Bahagian Ⅰ:Cistanche Tubulosa Phenylethanoid Glycosides Menginduksi Apoptosis Sel Karsinoma Hepatoselular Oleh Laluan Bergantung Mitokondria Dan MAPK Serta Meningkatkan Kesan Antitumor Melalui Gabungan Dengan Cisplatin

Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com

Pengfei Yuan, Changshuang Fu, Yi Yang, Aipire Adila, Fangfang Zhou, Xianxian Wei, Weilan Zhang, Jie Lv, Yijie Li, Lijie Xia, Jinyao Li

Abstrak

Cistanche tubulosaadalah sejenis ubat herba Cina dan mempunyai pelbagai fungsi biologi. Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawaCistanche tubulosa phenylethanoid glycosides (CTPG)mempamerkan kesan antitumor pada pelbagai sel tumor. Walau bagaimanapun, kesan antitumor CTPG pada HepG2 dan BEL{1}} sel karsinoma hepatoselular (HCC) masih sukar difahami. Kajian kami menunjukkan bahawa CTPG menghalang pertumbuhan sel HepG2 dan BEL-7404 dengan ketara melalui induksi penangkapan kitaran sel dan apoptosis, yang dikaitkan dengan pengaktifan laluan MAPK yang dicirikan oleh fosforilasi terkawal p38, JNK, dan ERK1/2 dan laluan bergantung kepada mitokondria yang dicirikan oleh pengurangan potensi membran mitokondria. Pembebasan cytochrome c dan belahan caspase-3, -7, -9 dan PARP kemudiannya ditingkatkan dengan rawatan CTPG. Selain itu, CTPG telah menyekat penghijrahan HepG2 dengan ketara dengan mengurangkan tahap matriks metalloproteinase-2 dan faktor pertumbuhan endothelial vaskular. Menariknya, CTPG bukan sahaja meningkatkan percambahan splenosit tetapi juga mengurangkan apoptosis splenosit yang disebabkan oleh cisplatin. Dalam model tikus tumor H22, CTPG digabungkan dengan cisplatin seterusnya menghalang pertumbuhan sel H22 dan mengurangkan kesan sampingan cisplatin. Diambil bersama, CTPG menghalang pertumbuhan HCC melalui kesan antitumor langsung dan kesan imunoenhancement tidak langsung dan meningkatkan keberkesanan antitumor cisplatin.

Kata kunci

Cistanche tubulosaglikosida phenylethanoid, apoptosis, laluan MAPK, laluan yang bergantung kepada mitokondria, cisplatin, peningkatan imun.

pengenalan

Kanser hati diramalkan menjadi kanser keenam paling lazim didiagnosis dan punca keempat kematian akibat kanser di seluruh dunia pada 2018, dengan kira-kira 841 000 kes baharu dan 782000 kematian setiap tahun di Asia Tenggara (Mongolia, Kemboja dan Vietnam) .1 Di China, kanser hati merupakan punca ketiga kematian berkaitan kanser pada tahun 2015.2 Lebih daripada 90 peratus daripada kanser hati primer adalah karsinoma hepatoselular (HCC) di seluruh dunia. Pada masa ini, hepatektomi, pemindahan hati, dan ablasi perkutaneus adalah kaedah utama untuk rawatan HCC. Malangnya, rawatan ini berkesan untuk 30 peratus pesakit yang didiagnosis dengan kanser hati awal, manakala pesakit yang didiagnosis dengan kanser hati lanjutan (sebanyak 40 peratus ) perlu bergantung pada rawatan paliatif untuk memanjangkan masa hidup mereka.3,4 Sorafenib dalam kombinasi dengan hepatik chemoembolism arteri ialah terapi paliatif yang penting dan biasa bagi kebanyakan pesakit dengan HCC lanjutan di rantau Asia-Pasifik.5 Sorafenib, diluluskan oleh FDA pada tahun 2006 untuk rawatan kanser hati lanjutan, ialah perencat pelbagai kinase yang menghalang percambahan sel tumor dan vaskular. pengeluaran dan menggalakkan apoptosis sel tumor. Sorafenib memanjangkan masa hidup pesakit dengan ketara selama 3 hingga 5 bulan tetapi mempunyai kesan sampingan yang serius dan berkait rapat dengan kejadian rintangan dadah.6 Oleh itu, adalah penting untuk membangunkan ubat atau strategi baru untuk HCC.

Perubatan tradisional Cina (TCM) sahaja atau digabungkan dengan strategi lain telah digunakan untuk merawat HCC dan telah menunjukkan faedah klinikal termasuk masa kemandirian yang dilanjutkan, kualiti hidup yang lebih baik, mengurangkan tindak balas buruk, dan sebagainya.7,8Cistancheialah TCM yang mengandungi phenylethanoid glycosides (PhGs), iridoid, lignin, dan polisakarida yang mempunyai pelbagai fungsi biologi, seperti anti-pengoksidaan, anti-radang, anti-penuaan, peningkatan ingatan, dan fungsi peningkatan imun.9 PhG telah dianggap sebagai komponen aktif utamaCistanche, dan mempunyai pelbagai fungsi termasuk anti-pengoksidaan, anti-keradangan, anti-apoptosis, hepatoprotection dan neuroprotection.10-12 Kumpulan kami telah melaporkan bahawaGlikosida fenilethanoid cistanche tubulosa(CTPG) boleh menghalang pertumbuhan sel melanoma B16-F10, sel Eca-109 esofagus dan sel HCC H22 melalui laluan isyarat ekstrinsik atau intrinsik secara in vitro atau in vivo; selain itu, CTPG mempunyai kesan imunostimulasi.13-15

Dalam kajian ini, kami menyiasat kesan antitumor dan mekanisme CTPG pada sel HepG2 dan BEL-7404 in vitro, menganalisis fungsi imunomodulator CTPG in vitro dan in vivo, dan seterusnya menilai kesan terapeutik CTPG yang digabungkan dengan kemoterapi. ubat cisplatin pada tikus tumor HCC H22 dalam vivo. Kami mendapati bahawa CTPG boleh menghalang pertumbuhan sel HepG2 dan BEL-7404 melalui apoptosis yang bergantung kepada mitokondria dan laluan isyarat MAPK. CTPG menghalang penghijrahan sel HepG2 dengan ketara dengan mengurangkan tahap metalloproteinase matriks-2 (MMP-2) ​​dan faktor pertumbuhan endothelial vaskular (VEGF). Di samping itu, CTPG menggalakkan percambahan dan pengaktifan sel imun dan meningkatkan imuniti tikus. Yang penting, CTPG digabungkan dengan cisplatin boleh menghalang pertumbuhan sel H22 dalam vivo dan mengurangkan kesan sampingan cisplatin.

Bahan dan Kaedah

Haiwan

Kira-kira 6 hingga 8 minggu BALB/c jantan, tikus Kunming dan tikus C57BL/6 betina telah dibeli dari Pusat Makmal Haiwan, Universiti Perubatan Xinjiang (Urumqi, Xinjiang, China) dan ditempatkan di kemudahan haiwan Universiti Xinjiang dengan suhu bilik (RT) 25±3 darjah , dan tempoh gelap terang-terang 12/12 jam.

Garisan Sel dan Kultur Sel

Sel murine H22 telah dibeli daripada Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, China) dan sel HCC HepG2 dan BEL-7404 manusia diperoleh daripada Makmal Utama Sumber Biologi dan Kejuruteraan Genetik Xinjiang. , Universiti Xinjiang (Urumqi, Xinjiang, China) dan dikultur dalam medium RPMI 1640 (Gibco, USA) atau medium Eagle's modified Eagle (DMEM) (Gibco) Dulbecco yang mengandungi 10 peratus serum lembu janin yang tidak diaktifkan haba (MRC, China), 1 peratus L -glutamin (100mM), 100U/mL penisilin, dan 100ug/mL streptomycin pada 37 darjah dalam suasana lembap sebanyak 5 peratus CO2.

Kromatografi Cecair Berprestasi Tinggi (HPLC)

Sebatian utama CTPG (Upbio Tech Co., Ltd., Shanghai, China) telah layak dan dikira oleh HPLC seperti yang dilaporkan sebelum ini.13 Lajur ZORBAX SB-C18 (250×4.6mm; 5μm) telah digunakan dan fasa bergerak terdiri daripada 0.2 peratus larutan asid format dan metanol dengan kecerunan daripada 23 peratus kepada 31 peratus . Sebanyak 10μL sampel disuntik dan dikesan pada 330 nm. Piawaian echinacoside dan acteoside (Yuanye, Shanghai, China) digunakan untuk menganalisis komponen CTPG.

Analisis Daya Tahan Sel

Kesan antitumor CTPG pada sel HepG2 dan BEL-7404 dinilai menggunakan MTT (3-(4, 5-dimetil-2-thiazolyl)-2, {{7 }}difenil-2-H-tetrazolium bromida). Sel HepG2 dan BEL-7404 disalut ke dalam 96-plat perigi (5 × 104 sel/perigi) dan dirawat dengan 0, 200, 400, dan 600 ug/mL CTPG selama 24 dan 48 jam, masing-masing, selepas 24 jam pengeraman pada 37 darjah . Kira-kira 35 ug/mL cisplatin (Yuanye) digunakan sebagai kawalan positif. Kemudian 100 μL MTT (0.5mg/mL, dicairkan dengan medium tanpa medium FBS) ditambah ke dalam setiap telaga dan dikultur selama 3 jam pada 37 darjah dan 5 peratus CO2. Selepas pengeraman, plat telah disentrifugasi pada 1200 rpm selama 7 minit, medium dikeluarkan dan 200 ug/mL DMSO ditambah pada setiap telaga untuk melarutkan hablur formazan yang terbentuk. Nilai OD490 diukur oleh 96-pembaca plat mikro telaga (Bio-Rad Laboratories, CA, USA). Untuk menilai kesan CTPG pada splenosit, sel telah diasingkan daripada tikus C57BL/6 dan disalut ke dalam 96-plat perigi pada ketumpatan 1 × 105 sel/telaga. Splenocytes dirawat dengan 0, 200, 400, dan 600 ug / mL selama 24, 48, dan 72 jam, masing-masing. Daya maju sel dikira sebagai formula berikut: Daya maju sel ( peratus )=(ODtreated/ODutreated) × 100 peratus .

Pengesanan Ki-67

Pengesanan Ki{{0}} telah dilakukan mengikut kajian terdahulu kami.16 Ringkasnya, sel BEL-7404 dirawat dengan kepekatan yang berbeza (0, 200, 400 dan 600ug/mL) CTPG atau cisplatin (35ug/mL). Selepas 24 jam, sel dituai dan dicuci dengan PBS, kemudian dibetulkan dan telap dengan Set Penampan Pewarnaan Foxp3 (eBioscience, USA) mengikut arahan pengilang. Pewarnaan intraselular dilakukan menggunakan antibodi Ki-67 terkonjugasi FITC (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) selama 15 minit di RT. Sampel dianalisis oleh sitometri aliran (BD FACSCalibur, CA, Amerika Syarikat).

Analisis Apoptosis Sel dan Kitaran Sel

Sel HepG2 dan BEL-7404 telah disemai pada ketumpatan 2.5×105 sel/hidangan dan diinkubasi pada 37 darjah semalaman. Sel telah ditrypsin dan dituai melalui sentrifugasi selepas rawatan dengan pelbagai kepekatan CTPG atau prarawat dengan caspase inhibitor (Z-VAD-FMK) atau caspase-3 inhibitor tor (Ac-DEVD-CHO) (Beyotime, China) selama 2 jam sebelum rawatan CTPG. Selepas 24 jam, apoptosis dikesan oleh sitometri aliran. Secara ringkas, sel yang dikumpul telah dibasuh dengan PBS (Gibco) sejuk dan digantung semula dalam penimbal pengikat annexin dengan 2.5μL Annexin V-FITC dan 5μL PI-PE Staining Solution (Solarbio, Beijing, China), dan kemudian sel diinkubasi di RT dalam gelap selama 15 minit. Untuk analisis taburan kitaran sel, sel telah dituai selepas rawatan CTPG dan difiksasi dalam etanol 70 peratus sejuk pada 4 darjah selama 30 minit. Sel telah diwarnai dengan PI (BD Biosciences) dalam gelap selama 30 minit. Sampel dianalisis dengan aliran cytom eter (BD FACSCalibur). Tahap ekspresi apoptosis sel dan protein berkaitan kitaran telah dikesan oleh Western blot.

Penghapusan Barat

Western blot telah dilakukan mengikut kajian terdahulu kami.17 HCC telah dirawat dengan CTPG selama 24 jam. Selepas mencuci dengan PBS sejuk ais dua kali, semua sel yang melekat dan terapung dikumpulkan dan dilisekan dalam RIPA Lysis Buffer (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) selama 20minit di atas ais. Selepas sentrifugasi pada 12000 rpm 4 darjah selama 10 minit, kepekatan protein ditentukan menggunakan Kit Ujian Asid Bicinchoninic (Thermo Fisher Scientific, USA) mengikut arahan pengilang. Kepekatan protein yang sama dipisahkan oleh 12 peratus SDS-PAGE dan dipindahkan ke membran PVDF. Selepas mencuci dengan penimbal PBST (PBS dengan 0.05 peratus Tween-20), membran telah disekat dengan 5 peratus susu tanpa lemak pada 37 darjah selama 1 jam dan kemudian diinkubasi dengan antibodi utama (Cell Signaling Technology, MA, USA ) pada pencairan yang betul semalaman pada 4 darjah . Selepas mencuci 3 kali dengan PBST, membran diinkubasi dengan antibodi sekunder konjugasi HRP yang sepadan (eBioscience) selama 2 jam pada 37 darjah . Protein sasaran dikesan menggunakan kit ujian ECL (Beyotime). Data imbasan skala kelabu diperolehi oleh Image J.

Analisis Potensi Membran Mitokondria (Δψm)

Δψm ditentukan oleh pewarna JC-1 telap membran (Beyotime). Secara ringkasnya, sel HepG2 dan BEL-7404 telah dirawat dengan kepekatan CTPG yang berbeza (0, 200, 400 dan 600ug/mL) selama 24 jam. Semua sel telah dikumpulkan dan dibasuh dengan penimbal pencuci JC-1. Sel telah diwarnai dengan probe pendarfluor JC{10}} mengikut arahan pengilang selama 20 minit di RT. Selepas mencuci dengan PBS dua kali, semua sampel dianalisis oleh sitometri aliran (BD FACSCalibur).

Hoechst 33342 Pewarnaan

Pewarnaan Hoechst 33342 telah dilakukan mengikut kajian kami sebelum ini.16 Perubahan morfologi nukleus telah diperiksa menggunakan pewarna pengikat DNA telap membran Hoechst 33342 (Beyotime). Secara ringkasnya, sel telah diinokulasi dalam 6-plat perigi pada kepekatan 1×105 sel/telaga dalam medium 2mL. Apabila mencapai 70 peratus hingga 80 peratus pertemuan, sel telah dirawat dengan 200, 400, dan 600ug/mL CTPG atau cisplatin selama 24 jam. Sel-sel telah dibasuh dengan PBS dan diperbaiki dengan 4 peratus paraformaldehid ais sejuk pada 4 darjah selama 10 minit. Selepas mencuci dengan PBS, sel telah diwarnai dengan Hoechst 33342 pada 4 darjah selama 10 minit. Sampel diperhatikan oleh mikroskop terbalik pendarfluor (Nikon Eclipse Ti-E, Jepun).

Ujian Migrasi

Penghijrahan sel HCC dikesan melalui ujian penyembuhan luka. Secara ringkasnya, sel HepG2 (2×104 /telaga) telah disemai dalam plat telaga 24-. Selepas mencapai 8{16}} peratus pertemuan, bahagian tengah setiap telaga dicalar sekali dengan hujung pipet 20μL. Selepas mencuci dengan PBS, sel telah dirawat dengan cisplatin (35ug/mL) atau kepekatan berbeza (0, 200, 400, dan 600ug/mL) CTPG pada 37 darjah . Selepas 24 jam, imej setiap sampel diambil di bawah mikroskop (Nikon Eclipse Ti-E). Jarak purata penghijrahan sel telah dianalisis oleh Imej J. Peratusan penyembuhan luka dikira dengan persamaan: penyembuhan luka ( peratus )=(1−kawasan calar pada titik masa/kawasan calar yang ditunjukkan pada 0jam)×100 peratus . Tahap ekspresi protein berkaitan migrasi sel MMP-2 dan VEGF telah dikesan oleh Western blot.

Percambahan dan Apoptosis Splenosit

Untuk analisis percambahan, splenosit telah diasingkan daripada 3 tikus C57BL/6 dan diwarnai dengan CFSE (eBioscience). Sel berlabel CFSE telah diinokulasi ke dalam 24-plat perigi pada ketumpatan 2 × 106 sel dalam 1 mL medium setiap telaga dan dirawat dengan kepekatan CTPG yang berbeza (200, 400 dan 600 ug/mL) atau digabungkan dengan 35 ug /mL cisplatin selama 72 jam. Analisis sitometri aliran dilakukan selepas pewarnaan dengan CD3-APC dan CD19-PE (BD Biosciences). Untuk analisis apoptosis, splenosit telah diinokulasi ke dalam 24-plat perigi pada ketumpatan 2 × 106 sel dalam 1 mL medium setiap telaga dan dirawat dengan kepekatan CTPG yang berbeza (200, 400, dan 600 ug/mL) atau digabungkan dengan cisplatin selama 24 jam. Analisis sitometri aliran dilakukan selepas pewarnaan dengan 2.5 μL Annexin V-FITC dan 5 μL PI-PE Solution.

Penilaian Keselamatan dan Aktiviti Imunostimulasi CTPG Dalam Vivo

Untuk menilai aktiviti imunostimulasi in vivo CTPG, 6 hingga 8 minggu tikus Kunming jantan secara rawak dibahagikan kepada 7 kumpulan (5 tikus / kumpulan). Suntikan subkutaneus (sc, 200, 400 mg/kg), suntikan intraperitoneal (ip, 200, 400 mg/kg), dan pentadbiran intragastrik (ig, 200, 400 mg/kg) digunakan setiap 2 hari sebanyak 7 kali. , manakala kumpulan kawalan tidak menerima sebarang rawatan. Tikus telah ditimbang setiap hari dan status tikus diperhatikan setiap hari. Selepas rawatan CTPG, organ tikus dipisahkan dan ditimbang. Indeks organ dikira mengikut formula: indeks organ=berat organ (mg)/berat badan (g). Splenosit telah dikumpulkan, dikira dan diwarnai dengan anti-CD3-APC, anti-CD19-PE, anti-CD49b FITC atau anti-CD4-APC, anti-CD{{ 22}}PE, anti-CD8-FITC (BD Biosciences). Sampel dikesan oleh sitometri aliran (BD FACSCalibur).

Keberkesanan Antitumor CTPG Digabungkan dengan Cisplatin dalam Tikus Pembawa Tumor H22

Kira-kira 6 hingga 8 minggu tikus lelaki BALB/c telah disuntik secara subkutan dengan sel H22 (1.0 × 106 setiap tetikus dalam 100 μL PBS). Apabila jumlah tumor mencapai kira-kira 60mm3, tikus yang membawa tumor dibahagikan secara rawak kepada 4 kumpulan (6 tikus/kumpulan) dan dirawat dengan cisplatin (4mg/kg), CTPG (400mg/kg), cisplatin (4mg/kg) ditambah CTPG ( 400mg/kg), atau tanpa rawatan (kumpulan kawalan), masing-masing. Tikus tumor disuntik secara intraperitoneal dengan CTPG pada hari ke-5, ke-7, ke-9, ke-11, dan ke-13, masing-masing. Cisplatin disuntik secara intravena pada hari ke-7 dan ke-11. Jumlah tumor dan berat badan diukur setiap hari. Isipadu tumor dikira seperti berikut: Isipadu tumor (V)=a × b2 /2, di mana a dan b mewakili diameter terpanjang dan terpendek tumor yang diukur dengan angkup vernier, masing-masing. Pada hari ke-20, organ dan tumor telah diasingkan dan ditimbang. Splenosit telah dikumpulkan, dikira dan diwarnai dengan anti-CD3-APC dan anti-CD19-PE atau anti-CD4-FITC dan anti-CD8-APC atau anti-CD11b-PE dan anti-Gr-1-APC atau anti-CD4-FITC, anti-CD25-APC dan anti-Foxp3-PE (BD Biosciences) . Selepas itu, frekuensi dan bilangan sel dianalisis oleh sitometri aliran (BD FACSCalibur).

Analisis statistik

Semua data dinyatakan sebagai min±ralat piawai min (SEM). Analisis statistik telah dijalankan menggunakan analisis varians satu/ dua hala (ANOVA) menggunakan perisian Prism5.0. P<.05 was="" considered="" statistically="">

Keputusan

CTPG Menghalang Pembiakan Sel HCC Secara In Vitro

Komponen CTPG telah layak dan dikira oleh HPLC menggunakan piawaian echinacoside dan acteoside (Tambahan Rajah 1A), yang merupakan komponen utama glikosida phenylethanoid daripada Cistanche. 18 Mengikut masa pengekalan puncak dan kawasan puncak, CTPG mengandungi 28 peratus echinacoside dan 9.9 peratus acteoside. Selain itu, kandungan polisakarida dalam CTPG ialah 34.8 peratus dengan kaedah asid fenol-sulfurik.19 Ujian MTT menunjukkan bahawa CTPG mengurangkan daya maju sel BEL-7404 dan HepG2 dengan ketara dalam dos dan cara yang bergantung kepada masa ( Rajah 1A). Secara konsisten, pembiakan sel BEL-7404 telah dihalang dengan ketara oleh rawatan CTPG, yang dianalisis dengan pewarnaan Ki-67 (Rajah 1B). Kesan CTPG pada percambahan splenosit secara in vitro juga dianalisis oleh ujian MTT. Kami memerhatikan bahawa CTPG meningkatkan percambahan splenosit dalam cara yang bergantung kepada dos (Rajah 1C).

Laluan isyarat protein kinase diaktifkan mitogen (MAPK) memainkan peranan penting dalam kemandirian, pembezaan dan rintangan dadah sel-sel kanser manusia.20 Untuk menyiasat sama ada laluan isyarat MAPK terlibat dalam kesan perencatan CTPG terhadap percambahan daripada sel HCC, tahap fosforilasi pelbagai protein daripada laluan isyarat MAPK dianalisis dalam sel HepG2 selepas rawatan dengan CTPG pada kepekatan yang berbeza dan titik masa yang berbeza. Fosforilasi JNK (P-JNK) dan p38 (P-p38) adalah bergantung kepada dos yang dipertingkatkan oleh rawatan CTPG. Fosforilasi ERK (P-ERK) dikawal turun oleh rawatan CTPG 200 dan 400ug/mL, manakala P-ERK dikawal selia di bawah rawatan CTPG 600ug/mL (Rajah 1D). Selain itu, tahap P-JNK, P-p38, dan P-ERK dikawal selia dengan cara yang bergantung pada masa (Rajah 1D). Keputusan ini mencadangkan bahawa CTPG mungkin menghalang percambahan sel HCC melalui laluan isyarat MAPK

Penangkapan Kitaran Sel HCC Teraruh CTPG pada Fasa S

Kami selanjutnya menganalisis sama ada CTPG menghalang percambahan sel HCC melalui induksi penangkapan kitaran sel. Selepas rawatan dengan CTPG, pengumpulan sel BEL-7404 pada fasa S diperhatikan dalam cara yang bergantung kepada dos. Begitu juga, CTPG juga mendorong penangkapan kitaran sel HepG2 pada fasa S dan frekuensi meningkat daripada 40.66 peratus dalam kumpulan kawalan kepada 61.90 peratus dalam kumpulan yang dirawat CTPG 600ug/mL (Rajah 2A). Cyclin dan cyclin-dependent kinase (CDKs) memainkan peranan penting dalam kawalan dan pembangunan pembahagian sel, 21 daripadanya dikaitkan dengan fasa G2/M.22 Tahap ekspresi Cyclin D1 adalah bergantung kepada dos dikurangkan oleh rawatan CTPG tetapi mempromosikan G1 kepada Perkembangan fasa S. Tahap ekspresi Cyclin B1, CDK1, dan CDK2 juga dikurangkan; protein ini dikaitkan dengan fasa G2/M (Rajah 2B). Keputusan ini mencadangkan bahawa CTPG menindas percambahan sel HCC dengan mendorong penangkapan kitaran sel.

Laluan Apoptosis Bergantung Mitokondria Diaktifkan CTPG dalam Sel HCC

Kami juga mengesan sama ada CTPG mencetuskan apoptosis dalam sel HCC dan mendapati bahawa CTPG mendorong apoptosis dalam sel HepG2 dan BEL-7404 dalam cara yang bergantung kepada dos (Rajah 3A). Di samping itu, tahap ekspresi Bax dan Bcl-2 masing-masing meningkat dan menurun dengan rawatan CTPG mengikut dos (Rajah 3B). Apoptosis sel HepG2 selanjutnya ditentukan oleh pewarnaan Hoechst 33342 selepas rawatan dengan CTPG selama 24 jam. Morfologi nuklear diperhatikan oleh mikroskop pendarfluor terbalik. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3C, sel kawalan HepG2 diwarnakan secara homogen manakala sel HepG2 yang dirawat dengan CTPG menunjukkan pemeluwapan dan pemecahan kromatin dalam cara yang bergantung kepada dos, yang serupa dengan sel HepG2 yang dirawat dengan cisplatin. Keputusan ini menunjukkan bahawa CTPG menyebabkan apoptosis sel HCC.

Keutuhan membran mitokondria luar dikawal ketat oleh keluarga Bcl-2 dan pengurangan Δψm menggalakkan pembebasan sitokrom c yang mengaktifkan lata caspase untuk mendorong apoptosis.23,24 Apabila Δψm berkurangan, JC{{ 3}} polimer (pendarfluor merah) terurai kepada monomer (pendarfluor hijau).25 Oleh itu, Δψm sel HCC telah dikesan oleh pewarnaan JC-1 selepas rawatan CTPG selama 24 jam. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4A, keamatan pendarfluor hijau bagi saluran FL-1 adalah bergantung kepada dos yang ditambah dengan rawatan CTPG manakala keamatan pendarfluor merah bagi saluran FL-2 dikurangkan bergantung kepada dos dalam kedua-dua sel BEL{12}} dan HepG2. Pemerhatian mikroskop pendarfluor terbalik menunjukkan hasil yang sama (Rajah 4B), menunjukkan bahawa CTPG mengurangkan Δψm sel HCC. Selepas itu, kami memerhatikan bahawa tahap cytochrome c telah meningkat dalam kedua-dua sel BEL-7404 dan HepG2 selepas rawatan CTPG (Rajah 4C), yang seterusnya mengesahkan pengurangan Δψm dalam sel HCC yang dirawat CTPG.

Pembebasan cytochrome c boleh mengaktifkan caspase pemula-9 untuk mendorong apoptosis.26 Keputusan ujian Western blot mencadangkan bahawa tahap caspase terbelah-3, -7 dan{{4} } telah ditingkatkan manakala tahap caspase terbelah-8 tidak diubah (Rajah 5). Caspase yang diaktifkan-3 boleh membelah enzim pembaikan DNA polimerase (ADP-ribose) polimerase (PARP) untuk mengelakkan pembaikan DNA dan mengumpul kerosakan DNA.27 Kami juga memerhatikan tahap terkawal PARP terbelah. Peranan lata caspase dalam apoptosis sel HCC yang disebabkan oleh CTPG ditentukan selanjutnya dengan menggunakan perencat caspase (Z-VAD-FMK) dan perencat caspase-3 (Ac-DEVD-CHO) masing-masing. Z-VAD-FMK membalikkan dengan ketara apoptosis sel BEL-7404 dan HepG2 yang disebabkan oleh CTPG (Rajah Tambahan 1B). Begitu juga, Ac-DEVD-CHO juga dengan ketara membalikkan apoptosis sel HepG2 yang disebabkan oleh CTPG (Tambahan Rajah 1C). Keputusan menunjukkan bahawa CTPG mendorong apoptosis sel HCC oleh laluan yang bergantung kepada mitokondria.

CTPG Menekan Penghijrahan Sel HCC Secara In Vitro

Penghijrahan sel kanser dianggap sebagai salah satu proses kritikal dalam metastasis tumor. Untuk menentukan sama ada CTPG menjejaskan penghijrahan sel HCC, motilitas sel HepG2 dinilai oleh ujian penyembuhan luka. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 6A dan B, penghijrahan sel HepG2 dengan ketara dihalang oleh rawatan CTPG dalam cara yang bergantung kepada dos. Keluarga MMP dan VEGF memainkan peranan penting dalam penghijrahan sel tumor.28 Selepas rawatan CTPG selama 24 jam, tahap MMP-2 dan VEGF telah menurun dengan ketara (Rajah 6C), menunjukkan bahawa CTPG mungkin menyekat pencerobohan dan metastasis daripada HCC.

CTPG Meningkatkan Kekebalan Tikus

Telah dilaporkan bahawa polisakarida Cistanche deserticola mempunyai fungsi imunomodulator termasuk menggalakkan percambahan limfosit dan mengaktifkan makrofaj.29 Sel T dan sel B ialah limfosit utama, yang masing-masing menjadi pengantara tindak balas imun selular dan humoral. CTPG mengandungi 34.8 peratus kandungan polisakarida. Oleh itu, kami mengkaji kesan CTPG pada percambahan sel T dan sel B. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah Tambahan 2A, CTPG dengan ketara meningkatkan percambahan sel T dan sel B dalam cara yang bergantung kepada dos, walaupun dengan kehadiran cisplatin. Menariknya, CTPG dengan ketara menghalang apoptosis splenosit yang disebabkan oleh cisplatin (Tambahan Rajah 2B), menunjukkan bahawa CTPG boleh memperbaiki kesan sampingan cisplatin pada sistem imun tikus.

Teruskan membaca, untuk bahagian Ⅱ...