BJ, Xu D, Guo Y, Ping J, Chen LB, Wang H. Perlindungan oleh mekanisme antioksidan berberine terhadap fibrosis hati tikus yang disebabkan oleh pelbagai faktor hepatotoksik. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2008;35(3):303–9.
30. Tornatore L, Thotakura AK, Bennett J, Moretti M, Franzoso G. Laluan isyarat faktor nuklear kappa B: mengintegrasikan metabolisme dengan keradangan. Trends Cell Biol. 2012;22(11):557–66.
31. Luedde T, Schwabe RF. NF-κB dalam kecederaan penghubung hati, fibrosis, dan karsinoma hepatoselular. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2011;8(2):108–18.
32. Petrasek J, Csak T, Szabo G. Reseptor seperti tol dalam penyakit hati. Adv Clin Chem. 2013;59:155–201.
33. Wang Y, Cheng M, Zhang B, Nie F, Jiang H. Suplemen diet jus blueberry meningkatkan ekspresi hepatik metallothionein dan melemahkan fibrosis hati pada tikus. PLoS One. 2013;8, e58659.