Phenylethanol Glycosides Daripada Cistanche Tubulosa Menyekat Pengaktifan Sel Stellate Hepatik Dan Menyekat Pengaliran Laluan Isyarat dalam TGF-01/smad Sebagai Ejen Fibrosis Anti-Hepatik Berpotensi
Mar 05, 2022
Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com
Shu-Ping You, Long Ma, Jun Zhao, Shi-Lei Zhang dan Tao Liu
Abstrak: Cistanche tubulosaadalah ubat herba tradisional Cina yang digunakan secara meluas untuk mengawal imuniti danglikosida fenilethanoid(CPhGs) adalah antara komponen utama yang bertanggungjawab untuk aktiviti ini. Kajian terdahulu telah menunjukkan kesan pencegahan dan terapeutik CPhG pada fibrosis hepatik yang disebabkan oleh albumin serum lembu (BSA) dalam tikus. Matlamat kajian adalah untuk menilai kesan fibrosis anti-hepatik CPhG dan monomer.echinacosidedanacteosidedengan menghalang pengaktifan sel stellate hepatik (HSC), menyekat pengaliran laluan isyarat dalam mengubah faktor pertumbuhan-p1 (TGF-p1)/smad, dan menentukan ia adalah aktiviti hepatoprotektif in vitro. Proliferasi HSC jelas dihalang selepas rawatan dengan CPhGs (100,50 ^g/mL)/echinacoside (500,250,125 ^g/mL)/acteoside (6, 3 ^g/mL), dengan nilai IC50 119.125,520.345 dan 6. mL, masing-masing, dalam ujian MTT. Kepekatan CPhG yang berbeza/echinacoside/acteosidetidak menjejaskan ketoksikan selular pada HSC mengikut ukuran laktat dehidrogenase (LDH). Kepekatan CPhG yang berbeza/echinacoside/acteosidemeningkatkan tahap mRNA dan ekspresi protein smad7 dan menurunkan tahap mRNA smad2, smad3 dan ekspresi protein smad2, phospho-smad2 (p-smad2), smad3, phospho-smad3 (p-smad3) dalam HSC. Secara ringkasnya, keputusan ini menunjukkan bahawa CPhGs/echinacoside/acteosideboleh menyekat pengaliran laluan isyarat dalam TGF-p1/smad, dan menghalang pengaktifan HSC, menunjukkan bahawaC. tubulosaOleh itu, ia boleh menjadi ubat herba yang berpotensi untuk rawatan fibrosis hati.
Kata kunci: Cistanche tubulosa; phenylethanol glycosides daripadaCistanche(CPHG);echinacoside; acteoside; sel stellate hepatik (HSC); TGF-p1/smad
1. Pengenalan
menjadi proliferatif dan fibrogenik, seterusnya mengumpul ECM, dan akhirnya membezakan kepada sel-sel seperti myofibroblast fibrogenik. Mengubah faktor pertumbuhan-.1 (TGF-p 1) dianggap sebagai pengantara profibrogenik utama. Laluan isyarat yang berkaitan dengan TGF-&1 ialah mekanisme penting fibrosis hepatik, dan ia terutamanya termasuk isyarat yang bergantung kepada smad dan tidak bergantung kepada smad, dan laluan transduksi isyarat yang bergantung kepada smad dianggap sebagai saluran utama isyarat TGF-p1. . Oleh itu, sekatan laluan isyarat TGF-p1/smad boleh menyekat pengeluaran kolagen dan akhirnya mengurangkan makan fibrosis hepatik, yang telah menjadikan laluan ini sebagai sasaran penting dalam penyelidikan ubat anti-hepatik fibrosis dalam beberapa tahun kebelakangan ini.
Walaupun insiden fibrosis hepatik yang tinggi di seluruh dunia, tiada terapi anti-fibrogenik yang diterima umum tersedia [2-4]. Ubat-ubatan Herba Tradisional Cina (TCHMs) sangat menarik untuk rawatan gangguan hati kerana sesetengahnya boleh digunakan sebagai ubat terapeutik dalam pengurusan dan pencegahan fibrosis hati. Pada masa ini, banyak kajian tertumpu kepada ubat anti-fibrogenik yang berpotensi yang telah digunakan sebagai TCHM selama beribu-ribu tahun [5].
Tumbuhan parasit Cistanche tubulosa W (keluarga Orobanchaceae)fa, ditanam secara meluas di kawasan selatan Xinjiang di China [6]. Orang ramai menggunakannya untuk mencergaskan buah pinggang, menyuburkan darah, melegakan usus dan melambatkan penuaan tanpa kesan sampingan, dan disenaraikan secara rasmi dalam Pharmacopoeia Cina [7]. C. tubulosa mengandungi pelbagai komponen aktif, termasuk glikosida phenylethanoid (CPhGs), iridoid dan polisakarida. Di antara banyak komponen aktif dalam C. tubulous, CPhGs, yang membentangkan beberapa bioaktiviti (antioksidan, antikeletihan, rintangan radio, dll.) adalah komponen ciri utama Pai bagi tumbuhan ini. Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, dilaporkan bahawa CPhGis mempunyai kesan hepatoprotektif Hent yang berlebihan, dan boleh menghilangkan radikal pokok, melindungi membran hepatik, dan mempamerkan kesan immunoregulatory, perencatan apoptosis, perencatan ekspresi antigen permukaan hepatitis B (HBs Ag) dan hepatitis B aktiviti replikasi DNA antigen (HBeAg) dan virus hepatitis B (HBV), dsb. Tahap DNA HBV ialah indeks paling boleh dipercayai yang secara langsung mencerminkan aktiviti replikasi virus, yang merupakan faktor utama dalam menentukan sejarah semula jadi jangkitan HBV kronik, memantau kesan terapi antiviral oP, dan menilai prognosis jangkitan HBV akut dan kronik. Indeks pengesanan serologi HBV terutamanya termasuk HBsAg, HBeAg, dsb. [8—11]. Walau bagaimanapun, terdapat beberapa laporan literatur dalam kesan fibrosis anti-hepatik CPhGs. Kajian terdahulu telah menunjukkan kesan pencegahan dan terapeutik CPhG pada fibrosis hepatik yang disebabkan oleh albumin serum lembu (BSA) dalam tikus, tetapi aktiviti antifibrogenik CPhG dan monomer utamanya (echinacoside dan acteoside, Rajah 1) tidak pernah dinilai secara in vitro.
organik Cistanche tubulosa
2. Keputusan
2.1. Penentuan Kuantitatif CPhGs
CPhG masukC. tubulosamengandungi dua phenylethyl alcohol glycosides: echinacoside dan acteo side, dan kandungannya dalam CPhGs telah dikesan oleh analisis HPLC (Rajah 1) menjadi 42.71 peratus 土 0.42 peratus dan 14.27 peratus 土 0.18 peratus, masing-masing.
2.2. Aktiviti Perencatan CPhGs, Echinacoside dan Acteoside pada HSC-T6
CPhGs, echinacoside dan acteoside (62.5-500 卩g/mL) menghalang daya maju sel HSC dalam cara yang bergantung kepada kepekatan. CPhGs dan acteoside menunjukkan aktiviti perencatan yang luar biasa pada sel HSC, dengan 50 peratus perencatan aktiviti pertumbuhan sel (IC50) nilai masing-masing ialah 119.125 昭/mL dan 6.999 昭/mL. Echinacoside memaparkan aktiviti perencatan sederhana (IC50,520.345 昭/mL; Jadual 1 dan Rajah 2).
2.3. Ketoksikan Sel CPhGs, Echin acoside dan Acteorida pada HSC
Laktat dehidrogenase (LDH), enzim sitoplasma stabil yang terdapat dalam semua sel, dipajak semula dengan pantas ke dalam supernatan kultur sel apabila kerosakan membran plasma. Aktiviti enzim dalam supernatan kultur berkorelasi dengan perkadaran sel terselit [12]. Seperti yang ditunjukkan dalam Jadual 2, apabila dirawat dengan berbeza: kepekatan C PhGs, echinacoside dan acteoside, walaupun aktiviti LDH menunjukkan sedikit peningkatan berbanding kumpulan coirtrol sel, perbezaannya tidak ketara secara statistik (p > 0.05 ), menunjukkan bahawa kebanyakan membran sel mengekalkan integritinya, dan perencatan CPhGs, echinacoside dan acteoside pada HSC bukan disebabkan oleh ketoksikan selular yang tidak spesifik.
2.4. Kesan CPhGs, Echinacoside dan Acteosde pada Percambahan HSC yang Disebabkan oleh TGF-^i
Percambahan, pengaktifan dan pembezaan HSC dikawal oleh pelbagai faktor. Antara pelbagai faktor yang terlibat dalam fibrosis hati, TGF{{0}} dianggap paling penting, kerana ia boleh mengaktifkan HSC, menggalakkan pembezaan myofibroblast, meningkatkan sintesis ECM, dan menghalang degradasi ECM, dan membebaskan kemokin dan sitokin yang terlibat dalam fibrosis hati [13]. Dalam kajian ini, kecuali bagi kumpulan kawalan, HSC pegun telah dirangsang dengan TGF-P1 in vitro untuk mensimulasikan pembentukan fibrosis hati awal, dan untuk menyiasat kesan CPhGs, echinacoside dan acteoside pada TGF-p1- percambahan HSC yang disebabkan. Seperti yang ditunjukkan Jadual 3, berbanding dengan kumpulan kawalan, kumpulan TGF-61 menggalakkan percambahan HSC dengan ketara (p < 0.01).="" berbanding="" dengan="" kumpulan="" tgf-p1,="" tgf-p1="" ditambah="" cphgs="" (tc)="" (50,100="" 卩g/ml,="" p="">< 0.05),="" tgf{{18}="" }="" ditambah="" echinacoside="" (te)="" (125,="" 250,="" 500="" 卩g/ml,="" p="">< 0.05),="" tgf-p1="" ditambah="" acteoside="" (ta)="" (3.0,="" 6.0="" 卩g/ml,="" p="">< 0.05)="" semuanya="" sangat="" menghalang="" percambahan="" hsc="" diinduksi="" oleh="" tgf-|3="" 1="" kepada="" darjah="" yang="">
2.5. Ungkapan mRNA smad2)smad3 dan smad7 selepas campur tangan CPhG, ochmacoside dan acteaside pada HSC
Smad3 dan smad2 ialah pengesan hiliran utama bagi laluan isyarat TTGF-p [14,15], dan smad7 ialah perencat isyarat smad. Secara teorinya, peningkatan ekspresi smad7 atau penurunan ekspresi smad2/smad3 boleh menghalang pengaliran laluan isyarat dalam TGF-p 1/ smad. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3, analisis PCR kuantitalima masa nyata menunjukkan bahawa ekspresi mRNA smad2 dan smad3 menunjukkan tahap yang lebih rendah, manakala smad7 menunjukkan tahap yang lebih tinggi dalam kumpulan kawalan, berbanding dengan kumpulan TGF-|31. Dalam kumpulan TC (25, 50, 75,100 |dg/mL), tahap mRNA smad2 (p < 0.{{37="" }}5)="" dan="" smad3="" (p=""><0.01) telah="" menurun="" dengan="" ketara="" berbanding,="" dengan="" kumpulan="" tgf-pf="" ,="" malah="" serupa="" dengan="" kumpulan="" kawalan;="" sementara="" itu,="" tahap="" mrna="" smad7="" telah="" meningkat="" dengan="" ketara="" dalam="" kumpulan="" tc="" (50,="" 75,100="" 卩g/ml)="" (p=""><0.05, p=""><0.05, p=""><0.01, masing-masing).="" walau="" bagaimanapun;="" ungkapan="" smad7="" menunjukkan="" aliran="" menaik="" dalam="" kumpulan="" tc="" 25="" 卩g/ml="" berbanding="" dengan="" kumpulan="" tgf-p1="" (rajah="">
Sebaliknya, jika dibandingkan dengan kumpulan TGF-p1, ekspresi mRNA smad2 dan smad3 telah menurun dengan ketara dalam TE (62.5, 125, 250, 500 卩g /mL) (p < 0.01),="" dan="" ekspresi="" mrna="" smad7="" telah="" meningkat="" dengan="" ketara="" dalam="" kumpulan="" te="" (125,="" 250,500="" 昭/ml)="" (p="">< 0.01)="" (rajah="" 4)="" .="" begitu="" juga,="" kumpulan="" ta="" (0.75,1.5,="" 3.0,="" 6.0="" ^g/ml)="" juga="" menunjukkan="" trend="" yang="" sama="" (rajah="">
2.6. Pengaruh CPhG, Echinacoside dan Ac)eosid pada Laluan Isyarat T GF-^i/smad di HSC
Laluan isyarat TGF-p 1/smad bergantung kepada smad2, smad3, phospho-smad2 (p-smad2), phospho-smad3 (p-smad3) dan smad7, di mana p-smad2, p-smad3 ialah bentuk smad2 dan smad3 yang diaktifkan smad3. Dalam kajian ini, tahap protein omad2, smad3, p-smad2, p-smsd3 dan smad7 telah dianalisis. Analisis Western blot mengesan peningkatan dalam tahap smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 oleh TGF-p1, dan perencatan peningkatan ini oleh CPhGs, ec hinacoside dan acteoside; Sementara itu, analisis wesiern blot mendedahkan tahap smad7 terkawal oleh CPhGs, echinacoside dan acteoside. (Rajah 6—8).
Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 6, berbanding dengan kumpulan c on2rol (ekspresi protein smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 meningkat dengan ketara, dan ekspresi protein smad7 telah menurun dalam kumpulan TGF-p1. Dalam TC (25 , 50, 75, 100 昭/mL) kumpulan ubat, smad/ (Rajah 6A), p-smad2 (Rajah 6B), smad 3 (Rajah 6C), p -smad3 (Rajah 6D) adalah jauh lebih rendah daripada dalam kumpulan TGF-p1 (卩 < 0.01), dan ekspresi protein smad7 (Rajah 6E) adalah lebih tinggi daripada kumpulan TGF- S1 (p <0.01) (Rajah 6).
Pada masa yang sama, ungkapan ot smad 2, smad3, p-smad2, p-smad3 dan smad7 protein diukur selepas campur tangan echinacoside dan acteoside pada HSC. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 7 dan 8 tahap ekspresi protein smad2, smad3, p-smad2 dan p-smad3 telah dihalang dengan ketara (p < 0.05="" atau="" p="">< 0.01="" ),="" tahap="" ekspresi="" protein="" smad7="" telah="" dinaikkan="" (p=""><0.01), berbanding="" dengan="" kumpulan="" tgf-="" p="" 1="" (rajah="" 7="" dan="">
3. Perbincangan
Fibrosis hati adalah salah satu punca utama morbiditi dan kematian di seluruh dunia, tetapi pilihan terapeutik yang sangat terhad pada masa ini tersedia untuk keadaan ini, oleh itu, adalah sangat penting bagi kita untuk mencari sasaran yang berpotensi untuk campur tangan terapeutik untuk mencegah perkembangan )fibrosis hati [ 16]. Baru-baru ini, penyelidik telah mendapati bahawa pelbagai ubat herba mempunyai hepatoprotektif kesan anti-fibrotik. Banyak TCHM seperti pil Fufang Biejia Ruangan [17] dan rebusan Xiao-chai-hu (shosaiko hingga di Jepun) [18,19] telah digunakan secara meluas untuk merawat fibrosis hepatik di China, Korea, dan Jepun selama beribu-ribu tahun. C. tubulosa mengandungi pelbagai komponen aktif termasuk CPhG, iridoid, dan polisakarida. Sebagai salah satu asas bahan mujarab C. tubulosa, CPhGs mempunyai aktiviti hepatoprotektif yang sangat baik, tetapi terdapat maklumat terhad tentang kesan anti-fibrotik GPhCs dan sebatian berkaitannya. Dalam kajian ini, kami menyiasat bagaimana CPhGs, echinacoside dan acteoside menindas pengaktifan HSC dan menyekat isyarat dalam TGF-p1/snaad sebagai agen fibrosis anti-hep atik yang berpotensi secara in vitro.
Kecederaan hati mana-mana etiologi akhirnya akan membawa kepada pengaktifan HSC, yang menjalani transdifferentiation kepada sel seperti myofibroblast fibrogenik [20]. Maksudnya ialah myofibroblast
diperoleh daripada pengaktifan dan percambahan HSCss [21], dan ia dianggap sebagai pengantara pembentukan fibrosis hepatik. Atas sebab ini, kami melakukan kajian in vitro untuk membandingkan kadar daya maju sel HSC yang terdedah kepada CPhG, echinacoside dan acteoside. Keputusan menunjukkan bahawa kesan perencatan acteoside pada HSC adalah yang paling kuat, dan kesan CPhGs adalah lebih baik daripada echinacoside. Sera berubat CPhG, echinacoside dan acteoside semuanya menghalang percambahan HSC dalam cara yang bergantung kepada dos.
LDH ialah enzim sitoplasma dalam sel hidup, dan ia tidak boleh menembusi membran sel dalam keadaan biasa. Apabila sel rosak, kebolehtelapan membran meningkat dan LDH dilepaskan ke bahagian luar sel. Biasanya, LDH boleh mengesan tahap kerosakan sel [{{0}}]. Siasatan menunjukkan bahawa aktiviti LDH CPhGs, echinacoside dan acteoside medicated serum hanya menunjukkan sedikit peningkatan berbanding dengan kumpulan kawalan sel, dan perbezaannya tidak signifikan secara statistik (p> 0.05), menunjukkan bahawa kebanyakan membran sel mengekalkan integritinya. , dan perencatan HSC oleh CPhGs, echinacoside dan acteoside bukan disebabkan oleh ketoksikan selular yang tidak spesifik.
Apabila kecederaan hati berlaku, hepatosit yang diaktifkan boleh melepaskan TGF-pi yang seterusnya mengaktifkan HSC-T6, oleh itu, TGF-pi mempunyai hubungan rapat dengan fibrosis [25-27]. Dalam kajian ini, CPhGs, echinacoside dan acteoside boleh dianggap sebagai strategi terapeutik yang menarik untuk menghalang percambahan HSC selepas HSC dirangsang dengan wTGF-pi in vitro. Kami membuat spekulasi bahawa CPhGs, echinacoside dan acteoside boleh digunakan sebagai sejenis rawatan dan/atau pencegahan fibrosis hati, dan menghalang pembentukan fibrosis hati awal. Pembentukan fibrosis hepatik adalah proses kompleks penglibatan multifaktor dan multisel. Dalam proses patologi ini, interaksi sel-sel, sel-sitokin dan sel-matriks membentuk rangkaian yang rumit. Dalam rangkaian ini, perkembangan fibrosis hepatik boleh dikawal oleh laluan dan cara isyarat yang berbeza. TGF-pi adalah pengaktif klasik HSC dan pengantara utama dalam patogenesis fibrosis hati [28]. CPhGs, echinacoside dan acteoside boleh menghalang ekspresi mRNA dan protein yang berkaitan dengan laluan TGF-pi / smad dalam HSC.
TGF-pi memberikan kesan selularnya melalui laluan isyarat smad, dan ia telah dianggap sebagai pengantara utama dalam perkembangan fibrosis dan keradangan hati. Apabila mengikat TGF-pi kepada reseptor TGF-p-jenis II, kinase reseptor jenis II memfosforilasi domain GS dari reseptor jenis TGF-p I, yang membawa kepada pengaktifan reseptor jenis I [29]. Melalui tindakan p-smad2 dan p-smad3 pada dua residu serin dalam motif SSXS terminal C mereka, tindak balas hiliran laluan isyarat smad diaktifkan dengan pengaktifan reseptor jenis I [30]. P-smad2 dan p-smad3 membentuk kompleks oligomerik dengan smad4, kemudian memasuki nukleus dan melaksanakan aktiviti transkripsi biologi mereka. Oleh itu, protein smad menghantar isyarat terus dari kinase reseptor ke nukleus [3i]. Sebaliknya, smad7 digabungkan secara kukuh dengan reseptor TGF-pi, membawa kepada ketidakupayaan smad 2/3 untuk diaktifkan serta perencatan laluan transduksi isyarat [32]. Smad7 boleh bertindak untuk menghalang p-smad2 dan p-smad3, translokasi nuklear kompleks smad diaktifkan, dan pengaktifan (CAGA) (9)-MLP-Luc, mengakibatkan penurunan ekspresi kolagen I dan perencatan lengkap transduksi isyarat TGF-p [33,34]. Keputusan kami menunjukkan bahawa CPhGs, echinacoside dan acteoside boleh mengurangkan ekspresi mRNA smad2 dan smad3, dan meningkatkan ekspresi mRNA smad7; menghalang ekspresi protein smad2, p-smad2, smad3 dan p-smad3, dan mengawal selia ekspresi protein smad7, menunjukkan bahawa CPhGs, echinacoside dan acteoside juga memainkan peranan dalam menghalang pengaktifan HSC dan dengan itu menghalang fibrosis hepatik, menonjolkan potensi anti-fibrotik mekanisme.
Urutan kesan hepatoprotektif ketiga-tiga agen ujian ditunjukkan sebagai acteoside > CPhGs > echinacoside. Untuk menjelaskan lebih lanjut sebab-sebab perbezaan dalam mekanisme yang mana CPhGs, echinacoside dan acteoside melindungi daripada fibrosis hati, struktur kimia mereka dianalisis. Bahagian phenethyl alcohol glycoside nampaknya merupakan struktur penting untuk kesan hepatoprotektif [35]. Acteoside (C29H36Oi5) ialah glikosida berganda, dan echinacoside (C35H46O20) ialah triglycoside, iaitu, echinacoside mempunyai glikosida tambahan dalam strukturnya berbanding acteoside, yang membawa kepada peningkatan dalam saiz ruangnya. Hepatoprotective atau perencatan aktiviti HSC acteoside adalah lebih baik daripada echinacoside, yang mungkin disebabkan oleh kewujudan halangan sterik.
melindungi hati: ekstrak cistanche
4. Bahagian Eksperimen
4.1. Bahan Kimia dan Reagen
TGF-pi telah dibeli daripada Peprotech (Rocky Hill, NJ, Amerika Syarikat). Talian sel HSC-T6 telah dibeli daripada Wuhan Procell Gene Bio-technology Co., Ltd. (Wuhan, China). Dimetil sulfoksida (DMSO) telah dibeli daripada Sigma Inc. (St. Louis, MO, Amerika Syarikat). Primer Smad2, smad3 dan smad7 dihasilkan oleh Syarikat Biologi dan Teknologi Shanghai Sangon (Shanghai, China). Kit sintesis cDNA untaian pertama Revert Aid telah dibeli daripada Thermo Scientific (Shanghai, China). Kit PCR hijau SYBR Quantifast telah dibeli daripada QIAGEN GmbH (Hilden, Jerman). antibodi p-smad2 (ser465/467), Smad3 (C67H9) arnab mAb dan p-smad3 (ser423/425) arnab mAb telah dibeli daripada Teknologi Isyarat Sel (Boston, MA, Amerika Syarikat). Antibodi Smad7 dibeli dari Boster (Wuhan, China). Antibodi poliklonal Smad2 dan antibodi monoklonal p-actin telah dibeli daripada Proteintech (Wuhan, China). Pengesanan antibodi primer dilakukan menggunakan larutan Antibodi 2 darjah (Alk-Phos. Conjugated, Anti-arnab) dan larutan Antibodi 2 darjah (Alk-Phos. Conjugated, Anti-mouse) yang dibeli daripada Invitrogen™ (Carlsbad, CA, USA). Kit ujian laktat dehidrogenase adalah dari Institut Bioengineering Nanjing Jiancheng (Nanjing, China).
4.2. Bahan Tumbuhan
C. tubulosa telah dikumpulkan dari Tulufan, di wilayah autonomi Uirghur Xinjiang di China, pada M ay 2006. Bahan tumbuhan telah dikenal pasti sebagai C. tubulosa oleh Jiang He, Institut Materia Medica Xinjiang. Satu spesimen baucar telah disimpan di Institut Materia Medica Xinjiang di China.
4.3. Pengasingan dan Pemurnian CPhG dan Sebatiannya
Rizom C. tubulosa (6.0}) yang dikeringkan dan dihiris diekstrak berturut-turut tiga kali di bawah refluks dengan 7{11}} peratus etanol (4.8 L), dan pelarut kemudiannya dialihkan daripada ekstrak gabungan ke untuk menghasilkan ekstrak etanol (1.146 kg). Ekstrak etanol telah ditulenkan oleh resin AB-8 untuk mendapatkan ekstrak fenil etanol glyc os ides (CPhG s) mentah. Selepas d terlarut dalam air, tindakan tambahan telah ditulenkan oleh kromatografi resin makroporous penyerapan iklan AB-8 untuk mendapatkan jumlah sisi fenil etanol gliko daripada C. tubulosa (CPhGs, 210 g). CPhG telah digunakan pada lajur ODS OP{{10}} dan dielusi berturut-turut dengan campuran MeOH—H?.(0:1 -^1:0). Elua tes telah digabungkan menjadi lima sub pecahan mengikut kelakuan TLC menggunakan sistem pelarut CHCh-MeOH-H?.(6:4:0.5). Tompok telah divisualisasikan selepas semburan dengan 1 peratus FeCih .Pelbagai pecahan telah dimurnikan berulang kali oleh kromatografi lajur Sephadex LH-20 dengan metanol sebagai eluen, dan dua glikosida fenil etanol telah diasingkan daripada CPhGs. Strukturnya telah disahkan sebagai echinacoside (C35H46O20) dan acteoside (C29H36O15) menggunakan MS, 1H-, dan MC-NMR [35], yang mana ketulenannya ditentukan masing-masing 99.17 peratus dan 98.92 peratus, oleh UV-HPLC. Struktur echinacoside dan acteoside ditunjukkan dalam Rajah 9.
4.5. Penentuan Kuantitatif CphGs
Kromatografi cecair (HPLC) (LC{{0}}Instrumen HPLC, Shimadzu Co., Kyoto, Jepun) telah digunakan untuk menganalisis kandungan echina coside dan cteoside dalam CPhGs. Lajur Phenomenex Gemini ODS (250 x 4.6 mm, 5 |^m) telah digunakan pada 30 darjah . Fasa mudah alih isokratik yang terdiri daripada metanol-acetonitrile-1 peratus asid asetik (15:10:75, v/v/v) telah digunakan untuk larian selama 40 minit, pada kadar aliran 0.6 mL/min, dengan UV pengesanan pada 334 nm.
4.6. Kultur sel
Sel HSC telah dikultur dalam medium Eagle yang diubah suai Dulbecco (Glukosa Tinggi) (DMEM, Beijing, China) ditambah dengan 10 peratus serum lembu janin (FBS, Gibco, Carlsbad, CA, Amerika Syarikat), 10 0 IU/mL penicillin dan 100 ^g/mL streptomycin (HyClone, Logan, UT, USA) dalam inkubator lembap pada 37 darjah dengan 5 peratus CO2. Sel-sel ini disubkultur secara berkala oleh larutan trypsin 0.25 peratus (1x) (HyClone, Logan, UT, USA) dan medium ditukar setiap 2 hari. Pada mulanya, sel telah dibiakkan dengan DMEM yang mengandungi 10 peratus FBS selama 48 jam. Medium itu kemudiannya digantikan dengan DMEM tanpa FBS untuk menghilangkan sel-sel selama 12 jam. Sel-sel ini telah dibiakkan selama 48 jam dan Selepas 48 jam, serum telah kebuluran dengan 0.5 peratus FBS selama 12 jam sebelum menambah 5 ng/mL TGF-&1,
4.7. Penentuan Nilai IC50
Selepas pengeraman semalaman dalam medium kelaparan yang mengandungi {{0}}.5 peratus FBS, sel HSC telah disemai dalam 96-plat perigi pada ketumpatan 5 x 104 sel/mL selama 24 jam. Sel HSC telah dirawat dengan CPhGs, echinacoside dan acteoside pada kepekatan yang berbeza (0, 3.90625, 7.8125, 15.625,31.25, 62.5, 125, 250, dan 500 ^ g/mL) selama 48 jam. Setiap kepekatan mempunyai empat telaga. Pada akhir rawatan, 20 卩L MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium bromida] (Sigma; 5 mg/mL) telah ditambah dan sel-sel tersebut diinkubasi selama 4 jam lagi. DMSO (200 rL) telah ditambah kepada setiap telaga selepas mengeluarkan supernatan. Selepas menggoncang plat selama 10 minit pada penggoncang, nilai IC50 diperoleh dengan mengukur penyerapan pada panjang gelombang 490 nm menggunakan instrumen pelabelan enzim (Benchmark PLUS, Hercules, CA, USA), ujian ini dilakukan tiga kali ganda. Nilai IC50 CPhGs, echinacoside dan acteoside masing-masing ialah 119.125, 520.345 dan 6.999 Rg/mL.
4.8. Kesan Perencatan Proliferatif Sel dan Daya Tahan Sel
Sel HSC telah terdedah kepada kepekatan CPhG yang berbeza (25,50,100 Rg/mL), echinacoside (125,250,500 Rg/mL) dan acteoside (1.5,3, 6 Rg/mL). Kepekatan CPhGs, echinacoside dan acteoside yang berbeza telah digunakan pada plat dalam empat telaga berturut-turut dan diinkubasi selama 48 jam. Kesan perencatan percambahan sel dan tahap daya maju sel (berdasarkan pengukuran aktiviti LDH yang dikeluarkan daripada sel yang rosak ke dalam supernatan [36]) ditentukan oleh ujian MTT. Kadar perencatan dikira menggunakan formula berikut [37]:
Kadar perencatan ( peratus ) " [1 — (purata penyerapan kumpulan eksperimen/purata penyerapan kumpulan kawalan kosong)] x 100 peratus
Mengikut arahan kit,
LDH (U/L) {{0}} (OD terukur — OD kawalan)/(OD standard — blankOD) x 0.2 mmol/L x 1000
Kajian awal kami menunjukkan bahawa CPhGs, echinacoside dan acteoside tidak menjejaskan daya maju sel.
4.9. Aktiviti Anti-Proliferatif oleh TGF-^1
HSC yang diaktifkan oleh TGF-p1 telah lama dianggap dikaitkan dengan fibrosis hati, dan perencatan untuk pertumbuhan HSC telah dicadangkan sebagai kaedah untuk merawat fibrosis hati [36,38]. Kesan anti-proliferatif CPhG, echinacoside dan acteoside pada HSC yang diaktifkan oleh TGF-p1 ditentukan oleh ujian MTT [39]. Menggunakan prosedur dan kepekatan ubat seperti yang diterangkan,
kumpulan eksperimen termasuk kumpulan kawalan, kumpulan TGF-pi, TGF-pi ditambah kumpulan ubat kepekatan yang berbeza. Semua kumpulan sel kecuali kumpulan kawalan telah dikultur dengan DMEM yang mengandungi 5.0 ng/mL TGF-p1 (tanpa FBS) selama 24 jam. Aktiviti perencatan pada percambahan sel dikira sebagai 100 x (penyerapan sebatian yang dirawat — penyerapan cahaya latar belakang)/(penyerapan model — penyerapan cahaya latar belakang).
4.10. Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
Tahap ekspresi mRNA smad2, smad3 dan smad7 ditentukan oleh PCR masa nyata. Untuk menentukan ekspresi mRNA dalam sel HSC, sel (5 x 104 sel) telah disemai dalam plat enam perigi dengan 3.0 mL DMEM dengan 10 peratus FBS dan diinkubasi semalaman pada 37 darjah dan 5 peratus CO2. Selepas media kultur ditukar kepada DMEM bebas serum, CPhGs (100,50,25 卩g/mL), echinacoside (500,250,125 昭/mL) dan acteoside (6, 3,1.5 ^g/mL) telah ditambah ke dalam telaga. Selepas pengeraman selama 48 jam dengan komposisi CPhG dan monomer, jumlah RNA diekstrak menggunakan reagen TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, Amerika Syarikat) dan digerakkan dengan kuat dengan kloroform selama 15 saat. Selepas dibiarkan pada suhu bilik selama 3 minit, lisat diempar pada 12,000 xg selama 15 minit pada 4 darjah . RNA dalam fasa akueus dimendakkan dengan isopropanol, dan fasa akueus atas dipindahkan ke tiub mikrosentrifuge baru. RNA dimendakkan dengan menambah 0.75 peratus etanol, selepas itu tiub mikrosentrifuge dan diempar pada 12,000 xg pada 4 darjah selama tidak lebih daripada 5 minit. Supernatan dikeluarkan dan RNA dikeringkan pada suhu bilik selama 5-10 min. Primer (Sangon) direka bentuk menggunakan Primer Batch 3, dan disenaraikan dalam Jadual 4. Keputusan telah dinormalisasi kepada mRNA gen pengemasan p-actin sebagai kawalan dalaman dan dibentangkan sebagai tahap mRNA relatif. Tindak balas dilakukan dengan 8 |^L iQ SYBR Green Supermix, 1 10 pasangan primer pM, 8.5 air suling dan 2.5 rL cDNA.
Setiap tindak balas rantai polimerase dilakukan di bawah keadaan berikut: 95 darjah selama 3 minit, kemudian 40 kitaran 10 saat pada 95 darjah, 30 saat pada 55 darjah dan 10 saat pada 55 darjah -95 darjah untuk lanjutan, diikuti dengan pengukuran pendarfluor tunggal. Keputusan akhir diterangkan dengan nilai relatif (2_AACt). Pengiraan dan analisis dilakukan oleh Sistem Pengesanan PCR Masa Nyata iQ5.
4.11. Analisis Western Blot
Ekstrak sel keseluruhan disediakan menggunakan penimbal Radioimmunoprecipitation Assay (RIPA) (Thermo Fisher Scientific, Inc.) dengan 1 peratus perencat protease Halt dan 1 peratus koktel perencat Halt fosfatase (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Jumlah protein digunakan untuk pengesanan smad2, p-smad2, smad3, p-smad3 dan smad7. Kepekatan protein diukur dan dikira dengan kaedah Bradford. Protein (10-30 Rg) diasingkan pada 10 peratus gel SDS-PAGE dan dipindahkan ke membran polyvinylidene fluoride (PVDF) (Millipore, Boston, MA, USA). Membran disekat selama 1j pada suhu bilik dengan 5 peratus albumin serum lembu, dan antibodi utama (antibodi poliklonal smad2, antibodi p-smad2, arnab smad3 mAb dan arnab p-smad3 mAb, pencairan 1:1000; arnab mAb smad7, 1 :200 pencairan, antibodi monoklonal p-aktin, 1:5000 pencairan) telah diinkubasi pada 4 darjah semalaman. Alk-Phos yang sepadan. antibodi sekunder terkonjugasi diinkubasi pada suhu bilik. Akhirnya, membran telah dibasuh tiga kali dengan 1 x Tris-HCl saline dengan 0.1 peratus Tween 20, dan isyarat telah diimbas dan divisualisasikan oleh Sistem Pengimejan GEL DOC XR (Bio-Rad, Hercules, CA, Amerika Syarikat). Analisis densitometrik dilakukan pada protein yang diminati dan dinormalisasikan kepada p-actin oleh perisian GEL DOC Image Studio (Bio-Rad). p-actin digunakan sebagai kawalan dalaman.
4.12. Analisis statistik
Data dinyatakan sebagai min 土 sisihan piawai (SD). Analisis statistik telah dilakukan menggunakan perisian SPSS 16.0 (Universiti Perubatan Xinjiang). Analisis probit digunakan untuk menganalisis nilai IC50. Kepentingan perbezaan dikira dengan ujian ANOVA sehala, dan nilai dengan p <0.05 dianggap="" signifikan="" secara="">
5. Kesimpulan
Kesimpulannya, CPhG daripada C. tubulosa dan komponennya echinacoside dan acteoside menunjukkan kesan anti-fibrotik yang ketara. Antaranya, aktiviti acteoside adalah yang paling kuat, manakala aktiviti CPhGs adalah antara kedua-dua sebatian. Perencatan pengaktifan isyarat TGF-p1/Smad mungkin merupakan mekanisme asas yang melindungi CPhG daripada penyakit hati kronik yang dikaitkan dengan fibrosis, dan echinacoside dan acteoside ialah asas bahan anti-fibrotik yang berkesan bagi C. tubulosa.
Penghargaan:Penyelidikan ini disokong oleh National Natural Science Foundation of China (81260624). Penulis ingin mengucapkan terima kasih yang tidak terhingga kepada Profesor Tao Liu atas penambahbaikan penulisan dalam kertas kerja ini.
Sumbangan Pengarang:TL, JZ, S.-PY, LM dan S.-LZ menyusun dan mereka bentuk eksperimen. S.-PY, TL dan JZ menganalisis data. S.-PY dan JZ menulis manuskrip. TL, LM dan JZ menyemak manuskrip. Semua pengarang membaca dan meluluskan manuskrip akhir.
Konflik Kepentingan:Penulis mengisytiharkan tiada konflik kepentingan.
Rujukan
1. Subramoniam, A.; Pushpangadan, P. Pembangunan phytomedicine untuk penyakit hati. Ind. J. Pharmacol. 1999, 31,166-175.
2. Friedman, SL Mekanisme penyakit: Mekanisme fibrosis hepatik dan implikasi terapeutik. Nat. Clin. Berlatih. Gastroenterol Hepatol. 2004,1, 98-105. [CrossRef] [PubMed]
3. Friedman, SL; Roll, FJ; Boyles, J.; Bissell, DM Hepatic lipocytes: Sel penghasil kolagen utama hati tikus normal. Proc. Natl. Acad. Sci. Amerika Syarikat 1985, 82, 8681-8685. [CrossRef] [PubMed]
4. Friedman, SL; Bansal, MB Pembalikan fibrosis hepatik一Fakta atau fantasi? H叩atology 2006, 43, S82-S88. [CrossRef] [PubMed]
5. Ahmad, A.; Ahmad, R. Memahami mekanisme fibrosis hepatik dan pendekatan terapeutik yang berpotensi. Saudi J. Gastroenterol. 2012,18,155-167. [CrossRef] [PubMed]
6. Peter, H.; Raven; Zhang, LB Orobanchaceae Ventenat. Dalam Flora of China, ed. ke-23; Jawatankuasa Editorial Flora China: Akademi Sains China, Beijing, China, 2013; ms 1-16.
7. Suruhanjaya Farmakope China Kementerian Kebersihan Republik Rakyat China. Farmakope Cina; Bahagian 1; Rumah Penerbitan Industri Kimia: Beijing, China, 2010; hlm. 126.
8. Li, J.; Huang, D.; He, L. Kesan roucongrong (Herba Cistanches Deserticolae) pada ketoksikan pembiakan pada tikus yang disebabkan oleh glikosida Leigongteng (Radix et Rhizoma Tripterygii). J. Tradit. Dagu. Med. 2014, 34, 324-332. [CrossRef]
9. Xing, Y.; Liao, J.; Tang, Y.; Zhang, P.; Tan, C.; NIH.; Wu, X.; Li, N.; Jia, X. ACE dan perencat pengagregatan platelet daripada Tamarix hohenackeri Bunge (tumbuhan hos Herba Cistanches) yang tumbuh di Xinjiang. Farmakog. Mag. 2014,10,111-118. [PubMed]
10. Jia, Y; Guan, Q.; Jiang, Y.; Salh, B.; Guo, Y.; Tu, P.; Du, C. Ameliorasi kolitis akibat natrium dextran sulfate pada tikus oleh ekstrak Cistanche tubulosa yang diperkaya echinacoside. Phytother. Res. 2014, 28, 110-119. [CrossRef] [PubMed]
11. Wong, HS; Ko, KM Herba Cistanches merangsang kitaran redoks glutathione selular oleh spesies oksigen reaktif yang dihasilkan daripada respirasi mitokondria dalam kardiomiosit H9c2. Pharm. biol. 2013, 51, 64-73. [CrossRef] [PubMed]
12. Martin, A.; Clynes, M. Acid phosphatase: Titik akhir untuk ujian ketoksikan in vitro. Sel Vitro. Dev. biol. 1991, 27, 183-184. [CrossRef]
13. Lechuga, CG; Hernandez-Nazara, ZH; Dominguez Rosales, JA; Morris, ER; Rincon, AR; Rivas-Estilla, AM; Esteban-Gamboa, A.; Rojkind, M. TGF-01 memodulasi ekspresi metalloproteinase-13 matriks dalam sel stellate hepatik dengan mekanisme kompleks yang melibatkan p38MAPK, PI3-kinase, AKT dan p70S6k. Am. J. Physiol. Fisiol Hati Uji Gastrointest. 2004, 287, G974-G987. [CrossRef] [PubMed]
14. Nguyen, J.; Tang, SY; Nguyen, D.; Alliston, T. Beban mengawal pembentukan tulang dan ekspresi Sclerostin melalui mekanisme yang bergantung kepada TGFp. PLoS ONE 2013, 8, e53813. [CrossRef] [PubMed]
15. Pessah, M.; Marais, J.; Prunier, C.; Ferrand, N.; Lallemand, F.; Mauviel, A.; Atfi, A. C-Jun mengaitkan dengan oncoprotein Ski dan menyekat aktiviti transkripsi Smad2. J. Biol. Kimia. 2002, 277, 29094-29100. [CrossRef] [PubMed]
16. Ding, N.; Yu, RT; Subramaniam, N.; Sherman, MH; Wilson, C.; Rao, R.; Leblanc, M.; Coulter, S.; Beliau, M.; Scott, C.; et al. Reseptor Vitamin D/litar genomik SMAD mengawal tindak balas fibrotik hepatik. Sel 2013,153, 601-613. [CrossRef] [PubMed]
17. Yang, FR; Fang, BW; Lou, JS Kesan Pil Fufang Biejia Ruangan pada fibrosis hepatik dalam vivo dan in vitro. Dunia J. Gastroenterol. 2013,19, 5326-5333. [CrossRef] [PubMed]
18. Sakaida, I.; Hironaka, K.; Kimura, T.; Terai, S.; Yamasaki, T.; Okita, K. Perubatan herba Sho-saiko-to (TJ-9) meningkatkan ekspresi matriks metalloproteinase (MMP) dengan pengurangan ekspresi perencat tisu metalloproteinase (TIMP) dalam sel stellate tikus. Life Sci. 2004, 74, 2251-2263. [CrossRef] [PubMed]
19. Chen, M.; Chen, J.; Tsai, C.; Wang, W.; Chang, D.; Tu, DG; Hsieh, HY Peranan TGF-01 dan sitokin dalam modulasi fibrosis hati oleh Sho-saiko-to dalam model berikat saluran hempedu tikus. J. Ethnopharmacol. 2005, 97, 7-13. [CrossRef] [PubMed]
20. Bolarin, DM; Azinge, penanda biokimia EC, komponen ekstraselular dalam fibrosis hati dan sirosis. Nig. QJ Hosp. Med. 2007,17, 42-52. [CrossRef] [PubMed]
21. Kong, D.; Zheng, S.; Lu, Y. Sumber dan peranan myofibroblast dalam fibrosis hati. Dagu. Pharmacol. lembu jantan. 2011, 27, 297-300.
22. De Lavor, MSL; Binda, NS; Fukushima, FB; Caldeira, FMC; Da Silva, JF; Silva, CMO; de Oliveira, KM; Martins Bde, C.; Torres, BB; Rosado, IR; et al. Model iskemia-reperfusi dalam saraf tunjang tikus: Daya maju sel dan kajian isyarat apoptosis. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2015, 8, 9941-9949. [PubMed]
23. Bahadar, H.; Maqbool, F.; Niaz, K.; Abdollahi, M. Ketoksikan zarah nano dan gambaran keseluruhan model eksperimen semasa. Iran Biomed. J. 2016, 20, 1-11. [PubMed]