Bahagian Ⅰ The Iron Chelator, PBT434, Memodulasi Pemerdagangan Besi Transselular dalam Sel Endothelial Mikrovaskular Otak

Abstrak

Besi dan logam peralihan lain, seperti tembaga dan mangan, adalah penting untuk menyokong fungsi otak, namun pengumpulan berlebihan adalah sitotoksik. Pengumpulan berlebihan logam ini, terutamanya besi, adalah biasa kepada beberapa gangguan neurologi; ini termasuk penyakit Alzheimer, penyakit Parkinson, ataxia Friedrich, dan gangguan lain yang membawa kepada kemerosotan saraf dan pengumpulan besi otak yang berkaitan. Pengurusan fluks besi oleh penghalang darah-otak menyediakan barisan pertahanan pertama terhadap pengumpulan berlebihan besi dalam fisiologi normal dan keadaan patologi ini. Dalam kajian ini, kami menentukan bahawa chelator besi PBT434, yang kini sedang dibangunkan untuk rawatan penyakit Parkinson dan atrofi sistem berbilang, memodulasi pengambilan besi oleh sel endothelial mikrovaskular otak manusia (hBMVEC) dengan pengkelasi Fe ekstraselular.^{2 tambah}. Rawatan hBMVEC dengan PBT434 menghasilkan peningkatan dalam banyaknya transkrip untuk reseptor transferrin (TfR) dan ceruloplasmin (Cp). Analisis Western blot dan ELISA mendedahkan peningkatan yang sepadan dalam protein juga. Di dalam sel, PBT434 meningkatkan tahap amal, Fe labil yang boleh dikesan^{2 tambah}; data menunjukkan bahawa Fe ini^{2 tambah}dibebaskan daripada feritin. Di samping itu, PBT434 mempotensikan efluks besi mungkin disebabkan oleh peningkatan besi ferus sitosolik, substrat untuk pengeksport besi, ferroportin. PBT434 menyeimbangkan dengan cepat dan dua arah merentasi penghalang darah-otak hBMVEC. Keputusan ini menunjukkan bahawa kompleks besi PBT434-bukan substrat untuk pengambilan hBMVEC dan dengan itu menyokong model di mana PBT434 akan mengelat besi celahan dan menghalang pengambilan semula besi oleh sel endothelial penghalang darah-otak, seperti serta menghalang pengambilannya oleh sel-sel lain unit neurovaskular. Secara keseluruhannya, ini membentangkan mekanisme baru dan menjanjikan untuk chelation besi terapeutik.

Klik di sini untuk mendapatkanapakah kebaikan Cistanche

pengenalan

Terapi khelasi logam (MCT) telah lama digunakan sebagai rawatan untuk keracunan logam peralihan dan untuk gangguan genetik dalam metabolisme ion logam penting yang membawa kepada pengumpulan berlebihan logam [1-3]. Dua contoh yang terakhir ialah pengumpulan hiper kuprum dalam penyakit Wilson [4] dan besi dalam hemochromatosis keturunan [5]. Kedua-dua kuprum dan besi adalah pemangkin kepada tegasan oksidatif dan oleh itu adalah sitotoksik pada kepekatan yang melebihi keupayaan sel dan organisma untuk 'menolong' logam peralihan aktif redoks ini [6, 7]. Pengumpulan besi, khususnya, secara amnya adalah idiopatik; sesungguhnya, peningkatan zat besi adalah ciri otak yang semakin tua [8–10]. Secara patologi, pengumpulan besi otak ini adalah ciri mutasi dalam gen yang tidak berkaitan dengan metabolisme besi [11-15] serta pelbagai penyakit neurodegeneratif lain, beberapa daripadanya kekurangan pautan genetik tertentu seperti penuaan [16], Penyakit Alzheimer [16]. 17], Ataxia Friedreich [18] dan Penyakit Parkinson [19]. Sebagai satu kumpulan, gangguan tersebut boleh dianggap sebagai neurodegeneration dengan pengumpulan besi otak (NBIA) walaupun akronim ini biasanya terhad kepada mereka yang mana pautan genetik telah dikenalpasti [11, 13, 14].

Dalam kes lebihan besi, objektifnya adalah untuk 'membersihkan' badan daripada besi berlebihan akibat kecacatan dalam pengambilan atau pengeluaran besi sel. Di sini objektifnya adalah untuk mengalahkan chelator besi fisiologi dengan ubat; sebatian yang mempunyai farmakokinetik yang baik dan pertalian yang tinggi untuk besi ferus adalah ubat sasaran. Memandangkan badan terlalu penuh dengan logam penting, terdapat sedikit kebimbangan tentang menyebabkan kekurangan semasa rawatan. Merawat penyakit serebrum dengan terapi khelasi besi memerlukan strategi yang berbeza. Ini bukan masalah lebihan besi sistemik, tetapi pengumpulan besi di kawasan patologi dengan sekuela hiliran yang merosakkan. Pengumpulan besi yang berkaitan dengan usia dalam penyakit Parkinson (PD), misalnya, berpotensi menyumbang kepada kerosakan sel berkaitan tekanan oksidatif [20]. Besi labil yang berlebihan menggalakkan salah lipatan -synuclein dalam neuron substantia nigral. Penggunaan chelator pertalian tinggi boleh menyebabkan sedikit pengurangan dalam beban besi otak tetapi pastinya akan menyebabkan kekurangan zat besi yang pada populasi yang berumur, sekurang-kurangnya, adalah kontraindikasi memandangkan kekurangan zat besi sistemik yang biasa bagi kumpulan umur tersebut [21] . Chelator dengan pertalian optimum berpotensi untuk mengurangkan pengumpulan besi serta tekanan oksidatif atendan disebabkan oleh besi labil yang berlebihan dan proses penyakit yang mendasari.

Cistanche tubulosadanKesan Cistanche

Satu chelator yang diluluskan untuk digunakan dalam merawat beban besi yang disebabkan oleh transfusi dalam pesakit talasemia ialah deferiprone (DFP, jenama Ferriprox) [5, 22]. DFP juga telah digunakan dalam merawat ataxia Friedreich [23] dan penyakit Parkinson [24, 25]. Dalam meta-analisis, DFP telah ditunjukkan untuk memberikan pengurangan ketara dalam kandungan besi miokardium serta perlindungan jantung yang lebih besar dalam pesakit talasemia berbanding deferoxamine, agen pengkelat besi klasik [5]. Sebaliknya, DFP dimetabolismekan dengan pantas oleh hati [26] dan kerja yang lebih baru telah menunjukkan ia mengelat Fe2 ditambah di tapak aktif demetilases lisin histon bergantung kepada besi, satu aktiviti yang berkorelasi dengan sitotoksisiti yang tidak dikenali sebelum ini [27]. Penemuan ini menggariskan batasan utama dalam penggunaan terapi khelasi besi, iaitu persaingan oleh ubat untuk besi yang penting secara fisiologi, sama ada dalam simpanan besi atau protein yang mengandungi spesies besi prostetik. Walau bagaimanapun, DFP, sebagai contoh, telah menunjukkan keberkesanan dalam rawatan percubaan Fasa 2 bagi penyakit Parkinson seperti yang ditunjukkan oleh kedua-dua analitik (mengurangkan beban besi otak oleh T2- berwajaran MRI) dan indeks tingkah laku (fungsi neuron kognitif dan motor) [ 24, 25].

Walau bagaimanapun, perkaitan DFP untuk Fe3 plus masih menjadi kebimbangan. Spesies besi DFP yang stabil ialah kompleks tris, [Fe(DFP)3] 0 [28]. Walaupun neutraliti kompleks ini sesuai untuk menggerakkan besi keluar dari sel, pemalar kestabilan untuknya, ~1037, menjadikan DFP sebagai pemulung besi yang sebenar; dalam konteks ini, perencatan enzim besi seperti lysine demethylase boleh diramal [27]. Kebimbangan ini mencerminkan keperluan untuk membangunkan chelator besi yang mempunyai kebolehtelapan membran DFP tetapi pertalian yang jauh lebih lemah untuk kedua-dua Fe2 plus dan Fe3 plus. Ciri terakhir ini mengehadkan penghapusan dadah logam prostetik dan potensi termodinamik agen pengkelat untuk memangkinkan auto-pengoksidaan besi ferus yang mengakibatkan penghasilan spesies oksigen reaktif. Pada dasarnya, chelator besi ferik yang kuat memangkinkan sifat pro-oksidan Fe2 plus [29]. Dalam kajian ini, kami melaporkan bagaimana chelator besi seperti itu dengan pertalian besi ferik dan ferus sederhana memodulasi fluks besi dalam sel endothelial mikrovaskular otak yang membentuk penghalang darah-otak (BBB).

Pil cistanche

Ubat ini, PBT434 [5,7-dichloro-2-((methylamino)methyl)-8-hydroxy-3-methylquinazolin-4 (3H)-one, Rajah 1A] , membentuk kompleks bis-besi dengan pemalar kestabilan log ~11 dan ~15 untuk Fe^{2 tambah}dan Fe^{3 tambah}, masing-masing [30]. PBT434 menghalang kehilangan neuron substantia nigra pars compacta (SNpc), menurunkan pengumpulan nigral -synuclein, mengurangkan kandungan besi berkaitan model penyakit PD dalam otak tengah, dan menyelamatkan prestasi motor dalam dua model tetikus penyakit Parkinson tanpa sebarang kekurangan simpanan besi sistemik yang ketara. [30]. PBT434 juga berkesan dalam model murine Multiple System Atrophy (MSA) [30, 31], gangguan motor yang serupa dalam persembahan kepada Parkinson tetapi yang dicirikan oleh salah lipatan -synuclein dan pengumpulan seterusnya menyebabkan pembentukan kemasukan sitoplasma glial yang menjadi ciri khas. patologi penyakit [32]. Secara ketara, PBT434 mengurangkan penanda tekanan oksidatif dalam model PD tetikus [30] yang menunjukkan bahawa 1) PBT434 menyasarkan simpanan besi yang sebaliknya berfungsi sebagai pro-oksidan dan 2) PBT434 tidak mempotensiasi sitotoksisiti berasaskan pengoksidaan yang baru lahir ini. PBT434 telah menyelesaikan kajian Fasa 1 dengan memuaskan [33].

Kerja yang dibentangkan di sini direka untuk menyoal siasat kesan PBT434 terhadap pemerdagangan besi dalam sel penghalang otak, sel endothelial mikrovaskular yang bersama-sama dengan glia asas membentuk penghalang darah-otak. Kajian-kajian ini telah menggunakan garisan sel endothelial yang diabadikan dengan baik dalam kedua-dua format kultur monolayer dan transwell [34-37]. Objektif utama kajian ini adalah untuk menentukan kinetik pengambilan besi dan efluks daripada sel-sel ini dan modulasinya oleh PBT434. Model transwell BBB juga digunakan untuk menunjukkan fluks transselular PBT434 dwi-arah merentasi penghalang sel endothelial. Model ini menunjukkan dari segi molekul bahawa PBT434 menghalang pengambilan besi oleh chelation sambil merangsang pengeluaran besi. Kajian pengimejan sel menunjukkan bahawa PBT434 mengakses kolam besi labil yang sama yang disiasat oleh Fe klasik^{2 tambah}agen pengkelat, 2,2'-bipyridine atau bipyridyl, dan probe pendarfluor untuk besi ferus. Hasilnya mencadangkan mekanisme tindakan yang mungkin untuk PBT434 yang merangkumi perencatan pengambilan besi sistemik di BBB, dan penyerapan besi otak seterusnya di ruang interstisial.

Keputusan

1. PBT434 tidak mempunyai kesan sitotoksik pada sel endothelial mikrovaskular otak

Untuk menentukan julat kepekatan kerja yang sesuai untuk PBT434 dalam kultur sel in vitro kami, kami menggunakan ujian MTT untuk memantau fungsi mitokondria hBMVEC sebagai tindak balas kepada PBT434. Berdasarkan laporan terdahulu [30], telah dirawat dengan julat kepekatan PBT434 sehingga 100 μM selama 24 jam. Kami melihat tiada perubahan ketara dalam daya maju hBMVEC dengan sebarang kepekatan yang diuji (Rajah 2).

2. PBT434 cepat diambil dan diperdagangkan merentasi halangan hBMVEC

PBT434 adalah ubat bioavailable secara lisan yang mudah menembusi BBB, seperti yang dilihat dalam kajian yang dijalankan pada tikus dan manusia [30, 38, 39]. Kami memantau pengumpulan PBT434 dalam hBMVEC yang ditanam dalam lapisan tunggal menggunakan PBT434 berlabel 14C sebagai radiotracer. Data menunjukkan bahawa dalam fasa pertama, 14C-PBT434 dengan cepat diseimbangkan antara medium pengambilan dan sel. Pengambilan awal ini diikuti dengan pengumpulan perlahan tambahan selama 3 jam yang menunjukkan kadar 30.1 ± 9.8 pmol/mg/j (Rajah 3A). Dalam protokol pengambilan, pengambilan dipadamkan dan sel dibasuh pada suhu 4˚C sebelum diproses untuk pengumpulan 14C-PBT434 (Kaedah). Dalam percubaan berasingan, kami memeriksa efluks 14C-PBT434 daripada hBMVEC selepas tempoh pemuatan 30 minit. Dalam protokol efflux, sel dibasuh pada suhu 25˚C. Data dalam Rajah 3B menunjukkan bahawa dalam cucian 25˚C, kira-kira 92 peratus daripada 14C-PBT434 terkumpul sel telah hilang (cf 550 pmol 14C-PBT434/mg protein dalam 3A pada 30 minit hingga 43 pmol 14C-PBT434/mg protein pada t=0 dalam 3B). Terdapat kehilangan lebih perlahan bagi baki 14C-PBT434 (Rajah 3B). Data mencadangkan dua aspek pengumpulan dan pengeluaran PBT434 oleh hBMVEC. Fluks merentasi membran plasma dengan cepat mencapai apa yang kelihatan sebagai keseimbangan sama ada semasa pengambilan atau efluks. Walau bagaimanapun, dalam kedua-dua proses, terdapat proses lain yang lebih perlahan. Ini menunjukkan bahawa dalam sel, beberapa pecahan sel PBT434 berada dalam lokasi/keadaan yang berada dalam hubungan keadaan mantap kinetik dengan pecahan dalam keseimbangan dengan persekitaran ekstraselular. Analisis kinetik yang dinyatakan dalam Rajah 3B menganggarkan kumpulan PBT434 ini diwakili oleh protein 27±4 pmol/mg dalam lisat sel apabila sel dirawat dengan reagen 20 μM.

Untuk mengkaji fluks transselular PBT434, kami menggunakan model BBB in vitro yang disahkan dengan baik menggunakan telah berkembang pada sisi apikal membran transwell [35, 36, 40, 41]. Ciri-ciri penghalang kultur transwell ini telah disahkan dengan kuantifikasi rintangan elektrik transendothelial (TEER) dan kebolehtelapan kepada dextran berlabel FITC (S1 Fig). Kami membandingkan pengambilan 14C-PBT434 pada luminal (atau apikal, bahagian darah) (Rajah 4A) untuk pengambilan pada membran abluminal (atau basolateral, otak) (Rajah 4C). Dalam eksperimen yang sama, efluks yang sepadan (fluks transselular) dikira dengan penampilan 14C-PBT434 dalam ruang efluks (Rajah 4 panel B dan D). Kadar proses ini disediakan dalam Jadual 1. Data jisim yang digambarkan dalam Rajah 4 (panel B dan D) menunjukkan bahawa fluks bersih PBT434 merentasi halangan otak darah model ini adalah sama dalam dua arah. Terdapat 976±185 pmol 14C-PBT434 terkumpul dalam ruang basal (Rajah 4B) dan 1033±210 pmol dikira dalam ruang basal (Rajah 4D). Kesetaraan hampir ini juga ditunjukkan dalam kadar efluks PBT434 yang hampir sama pada dua membran penghalang (Jadual 1). Walau bagaimanapun, terdapat pengambilan PBT434 yang lebih besar pada membran basolateral dalam model penghalang ini seperti yang digambarkan oleh ~ 50 peratus kehilangan kompaun yang lebih besar daripada ruang basal (Rajah 4C) yang sepadan dengan ~ 40 peratus lebih besar kadar pengambilan sel yang jelas. (Jadual 1). Pengambilan yang lebih mantap akan diramalkan akan menghasilkan pengumpulan yang lebih besar. Analisis sel pada 3j menunjukkan bahawa mereka mengekalkan ~ 6 μM PBT434 tanpa mengira arah fluks. Nilainya ialah 8.1± 1.3 μM (apikal kepada basal) dan 4.7±1.2 μM (basal kepada apikal). Seperti yang dinyatakan di atas, analisis ini mengikuti pencucian sel sebelum lisis dan kuantifikasi jumlah protein sel dan 14C-PBT434. Selain itu, medium dalam ruang apikal mengandungi RPMI ditambah 10 peratus FBS dan 10 peratus NuSerum manakala ruang basal, 'otak' hanya mengandungi RPMI (Kaedah). Inferens yang munasabah ialah 'pengambilan' yang lebih besar pada membran basal mencerminkan penjerapan permukaan sel PBT434 yang dihadkan dalam ruang apikal dengan kehadiran komponen protein dalam serum. Selepas mencuci sel untuk pengumpulan PBT434, bahan terjerap ini (yang didaftarkan sebagai 'serapan') telah dialih keluar. Mengulangi eksperimen fluks ini tetapi dengan serum dalam ruang basal menunjukkan bahawa, sesungguhnya, serum menindas kemungkinan penjerapan PBT434 permukaan sel ini (S2 Fig).

3. PBT434, tidak seperti bipyridyl, tidak mengehadkan ketersediaan intraselular besi labil

Oleh kerana PBT434 mempunyai pertalian yang lebih sederhana untuk besi berbanding dengan chelator besi klasik seperti deferiprone atau bipyridyl, kami mengkaji bagaimana perbezaan itu dicerminkan dalam kesan PBT434 pada kolam besi labil selular (LIP) hBMVEC. Untuk melakukan ini, kami mengambil kesempatan daripada telap, Fe^{2 tambah}-pewarna pendarfluor khusus FerroOrange, yang bertindak balas dengan besi sitoplasma amal. Kami melihat ablasi pendarfluor yang ketara dalam sel apabila dirawat dengan bipyridyl, selaras dengan chelation LIP oleh chelator besi ferus pertalian tinggi ini dan dengan itu menyekat tindakan penunjuk besi pendarfluor (Rajah 5A). Sebaliknya, PBT434 tidak bersaing dengan FerroOrange untuk Fe^{2 tambah}, tingkah laku yang konsisten dengan pertalian yang lebih sederhana [30]. Keputusan menunjukkan bahawa PBT434, tetapi tidak PBT434-memenuhi derivatif tidak aktif, mendorong peningkatan 34 ± 9 peratus dalam Fe boleh diakses FerroOrange^{2 tambah}mencadangkan agen pengkelat ini menggerakkan besi dalam sel tanpa ketoksikan serentak. Data yang dibentangkan di bawah menunjukkan besi ini berasal dari feritin.

PBT434 ditunjukkan sebelum ini untuk memulihkan ekspresi protein ferroportin yang telah habis dalam tikus yang dirawat MPTP ke tahap yang serupa dengan tikus yang tidak berlesi [30]. Keputusan ini, bersama-sama dengan peningkatan pewarnaan besi ferus intrasel sebagai tindak balas kepada PBT434, mencadangkan kesan yang berpotensi pada sistem tindak balas besi selular dan fungsi protein berkaitan besi hiliran. Untuk menilai ini, kami mula-mula menjalankan analisis PCR (qPCR) kuantitatif kesan PBT434 pada banyaknya transkrip untuk beberapa protein pengendalian besi (Rajah 6). Walaupun transkrip untuk protein efluks besi, ferroportin (Fpn), dan dua pendamping besi sitoplasma, PCBP1 dan 2 tidak terjejas, banyaknya mRNA untuk reseptor transferrin (TfR), dan ferroxidase, ceruloplasmin (Cp), melakukan ubah. TfR dan transkrip Cp meningkat sebanyak 2.8 dan 3.6-kali ganda, masing-masing. Ekspresi reseptor transferrin (TfR) dikaitkan dengan sistem unsur tindak balas besi (IRE)/protein kawal selia besi (IRP) [42-44]. Peningkatan dalam mRNA TfR menunjukkan bahawa PBT434 bersaing dengan penghantaran besi bergantung{18}}PCBP untuk pemasangan gugusan Fe, S yang menukarkan IREBP pengawalseliaan daripada protein pengikat RNA kepada cytosolic aconitase [45]. Oleh itu, PBT434 mengalihkan modulasi pengawalseliaan ini ke arah pengikatan RNA dan perencatan yang sepadan dengan degradasi mRNA TfR. Dalam kekurangan zat besi sel, ungkapan Cp, sebahagiannya, dikawal oleh HIF-1 [46]. Peningkatan dalam fungsi HIF-1 berikutan daripada penurunan hidroksilasinya oleh aktiviti prolil hidroksilase dalam tindak balas bergantung kepada besi [47]. Seperti dalam kes IREBP, PBT434 nampaknya mengurangkan kumpulan besi yang berfungsi sebagai faktor bersama dalam hidroksilasi dan degradasi HIF{31}}. Dalam model ini, peningkatan dalam tahap mantap pengaktif transkrip ini meningkatkan transkripsi Cp.

Menggunakan gabungan analisis ELISA dan western blotting, kami menyiasat ekspresi protein pengendalian besi dalam PBT434 atau PBT434-memenuhi hBMVEC yang dirawat; contoh analisis WB diberikan dalam Rajah 7A. Data menunjukkan kelimpahan monomer dan dimer TfR meningkat dengan ketara sebanyak 24 jam seperti Cp (Rajah 7B dan 7C). Kedua-dua peningkatan selari dengan peningkatan bergantung PBT434-dalam transkrip masing-masing (Rajah 6), Sebaliknya, ungkapan protein efluks besi, Fpn, tidak sensitif terhadap rawatan PBT434 (Rajah 7D).

Kami menggunakan ELISA sebagai kaedah tambahan untuk mengukur perubahan lipatan yang ditunjukkan oleh data blot barat. Oleh itu, hBMVEC telah dirawat dengan PBT434 selama 24 jam dan lisat sel telah diuji oleh ELISA untuk TfR (Rajah 8A). Peningkatan kali ganda dalam TfR sebagai tindak balas kepada rawatan PBT434 yang dikira oleh ELISA adalah bersamaan dengan yang disediakan oleh analisis blot barat (Rajah 7B). ELISA juga digunakan untuk menilai kelimpahan protein Cp yang dirembeskan dan dikaitkan dengan GPI, menggunakan sel HepG2 sebagai kawalan positif. Mengenai Cp yang dirembeskan ke dalam media pertumbuhan, pendekatan ini terhad kerana kelimpahan sCp dalam kedua-dua media terkondisi HepG2 dan hBMVEC berada pada atau di bawah had sensitiviti yang lebih rendah bagi ujian ini (S3 Rajah). Walau bagaimanapun, ia membolehkan penilaian kelimpahan GPI-Cp. Dalam kaedah ini, sel telah dirawat dengan phosphatidylinositol-specific phospholipase C (PI-PLC), yang membelah penambat GPI; media yang dikondisikan telah ditumpukan dan dianalisis oleh Cp-ELISA. Walaupun pendekatan ini menunjukkan PBT434 meningkatkan jumlah GPI-Cp dalam sel HepG2, ia sekali lagi gagal untuk mengesan sebarang Cp yang dikeluarkan oleh PI-PLC (Rajah 8B). ELISA juga memberikan kaedah langsung untuk kuantifikasi feritin. Untuk berbuat demikian, hBMVEC dimuatkan dengan 1 uM Fe-citrate selama 24 jam, diikuti dengan rawatan tanpa kehadiran atau kehadiran PBT434 untuk tambahan 1 jam. Lisat sel yang terhasil tertakluk kepada analisis ELISA untuk feritin (Rajah 8C). Berbeza dengan peningkatan TfR, rawatan dengan PBT434 menurunkan protein feritin (Ft) sebanyak ~18 peratus . Sesungguhnya, kehilangan protein Ft ini nyata selepas hanya 1 jam rawatan dengan reagen. Sifat temporal hasil ini boleh dikaitkan dengan peningkatan Fe2 amal yang dinyatakan di atas berikutan rawatan 30 minit dengan PBT434. Seperti yang dibincangkan kemudian, ketukan feritin telah ditunjukkan berikutan rawatan dengan Fe2 kekal sel dan agen pengkelat yang lain [48].

4. ⁵⁵Fe^{2 tambah}pengambilan dihalang oleh kompleks dengan PBT434

Memandangkan keseimbangan pesat PBT434 dalam hBMVEC dalam masa 30 minit, berbanding dengan pengambilan yang perlahan, dwifasa dan keseimbangan Fe2 tambah selama 24j [49], kami membuat hipotesis bahawa PBT434 dan Fe2 plus tidak berkongsi mekanisme pengambilan yang sama. Untuk menguji ini, lapisan tunggal diinkubasi dengan 55Fe2 plus berlabel radio jika tiada atau kehadiran PBT434 atau PBT434-ditemui, dan pengambilan 55Fe2 tambah selama 3 jam dipantau (Rajah 9A). PBT434 dengan ketara mengurangkan kadar pengambilan 55Fe2 ditambah, serta mengurangkan pengumpulan keseluruhan 55Fe2 ditambah dalam lisat sel (Rajah 9C). Kesan ini tidak dilihat dengan PBT434-ditemui. Perbandingan kadar pengambilan PBT434 hingga 55Fe menunjukkan bahawa PBT434 dan Fe2 plus diambil oleh laluan pengangkutan yang berasingan. Tambahan pula, perencatan pengambilan 55Fe dengan kehadiran PBT434 tetapi tidak PBT434-met menunjukkan bahawa kompleks besi PBT434-ekstraselular bukanlah ligan untuk pengangkut besi ferus dalam hBMVEC, iaitu ZIP8, dan ZIP14.

Suplemen cistanche

Untuk mengkaji lebih lanjut peranan PBT434 dalam pengumpulan besi, kami menguji kesan prapendedahannya terhadap pengambilan 55Fe2 ditambah. Sel pra-rawatan dengan PBT434 yang, selepas dibasuh, terdedah kepada 55Fe2 plus menunjukkan peningkatan dalam kadar pengambilan dan pengumpulan 55Fe2 tambah selepas 3h (Rajah 9, panel B dan D). Pengumpulan yang meningkat ini dikekalkan sekurang-kurangnya 24 jam. Data ini mencadangkan bahawa pra-pendedahan sel kepada PBT434 secara sementara mempotensiasi pengambilan besi. Tanpa diduga, PBT434-memenuhi pra-rawatan juga menunjukkan peningkatan dalam kedua-dua pengambilan dan pengumpulan (Rajah 9B), tetapi kesan ini tidak begitu ketara atau berterusan seperti yang ditunjukkan oleh PBT434.

Kami telah menunjukkan bahawa pengambilan besi daripada 59Fe-transferrin disokong oleh pengurangan ferri dan resapan fero pada membran plasma have [50, 51]. Satu hasil eksperimen untuk menyokong model pengambilan besi TBI ini ialah ketukan pengambilan ini dengan menghalang aktiviti ferrireductase ekstra-sitoplasma; keputusan lain ialah perencatan 60 peratus pengambilan besi TBI oleh ferrozine, agen pengkelat besi ferus yang kuat [50]. Strategi terakhir ini digunakan untuk menunjukkan bahawa PBT434, tetapi tidak PBT{10}}ditemui, juga menghalang pengambilan besi TBI (Rajah 10).

5. PBT434 merangsang 55Fe2 yang bergantung kepada Fpn ditambah efluks

PBT434 mempunyai kira-kira 20 peratus keupayaan deferiprone untuk menghasilkan rangsangan jelas Fe2 ditambah efluks daripada sel neuron [30]. Kami menilai efluks 55Fe2 plus dari hBMVEC jika tiada atau kehadiran PBT434 dalam sel kawalan atau sel yang dirawat dengan mini-hepcidin, PR73. Hepcidin ialah hormon peptida yang ditemui secara sistemik dan dalam interstitium otak yang mengikat Fpn dan menyasarkan pengangkut untuk degradasi. Kesan hepcidin pada fungsi eksport besi Fpn telah dikaji secara meluas [52-54]. Kami sebelum ini telah menunjukkan efluks Fe2 plus dari hBMVEC adalah bergantung kepada Fpn [35, 49]. PR73 mempunyai EC50 ~4 nM untuk kemerosotan Fpn dalam ujian wartawan GFP [55]. hBMVEC dalam lapisan tunggal dimuatkan dengan 55Fe2 ditambah selama 24 jam tanpa kehadiran atau kehadiran PR73. 55Fe-efflux kemudiannya dikira dalam tempoh 5 jam dalam ketiadaan berterusan atau kehadiran PR73 dalam kombinasi dengan ketiadaan dan kehadiran PBT434 (Rajah 11). Walaupun PR73 menumbangkan efluks 55Fe daripada kedua-dua kultur kawalan dan PBT434-yang dirawat, PBT434 menghalang sebahagian daripada perencatan disebabkan oleh mini-hepcidin. Dengan ketiadaan PBT434, efluks besi daripada kultur yang dirawat73-PR telah dirobohkan sebanyak ~75 peratus manakala kejatuhan dalam kultur yang dirawat434-PBT hanya ~50 peratus (Rajah 11 dan Jadual 2). Dua inferens boleh dibuat daripada keputusan ini. Pertama, kejatuhan Fpn oleh PR73 mengawal ke bawah 55Fe-efflux dengan kehadiran serta ketiadaan PBT434. Kedua, di bawah kedua-dua keadaan, PBT434 menyokong rangsangan pengeluaran besi yang ketara walaupun kecil.

Rujukan

1. Hatcher HC, Singh RN, Torti FM, Torti SV. Chelator besi sintetik dan semulajadi: potensi terapeutik dan penggunaan klinikal. Med Chem Masa Depan. 2009; 1(9):1643–70.

2 . Nuñez MT, Chana-Cuevas P. Perspektif Baharu dalam Terapi Chelation Besi untuk Rawatan Penyakit Neurodegeneratif. Farmaseutikal (Basel). 2018; 11(4):109.

3. Tosato M, Di Marco V. Terapi Pengkelasi Logam dan Penyakit Parkinson: Kajian Kritikal tentang Termodinamik Pembentukan Kompleks antara Ion Logam Berkaitan dan Dadah yang Menjanjikan atau Diwujudkan. Biomolekul. 2019; 9(7).

4. Hedera P. Kemas kini mengenai pengurusan klinikal penyakit Wilson. Appl Clin Genet. 2017; 10:9–19.

5. Xia S, Zhang W, Huang L, Jiang H. Keberkesanan perbandingan dan keselamatan deferoxamine, deferiprone dan deferasirox pada talasemia teruk: meta-analisis 16 ujian terkawal rawak. PLoS One. 2013; 8(12):e82662.

6. Buettner GR, Jurkiewicz BA. Logam pemangkin, askorbat, dan radikal bebas: kombinasi yang perlu dielakkan. Radiat Res. 1996; 145(5):532–41. PMID: 8619018

7. Singh A, Kukreti R, Saso L, Kukreti S. Tekanan Oksidatif: Modulator Utama dalam Penyakit Neurodegeneratif. Molekul. 2019; 24(8).

8. Ashraf A, Clark M, So PW. Penuaan Iron Man. Neurosci Penuaan Depan. 2018; 10:65.

9. Ghadery C, Pirpamer L, Hofer E, Langkammer C, Petrovic K, Loitfelder M, et al. Pemetaan R2* untuk besi otak: persatuan dengan kognisi dalam penuaan normal. Penuaan Neurobiol. 2015; 36(2):925–32.

10. Zecca L, Youdim MBH, Riederer P, Connor JR, Crichton RR. Besi, penuaan otak, dan gangguan neurodegeneratif. Nat Rev Neurosci. 2004; 5(11):863–73.

11. Di Meo I, Tiranti V. Klasifikasi dan patogenesis molekul sindrom NBIA. Eur J Paediatr Neurol. 2018; 22(2):272–84.

12. Levi S, Finazzi D. Neurodegeneration dengan pengumpulan besi otak: kemas kini mengenai mekanisme patogenik. Pharmacol Depan. 2014; 5:99–.

13. Levi S, Tiranti V. Neurodegeneration dengan Gangguan Pengumpulan Besi Otak: Model Berharga Bertujuan Memahami Patogenesis Pemendapan Besi. Farmaseutikal (Basel). 2019; 12(1).

14. Meyer E, Kurian MA, Hayflick SJ. Neurodegeneration dengan Pengumpulan Besi Otak: Kepelbagaian Genetik dan Mekanisme Patofisiologi. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2015; 16:257–79.

15. Tonekaboni SH, Mollamohammadi M. Neurodegeneration dengan pengumpulan besi otak: gambaran keseluruhan. Iran J Kanak-kanak Neurol. 2014; 8(4):1–8. PMID: 25657764

16. Cozzi A, Orellana DI, Santambrogio P, Rubio A, Cancellieri C, Giannelli S, et al. Pemodelan Sel Stem Neuroferritinopati Mendedahkan Besi sebagai Penentu Senescence dan Ferroptosis semasa Penuaan Neuronal. Laporan Sel Stem. 2019; 13(5):832–46.

17. Liu JL, Fan YG, Yang ZS, Wang ZY, Guo C. Penyakit Besi dan Alzheimer: Daripada Patogenesis kepada Implikasi Terapeutik. Neurosci hadapan. 2018; 12:632.

18. Llorens JV, Soriano S, Calap-Quintana P, Gonzalez-Cabo P, Molto MD. Peranan Besi dalam Ataxia Friedreich: Pandangan Daripada Kajian dalam Tisu Manusia dan Model Selular dan Haiwan. Neurosci hadapan. 2019; 13:75.

19. Puschmann A. Gen Baru Menyebabkan Penyakit Parkinson Keturunan atau Parkinsonisme. Curr Neurol Neurosci Rep. 2017; 17(9):66.

20. Crielaard BJ, Lammers T, Rivella S. Mensasarkan metabolisme besi dalam penemuan dan penghantaran ubat. Nat Rev Drug Discov. 2017; 16(6):400–23.

21. Guralnik JM, Eisenstaedt RS, Ferrucci L, Klein HG, Woodman RC. Kelaziman anemia pada orang 65 tahun dan lebih tua di Amerika Syarikat: bukti untuk kadar anemia yang tidak dapat dijelaskan yang tinggi. Darah. 2004; 104 (8):2263–8.

22. Pepe A, Meloni A, Capra M, Cianciulli P, Prossomariti L, Malaventura C, et al. Rawatan deferasirox, deferiprone dan desferrioxamine dalam pesakit talasemia utama: besi jantung dan perbandingan fungsi ditentukan oleh pengimejan resonans magnetik kuantitatif. Hematologica. 2011; 96(1):41–7.

23. Pandolfo M, Arpa J, Delatycki MB, Le Quan Sang KH, Mariotti C, Munnich A, et al. Deferiprone dalam Friedreich ataxia: 6-percubaan terkawal rawak sebulan. Ann Neurol. 2014; 76(4):509–21.

24. Martin-Bastida A, Ward RJ, Newbould R, Piccini P, Sharp D, Kabba C, et al. Pengkelat besi otak oleh deferiprone dalam percubaan klinikal terkawal plasebo dua buta fasa 2 rawak dalam penyakit Parkinson. Sci Rep. 2017; 7(1):1398.

25. Devos D, Moreau C, Devedjian JC, Kluza J, Petrault M, Laloux C, et al. Menyasarkan zat besi kelat sebagai modaliti terapeutik dalam penyakit Parkinson. Isyarat Redoks Antioksida. 2014; 21(2):195–210. https://doi. org/10.1089/ars.2013.5593 PMID: 24251381

26. Singh S, Epemolu RO, Dobbin PS, Tilbrook GS, Ellis BL, Damani LA, et al. Profil metabolik kencing pada manusia dan tikus 1,2-dimetil dan 1,2-diganti 3-hidroksi piridin-4-yang. Metabolisme dan Pelupusan Dadah. 1992; 20(2):256. PMID: 1352218

27. Khodaverdian V, Tapadar S, MacDonald IA, Xu Y, Ho PY, Bridges A, et al. Deferiprone: Kajian Hubungan Aktiviti Perencatan Histon Lysine Demethylase Pan-selektif dan Kajian Hubungan Aktiviti Struktur. Sci Rep. 2019; 9(1):4802.

28. Hider R. Perkembangan terkini tertumpu pada chelator besi aktif secara lisan. Laporan Talasemia. 2014; 4 (2).

29. Kosman DJ. Metabolisme besi dalam aerobes: menguruskan hidrolisis besi ferik dan autooksidasi besi ferus. Coordinat Chem Rev. 2013; 257(1):210–7.

30. Finkelstein DI, Billings JL, Adlard PA, Ayton S, Sedjahtera A, Masters CL, et al. Kompaun novel PBT434 menghalang neurodegenerasi pengantara zat besi dan ketoksikan alpha-synuclein dalam pelbagai model penyakit Parkinson. Acta Neuropathol Commun. 2017; 5(1):53.

31. Heras-Garvin A, Refolo V, Schmidt C, Bradbury M, Stamler D, Stefanova N, editor. PBT434 Memelihara Neuron Dopaminergik, Mengurangkan Oligomerisasi alpha-Synuclein, dan Meningkatkan Fungsi Motor dalam Model Atrofi Sistem Berbilang Murine Transgenik. Annals of Neurology; 2020: Wiley 111 River St, Hoboken 07030–5774, NJ USA.

32. Heras-Garvin A, Stefanova N. MSA: Dari mekanisme asas kepada terapeutik eksperimen. Gangguan Berkaitan Parkinsonisme. 2020; 73:94–104.

33. Dawson VL, Dawson TM. Menjanjikan terapi pengubahsuaian penyakit untuk penyakit Parkinson. Perubatan Translasi Sains. 2019; 11(520):eaba1659.

34. Eigenmann DE, Xue G, Kim KS, Moses AV, Hamburger M, Oufir M. Kajian perbandingan empat garisan sel endothelial kapilari otak manusia yang diabadikan, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, dan BB19, dan pengoptimuman keadaan kultur, untuk model penghalang darah-otak in vitro untuk kajian kebolehtelapan dadah. Cecair dan Halangan CNS. 2013; 10(1):33.

35. McCarthy RC, Kosman DJ. Seruloplasmin sel glial dan hepcidin secara berbeza mengawal pengeluaran besi daripada sel endothelial mikrovaskular otak. PLoS One. 2014; 9(2):e89003.

36. Steimle BL, Smith FM, Kosman DJ. Pembawa zat terlarut ZIP8 dan ZIP14 mengawal pengumpulan mangan dalam sel endothelial mikrovaskular otak dan mengawal tahap mangan otak. J Biol Chem. 2019; 294(50):19197–208.

37. Stins MF, Badger J, Sik Kim K. Pencerobohan bakteria dan transcytosis dalam sel endothelial mikrovaskular otak manusia yang ditransfeksi. Pathog Mikrob. 2001; 30(1):19–28.

38. Stamler D, Bradbury M, Wong C, Offman E. A First in Human Study of PBT434, Novel Small Molecule Inhibitor of -Synuclein Aggregation (S4.001). Neurologi. 2019; 92(15 Tambahan):S4.001.

39. Stamler D, Bradbury M, Wong C, Offman E. Kajian Fasa 1 PBT434, Perencat Molekul Kecil Novel bagi -Synuclein Aggregation, dalam Sukarelawan Dewasa dan Dewasa Tua (4871). Neurologi. 2020; 94(15 Tambahan):4871.

40. McCarthy RC, Kosman DJ. Pengaktifan ekspresi ceruloplasmin sel glioblastoma C6 oleh interleukin yang berasal dari endothelia otak manusia jiran dalam sistem model penghalang darah-otak in vitro. Komunikasi dan Isyarat Sel: CCS. 2014; 12:65.

41. McCarthy RC, Park YH, DJ Kosman. sAPP memodulasi pengeluaran besi daripada sel endothelial mikrovaskular otak dengan menstabilkan ferroportin pengeksport besi ferus. Laporan EMBO. 2014; 15(7):809–15. https://doi. org/10.15252/embr.201338064 PMID: 24867889

42. Hentze MW, Muckenthaler MU, Galy B, Camaschella C. Two to Tango: Peraturan Metabolisme Besi Mamalia. sel. 2010; 142(1):24–38. https://doi.org/10.1016/j.cell.2010.06.028 PMID: 20603012

43. Zhou ZD, Tan EK. Laluan isyarat protein pengawalseliaan besi (IRP) -elemen tindak balas besi (IRE) dalam penyakit neurodegeneratif manusia. Neurodegenerasi Molekul. 2017; 12(1):75. https://doi.org/10. 1186/s{10}} PMID: 29061112

44. Crichton RR, Dexter DT, Ward RJ. Metabolisme besi otak dan gangguannya dalam penyakit saraf. J Transm Neural. 2011; 118(3):301–14. https://doi.org/10.1007/s00702-010-0470-z PMID: 20809066

45. Patel SJ, Frey AG, Palenchar DJ, Achar S, Bullough KZ, Vashisht A, et al. Kompleks pendamping PCBP1-BolA2 menghantar besi untuk pemasangan kluster [2Fe-2S] sitosol. Nat Chem Biol. 2019; 15(9):872–81. https://doi.org/10.1038/s41589-019-0330-6 PMID: 31406370

46. ​​Mukhopadhyay CK, Mazumder B, Fox PL. Peranan faktor boleh aruh hipoksia-1 dalam pengaktifan transkrip ceruloplasmin oleh kekurangan zat besi. J Biol Chem. 2000; 275(28):21048–54.

47. Strowitzki MJ, Cummins EP, Taylor CT. Hidroksilasi Protein oleh Hypoxia-Inducible Factor (HIF) Hydroxylases: Unik atau Ada di mana-mana? sel. 2019; 8(5).

48. De Domenico I, Vaughn MB, Li L, Bagley D, Musci G, Ward DM, et al. Mobilisasi feritin dengan pengantara feritin mendahului degradasi feritin oleh proteasome. Embo j. 2006; 25(22):5396–404.

49. McCarthy RC, Kosman DJ. Aktiviti feroportin dan exocytoplasmic ferroxidase diperlukan untuk pengeluaran besi sel endothelial mikrovaskular otak. Jurnal Kimia Biologi. 2013; 288(24):17932– 40.

50. McCarthy RC, Kosman DJ. Analisis mekanistik pengumpulan besi oleh sel endothelial BBB. Biologam. 2012; 25(4):665–75.

51. Kosman DJ. Telos pengurangan Metallo dan pengoksidaan metalo dalam pemerdagangan besi dan tembaga eukariotik. Metallomik. 2018; 10(3):370–7. https://doi.org/10.1039/c8mt00015h PMID: 29484341

52. Aschemeyer S, Qiao B, Stefanova D, Valore EV, Sek AC, Ruwe TA, et al. Analisis struktur-fungsi ferroportin mentakrifkan tapak pengikatan dan mekanisme alternatif tindakan hepcidin. Darah. 2018; 131(8):899–910.

53. Ganz T, Nemeth E. Hepcidin dan homeostasis besi. Biochim Biophys Acta. 2012; 1823(9):1434–43.

54. Qiao B, Sugianto P, Fung E, Del-Castillo-Rueda A, Moran-Jimenez MJ, Ganz T, et al. Endositosis ferroportin yang disebabkan oleh Hepcidin bergantung kepada ubiquitination ferroportin. Metab Sel. 2012; 15(6):918–24.

55. Fung E, Chua K, Ganz T, Nemeth E, Ruchala P. Minihepcidin terbitan Thiol mengekalkan aktiviti biologi. Bioorg Med Chem Lett. 2015; 25(4):763–6.

Danielle K. BaileyID, Whitney Clark, Daniel J. Kosman

Jabatan Biokimia, Sekolah Perubatan dan Sains Bioperubatan Jacobs, Universiti Negeri New York di Buffalo, Buffalo, NY, Amerika Syarikat