Bahagian1: Kesan Renovaskular Nitrat Tak Organik Berikutan Iskemia-reperfusi Buah Pinggang

Untuk maklumat lanjut. kenalantina.xiang@wecistanche.com

ABSTRAK

Latar belakang: Kecederaan iskemia-reperfusi (IR) buah pinggangadalah punca biasakecederaan buah pinggang akut(AKI), yang dikaitkan dengan tekanan oksidatif dan pengurangan bioaktiviti nitrik oksida (NO), dan peningkatan risikopenyakit buah pinggang yang kronik(CKD) dan penyakit kardiovaskular (CVD). Strategi baharu yang memulihkan keseimbangan redoks mungkin mempunyai implikasi terapeutik semasa AKI dan komplikasi yang berkaitan.

Matlamat: Untuk menyiasat nilai terapeutik untuk meningkatkan laluan nitrat-nitrit-NO semasa perkembangan disfungsi buah pinggang dan kardiovaskular yang disebabkan oleh IR.

Kaedah: Tikus C57BL/6 J jantan diberi natrium nitrat (10 mg/kg,ip) atau kenderaan 2 jam sebelum iskemia panas buah pinggang kiri (45 min) diikuti dengan suplemen natrium nitrat dalam air minuman (1 mmol/kg/ hari) untuk 2 minggu berikutnya. Tekanan darah dan kadar penapisan glomerular diukur dan darah dan buah pinggang dikumpul dan digunakan untuk analisis biokimia dan histologi serta kajian kereaktifan saluran buah pinggang. Sel endothelial glomerular yang terdedah kepada hypoxia-reoxygenation, dengan atau tanpa angiotensin Ⅱ, digunakan untuk kajian mekanistik.

Keputusan: IR dikaitkan dengan fungsi buah pinggang yang berkurangan dan tekanan darah yang sedikit meningkat, dalam kombinasi dengan kecederaan buah pinggang, keradangan, disfungsi endothelial, peningkatan tahap Ang Ⅱ, dan vasoreaktiviti pengantara Ang II, yang semuanya diperbaiki oleh nitrat. Selain itu, rawatan dengan nitrat (in vivo) dan nitrit (in vitro) memulihkan bioaktiviti NO dan mengurangkan tekanan dan kecederaan oksidatif mitokondria.

Kesimpulan: Rawatan akut dengan nitrat bukan organik sebelum iskemia buah pinggang boleh berfungsi sebagai pendekatan terapeutik baru untuk mencegah AKI dan CKD dan risiko yang berkaitan untuk berkembangdisfungsi kardiovaskular.

Klik untuk menghubungi pembekal untuk pengalaman cistanche

1. Pengenalan

Kecederaan iskemia-reperfusi (IR) buah pinggang, yang dikaitkan dengan pemindahan, pembedahan pintasan jantung, dan kejutan, adalah risiko utama untuk mengalami kecederaan buah pinggang akut (AKI) dan penyakit buah pinggang kronik (CKD) berikutnya [1]. Mekanisme asas adalah kompleks dan melibatkan tekanan oksidatif yang berkaitan dengan reperfusi, kekurangan oksida nitrik, dan pengaktifan sel imun, yang bersama-sama membawa kepada disfungsi endothelial [2, 3]. Penyelidikan yang berterusan telah difokuskan untuk mencari terapi baru dan berkesan untuk mencegah dan merawat AKI dan perkembangannya kepada CKD, seperti prakondisi iskemia jauh, hipotermia tempatan sementara serta campur tangan farmakologi baru [3,4].

Molekul isyarat gas nitrik oksida (NO) penting menyumbang kepada pengawalan homeostasis kardiovaskular dan buah pinggang dan telah ditunjukkan untuk memainkan peranan perlindungan semasa kecederaan IR [5,6]. Walau bagaimanapun, semasa kejadian iskemia, kekurangan oksigen menjejaskan fungsi endothelial NO synthase (eNOS), yang mungkin menyumbang kepada "fenomena tiada aliran semula" dalam tisu iskemia semasa fasa reperfusi. Ini seterusnya menyebarkan kecederaan sel epitelium endothelial dan tiub [7], yang menyumbang kepada perkembangan fungsi buah pinggang yang berkurangan. Sebagai tambahan kepada hipoksia semasa tempoh iskemia, pengeluaran berlebihan spesies oksigen reaktif (ROS) yang dihasilkan secara berlebihan oleh nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH)oxidase dan mitokondria semasa fasa reperfusi memusnahkan NO [8]. Pendekatan baharu yang mengurangkan tekanan oksidatif dan mengekalkan bioaktiviti NO mungkin mempunyai nilai terapeutik dalam memerangi kegagalan buah pinggang yang disebabkan oleh IR.

Nitrat tak organik (NO3) dan nitrit (NOZ) sebelum ini dilihat sebagai produk lengai yang diperoleh daripada metabolisme NO. Walau bagaimanapun, penyelidikan yang dijalankan selama lebih daripada dua dekad telah menunjukkan bahawa anion ini boleh menjalani biokonversi, melalui pengurangan bersiri, dan sekali lagi membentuk NO dan spesies nitrogen oksida bioaktif yang lain [9]. Aktiviti laluan alternatif nitrat-nitrit-NO ini dipertingkatkan semasa keadaan hipoksia dan pH rendah apabila sistem NOS klasik boleh menjadi tidak berfungsi [10].

Pemakanan, sebagai tambahan kepada sistem NOS, adalah sumber penting peredaran nitrat dan nitrit, disebabkan oleh paras nitrat yang tinggi contohnya dalam sayur-sayuran berdaun hijau. Suplemen dengan nitrat tak organik dan nitrit telah dikaitkan dengan kesan kardiovaskular yang menggalakkan, termasuk pengurangan tekanan darah, dalam kedua-dua kajian eksperimen dan klinikal [11]. Kesan perlindungan organ juga telah ditunjukkan dalam model kecederaan IR eksperimen hati [12], otak [13], paru-paru [14], dan jantung [12,15]. Walau bagaimanapun, potensi nilai terapeutik nitrat tak organik dan nitrit dalam kecederaan IR buah pinggang masih menjadi kontroversi. Seperti yang disemak baru-baru ini [5], hasil berubah dalam model IR, menggunakan terapi nitrit, mungkin disebabkan oleh perbezaan dalam dos yang digunakan, laluan pentadbiran, tempoh rawatan, serta model eksperimen itu sendiri [16,17]. Beberapa kajian eksperimen telah menunjukkan kesan perlindungan suplemen nitrat diet dalam model penyakit kardiorenal, melalui mekanisme yang melibatkan pelembab tekanan oksidatif dan peningkatan bioaktiviti NO serta modulasitindak balas keradangan[5]. Sehingga kini, terdapat pengetahuan terhad tentang kesan terapi nitrat tak organik dalam kecederaan IR buah pinggang. Kami sebelum ini telah menunjukkan bahawa prarawatan diet kronik dengan nitrat melemahkan kecederaan buah pinggang yang disebabkan oleh IR [18]. Walau bagaimanapun, terdapat kurang pengetahuan mengenai nilai potensi meningkatkan laluan nitrat-nitrit-NO pada permulaan IR untuk mengurangkan risiko mengembangkan AKI dan CKD. Jika melindungi, ini boleh mempunyai aplikasi klinikal yang luas pada pesakit yang berisiko mendapat AKI contohnya mereka yang menjalani pembedahan besar.

Dalam kajian ini, kami menggunakan model tetikus kecederaan IR buah pinggang untuk menyiasat potensi manfaat rawatan nitrat akut sejurus sebelum kejadian iskemia. Ini digabungkan dengan kajian vesel ex vivo mekanistik dan eksperimen kultur sel in vitro dengan rawatan nitrit. Kami membuat hipotesis bahawa meningkatkan laluan nitrat-nitrit-NO akan menggalakkan perlindungan buah pinggang terhadap kecederaan IR melalui modulasi tekanan oksidatif dan bioaktiviti NO serta fungsi mitokondria.

2. Kaedah

2.1.Reagen

Melainkan dinyatakan sebaliknya, semua reagen diperoleh dari Sigma-Aldrich, Sweden.

2.2. Model iskemia-reperfusi haiwan dan buah pinggang

Tikus C57BL/6 J (Lelaki, 10 minggu) diperolehi dari Janvier Lab-oratoryries (Perancis) dan ditempatkan di kemudahan haiwan kami di Karolinska Institutet di bawah keadaan terkawal iklim dengan 12-h kitaran terang/gelap dan disediakan dengan chow tikus standard dan air paip. Semua prosedur haiwan telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Serantau untuk Eksperimen Haiwan (ID Protokol: N139/15) dan telah dijalankan mengikut garis panduan Institut Kesihatan Nasional (NIH) dan dengan Arahan EU 2010/63/EU untuk menjalankan eksperimen pada haiwan.

Selepas 1 minggu penyesuaian, tikus diberikan plasebo (NaCl) atau natrium nitrat (NaNO3) secara intraperitoneal (10 mg/kg)2 jam sebelum iskemia unilateral buah pinggang kiri. Buah pinggang kanan telah diperiksa tetapi sebaliknya dibiarkan utuh. Pembedahan syam dilakukan dengan cara yang sama, tetapi tanpa mengapit buah pinggang kiri. Tikus telah dibius dengan isoflurane dan suhu badan disimpan pada 37 ± 0.5 darjah menggunakan lampu pemanas dan pad pemanas yang dipantau sendiri sepanjang pembedahan. Selepas pembedahan, tikus dirawat dengan sama ada natrium nitrat (1 mmol/kg/hari) atau plasebo selama 2 minggu sehingga penamatan.

2.3. Pengukuran tekanan darah

Tekanan darah diukur pada tikus menggunakan kaedah cuff ekor bukan invasif sebelum penamatan. Tikus telah dikondisikan pada pinggan suam pada suhu 35 darjah C selama 10 minit dan kemudian dimasukkan ke dalam penahan plastik. Cuff dengan sensor nadi pneumatik telah dipasang pada ekor, dan nilai tekanan darah direkodkan dengan sistem CODA (Kent Scientific, Torrington, CT, USA). Haiwan telah dilatih dengan penahan pada plat pemanasan sekurang-kurangnya tiga hari sebelum rakaman tekanan darah. Tekanan arteri sistolik, diastolik dan purata dikumpulkan selama 3 hari berturut-turut dan median individu bagi semua nilai yang diterima dikumpulkan untuk penilaian.

2.4.Tuai tisu

Sebelum ditamatkan, tikus dimasukkan ke dalam sangkar metabolik untuk mengumpul air kencing bagi pengiraan kadar penapisan glomerular (GFR). Haiwan kemudian dibius dengan isoflurane dan sampel darah dikumpulkan melalui vena kava inferior. Semua sampel telah disentrifugasi serta-merta pada 6000 × g, 4 darjah C selama 5 minit dengan kehadiran EDTA (Sigma-Aldrich, Stockholm, Sweden), kepekatan akhir 2 mM. Sampel plasma dipindahkan ke dalam tiub baru dan segera dibekukan dalam ais kering dan akhirnya disimpan pada -80 darjah . Buah pinggang telah diekstrak dan dipotong kepada beberapa bahagian untuk eksperimen fungsi vaskular ex vivo (arteri interlobar dan arteriol aferen), histologi ( Pewarnaan HE dan PAS), dan kuantifikasi apoptosis dan keradangan (pembenaman kompaun suhu pemotongan optimum Tissue-Tek (OCT) dan dibekukan untuk pewarnaan TUNEL dan F4/80).

2.5. Pengukuran nitrat, nitrit, cGMP, kreatinin, nitrogen urea darah (BUN), dan angiotensin II

Nitrit dan nitrat dianalisis oleh HPLC(ENO-20) seperti yang diterangkan sebelum ini 【19】. Sampel plasma（10 ul telah disuntik ke dalam sistem HPLC dengan picagari Hamilton. Selepas itu, nitrit dan nitrat dipisahkan dengan kromatografi pertukaran fasa terbalik/ion diikuti dengan pengurangan nitrat kepada nitrit oleh kadmium dan kuprum terkurang. Nitrit telah diterbitkan menggunakan reagen Griess untuk membentuk sebatian diazo dan dikesan pada 540 nm. Untuk mengelakkan degradasi cGMP, plasma dipindahkan ke tiub yang mengandungi perencat PDE, BMX(3-Isobutyl-1methylxanthine; Sigma-Aldrich #I5879） untuk memberikan kepekatan akhir （10 μM）. Sampel adalah selepas itu dibekukan dan disimpan pada-80 darjah sebelum menganalisis cGMP dengan kit ELISA(GE Healthcare #RPN226), mengikut arahan pengeluar.

Paras kreatinin plasma dan air kencing telah dikesan dengan menggunakan Kit Ujian Kolorimetrik Kreatinin (Cayman Chemical, #700460 dan#500701). Formula pelepasan kreatinin(CLcr =Urinecrx Urine flow/Plasmacr) telah digunakan untuk menganggarkan GFR. Tahap BUN plasma telah dikesan dengan menggunakan Kit Pengesanan Warna BUN (Invitrogen, #EIA-BUN). Tahap Ang dalam plasma dan tisu buah pinggang diukur menggunakan kit Ang ⅡI ELISA(Cloud-Clone Corp.,# CEA005Mu) mengikut arahan pengeluar. Walau bagaimanapun, penyediaan ekstrak tisu berbeza sedikit daripada pengesyoran.10 vol 50 mM HCl dalam 50 peratus EtOH telah ditambah pada tisu dan dipanaskan selama 10 minit pada 100 darjah , disentrifugasi 10 000×g 10 min. Selepas itu sampel dibekukan dan disimpan pada-80 darjah sebelum dianalisis. Semua bacaan penyerapan dilakukan dalam SpextraMax iD3 daripada Peranti Molekul.

2.6. Pengasingan dan perfusi arteri interlobar

Buah pinggang dituai selepas pengorbanan dan disimpan dalam larutan garam fisiologi (PSS) ais sehingga pengasingan arteri interlobar. Arteri interlobar buah pinggang dibedah (panjang 2 mm) dan dipasang dalam a

ruang myograph (Model 620 M, Danish Myo Technology, Denmark)dengan PS seperti yang diterangkan sebelum ini [20]. Ketegangan isometrik telah direkodkan dengan sistem Powerlab (Powerlab 4/30, AD Instruments, Australia). Selepas dipasang, kapal telah diseimbangkan selama 20 minit dalam PSs menggelegak dengan karbogen (95 peratus O2; 5 peratus CO2) pada 37 darjah, pH7.4. Kemudian ketegangan rehat arteri ditetapkan seperti yang diterangkan sebelum ini [21], iaitu mengikut prosedur normalisasi Mulvany [22]. Selepas penyamaan kedua, 0.1 mol/L KCl digunakan untuk menilai daya maju cincin arteri.

2.7. Pengasingan dan mikro-perfusi arteriol aferen

Tikus C57BL/6 J telah dibius dengan isoflurane yang disedut dan buah pinggang dikeluarkan dan dihiris dengan cepat seperti yang diterangkan sebelum ini [23-25]. Potongan buah pinggang diletakkan dalam medium Eagle's modified Eagle (DMEM) yang sejuk ais. Satu arteriol aferen tunggal dengan glomerulus yang melekat telah dibedah mikro di bawah stereomikroskop dan dipindahkan ke

ruang terkawal suhu pada pentas mikroskop terbalik. Glomerulus telah difiksasi dengan mikropipet pegangan dan arteriol aferen dikanulasi dan diperas dengan satu set mikropipet. Tekanan intraluminal arteriol aferen perfused dikekalkan pada 60 mmHg semasa eksperimen. Masa untuk pembedahan dan perfusi mikro berikut adalah terhad kepada 120 minit selepas tetikus dikorbankan seperti yang diterangkan sebelum ini [26]. Selepas tempoh penyamaan 30 minit pada 37 darjah, lengkung tindak balas dos terkumpul kepada Ang II (10-12 hingga 10-8 mol/L) diperolehi. Setiap kepekatan Ang II diserap selama 2 minit, tindak balas konstriktif direkodkan dan kemudian diameter arteriol aferen diukur.

2.8. Pemeriksaan histologi

Sampel buah pinggang telah dituai dan difikatkan dalam larutan paraformaldehid 4 peratus. Tisu buah pinggang tetap dibenamkan dalam parafin dan selepas itu dihiris dan diwarnai dengan Hematoxylin-Eosin (H&E) atau Periodic Acid Schiff (PAS) untuk penilaian histologi. Empat haiwan yang dipilih secara rawak daripada setiap kumpulan eksperimen digunakan untuk analisis. Sepuluh medan yang dipilih secara rawak dari setiap bahagian telah ditangkap di bawah pembesaran 400x. Semua analisis morfometrik dilakukan secara buta.

2.9. pewarnaan TUNEL

Sampel buah pinggang tertanam OCT digunakan untuk pewarnaan TUNEL. Bahagian tebal 6-μm diinkubasi dengan 20ug/mL proteinase K selama 15 minit pada suhu bilik dan tindak balas TUNEL dilakukan dengan menggunakan Click-iTTM Plus TUNEL Assay (Invitrogen C10618, USA) mengikut arahan pengilang. Pada akhir protokol, DAPIstaining telah dilakukan. Untuk kuantifikasi, tiga haiwan dan tiga bidang medan imej (200 ×) telah dipilih secara rawak dan diambil gambar menggunakan mikroskop konfokal Zeiss LSM800-Airy, isyarat positif dikira menggunakan perisian ImageJ/Fiji dan dikira sebagai nisbah isyarat positif kepada DAPI.

2.10. Pewarnaan imunofluoresensi tisu dan mikroskopi konfokal (F4/80)

Buah pinggang dibekukan dalam OCT (Tissue-Tek, Torrence, CA, USA) dan bahagian（6 μm） telah disediakan dan diproses selanjutnya. Bahagian beku telah dibasuh dengan 1× PBS dan disekat dengan 2 peratus BSA dalam PBS selama 30 minit dan kemudian diinkubasi dengan anti-F4/80(1:50, BIO-RAD Cl: A3-1) semalaman dalam 4 darjah bilik sejuk, dan seterusnya dengan antibodi sekunder (Teknik isyarat sel 1:200 #4417) pada suhu bilik selama 1 jam, diikuti dengan pewarnaan balas dengan 300 nmol/L DAPI(4'6-diamidino-2-fenil -indole, dihydrochloride, Invitrogen) selama 3 min. Isyarat imunofluoresensi telah divisualisasikan di bawah Zeiss LSM{23}}mikroskop confocal berangin. tiga haiwan dan tiga kawasan medan imej (200×) telah dipilih secara rawak. Isyarat positif F4/80 dikira menggunakan perisian ImageJ/Fiji dan dikira sebagai nisbah isyarat positif kepada DAPI.

2.11. Kultur sel

Sel endothelial glomerular tikus(GEC)(DSMZ ACC262, Jerman) telah dikultur dalam medium RPMI1640(Gibco 21870-076) dengan 10 peratus serum lembu janin dan 2 m ML-Glutamine(Gibco 25030-082), penisilin dan streptomycin (50 mg/L, Gibco 15140-122). Sel dikekalkan pada 37 darjah dalam suasana lembap sebanyak 5 peratus CO2. Dalam eksperimen hipoksia, sel telah diinkubasi dalam HBSS(Gibco 14025-092) dan bukannya medium bebas serum dalam ruang dengan 1 peratus oksigen pada 37 darjah C selama 2 jam. Sel telah diinkubasi terlebih dahulu dengan nitrit (10 μM, dengan/tanpa xanthine oxidoreductase(XOR) inhibitor febuxostat (100 nM), selama 30 minit sebelum hyp-oxia. Daya maju sel telah dinilai oleh ujian PrestoBlue⑧ (Invitrogen, A13261, dan A13262), dan kematian sel telah dinilai oleh ujian pengecualian Trypan Blue (Sigma, T8154-20 ML).

2.12. Pengesanan ROS mitokondria

Tahap superoksida mitokondria dikesan dengan pewarna fluorogenik (MitoSOXTM, Invitrogen M36008). Selepas rawatan, sel endothelial diinkubasi dengan 2 μmol/L MitoSox dalam medium kultur pada 37 darjah selama 10 minit. Kemudian sel-sel telah dibasuh dengan 1 × HBSS dua kali dan isyarat pendarfluor diukur (pembaca SpectraMax iD3, Peranti Molekul, Amerika Syarikat) dan dinormalisasi kepada daya maju sel.

2.13. Analisis imunoblotting

Sampel buah pinggang beku atau sel endothelial telah disaring dalam penimbal yang mengandungi 10 mmol/L Tris-HCl pH 8, 150 mmol/L NaCl, 5 mmol/L EDTA, 60 mmol/L N-octyl-glucoside, 1 peratus Triton X{{9 }}, koktel perencat protease, dan perencat protein fosfatase. Lisat sel atau tisu telah disentrifugasi selama 5 minit pada 10,000×g pada 4 darjah . Supernatan/protein dipindahkan ke dalam tiub baru dan dikira dengan menggunakan Bio-Rad

ujian protein. Ekstrak protein yang mengandungi jumlah protein yang setara telah dianalisis dengan menggunakan {{0}} peratus elektroforesis gel sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide(SDS-PAGE). Protein telah dipindahkan ke membran immobilon polyvinylidene difluoride selama 1 jam pada 300 mA. Membran telah disekat dalam 20mM Tris-HCl(pH7.4),150 mM NaCl, dan 0.1 peratus Tween 20 (TBS-T) yang mengandungi 5 peratus bebas lemak susu tepung selama 1 jam dan immunodetected dengan antibodi kepada anti-TFAM(1:2000, ab131607), anti-OXPHOS(1:1000, ab110413), anti-vinculin(1:5000, ab129002)(Abcam Cambridge, UK) dan anti -Cleaved caspase-3 (1:1000,#9664)(Teknologi Isyarat Sel, Beverly, MA, Amerika Syarikat). Semua antibodi sekunder untuk analisis imunoblot adalah daripada Teknologi Isyarat Sel. Untuk tompok Barat, imej yang tidak dipangkas, beranotasi, penuh dengan penanda MW ditunjukkan dalam Fail Tambahan.

2.14. Analisis statistik

Perbandingan berbilang antara kumpulan dianalisis dengan ANOVA satu atau dua hala diikuti dengan ujian post-hoc yang disyorkan. Data dibentangkan sebagai min ± SEM. Semua pengiraan statistik telah dibuat menggunakan Graphpad Prism 8.0. Kepentingan statistik ditakrifkan sebagai p<>