Pentraxin-3-pengantaraan Pengaktifan Pelengkap dalam Model Babi Iskemia Buah Pinggang/Kecederaan Reperfusi
Mar 21, 2022
Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com
Chiara Divella et al
ABSTRAK
Pentraxin ialah keluarga molekul pengecaman corak yang dipelihara secara evolusi dengan peranan penting dalam imuniti dan keradangan semula jadi, seperti opsonisasi patogen semasa jangkitan bakteria dan virus. Khususnya, Pentraxin 3 (PTX3) yang panjang telah ditunjukkan untuk mengawal beberapa aspek keradangan vaskular dan tisu semasa pemindahan organ pepejal.
Kajian kami menyiasat peranan PTX3 sebagai modulator kemungkinan pengaktifan Pelengkap dalam model babi kecederaan iskemia / reperfusi (I / R) buah pinggang. Kami menunjukkan bahawa deposit awal PTX3 yang disebabkan oleh kecederaan I/R pada tahap kapilari peritubular dan glomerular. Mikroskopi pengimbasan laser confocal mendedahkan deposit PTX3 dengan penyetempatan bersama CD31 ditambah sel endothelial. Di samping itu, PTX3 dikaitkan dengan makrofaj yang menyusup (CD163), sel dendritik (SWC3a), dan myofibroblast (FSP1). Khususnya, kami menunjukkan pengaktifan PTX{10}}pengantara yang ketara bagi laluan Pelengkap klasik (pengantara C1q) dan lektin (pengantara MBL). Menariknya, deposit PTX3 disetempatkan bersama dengan pengaktifan kompleks Komplemen terminal (C5b-9) pada sel endothelial, menunjukkan bahawa pengaktifan komplemen pengantara PTX{17}}berlaku terutamanya pada peringkat vaskular buah pinggang. Kesimpulannya, data ini menunjukkan bahawa PTX3 mungkin menjadi sasaran terapeutik yang berpotensi untuk mencegah kecederaan I/R yang disebabkan oleh Complement.
Surat-menyurat kepada:Giuseppe Castellano
Kata kunci:kecederaan iskemia/reperfusi, sistem pelengkap, pentraxin 3,buah pinggang, laluan klasik
Cistanche tubulosa mencegah penyakit buah pinggang, klik di sini untuk mendapatkan sampel
PENGENALAN
Kecederaan iskemia-reperfusi (I/R) mewakili punca utama akutbuah pinggangkecederaanselepas pemindahan dan dicirikan oleh pengaktifan penting sistem pelengkap [1, 2]. Dalam senario ini, sel endothelial (EC) memainkan peranan penting dalam pembaikan maladaptif selepas I/R, yang membawa kepada fibrosis awal oleh peralihan endothelial kepada mesenchymal (EndMT) [3]. Semasa fasa reperfusi, Complement mengatur proses imunologi dan keradangan, menyumbang kepada pelbagai penyakit imun dan keradangan [2-5]. Komponen penting lain dari lengan humoral sistem imun semula jadi diwakili oleh pentraxin yang dianggap memainkan peranan penting dalam biologi vaskular [6].
Pentraxin ialah keluarga protein larut multimerik [6] yang dikelaskan kepada keluarga pendek dan panjang berdasarkan strukturnya [7]. Protein yang dipelihara secara evolusi ini adalah pengesan fasa akut, yang berfungsi sebagai penderia untuk permulaan keradangan dan peningkatan pesat dalam plasma semasa jangkitan [8]. Pentraxin panjang 3 (PTX3) ialah molekul pengecaman corak larut yang penting dalam perlindungan imun semula jadi dan boleh mengaktifkan sistem pelengkap [9-11].
Khususnya, PTX3 mendorong pengaktifan laluan klasik dan lektin dengan mengikat dengan C1q, MBL, Ficolin-2 dan mampu menjejaskan laluan alternatif melalui CFH [10–12].
Berbeza dengan pentraksin lain yang dihasilkan oleh hati dalam aliran darah (iaitu CRP), PTX3 boleh dikeluarkan oleh sel pemastautin di dalam tapak keradangan, contohnya daripada fagosit mononuklear, sel dendritik, fibroblas, dan EC [9] bertindak secara parakrin. [13]. PTX3 juga disimpan dalam bentuk siap sedia dalam neutrofil, disetempatkan dalam butiran tertentu, dan dirembeskan sebagai tindak balas kepada pengiktirafan gugusan mikrob [14]. Dalam EC, ekspresi PTX3 mudah diinduksi oleh TNF- dan IL-1 , memberikan peralihan daripada fenotip anti-radang yang senyap, kepada keadaan prokoagulan dan proinflamasi, dengan itu mengawal selia fungsi mikrovaskular dengan kuat [7, 8 ]. Atas sebab itu, tahap PTX3 telah diterangkan sebagaikronikbuah pinggangpenyakit, peningkatan tahap protein PTX3 telah dikaitkan dengan penurunan GFR dan komplikasi kardiovaskular, namun, masih sedikit yang diketahui tentang peranan PTX3 dalam tetapan awal sebagai akut yang disebabkan oleh I/R.buah pinggangkecederaan [15, 16].
Peranan PTX3 dalam penyakit radang buah pinggang adalah bivalen, dari sisi protein boleh mengaktifkan laluan klasik dan lektin yang menggalakkan keradangan dan kecederaan awal [10-12]. Di sisi lain, domain N-terminal pengaktifan pelengkap termodulat PTX3 melemahkan pengambilan leukosit dan menghalang fibrosis interstisial dalam kecederaan buah pinggang akut yang menggalakkan pembaikan tisu [17-20].
Pelengkap memainkan peranan penting dalam patofisiologi akut yang disebabkan oleh kecederaan I/Rbuah pinggangkecederaan[21, 22]. Dalam model babi kecederaan I / R buah pinggang, kami menunjukkan peranan penting pengaktifan sistem Pelengkap dalam mendorong EndMT dan fibrosis awal, dengan penglibatan kedua-dua laluan klasik dan lektin [23]. Selain itu, kami menunjukkan bahawa perencatan terapeutik bagi laluan pelengkap ini oleh rekombinan C1-INH (rhC1INH) menghasilkan pengurangan ketara dalam pemendapan pelengkap, dengan pengurangan pengambilan sel-sel radang yang menyusup dan kerosakan tubulointerstitial [23]. Keputusan ini juga disahkan oleh Delpech PO et al [24]; modulasi yang ketara dalam pemendapan glomerular dan tiub C1q, MASP dan C4d dinilai selepas 30 minit selepas reperfusi yang menunjukkan peranan utama C1-INH untuk mengatasi laluan klasik dan lektin.
Dalam kajian ini, kami menyiasat kemungkinan penglibatan PTX3 dalam pengantaraan pengaktifan Pelengkap awal dalam kecederaan I/R buah pinggang, mencirikan sumber selular PTX3 yang berbeza.
KEPUTUSAN
PTX3 dinyatakan oleh sel endothelial dan sel penyusupan imun dalam model babi kecederaan I/R
Pertama, kami menyiasat kehadiran PTX3 dalam model babi kecederaan buah pinggang yang disebabkan oleh I/R yang hangat. Kami memerhatikan deposit PTX3 yang sangat terhad dalam tisu biasa (Rajah 1A). Kecederaan I/R menyebabkan pemendapan meresap PTX3 sudah pada 15 minit selepas reperfusi (Rajah 1B, 1C) di kawasan tubulointerstitial (Rajah 1E), pada kapilari peritubular (Rajah 1D; anak panah), dan pada tahap glomerular (Rajah 1D). Deposit PTX3 masih dapat dikesan 1 jam selepas reperfusi pada tahap kapilari peritubular (Rajah 1G). Dalam kerja kami sebelum ini [23] kami menunjukkan bahawa ciri-ciri utama kecederaan I / R ialah apoptosis sel epitelium tiub dan pengambilan sel-sel radang yang menyusup seperti monosit, sel dendritik, dan limfosit. Walau bagaimanapun, dengan penilaian histologi rutin (Tambahan Rajah 1), kami menunjukkan bahawa 30 minit iskemia hangat diikuti oleh 15 minit kerosakan interstisial tubul awal yang disebabkan oleh reperfusi, yang dicirikan oleh kesesakan kapilari yang lebih besar dan vakuolasi sitoplasma fokus epitelium tubul renal, berbanding dengan basal. syarat.
Untuk mencirikan lagi penyetempatan selular deposit PTX3 dan menilai kesan potensinya dalam modulasi tindak balas dan kecederaan keradangan, kami melakukan analisis mikroskopi dua imunostaining dan confocal. Ekspresi protein PTX3 dikesan dalam kebanyakan EC pada tahap kapilari peritubular (Rajah 2A) dan glomerular (Rajah 2B), 15 minit selepas reperfusi.
Adalah diketahui umum bahawa kecederaan I/R dicirikan oleh peningkatan pengaktifan tindak balas imun semula jadi dan adaptif, termasuk pemerdagangan sel radang ke dalam organ berpenyakit yang memburukkan lagi kecederaan melalui sel imun dan sistem Pelengkap [25]. Dalam model babi kami, kami juga memerhatikan, sudah 15 minit selepas reperfusi, infiltrat keradangan padat yang sebahagian besarnya terdiri daripada makrofaj dan sel dendritik di kawasan interstisial tubul. Kami mendapati bahawa kedua-dua sel pembentang antigen ini dicirikan oleh peningkatan ekspresi PTX3 jika dibandingkan dengan T0 kerana kami melihat peningkatan bilangan CD163 tambah /PTX3 tambah (Rajah 2E, 2F, 2K) dan SWC3a tambah /PTX3 tambah (Rajah 2G, 2H, 2L) sel pada paras interstisial tubul pada T15.
Ekspresi PTX3 boleh menyumbang kepada EndMT dalam kecederaan I/R
Dalam pemerhatian terdahulu, kami menunjukkan bahawa kecederaan I / R bertanggungjawab untuk EndMT [26, 27], yang dicirikan oleh pemerolehan fenotip mesenchymal oleh EC dengan kehilangan penanda endothelial tertentu dan keuntungan penanda mesenchymal, seperti fibroblast khusus. protein 1 (FSP-1), kadherin neuron (N-cadherin) dan aktin otot licin alfa (alfa-SMA). Oleh itu, kami menyiasat sama ada ungkapan PTX3 oleh EC boleh menjejaskan proses ini. Seperti yang dijangkakan, apabila kami menyiasat ekspresi alfa-SMA, sebagai penanda myofibroblast yang diaktifkan, kami tidak menemui sebarang penyetempatan bersama antara alpha-SMA dan PTX3 (Rajah 2C, 2D). Sebaliknya, kami melihat peningkatan dalam tubulointerstitial FSP1 plus / PTX3 plus myofibroblast sepanjang tempoh pemerhatian (Rajah 2K-2M).
Deposit PTX3 dikaitkan dengan pengaktifan sistem pelengkap
Akhirnya, kami menyiasat sama ada deposit PTX3 dikaitkan dengan pengaktifan Pelengkap. Sesungguhnya, seperti komponen lain keluarga pentraxin, PTX3 boleh mengawal selia pengaktifan laluan pelengkap klasik [7]. Untuk menentukan hubungan antara pengaktifan PTX3 dan Pelengkap, kami melakukan imunofluoresensi dua label untuk menilai ekspresi PTX3 dan terminal. Lengkapkan kompleks, C5b-9, menggunakan antibodi yang ditujukan terhadap C9-neoepitope. Kami melihat penyetempatan bersama yang ketara bagi deposit PTX3 dan C5b-9 (Rajah 3A, 3B). Kompleks terminal Complement disetempatkan pada tahap peritubular serta dalam kapilari peritubular bersama-sama dengan lapisan sel endothelial, seperti yang telah kami tunjukkan sebelum ini [23, 28]. Oleh kerana PTX3 boleh mengaktifkan sistem Pelengkap melalui laluan klasik dan lektin, kami menilai pemendapan C1q dan MBL dalam parenkim buah pinggang. Menariknya, deposit C1q (Rajah 3E, 3F) dan MBL (Rajah 3C, 3D) didapati terutamanya pada peringkat interstisial dan kapilari (Rajah 3C hingga 3F), seperti yang diterangkan sebelum ini [23] dan dikolokalisasikan dengan deposit PTX3.
Perencat C1-mengganggu pengikatan PTX3 pada sel endothelial
Dalam kerja kami sebelum ini [23] kami menunjukkan bahawa pentadbiran perencat C1-menyebabkan pengurangan ketara dalam pemendapan pelengkap, dengan pengurangan pengambilan sel radang yang menyusup dan kerosakan tubulointerstitial. Oleh itu, kami memeriksa tahap ekspresi PTX3 dalam haiwan yang dirawat rhC1-INH. Kami mendapati bahawa penyerapan perencat C1-mengurangkan deposit PTX3 pada kapilari peritubular dan paras interstisial selepas 15 minit selepas reperfusi (Rajah 4A).
Selain itu, untuk menyokong hipotesis bahawa pengurangan deposit PTX3 dalam haiwan yang dirawat rhC1-INH dikaitkan dengan perencatan kerosakan endothelial, kami melakukan eksperimen in vitro dan kami menilai pengikatan rhC1-INH dan PTX3 pada EC berbudaya dalam keadaan biasa atau dengan kehadiran tekanan selular (Rajah 4B). Analisis FACS menunjukkan bahawa EC dalam keadaan biasa tidak mengikat kedua-dua rhC1-INH dan PTX3. Selaras dengan kajian terdahulu kami [26], kami memerhatikan peningkatan pengikatan selular rhC1-INH pada H2O2-EC yang dirangsang berbanding dengan keadaan basal. Selain itu, jika tiada rhC{11}}INH, PTX3 boleh mengikat EC yang diaktifkan. Menariknya, apabila H2O2-EC diaktifkan diinkubasi dengan PTX3 dan rhC1-INH, kami mendapati bahawa C1INH dapat melindungi EC apabila menyekat pengikatan PTX3.
PERBINCANGAN
Dalam kajian ini, kami menunjukkan pemendapan PTX3 pada fasa awal kecederaan I / R buah pinggang dan kemungkinan sumbangannya kepada pembangunan EndMT. Menariknya, kami mendapati bahawa pengaktifan Pelengkap pengantara PTX3-terjadi terutamanya pada peringkat vaskular, penyetempatan bersama dengan C1q dan MBL, molekul pengecaman laluan klasik dan lektin bagi lata Pelengkap.
Kecederaan I/R mencetuskan tindak balas keradangan yang ketara yang dicirikan oleh pengaktifan Pelengkap, radikal bebas oksigen, dan pengeluaran sitokin proinflamasi, mengakibatkan pengaktifan endothelium vaskular dan leukosit periferal [29, 30]. Semasa kecederaan I/R, pengaktifan Pelengkap membawa kepada pemendapan komponen pelengkap pada membran permukaan EC yang rosak dan tidak berfungsi, dengan penjanaan serentak anafilatoksin dan penguatan proses keradangan [31]. Semasa keradangan, PTX3 meningkat dengan cepat dan boleh memainkan peranan penting dalam memodulasi tindak balas endothelial. Malah, PTX3 telah ditunjukkan sebagai biomarker berpotensi disfungsi endothelial vaskular dalam beberapa penyakit, termasuk kronik.buah pinggangpenyakit, preeklampsia, dan beberapa penyakit vaskular [7, 16, 17, 32]. Kami juga menunjukkan bahawa PTX3 terlibat dalam komplikasi vaskular lain seperti kegagalan fistula arteriovenous dalam pesakit hemodialisis [33]. Pemerhatian ini menunjukkan bahawa PTX3 boleh menjadi jambatan antara tindak balas keradangan dan disfungsi endothelial [34]. Selaras dengan kajian ini, kami memerhatikan deposit PTX3 pada tahap endothelial sudah selepas 15 minit selepas reperfusi (Rajah 2A, 2B). Keputusan kami juga menunjukkan bahawa dalam fasa awal kecederaan I/R, PTX3 dikolokalisasikan dengan penanda myofibroblast, FSP-1 (Rajah 2I, 2J) tetapi tidak dengan alpha-SMA, penanda yang dinyatakan oleh myofibroblast diaktifkan (Rajah 2C, 2D). Diambil bersama, data ini boleh mencadangkan bahawa disfungsi endothelial dan proses EndMT [35], diperhatikan dalam haiwan I/R [26], mula-mula berlaku dalam EC yang menyatakan PTX3.
Hubungan antara PTX3 dan sel-sel radang diiktiraf secara meluas. Dalam makalah ini, kami secara khusus memberi tumpuan kepada kesan wujud PTX3 dalam penyusupan interstisial leukosit yang merupakan sumber utama PTX3 [36]. Khususnya, kami menemui makrofaj dan sel dendritik, selepas 15 minit selepas reperfusi, menyatakan tahap PTX3 yang lebih tinggi (Rajah 2E hingga 2H). Data ini adalah selaras dengan peningkatan badan bukti yang mencadangkan peranan yang relevan untuk imuniti semula jadi dalam mengantar kerosakan awal dalam kecederaan I / R [23]. Pengaktifan awal Pelengkap dalam tisu buah pinggang selepas kecederaan I / R membawa kepada penjanaan beberapa mediator keradangan yang meningkatkan pengambilan sel imun [21, 23, 37, 38]. Kajian terkini telah mengenal pasti PTX3 sebagai salah satu komponen utama rangkaian yang mengatur tindak balas keradangan yang dicetuskan oleh kecederaan I/R [39]. Dalam model eksperimen kecederaan I / R yang berbeza, PTX3 boleh menggunakan dua peranan bertentangan pada tisu tertentu [40, 41]. Pengeluaran awal PTX3 dikaitkan dengan kerosakan buah pinggang kerana ia mendorong ekspresi awal molekul lekatan endothelial dan kemokin yang mempercepatkan tindak balas keradangan maladaptif tempatan.
Sebaliknya, pengeluaran tempatan PTX3 yang berpanjangan menghalang keradangan organ yang berlebihan dan disfungsi [41].
PTX3 ialah modulator lata Pelengkap [9, 42]; ini adalah selaras dengan sifat pleiotropik PTX3 yang menunjukkan dua peranan PTX3 sebagai modulator atau penguat tindak balas imun semula jadi [39]. Pada mulanya, PTX3 mengaktifkan Pelengkap dengan mengikat C1q dan MBL [43]; bagaimanapun, keradangan awal yang meningkat perlu dihadkan kepada kawasan sasaran. Oleh itu, PTX3, dengan merekrut faktor H atau menghalang angiogenesis, juga boleh mengurangkan tindak balas keradangan dan melengkapkan pengaktifan memelihara parenkim buah pinggang daripada kerosakan keradangan [43]. Walaupun pengaktifan komplemen dalam I/R pada tikus terutamanya disetempat pada tahap tiub [44], semasa fasa reperfusi, endothelium adalah sasaran utama agen pro-radang yang berbeza, termasuk mediator Pelengkap [2]. Kami sebelum ini menunjukkan bahawa dalam model babi kecederaan I / R serta pada pesakit DGF, pengaktifan sistem Pelengkap berlaku pada fasa awal, pada kapilari peritubular, dalam interstitium, dan pada endothelium glomerular [23]. Data kami menunjukkan penyetempatan bersama yang jelas bagi deposit C5b-9 pada PTX3 plus EC selepas 15 minit selepas reperfusi (Rajah 3A, 3B). Oleh itu, endothelium buah pinggang nampaknya merupakan tapak lazim PTX3-pengantaraan pengaktifan Pelengkap dalam fasa awal kecederaan I/R dalam kedua-dua tetapan praklinikal dan klinikal.
Interaksi pentraxin dengan C1q dan peranannya dalam pengaktifan laluan Pelengkap klasik diterangkan dengan baik [45-47]. Dalam konteks tindak balas imun semula jadi, PTX3 boleh mengikat komponen Pelengkap yang berbeza dan memodulasi pengaktifan Pelengkap [43, 48]. PTX3 mengaktifkan Pelengkap oleh pengikatan C1q [49]. Keputusan kami dalam model haiwan dengan jelas menunjukkan bahawa PTX3 mungkin menengahi pengaktifan laluan klasik dengan berinteraksi dengan C1q (Rajah 3E, 3F). Selain itu, PTX3 juga memodulasi laluan lektin Pelengkap, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3C, 3D. MBL mengikat PTX3 melalui domain seperti kolagennya [45] dan kompleks MBL/PTX3 merekrut C1q dan menimbulkan pemendapan C3 dan C4 pada permukaan sel sasaran.
Secara keseluruhannya, keputusan ini mencadangkan peranan utama PTX3 dalam pengantaraanbuah pinggangkerosakan dalam kecederaan I/R, yang mungkin mempunyai implikasi penting untuk terapi terarah Pelengkap dalam kecederaan I/R buah pinggang.
Dalam kajian terdahulu kami [26], kami menyiasat penglibatan pelengkap dalam pengantaraan pengaktifan EC dengan menggunakan bentuk rekombinan C1-INH, perencat kuat protease laluan pelengkap klasik dan lektin (C1r, C1 s, dan MASP2). Dalam model haiwan yang sama, kami menunjukkan (Rajah 4A) bahawa perencatan terapeutik kedua-dua laluan oleh rhC1INH mengurangkan deposit PTX3 pada kapilari peritubular dan tahap interstisial selepas 15 minit selepas reperfusi. Data ini disahkan dengan keputusan in vitro pada EC (Rajah 4B), membawa kami membuat hipotesis bahawa rhC1INH mungkin melindungi EC yang rosak apabila menyekat pengikatan PTX3. Dalam kesusasteraan, terdapat bukti tentang pengikatan C{12}}INH kepada molekul lekatan endothelial, dinyatakan pada endothelium yang diaktifkan, dipanggil selektin, khususnya P dan E-selectins [50, 51]. Pengikatan pada EC ini boleh mengganggu interaksi endothelial-leukosit semasa keradangan dan ia mewakili satu lagi mekanisme anti-radang yang penting [50, 51]. Oleh itu, kami membuat hipotesis bahawa rh-C1INH boleh mengikat EC diaktifkan dan mengantara peraturan tempatan pengaktifan pelengkap dan proses keradangan. Dalam kajian terdahulu kami, kami telah menunjukkan penglibatan pelengkap dalam kecederaan I / R dan penyakit buah pinggang pengantara imun yang lain [38, 52-54]. Mekanisme pengaktifan Pelengkap dalam model haiwan ini boleh mempunyai implikasi penting untuk tafsiran data yang dijangkakan dalam persekitaran manusia. Untuk berjaya membangunkan campur tangan terapeutik yang disasarkan ke arah pengaktifan Pelengkap [36, 54], adalah penting untuk mewujudkan kesahihan data babi berbanding dengan apa yang berlaku dalam keadaan klinikal. Oleh kerana penyelidikan ini terhad kepada kajian pemerhatian, eksperimen lanjut diperlukan untuk menggambarkan mekanisme yang saling berkaitan antara PTX3 dan Complement yang mungkin menyerlahkan strategi terapeutik baharu. Daripada keputusan di atas, data kami menyokong hipotesis bahawa PTX3 mungkin mengawal selia pelbagai aspek kecederaan I/R yang dimediasi Pelengkap dengan itu mewakili sasaran terapeutik yang berpotensi.
BAHAN DAN KAEDAH
Model babi kecederaan I/R buah pinggang
Model haiwan kecederaan I / R buah pinggang telah dibangunkan seperti yang diterangkan sebelum ini [23]. Selepas diluluskan oleh jawatankuasa etika Kementerian Kesihatan, 4-babi Putih Besar betina berumur sebulan (n=8, n=4 untuk kumpulan, 20 kg) menjalani prosedur pembedahan terbuka eksperimen di bawah anestesia am. Haiwan tersebut berpuasa selama 24 jam sebelum induksi bius. Elektrokardiogram, kadar denyutan jantung, ketepuan hemoglobin oksigen, komposisi gas pernafasan, kadar pernafasan, jumlah pasang surut, tekanan saluran udara, tekanan darah arteri sistolik, dan tekanan vena pusat secara berterusan dipantau dan direkodkan secara automatik (CD Modulus Ohmeda; DatexOhmeda, Helsinki, Finland) . Arteri dan vena renal kiri diasingkan dan gelung vesel diletakkan di sekeliling arteri renal dengan pengapit sudut kanan. Biopsi buah pinggang dilakukan sebelum iskemia (T0). Kemudian, fasa iskemia diinduksi (30 minit) dengan menarik pada gelung kapal. Pelbagai biopsi kemudiannya dilakukan pada 15, 30, dan 60 minit selepas reperfusi; haiwan dikorbankan 24 jam selepas prosedur pembedahan. Sebahagian daripada setiap spesimen biopsi segera dibekukan dalam suhu pemotongan optimum (Tissuetek, Pittsburgh, PA) dan disimpan dalam nitrogen cecair. Satu bahagian lagi difiksasi dalam formalin buffer (4 peratus ) selama 12 jam dan dibenamkan dalam parafin menggunakan prosedur standard.
Kajian mikroskopi
Spesimen buah pinggang tertanam parafin daripada biopsi buah pinggang digunakan untuk pewarnaan histologi konvensional (H&E, asid berkala-Schiff). Imej diperoleh oleh peranti Aperio ScanScope CS2 (Aperio Technologies, Vista, CA, USA). Lesi tubul-interstitial dan glomerular dinilai menggunakan analisis kualitatif oleh dua pemerhati (CD, MR) yang tidak mengetahui asal usul
Antibodi
Antibodi utama yang digunakan dalam kajian ini mengiktiraf antigen berikut: PTX3 (MNB4: terus terhadap domain PTX3 N-terminal, Exira Life Sciences In., Larsen, Switzerland); CD163 (monosit/makrofaj, Biologi AS, Swampscott, MA); SWC3a (sel dendritik, [55] 74-22-15A, BD Biosains); FSP1 (protein khusus fibroblast 1, Abcam, Cambridge, UK); aktin otot licin alfa (Santa Cruz Biotechnology Inc.; Santa Cruz, CA, Amerika Syarikat); C1q (R9/2, AbDSerotec; Kidlington, United Kingdom); MBL (3E7: terus terhadap domain pengecaman karbohidrat MBL, bioteknologi Hycult, Uden, Belanda) dan neoantigen C9 (aE11, bioteknologi Hycult). Kereaktifan silang telah disahkan dengan pra-inkubasi antibodi khusus, sebelum digunakan, dengan peptida manusia digunakan untuk menaikkannya. Pra-pengeraman menghapuskan pewarnaan khusus pada tisu babi.
Imunofluoresensi tisu dan mikroskopi pengimbasan laser confocal
Pencirian dan penyetempatan isyarat PTX3 telah disiasat pada tisu beku yang termasuk dalam medium OCT (Tissue-Tek). Slaid telah diinkubasi dengan 5 peratus serum arnab selama 1 jam pada suhu 37 darjah C. Slaid kemudiannya diinkubasi selama 1 jam pada suhu bilik dengan antibodi spesifik. Selepas tiga kali cucian dalam PBS, slaid kemudian diinkubasi dengan antibodi sekunder yang sesuai (Alexa Flour 488 dan 555, Molecular Probes, Eugene, OR). Semua bahagian telah diwarnakan dengan TO-PRO-3 (Probe Molekul). Kawalan negatif disediakan dengan antibodi yang tidak berkaitan. Bahagian-bahagian tersebut dianalisis menggunakan mikroskop pengimbasan laser confocal Leica TCS SP2 (Leica, Wetzlar, Jerman). Bilangan sel penyusupan diukur dalam sekurang-kurangnya 10 medan/bahagian kuasa tinggi (x630) oleh dua pemerhati bebas yang buta terhadap asal usul slaid. Kiraan akhir adalah min bagi kedua-dua ukuran. Walau apa pun, kebolehubahan antara pemerhati adalah lebih tinggi daripada 20 peratus .
Kultur sel dan analisis sitometri aliran
Sel endothelial vena umbilical manusia (HUVEC, EC) telah dibeli daripada American Type Culture Collection (ATCC-LGC Standards, Sesto San Giovanni, Itali). EC telah ditanam dalam media disyorkan mereka, EndoGro (Merck Millipore, Darmstadt, Jerman). EC disalut pada ketumpatan 1{{10}},000sel/cm2 dan telah dirangsang dengan rawatan H2O2 (3 peratus , 1 jam). Kemudian EC basal dan terstimulasi dibasuh dua kali dengan PBS dan dikeluarkan dengan PBS-EDTA 2mM dan trypsin 0.001×. Kemudian sel digantung semula dalam PBS dan diinkubasi masing-masing dengan PTX3 (PTX3 manusia rekombinan, Sigma-Aldrich, Merck, Jerman) (1ug/ml) atau/dan dengan rhC1-INH (Ruconest®, Pharming) (2.5ug /ml) selama 60 min. Selepas mencuci tiga kali dengan PBS 1X, sel-sel telah digantung semula dalam penimbal aliran cytometry (FACS) (garam penampan fosfat, pH 7.2, 0.2 peratus albumin serum lembu, dan 0.02 peratus natrium azida) dan diinkubasi dengan reagen penyekat FCR (Miltenyi Biotec) untuk 10 min pada suhu bilik. Selepas menyekat, EC diinkubasi dengan C{30}}INH anti-manusia arnab (disediakan oleh Prof. M. Daha, University of Leiden, pencairan 1/100) atau/dan dengan anti-PTX3 tikus (MNB4, Exira Life Sciences In., 1/20 pencairan) pada suhu bilik selama 30 minit dan dibasuh dengan penimbal FACS. Kemudian, sel diinkubasi dengan kambing anti-arnab IgG PE (Molecular Probes, 1/100 dilution) atau/dengan anti-rat IgG FITC (Molecular Probes, 1/100 dilution) pada suhu bilik selama 30 minit dan dibasuh tiga kali. Sel dianalisis dengan perisian FC500 (Beckman Coulter, Brea, CA, Amerika Syarikat) dan Kaluza. Kawasan positif ditentukan dengan menggunakan mAb yang dipadankan dengan isotype, dan, secara keseluruhan, 104 peristiwa untuk setiap sampel telah diperoleh. Tiga eksperimen bebas telah dilakukan.
Analisis statistik
Data dibentangkan sebagai min ± sisihan piawai (SD) dan dibandingkan menggunakan analisis varians atau ujian t Pelajar berpasangan, mengikut kesesuaian. Perbezaan dianggap signifikan secara statistik apabila nilai p kurang daripada 0.05. Data dianalisis menggunakan pakej perisian Statview (versi 5.0) (SAS Inc. Co., Cary, NC, USA). Graf dipaparkan menggunakan Perisian GraphPad Prism 5.
Singkatan
I/R: iskemia/reperfusi; EC: sel endothelial; PTX3: pentraxin 3; FSP-1: protein khusus fibroblast 1; N-cadherin: kadherin neuron; alpha-SMA: alfa-aktin otot licin.
SUMBANGAN PENULIS
CD menyelaraskan kajian, mengambil bahagian dalam immunolabeling dan mikroskopi confocal bahagian buah pinggang, dan merangka manuskrip. AS dan RF mengambil bahagian dalam reka bentuk kajian, menyumbang kepada analisis data, melakukan eksperimen in vitro, dan menyemak semula manuskrip secara kritis. MR dan GSN melakukan analisis imej histopatologi. LL, FS, AMC melakukan model haiwan kecederaan Ischemia-Reperfusion dan membantu menyemak semula manuskrip. GL, PD, dan MB menjalankan semua prosedur pembedahan pada model babi dan membantu menyemak semula manuskrip. MRD, P.vdP., C.vK., dan FS menyemak semula manuskrip.
PP, ER, GG, GS dan LG menyemak semula manuskrip secara kritis. GC menyediakan alat analitik baharu, mereka bentuk dan menyelia penyelidikan. CD, AS, dan RF sama-sama menyumbang kepada kajian ini. Semua pengarang menyumbang kepada artikel dan meluluskan versi yang diserahkan.
PENGHARGAAN
Kami mengucapkan terima kasih kepada Claudia Curci dari Unit Renal, Dialisis dan Transplantasi, Jabatan Kecemasan dan Pemindahan Organ,
Universiti Bari atas bantuan teknikal yang sangat baik.
KONFLIK KEPENTINGAN
Penulis mengisytiharkan bahawa mereka tidak mempunyai konflik kepentingan.
PEMBIAYAAN
Kajian ini disokong oleh Universiti Bari "Aldo Moro", Kementerian Kesihatan Itali (GR 2016- 02362239 "Pendekatan berasaskan transkriptomi untuk mengenal pasti faktor ramalan dan sasaran terapeutik untuk fungsi cantuman tertunda dalambuah pinggangpenerima pemindahan", Bando di Ricerca Finalizzata 2016, CD menerima biasiswa untuk projek ini) dan Fondo Sociale Europeo, Azione I.2 "Attrazione e Mobilità Internazionale dei Ricercatori"- AIM-1810057-aktiviti 2 yang diberikan kepada AS
RUJUKAN
1. Bonventre JV, Yang L. Patofisiologi selular akut iskemiabuah pinggangkecederaan. J Clin Invest. 2011; 121:4210–21.
2. Jang HR, Rabb H. Tindak balas imun semula jadi dalam akut iskemiabuah pinggangkecederaan. Clin Immunol. 2009; 130:41–50.
3. Ricklin D, Hajishengallis G, Yang K, Lambris JD. Pelengkap: sistem utama untuk pengawasan imun dan homeostasis. Nat Immunol. 2010; 11:785–97.
4. Thurman JM, Holers VM. Peranan utama laluan pelengkap alternatif dalam penyakit manusia. J Immunol. 2006; 176:1305–10. PMID:16424154
5. Franzin R, Stasi A, Fiorentino M, Stallone G, Cantaluppi V, Gesualdo L, Castellano G. Sistem Radang dan Pelengkap: Pautan Antara Akutbuah pinggangKerosakan Kecederaan dan Kronik. Imunol hadapan.
2020; 11:734.PMID:32457738
6. Deban L, Jaillon S, Garlanda C, Bottazzi B, Mantovani A. Pentraxins dalam imuniti semula jadi: pelajaran daripada PTX3. Res Tisu Sel. 2011; 343:237–49.PMID:20683616
7. Cieślik P, Hrycek A. Long pentraxin 3 (PTX3) berdasarkan strukturnya, mekanisme tindakan dan implikasi klinikal. Autoimuniti. 2012; 45:119–28.PMID:21988562
8. Kunes P, Holubcova Z, Kolackova M, Krejsek J. Pentraxin 3(PTX 3): modulator endogen bagi tindak balas keradangan. Perantara Inflamm. 2012; 2012:920517.PMID:22577258
9. Garlanda C, Bottazzi B, Bastone A, Mantovani A. Pentraxins di persimpangan antara imuniti semula jadi, keradangan, pemendapan matriks, dan kesuburan wanita. Annu Rev Immunol. 2005; 23:337–66.115756PMID:15771574
10. Bottazzi B, Garlanda C, Cotena A, Moalli F, Jaillon S, Deban L, Mantovani A. Pentraxin panjang PTX3 sebagai reseptor pengecaman corak humoral prototaip: saling berinteraksi dengan imuniti semula jadi selular. Immunol Rev. 2009; 227:9–18.PMID:19120471
11. Ma YJ, Doni A, Hummelshøj T, Honoré C, Bastone A, Mantovani A, Thielens NM, Garred P. Sinergi antara ficolin-2 dan pentraxin 3 meningkatkan pengecaman imun semula jadi dan pemendapan pelengkap. J Biol Chem. 2009; 284:28263–75.PMID:19632990
12. Netti GS, Lucarelli G, Spadaccino F, Castellano G, Gigante M, Divella C, Rocchetti MT, Rascio F, Mancini V, Stallone G, Carrieri G, Gesualdo L, Battaglia M, Ranieri E. PTX3 memodulasi imunoflogosis dalam tumor persekitaran mikro dan merupakan faktor prognostik untuk pesakit dengan karsinoma sel renal sel yang jelas. Penuaan (Albany NY). 2020; 12:7585–602.PMID:32345771
13. Souza DG, Amaral FA, Fagundes CT, Coelho FM, Arantes RM, Sousa LP, Matzuk MM, Garlanda C, Mantovani A, Dias AA, Teixeira MM. Pentraxin PTX3 yang panjang adalah penting untuk keradangan tisu selepas itu
iskemia usus dan reperfusi pada tikus. Am J Pathol. 2009; 174:1309–18.PMID:19286566
14. Jaillon S, Peri G, Delneste Y, Frémaux I, Doni A, Moalli F, Garlanda C, Romani L, Gascan H, Bellocchio S, Bozza S, Cassatella MA, Jeannin P, Mantovani A. Reseptor pengecaman corak humoral PTX3 disimpan dalam butiran neutrofil dan menyetempat dalam perangkap ekstraselular. J Exp Med. 2007; 204:793–804.PMID:17389238
15. Tong M, Carrero JJ, Qureshi AR, Anderstam B, Heimbürger O, Bárány P, Axelsson J, Alvestrand A, Stenvinkel P, Lindholm B, Suliman ME. Plasma pentraxin 3 pada pesakit dengan kronikbuah pinggangpenyakit: persatuan dengan fungsi buah pinggang, tenaga protein, pembaziran, penyakit kardiovaskular, dan kematian. Clin J Am Soc Nephrol. 2007; 2:889–97.PMID:17702732
16. Witasp A, Rydén M, Carrero JJ, Qureshi AR, Nordfors L, Näslund E, Hammarqvist F, Arefin S, Kublickiene K, Stenvinkel P. Peningkatan tahap peredaran dan ekspresi tisu pentraxin 3 dalam uremia: gambaran disfungsi endothelial. PLoS One. 2013; 8: e63493.PMID:23658833
17. Presta M, Camozzi M, Salvatori G, Rusnati M. Peranan reseptor pengecaman corak larut PTX3 dalam biologi vaskular. J Sel Mol Med. 2007; 11:723–38.PMID:17760835
18. Bottazzi B, Inforzato A, Messa M, Barbagallo M, Magrini E, Garlanda C, Mantovani A. Pentraxin PTX3 dan SAP dalam imuniti semula jadi, pengawalan keradangan dan pembentukan semula tisu. J Hepatol. 2016; 64:1416–27.
19. Xiao Y, Yang N, Zhang Q, Wang Y, Yang S, Liu Z. Pentraxin 3 menghalang fibrosis interstisial akibat kecederaan buah pinggang akut melalui penindasan laluan IL-6/Stat3. Keradangan. 2014; 37:1895–901.PMID:24854162
20. Inforzato A, Reading PC, Barbati E, Bottazzi B, Garlanda C, Mantovani A. Bahagian "manis" pentraxin panjang: bagaimana glikosilasi mempengaruhi fungsi PTX3 dalam imuniti dan keradangan semula jadi. Imunol hadapan. 2013; 3:407. PMID:23316195
