Biomarker Koyak Berpotensi Untuk Diagnosis Penyakit Parkinson—Kajian Rintis Ⅰ

Abstrak: Penyakit Parkinson (PD) adalah penyakit neurodegeneratif kedua paling biasa selepas penyakit Alzheimer. Dalam kajian ini, profil proteom koyakan pesakit dengan PD idiopatik (iPD, n=24), pembawa mutasi E46K-SNCA (n=3), dan kawalan sihat (CT, n {{4 }}) subjek dianalisis untuk mengenal pasti biomarker calon untuk diagnosis PD. Kajian rintis pemerhatian, prospektif dan kawalan kes telah dijalankan, meneroka sampel koyakan peserta dengan spektrometri jisim kromatografi nano-cecair (nLC-MS/MS) dan menilai kemerosotan neurologi mereka. Data proteomik yang diperolehi tersedia di ProteomeXchange dengan pengecam 10.6019/PXD028811.

Klik untuk mencabut Amway untuk penyakit Parkinson

Analisis ini membawa kepada pengenalpastian 560 protein air mata, beberapa daripadanya telah dinyahkawal selia dalam pesakit PD dan yang telah terlibat dalam tindak balas imun, keradangan, apoptosis, degradasi kolagen, sintesis protein, pertahanan, pengangkutan lipid, dan fungsi lisosom yang diubah. Daripada protein ini, enam berkaitan dengan proses neurodegeneratif dan menunjukkan kapasiti yang sangat baik untuk mengklasifikasikan pesakit dan kawalan. Penemuan ini mendedahkan bahawa protein tertentu telah dikawal selia dalam air mata pesakit PD, terutamanya protein yang terlibat dalam fungsi lisosom. Oleh itu, dalam kajian ini, protein pemedih mata telah dikenal pasti sebagai terlibat dalam neurodegenerasi yang mungkin berkaitan dengan fenotip penyakit yang agresif dalam pesakit PD.

Kata kunci: biomarker; Penyakit Parkinson; filem pemedih mata; lisosom

1. Pengenalan

Penyakit Parkinson (PD) adalah penyakit neurodegeneratif kedua paling biasa selepas penyakit Alzheimer (AD), dan ia dicirikan oleh pergerakan perlahan (bradykinesia), peningkatan nada otot (ketegaran), gegaran (gegaran), dan kawalan postur terjejas. Dalam PD yang disahkan secara patologi, terdapat jumlah berubah-ubah dan pemendapan alpha-synuclein ( -syn) yang tersalah lipat dalam bentuk badan Lewy (LBs) dan neurit Lewy dalam sistem saraf pusat (CNS). Kebolehubahan dalam pengumpulan struktur ini mungkin mencerminkan heterogeniti klinikal dalam penyakit ini [1-3]. Malah, beberapa gangguan klinikal terletak pada spektrum penyakit badan Lewy (LBD), termasuk pesakit dengan idiopatik (IPD) dan PD genetik dan pesakit yang mengalami demensia dengan LB. Salah satu cabaran utama dalam menangani penyakit neurodegeneratif adalah untuk mencari penanda klinikal yang membolehkan klasifikasi awal pesakit dan membantu memantau perkembangan penyakit.

Faktor-faktor seperti tekanan oksidatif, proteolisis, dan asid lemak yang diubah atau kepekatan fosfolipid telah dikaitkan dengan perubahan struktur kepada -syn, dan pengubahsuaian selepas translasi juga boleh mengubah saiz, struktur, atau beban protein -syn [4]. Penyahkawalseliaan mutasi dan pendaraban dalam gen -syn (SNCA) menyebabkan bentuk keluarga dominan autosomal PD [5]. Mungkin mutasi paling patogenik yang diketahui menyebabkan PD ialah mutasi E46K dalam -syn (E46K-SNCA), yang mendasari sekumpulan LBD genetik yang agresif dengan ciri klinikal dan patologi yang mengingatkan demensia dengan LB [6,7]. Walaupun mutasi dalam -syn jarang berlaku, ia memberikan peluang unik untuk mengenal pasti pesakit dengan PD dan untuk lebih memahami perkembangan patologi ini.

Adalah diketahui bahawa pesakit PD mengalami halusinasi, perubahan dalam pergerakan mata dan kelopak mata, dan mengubah komposisi air mata dalam jumlah yang berkurangan [8,9]. Sebagai tambahan kepada kerosakan permukaan mata, pesakit ini boleh mengalami perubahan dalam penginapan, ketajaman penglihatan yang berkurangan, pembentukan skotoma (kawasan di mana bidang penglihatan mereka berkurangan sebahagiannya atau merosot sepenuhnya), dan penipisan lapisan retina, terutamanya disebabkan oleh pengurangan. dalam bilangan gentian saraf [10,11]. Kekurangan dalam neurotransmisi dan metabolisme monoamine juga mempengaruhi perubahan patologi pada sistem visual pesakit PD [12].

Perubahan ini agak tipikal kerana monoamin terlibat dalam penghantaran maklumat visual dalam retina [13]. Selain itu, pesakit PD mungkin mengalami perubahan pada pemuliharaan bahagian anterior mata yang akhirnya boleh mengubah komposisi air mata. Banyak neurotransmiter dan bahan trofik dirembeskan dalam air mata, berasal dari humor akueus atau saraf yang mengalir melalui kornea [14].

Walau bagaimanapun, mekanisme selular dan molekul yang mendasari persatuan ini masih belum dijelaskan sepenuhnya. Memandangkan PD menjejaskan beberapa sistem bukan motor dan saraf periferal, rembesan lakrimal boleh diubah pada pesakit ini, dan komposisi protein air mata mungkin menunjukkan profil ciri pada pesakit ini yang boleh berfungsi sebagai biomarker diagnostik. Dalam pengertian ini, menganalisis protein air mata pesakit dengan E46K-SNCA dan iPD boleh membantu mengenal pasti biomarker calon yang berguna untuk diagnosis dan perkembangan PD.

Oleh itu, kajian ini bertujuan untuk menganalisis profil proteom air mata dalam pesakit iPD dan pembawa mutasi E46K-SNCA untuk mencari biomarker yang boleh membantu dalam diagnosis masa depan PD, menggunakan sampel bukan invasif.

2. Bahan-bahan dan cara-cara

2.1. Kohort Kajian

Kami mereka bentuk kajian rintis kawalan kes pemerhatian, prospektif, di mana 24 pesakit dengan iPD, 3 pembawa mutasi E46K-SNCA dan 27 subjek sihat (CT) telah didaftarkan. Penyelidikan ini dijalankan oleh kakitangan yang berkelayakan dari segi perubatan selepas mendapat kelulusan daripada Jawatankuasa Etika OSI Ezkerralde-Enkaterri-Cruces CEIC E18/47. Kajian ini dijalankan mengikut ketat dengan prinsip Deklarasi Helsinki mengenai Penyelidikan Bioperubatan yang Melibatkan Subjek Manusia. Sebelum pengambilan sampel, persetujuan termaklum yang ditandatangani diperoleh daripada semua subjek selepas menjelaskan sifat dan kemungkinan akibat kajian. Pesakit telah diambil di Unit Perkhidmatan Neurologi dan Oftalmologi Hospital Universiti Cruces (Barakaldo, Bizkaia, Sepanyol) semasa perundingan pesakit luar, berdasarkan kriteria kemasukan dan pengecualian yang dipersetujui. Pesakit dengan IPD memenuhi kriteria Parkinson UK Brain Bank untuk diagnosis PD dan tidak membawa sebarang mutasi yang diketahui.

Kriteria kemasukan untuk CT adalah berumur lebih dari 40 tahun, sama ada jantina, dan tanpa sejarah klinikal sebarang gangguan neurologi. Individu yang mempunyai (atau mempunyai sejarah) sebarang gangguan/keadaan sistemik atau okular telah dimasukkan ke dalam kajian. Kriteria pengecualian terdiri daripada pembedahan mata dalam tiga bulan sebelumnya, ubat mata kronik (cth, untuk glaukoma), sejarah alahan, menggunakan sebarang ubat topikal (selain daripada air mata buatan) atau ubat oral yang mengandungi kortikosteroid, atopi, dan pesakit dengan Sjögren. sindrom.

Pengguna kanta sentuh juga dikecualikan untuk mengelakkan sebarang kemungkinan gangguan terhadap tafsiran keputusan. Ujian okular awal dan pengumpulan sampel dilakukan pada hari yang sama, manakala pesakit dengan PD juga dilihat pada hari yang berasingan oleh ahli pasukan penyelidik yang pakar dalam gangguan pergerakan untuk menilai Skala Parkinson.

2.2. Pemeriksaan Oftalmologi

Peperiksaan oftalmologi klinikal termasuk ujian Schirmer I (SCH), yang menentukan sama ada mata menghasilkan air mata yang mencukupi untuk memastikan ia lembap. Ujian ini membenarkan air yang koyak mengalir sepanjang jalur ujian kertas, dan nilai normal adalah Lebih besar daripada atau sama dengan 10 mm pembasahan kertas selepas 5 minit. Ketidakstabilan filem air mata dinilai dengan menggunakan masa pecah air mata (TBUT) dengan fluorescein. TBUT ialah masa yang diambil untuk tompok kering pertama muncul pada kornea selepas berkelip. Nilai kurang daripada 10 saat biasanya menggambarkan ketidakstabilan filem pemedih mata. Sebarang penyakit sistemik atau sebarang keadaan/penggunaan ubat lain yang boleh mengganggu tafsiran keputusan dianggap sebagai kriteria untuk dikecualikan.

2.3. Pemeriksaan Neurologi

Pakar neurologi dalam bidang gangguan pergerakan merekodkan umur pesakit PD pada pengumpulan air mata, tempoh penyakit mereka, dan skor mereka pada Skala Penilaian Penyakit Parkinson Bersepadu (UPDRS) dan skala Hoehn Yahr. Ujian ini berfungsi sebagai kriteria stratifikasi untuk mengesan perkembangan penyakit. Kerahsiaan data pesakit telah dipastikan melalui penggunaan Basque Biobank.

2.4. Koleksi Sampel Koyak

Semua sampel koyak dikumpul dengan menggunakan tiub mikrokapilari kaca 10 µL yang ditentukur (BLAUBRAND intraMark, Wertheim, Jerman). Sampel koyakan diperolehi daripada meniskus koyakan temporal inferior, meminimumkan kerengsaan permukaan okular atau margin tudung, dan tanpa pemasangan anestesia. Sampel air mata dikumpulkan dari kedua-dua mata setiap peserta dan segera diletakkan dalam tiub Eppendorf yang telah disejukkan terlebih dahulu. Selepas pengumpulan koyak, sampel disimpan pada −80 ◦C sehingga analisisnya.

2.5. Analisis Proteomik

Analisis proteomik telah dijalankan di Perkhidmatan Proteomik bioGUNE CIC (Derio, Bizkaia, Sepanyol), menggunakan protokol Penyediaan Sampel Berbantukan Penapis (FASP) [15] untuk pemprosesan sampel dan pencernaan. Trypsin (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) telah ditambahkan pada tripsin: nisbah protein 1:50 dan campuran itu diinkubasi semalaman pada suhu 37 ◦C, dikeringkan dalam RVC{{4} } Penumpu Speedvac (Christ, Vienna, Austria). Peptida yang diperoleh telah dinyahgaram dan digantung semula dalam 0.1 peratus Asid Formik (FA) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Syarikat) menggunakan petua peringkat C18 (Millipore, St. Louis, MO, Amerika Syarikat).

Sampel dianalisis dalam spektrometri mobiliti mobiliti terperangkap hibrid baru empat kali spektrometer jisim penerbangan (timsTOF Pro dengan PASEF, Bruker Daltonics, Bremen, Jerman), digabungkan dalam talian dengan kromatografi cecair nanoElute (Bruker, Coventry, UK). Spektrometer jisim ini mengambil kesempatan daripada mod imbasan novel yang dinamakan pemecahan siri pengumpulan selari (PASEF), yang mendarabkan kelajuan penjujukan tanpa kehilangan kepekaan, dan ia telah terbukti memberikan kelajuan dan kepekaan analisis yang luar biasa untuk analisis proteomik [16].

Sampel (200 ng) dimuatkan terus pada lajur analitik Bruker nano elute 15 cm LIMA BELAS C18 (Bruker, Coventry, UK) dan diselesaikan pada 400 nL/min. Lajur dipanaskan hingga 50 ◦C dalam ketuhar. Pengenalpastian dan kuantifikasi protein telah dijalankan dengan menggunakan perisian PEAKS (Bioinformatics Solutions Inc., Waterloo, CA, USA) Carian telah dijalankan terhadap pangkalan data entri Uniprot/Swissprot manusia kanonik (tiada pengira isoform), dengan toleransi prekursor dan serpihan 20 ppm dan 0.05 Da.

Kuantifikasi protein bebas label berasaskan kawasan dilakukan dengan menggunakan modul PEAKS Q yang terdapat dalam perisian PEAKS. Hanya protein yang dikenal pasti dengan sekurang-kurangnya dua peptida pada False Discovery Rate (FDR) < 1 peratus dan terdapat dalam sekurang-kurangnya 70 peratus sampel daripada salah satu kumpulan eksperimen yang dianalisis telah dipertimbangkan untuk analisis lanjut. Data telah dimuatkan ke platform Perseus [17] dan diproses selanjutnya (transformasi log2, imputasi) sebelum penggunaan ujian-t Pelajar untuk analisis ekspresi protein pembezaan. Data proteomik diringkaskan dalam Fail Bahan Tambahan S1, dan data proteomik spektrometri jisim telah didepositkan ke Konsortium ProteomeXchange melalui repositori rakan kongsi PRIDE [18], dengan pengecam dataset PXD028811 dan 10.6019/PXD028811.

2.6. Analisis Statistik

Analisis statistik telah dijalankan dengan menggunakan pakej IBM SPSS Statistics for Windows, 23.0v (IBM-SPSS, Armonk, New York, NY, USA). Normaliti data berterusan dinilai dengan ujian Shapiro-Wilk. Nilai p yang dikira menentukan kebarangkalian bahawa perkaitan antara protein dalam set data dan laluan kanonik tertentu, rangkaian berfungsi atau pengawal selia huluan dijelaskan secara kebetulan sahaja, berdasarkan ujian tepat Fisher, dengan nilai p < {{5 }}.05 dianggap penting.

Regresi logistik univariat telah digunakan untuk mengenal pasti ciri-ciri signifikan secara statistik yang dikaitkan dengan diskriminasi PD-pesakit. Selepas pemilihan pembolehubah, regresi logistik multivariate digunakan untuk membina model diskriminasi PD dan untuk mengenal pasti pembolehubah klinikal dan proteomik yang berkaitan dengan pengenalpastian PD. Model logistik membenarkan hubungan antara pembolehubah bersandar diskret dan satu set pembolehubah bebas berterusan atau diskret untuk dianggarkan. Model tersebut membenarkan klasifikasi pesakit dengan atau tanpa PD, mengira kebarangkalian tergolong dalam setiap kumpulan. Nilai p bagi setiap kovariat menerangkan kepentingan statistik perkaitan antara tindak balas dan setiap istilah yang disertakan dalam model.

untuk maklumat lanjut: Ali.ma@wecistanche.com