Bahagian1: Penurunan Kawal Selia Renal Hsa-miR-127-3p Menyumbang Kepada Pengaktifan Terlalu Banyak Laluan Isyarat Interferon Jenis I dalam Buah Pinggang Lupus Nefritis

Untuk maklumat lanjut. kenalantina.xiang@wecistanche.com

MikroRNA terlibat dalam patogenesis lupus erythematosus sistemik (SLE) dan disregulasi dalambuah pinggangpesakit lupus nefritis (LN), tetapi peranan patogen mereka dalam LN sebahagian besarnya tidak diketahui. Janus Kinase 1 (JAK1) mengantara pengaktifan laluan isyarat hiliran banyakradangsitokin, termasuk laluan isyarat interferon (IFN-I) jenis I yang penting untuk pembangunan SLE dan LN. Oleh itu, JAK1 adalah sasaran terapeutik yang kuat untuk inipenyakit autoimun. Walau bagaimanapun, terdapat beberapa kajian yang menunjukkan disregulasi JAK1 dalam penyakit autoimun dan mekanisme molekul di belakangnya. Dalam laporan ringkas ini, kami menunjukkan kesan perencatan hsa-miR-127-3p, mikroRNA yang dikurangkan dalam tisu buah pinggang pesakit LN, pada isyarat pada IFN-I. Kami mendapati ekspresi berlebihan hsa-miR-127-3p boleh menghalang induksi ekspresi gen pengantara ISRE dan GAS, fosforilasi STAT1 dan STAT2, dan pengawalseliaan gen rangsangan (ISG) IFN yang dirangsang oleh IFN-I. Manakala antagonis hsa-miR-127-3p meningkatkan pengaktifan isyarat IFN-I dalam sel mesangial renal primer. Selepas itu, kami mengenal pasti JAK1 sebagai gen sasaran bona fide hsa-miR-127-3p dan menunjukkan hsa-miR-127-3p JAK1 yang disasarkan melalui pengikatan pada rantau 3'UTR dan pengekodannya. Secara konsisten, kami mendapati pengawalseliaan rendah hsa-miR-127-3p dikaitkan dengan pengawalseliaan JAK1 dan ISG dalam tisu buah pinggang pesakit LN. Data kami menunjukkan penurunan renal hsa-miR-127-3p menyumbang kepada pengaktifan berlebihan laluan isyarat IFN-I dalam buah pinggang pesakit LN dengan mempromosikan ekspresi JAK1, mencadangkan hsa-miR-127-3p meniru boleh digunakan untuk menghalang laluan isyarat JAK1 dan IFN-I di LN.

Kata kunci: mikroRNA, hsa-miR-127-3p, interferon jenis I, Janus Kinase 1, lupus erythematosus sistemik, lupus nefritis
Maklumat yang dilampirkan:

Menurut data penyelidikan yang sedia ada dalam akademik, ia boleh dianggap bahawa fungsi imunoregulasi dan fungsi julap perubatan tradisional Cina.Cistanchemempunyai kepentingan klinikal yang besar untuk meningkatkan imuniti badan dan pemulihan pesakit dengan COVID-19. Peraturan fungsi imun oleh Cistanche terutamanya melalui perkara berikut:

Meningkatkan aktiviti fungsi sel imun badan (makrofaj, sel dendritik, sel T, sel B, sel pembunuh semulajadi (NK), dll.);

Meningkatkan pemprosesan antigen, fagositosis, dan fungsi membunuh sel imun; mengawal rembesan sitokin dan antibodi oleh sel imun;

Beberapa sarjana telah menjalankan penyelidikan mengenai Cistanchepolisakaridasebagai pembantu vaksin, dan mendapati polisakarida Cistanche boleh meningkatkan tindak balas imun selular tindak balas imun humoral vaksin virus influenza, menunjukkan bahawa polisakarida Cistanche boleh meningkatkan badanfungsi imun; Pakar telah mengesahkan bahawa ia juga mempunyai kesan positif terhadap peraturan imun.

Klik untuk mengetahui lebih lanjut mengenai akar dan ekstrak cistanche

PENGENALAN

Pengeluaran sitokinesis radang tertentu yang tidak sesuai dan berlebihan yang kritikal kepada perkembangan sistemik lupus erythematosus (SLE). Menyekat pengaktifan laluan isyarat hiliran sitokin patogen tersebut boleh menjadi strategi terapeutik yang menjanjikan untuk SLE(1). Selaras dengan tanggapan ini, antifrolumab, antibodi monoklonal kepada subunit reseptor interferon jenis I (IFN-I) 1 (IFNARl), telah terbukti menjanjikan dalam merawat SLE dengan menyekat pengaktifan laluan isyarat IFN-I(2) , yang penting kepada patogenesis SLE dan lupus nefritis(LN)(3).

Janus Kinases (JAKs) ialah kinase tyrosine, mengikat kepada domain intraselular reseptor sitokin, dan menghantar isyarat pengaktifan dengan memfosforilasi transduksi isyarat dan pengaktif transkripsi (STAT) faktor transkripsi (TF). Laluan isyarat JAK-STAT digunakan oleh banyak sitokin, seperti IFN-I, IL6, dan IL10, yang terlibat dalam patogenesis penyakit autoimun, termasuk SLE. Perencat JAK molekul kecil dengan keupayaan untuk menghalang berbilang laluan isyarat sitokin secara serentak telah dibangunkan untuk merawat penyakit autoimun(4). Nota, berbanding dengan perencat pan-JAK generasi pertama, kajian terkini menunjukkan bahawa perencat JAKI yang sangat selektif juga boleh mencapai keberkesanan terapeutik yang memuaskan untuk beberapa penyakit autoimun dengan risiko yang lebih rendah menyebabkan kesan buruk (4,5), menunjukkan peranan penting JAK1 dalam perkembangan penyakit autoimun. Walau bagaimanapun, kurang kajian telah memberi tumpuan kepada peraturan JAK1 semasa perkembangan penyakit autoimun, seperti dalam SLE atau LN.

MicroRNA(miRNA) ialah sejenis RNA bukan pengekodan kecil. Dengan pasangan asas pelengkap kawasan benih mereka ke 3'UTR atau kawasan pengekodan mRNA sasaran, miRNA mengenali dan menghalang ekspresi gen sasaran mereka, dan oleh itu mengawal fungsi biologi yang pelbagai(6). MiRNA telah diiktiraf sebagai pengawal selia kritikal tindak balas imun, dan disregulasi miRNA terlibat dalam patogenesis SLE (7). Profil miRNA buah pinggang kami yang terdahulu menemui banyak miRNA yang tidak terkawal dalam tisu buah pinggang pesakit LN (8). Walau bagaimanapun, fungsi miRNA yang tidak dikawal ini sebahagian besarnya tidak diketahui.

Di sini, kami menyaring 9 miRNA terkawal terpelihara dalam buah pinggang pesakit LN untuk peranan pengawalseliaan mereka dalam laluan isyarat IFN-I dan mengenal pasti hsa-miR-127-3p sebagai pengawal selia negatif bagi laluan isyarat IFN-I, dan mengesahkan peranan ini dalam sel mesangial buah pinggang. Kami membuktikan bahawa JAK1 ialah sasaran bona fide hsa-miR-127-3p. Data kami mencadangkan penurunan kawal selia hsa-miR-127-3p menyumbang kepada pengaktifan berlebihan laluan isyarat IFN-I dalam tisu buah pinggang pesakit LN, dan mimik hsa-miR-127-3p boleh berfungsi sebagai alternatif JAKl perencat dalam merawat LN.

BAHAN DAN KAEDAH

Reagen

Interferon jenis I universal adalah daripada Sistem R&D(Cat. 11200-1).miRNA mimik, kawalan mimik dan mutan hsa-miR-127-3p (5'UgccuagCGUCUGAGCUUGGCU3')adalah daripada Gene-

Pharma.Hsa-miR-127-3p antagomir adalah daripada ReboBio. Butiran plasmid adalah seperti berikut:

Plasmid wartawan pISRE- dan pGAS-luciferase adalah dari Makmal Clontech. Vektor psiCHECK2 dan pRL-TK adalah daripada Promega Biotech. dan vektor pcDNA3.1 adalah daripada Invitrogen.

Untuk pembinaan psiCHECK2-JAK1-3'plasmid wartawan UTR, serpihan (mengandungi ramalan tapak pengikat hsa-miR-127-3p) JAK manusia1 3'UTR ialah dikuatkan menggunakan teknik PCR standard (primer disenaraikan dalam Jadual S1) dan seterusnya dimasukkan ke dalam vektor psiCHECK2.

Untuk pembinaan psiCHECK2-JAK1-3'UTR-mutant reporter plasmid, ramalan tapak pengikat hsa-miR-127-3p (5'GATCTGA3')pada psiCHECK2-JAK 1-3'Plasmid wartawan UTR telah bermutasi kepada(5'CTAGACT3') menggunakan Kit KOD-Plus-Mutagenesis(TOYOBO)(primer disenaraikan dalam Jadual S1).

Untuk pembinaan pcDNA3.1-plasmid JAKlt, serpihan (mengandungi tapak pengikat hsa-miR-127-3p yang diramalkan) bagi kawasan pengekodan JAK1 manusia telah dikuatkan menggunakan teknik PCR standard (primer disenaraikan dalam Jadual S1)dan seterusnya dimasukkan ke dalam pcDNA3.1( tambah )-5'vektor HA.

Untuk pembinaan pcDNA3.1-plasmid mutan JAKlt, tapak pengikat hsa-miR-127-3p yang diramalkan (5tcgAtcGgaGcctcaaga aggAtcTggt3') pada pcDNA3.1-plasmid JAKlt telah dimutasi kepada (5 'tcgTtcCgaCcctcaagaaggTtcAggt3)menggunakan KOD-Plus-Mutagenesis Kit (TOYOBO) (primer disenaraikan dalam Jadual S1).

Semua plasmid telah disahkan dengan penjujukan.

Kultur sel

Sel Hela, sel HepG2 dan sel K562 adalah dari Bank Sel, Institut Sains Biologi Shanghai, Shanghai, China. Sel U4A dengan JAK1(9) bermutasi adalah hadiah daripada Y.Eugene Chin di Universiti Soochow. Sel-sel yang melekat (Hela, HepG2, dan U4A) telah dikultur dalam DMEM (Gibco) ditambah dengan 10 peratus FBS (Gibco) dan 100 ug/ml Penicillin-Streptomycin (Gibco). Sel penggantungan (K562) telah dibiakkan dalam RPMI 1640（Gibco） dengan 10 peratus FBS（Gibco） dan 100 ug/ml Penicillin-Streptomycin (Gibco). Sel mesangial renal manusia primer (HRMCs)(Cat. 4200, ScienCellTM Research Laboratories) telah dikultur dalam Mesangial Cell Medium (Cat.4201, ScienCellTM Research Laboratories) mengikut arahan pengilang. Semua sel dikekalkan pada 37 darjah dalam 5 peratus CO2.

Transfeksi dan Rangsangan

Untuk ujian wartawan luciferase, sel Hela atau HRMC telah disemai dalam 96-plat perigi dan ditransfeksi dengan wartawan ISRE-atau GAS-luciferase (100ng/telaga), plasmid pRL-TK (10ng/telaga) bersama-sama dengan miRNA yang ditunjukkan (100nM) atau antagomir (500nM) menggunakan Lipofectamine 2000(Invitrogen).12 jam kemudian, sel yang ditransfeksi telah dirangsang dengan interferon jenis I Universal (1000U/ml) selama 8 jam sebelum pengukuran.

Untuk pengesahan tapak sasaran hsa-miR-127-3p dalam 3'UTR mRNA JAK1, sel Hela telah disemai dalam 96-plat perigi dan ditransfeksi dengan psiCHECK2-JAK1-3 'UTR(atau psiCHECK2-JAK1-3'UTR-mutant atau psiCHECK2)plasmid(20ng/well)bersama-sama mimik miRNA yang ditunjukkan (100nM) menggunakan

Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Sel yang ditransfeksi telah dibiakkan selama 24 jam sebelum pengukuran.

Aktiviti Luciferase diukur dengan Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega Biotech) mengikut arahan.

Untuk pengesahan tapak sasaran hsa-miR-127-3p dalam kawasan pengekodan mRNA JAK1, sel U4A telah disemai dalam 6-plat perigi dan ditransfeksi dengan pcDNA3.1-JAKlt (atau pcDNA3. 1-JAK1t-mutant) plasmid(lug/well) bersama-sama dengan miRNA yang ditunjukkan (100nM) menggunakan Lipofectamine 2000(Invitrogen).

Untuk tujuan lain, sel Hela atau HRMC telah ditransfeksi dengan miRNA mimic (100nM) atau antagomir (500nM) menggunakan Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen).24 jam kemudian, sel yang ditransfeksi telah dirangsang dengan interferon jenis Universal I (1000U/ml) selama 6 jam. (untuk kuantifikasi mRNA atau microarray) atau selama 10 min atau 15 min (untuk western blot).

Kuantifikasi Ekspresi Gen

Jumlah RNA diekstrak dengan reagen TRIzol (Invitrogen). cDNA telah disintesis menggunakan kit reagen PrimeScript RT (Takara). Ekspresi gen dikira menggunakan kit SYBR Premix ExTaq (Takara). RPL13a digunakan sebagai gen rujukan untuk kuantifikasi mRNA. Ungkapan hsa-miR-127-3p dikira menggunakan kit TaqMan MicroRNA Assay (Applied Biosystems). RNU48 digunakan sebagai gen rujukan untuk kuantifikasi miRNA. Penguatan dilakukan pada Sistem PCR Masa Nyata ABI vii7 (Biosistem Gunaan). Ungkapan relatif telah dikira menggunakan kaedah 2-. Lipatan induksi dikira dengan membahagikan ungkapan relatif gen sampel dalam kumpulan eksperimen (miRNA meniru atau kumpulan transfeksi antagomir dengan rangsangan IFN-I) dengan ekspresi relatif gen yang sama bagi sampel kawalan yang tidak dirangsang (tiada pemindahan, tidak Rangsangan IFN-I). Primer disenaraikan dalam Jadual S2.

Penghapusan Barat

Lisat sel keseluruhan telah digunakan. Protein dipisahkan oleh 10 peratus SDS-PAGE, dipindahkan secara elektrik ke membran PVDF (EMD Millipore), dan disiasat dengan antibodi yang ditunjukkan. Band telah divisualisasikan dengan Pierce ECL Western Blotting Substrate (Thermo ScientificTM). Maklumat antibodi ada dalam Jadual S3.

Microarray

Jumlah RNA diekstrak dengan reagen TRIzol (Invitrogen) daripada sampel yang ditunjukkan dalam bahagian HASIL dan tertakluk kepada analisis microarray. Semua percubaan microarray telah dilakukan menggunakan tatasusunan Affymetrix U133 plus 2.0 oleh Shanghai Biotechnology Corporation. Secara ringkas, jumlah RNA telah diperiksa untuk nombor RIN untuk memeriksa integriti RNA oleh Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, AS). Jumlah RNA yang layak telah disucikan lagi oleh kit mikro RNeasy (Cat#74004, QIAGEN, GmBH, Jerman) dan Set DNase Tanpa RNase (Cat#79254, QIAGEN, GmBH, Jerman). Kemudian, sampel RNA telah dikuatkan, dilabel dan disucikan oleh GeneChip 3'IVT Express Kit(Cat#901229, Affymetrix, Santa Clara, CA, AS) mengikut arahan pengilang untuk mendapatkan cRNA berlabel biotin. Hibridisasi tatasusunan dan pencucian dilakukan menggunakan GeneChip①Hibridization, Wash and Stain Kit (Cat#900720, Affymetrix, Santa Clara, CA, US) dalam Hibridisasi

Oven 645(Cat#00-0331-220V,Affymetrix, Santa Clara, CA,US)dan Fluidics Station 450(Cat#00-0079, Affymetrix, Santa Clara, CA, US) mengikuti arahan pengeluar. Slaid telah diimbas oleh GeneChipScanner 3000(Cat#00-00212, Affymetrix, Santa Clara, CA, AS)dan Command Console Software 3.1 (Affymetrix, Santa Clara, CA, US) dengan tetapan lalai. Data mentah telah dinormalisasi oleh algoritma MAS5.0 dan diimport ke dalam Gene Spring Software 11.0 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, AS). Analisis ujian tidak berpasangan dengan pembetulan Benjamini-Hochberg digunakan untuk mendapatkan gen yang dinyatakan secara berbeza dengan nilai P yang diselaraskan<0.05. overlapping="" differentially="" expressed="" genes="" in="" ifn-α="" treated="" hela="" cells(upregulated="" or="" downregulated="" by="" 1.5-fold)="" between="" different="" comparison="" pairs="" (hsa-mir-127-3p="" mimics="" vs="" mock,="" hsa-mir-127-3p="" mimics="" vs="" negative="" control="" mimics,="" and="" hsa-mir-127-3p="" mimics="" vs="" hsa-mir-127-3p="" mutant="" mimics)="" were="" calculated.="" all="" the="" hsa-mir-127-3p="" inhibited="" genes="" were="" retrieved="" and="" subjected="" to="" the="" enrichment="" analysis="" of="" the="" cis-regulatory="" motifs="" at="" the="" upstream="" of="" these="" genes="" using="" the="" iregulon="" plugin="" on="" the="" cytoscape="" platform(10).="" the="" effect="" of="" hsa-mir-127-3p="" on="" the="" induction="" of="" the="" interferon-stimulated="" genes="" (isgs)from="" a21-gene="" ifnsignature="" (8)by="" ifn-α="" in="" hela="" cells="" was="" also="">

Ago2 Binding RNA Immunoprecipitation Sel Hela telah disemai dalam hidangan 10cm dan ditransfeksi dengan mutan hsa-miR-127-3p atau hsa-miR-127-3p pada kepekatan 100nM. Sel yang ditransfeksi dibiakkan semalaman. Kemudian sel-sel itu dibasuh dalam PBS sejuk dan dikikis. Imunopresipitasi telah diproses menggunakan EZ-Magna RIPRNA-Binding Protein Immunoprecipitation kit(Cat.17-701, Millipore) dan RIPAb plus Ago2(Cat. 03-110, Millipore).10 peratus daripada jumlah lisat digunakan sebagai input dan selebihnya 90 peratus daripada jumlah lisat digunakan untuk imunopresipitasi. Sampel RNA dari setiap kumpulan digunakan untuk mensintesis DNA pelengkap dengan kit reagen PrimeScript RT (Takara). Ungkapan JAK1 dikira menggunakan kit SYBR Premix ExTag (Takara). Ungkapan hsa-miR-127-3p dikira menggunakan kit TaqMan MicroRNA Assay (Applied Biosystems). Penguatan dilakukan pada Sistem PCR Masa Nyata ABI vii7 (Biosistem Gunaan). Urutan primer adalah dalam Jadual S2.

Sampel Buah Pinggang

Biopsi buah pinggang(n=14) diperoleh daripada biobank Hospital Ren Ji Shanghai. Persetujuan Termaklum bertulis diperoleh daripada semua pesakit. Kajian itu telah diluluskan oleh Lembaga Etika Penyelidikan Hospital Ren Ji Shanghai. Semua pesakit LN (kelas IV-V) memenuhi kriteria American College of Rheumatologi untuk LN(11). Sampel dalam kumpulan kawalan biasa (n=11) adalah daripada tisu renal para-karsinoma normal pesakit kanser buah pinggang (peringkat I-II) yang tidak mempunyai sejarah penyakit autoimun. Maklumat klinikal mengenai semua subjek telah diterangkan dalam kertas kami sebelumnya (8).

Perangkaan

Data dianalisis dan diplot dengan GraphPad Prism (versi 6.02). Ujian Mann-Whitney U dan analisis varians sehala (ANOVA) digunakan untuk perbandingan dua atau lebih kumpulan bebas. Ujian korelasi Spearman digunakan untuk kajian korelasi. Nilai P kurang daripada 0.05 dianggap signifikan secara statistik.