Bahagian Ⅱ: Ekspresi Berlebihan PKD1 Menyebabkan Penyakit Buah Pinggang Polikistik

Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com

Caroline Thivierge, Almira Kurbegovic, Martin Couillard, Richard Guillaume, Olivier Coté, dan Marie Trudel

Mekanisme patogenetik yang mendasaridominan autosomal penyakit buah pinggang polikistik(ADPKD) masih perlu dijelaskan. Walaupun terdapat bukti bahawa PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) haploinsufficiency gen dan kehilangan heterozigositas boleh menyebabkan pembentukan sista pada tikus, paras PKD1 yang paradoks tinggi (penyakit buah pinggang polikistik 1) ekspresi telah dikesan dalam buah pinggang pesakit ADPKD (penyakit buah pinggang polikistik dominan autosomal). Untuk menentukan sama ada PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) perolehan fungsi boleh menjadi proses patogenetik, PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) kromosom tiruan bakteria PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1)-BAC) telah diubah suai oleh penggabungan semula homolog untuk menyasarkan PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) ekspresi lebih disukai kepada buah pinggang dewasa. Beberapa talian transgenik telah dihasilkan yang secara khusus mengekspresikan PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) transgen dalam buah pinggang 2- kepada 15-lipat di atas PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik1) tahap endogen. Semua tikus transgenik menghasilkan semula sista tiub dan glomerular dan kekurangan buah pinggang dan mati akibat kegagalan buah pinggang. Model ini menunjukkan bahawa ekspresi berlebihan PKD1 jenis liar (penyakit buah pinggang polikistik 1) sahaja sudah memadai untuk mencetuskan cystogenesis menyerupai ADPKD manusia (dominan autosomalpenyakit buah pinggang polikistik). Keputusan kami juga menemui peningkatan ekspresi c-Myc buah pinggang yang ketara dalam tikus dari semua garis transgenik, menunjukkan bahawa c-Myc adalah pengesan hiliran vivo yang kritikal bagi PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) laluan molekul. Kajian ini bukan sahaja menghasilkan PKD yang tidak ternilai dan pertama（penyakit buah pinggang polikistik）model untuk menilai patogenesis dan terapi molekul tetapi juga memberikan bukti bahawa peningkatan fungsi boleh menjadi mekanisme patogenetik dalam ADPKD (penyakit buah pinggang polikistik dominan autosomal).

Cistanche merawat penyakit buah pinggang

KLIK DI SINI UNTUK BAHAGIAN Ⅰ

KEPUTUSAN

Pengeluaran PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1)-Ac-BAC oleh penggabungan semula homolog. Untuk menentukan sama ada PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) keuntungan fungsi sahaja sudah memadai untuk menghasilkan fenotip ADPKD (penyakit buah pinggang polikistik dominan autosomal), kami mula-mula mengasingkan klon genomik yang mengandungi keseluruhan PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) gen dalam perpustakaan vektor BAC 129/Sv. Perpustakaan ini telah disaring oleh PCR dengan dua set primer untuk PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) gen yang merentangi exon 1 pada hujung 5' dan exon 39 hingga 40 ke arah hujung 3'(Rajah 1). Klon BAC positif untuk PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) telah dikenalpasti termasuk keseluruhan badan gen Tsc2 yang bersebelahan. Sisipan PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) dicirikan secara terperinci untuk memastikan bahawa struktur genom sepadan dengan PKD1 endogen (penyakit buah pinggang polikistik1) gen strain tikus 129/Sv dari mana sisipan itu diperoleh dan daripada strain inbred C57BL/6J. Peta genom PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) lokus dalam BAC dan dalam strain inbred ini oleh analisis Southern blot, dengan empat pencernaan enzim sekatan dan tujuh probe meliputi keseluruhan PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1)gen, kelihatan sama tanpa bukti penyusunan semula (Rajah 1). BAC ini mengandungi sisipan -121-kb termasuk ~37 kb huluan dan -39 kb jujukan hiliran PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik1) gen seperti yang ditentukan oleh elektroforesis dan penjujukan.

Gbr. 2.Pengeluaran konstruk SBPkdlrAc dan tikus transgenik. (a) Peristiwa penggabungan semula homolog berturut-turut telah dijalankan pada murine Pkdl-BAC untuk memperkenalkan dua pengubahsuaian: elemen pengawalseliaan SB dimasukkan serta-merta di hulu kodon permulaan Pkdl dan mutasi titik senyap EcoRI (RI*) yang diperkenalkan dalam exon(ex) 10. Vektor penggabungan semula BAC mengandungi asal replikasi R6Ky, gen tahan ampisilin, gen SacB, gen RecA dan tapak pengklonan Smal yang unik di mana elemen pengawalseliaan "SB" (atau mutasi titik senyap exon 10) telah diklon dengan mengapit lengan gen Pkd1. Vektor penggabungan semula BAC telah dielektroporasi ke dalam sel E, coli (DH10B) yang mengandungi jenis liar Pkdl-BAC, dan berikutan pemilihan peristiwa penggabungan semula homolog pertama berlaku melalui salah satu daripada dua lengan Pkd1 untuk menghasilkan kointegrasi BAC. Vektor penggabungan semula dan kawasan Pkdl pendua bagi kointegrasi BAC telah dihapuskan dalam langkah pemilihan kedua. Pkdl-BAC yang diselesaikan boleh sama ada kembali kepada jenis liar atau menyertakan pengubahsuaian yang dimaksudkan. Penggabungan semula homolog seterusnya ke dalam BAC yang baru diubah suai kemudiannya boleh diperkenalkan.(b)(ienomc DNA ot SBPkd l-etransgenik mxce was anakZed bv Sou then blot.AVicToiD1ecLon of linearized fragments menyebabkan pemasukan transgen dalam head-to-head. head. -ke-ekor, dan/atau orientasi ekor-ke-ekor. Hujung 5'dianalisis dengan pencernaan DNA genom dengan HindIII dan dihibridkan dengan probe SB transgen khusus (panel kiri). Ketiga-tiga garisan tetikus transgenik menjana 10 yang dijangkakan .9-jalur kb untuk sisipan kepala ke ekor; jalur tambahan yang diperhatikan dalam baris 39 berkemungkinan besar mewakili serpihan simpang antara SB dan genom tetikus. Keutuhan dalaman transgen dipantau oleh beberapa pencernaan enzim sekatan, dan satu tompok wakil DNA genomik yang dicerna dengan EcoRI dan dihibridkan dengan probe Pkdl (exon 7-15) ditunjukkan (panel tengah).

SBPKD1 ini (penyakit buah pinggang polikistik 1Klon )-BAC telah diubah suai oleh dua peristiwa penggabungan semula homolog berturut-turut dalam E. coli. Gen PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) telah ditandakan dalam exon 10 dengan menggantikan nukleotida (G ke A) untuk mencipta tapak EcoRI novel pada kedudukan 2355 pada peta cDNA. Mutasi titik senyap ini dihasilkan untuk membezakan PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) gen dan transkrip BAC daripada asal endogen. Di samping itu, kami telah menggantikan 5'elemen kawal selia PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1Gen )-BAC dengan mengambil kesempatan daripada unsur-unsur khusus epitelium renal "SB" yang dikenal pasti sebelum ini daripada SBM(dipautkan kepada c-Myc) atau SBF yang dikaitkan dengan c-fos) construct-trans-gen untuk menyekat ekspresi kepada buah pinggang(36, 38)(Gamb. 2a).

SBPkdlrAG-BAC baharu ini telah dihadam dengan NotL, tapak unik yang terletak serta-merta di hulu unsur SB, dan ClaI dalam badan gen Tsc2, memotong elemen pengawalseliaan Tsc2 dan 5'separuh badan gen untuk memastikan kekurangan T'sc2 ekspresi eksogen dalam semua tisu dan untuk mengeluarkan jujukan vektor BAC prokariotik (Rajah 1 dan 2). Serpihan linear 70-kb NotI-ClaI ini telah diasingkan, disucikan. dan dikira untuk suntikan mikro oosit (36).

KEBAIKAN CISTANCHE: MERAWAT PENYAKIT BUAH PINGGANG

Pengeluaran dan analisis tikus transgenik SBPkdl-ac. Empat pengasas transgenik yang membawa beberapa salinan transgene SBPkdlrAc secara konsisten membangunkan PKD. Daripada empat SPKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1)Tikus pengasas RAC ditentukan oleh analisis Selatan, tiga SBPKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) Talian transgenik TAG telah diwujudkan dengan dua hingga sembilan salinan transgen (Rajah 2b). Pencirian integriti transgen dalam baris ini dipantau dengan probe 5', dalaman dan 3' seperti yang ditunjukkan oleh contoh perwakilan dalam Rajah.2b. Garisan transgenik yang didedahkan dengan jalur probe 5'"SB" pada 10.9 kb selaras dengan SBPkdlrAc gen trans disepadukan dalam orientasi kepala ke ekor dan didedahkan dengan kuar 3' jalur 7.1-kb (Gamb.2b). Selain itu, siasatan dalaman mengesan jalur 9.4-kb endogen PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) serta jalur 6.9-kb dan 2.5-kb transgen disebabkan oleh tapak sisipan EcoRI dalam exon 10 (Rajah 2b). Tikus-tikus ini mengandungi salinan lengkap transgen berdasarkan analisis struktur bertindih genomik.

PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1)perolehan fungsi dalam tikus transgenik SBPkdl-Ac dewasa. Ungkapan SBPkdl-AG. transgen dan PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) gen telah disiasat dalam pelbagai organ. Kuantifikasi tahap transkrip daripada transgen dan/atau gen endogen telah dijalankan oleh analisis Northern blot (Rajah 3a). Seperti yang dijangkakan, transkrip gen transgen dan endogen mempunyai panjang yang sama (14.2 kb). Berdasarkan ekspresi GAPDH kawalan, buah pinggang dari semua garis tetikus SBPkd 1 A telah secara konsisten meningkatkan ekspresi transkrip berbanding PKD1 biasa (penyakit buah pinggang polikistik 1) tahap dalam buah pinggang dewasa (n=3)berumur sama. Transgen renal dan ekspresi endogen untuk garis transgenik yang berbeza memaparkan julat 2- hingga 15-lipat di atas PKD1 endogen renal kawalan(penyakit buah pinggang polikistik 1)tahap (Gamb.3a). Terutamanya, garis transgenik39(n=4)menunjukkan PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) tahap daripada baris 3 (n=3)dan 41(n=4).Tambahan pula, PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1)aras ekspresi yang diukur oleh analisis Northern blot berkorelasi dengan yang diperolehi oleh PCR masa nyata menggunakan primer dalam ekson 1 dan 2(Rajah 3b).

GAMBAR.3.Analisis ekspresi buah pinggang tikus SBPkdlrA. (a) Analisis ekspresi transkrip Pkd1 endogen(endo) dan SBPkdlrA transgene (Tg) dalam buah pinggang daripada tiga garisan transgenik oleh Northern blotting. Dua sampel daripada setiap garis transgenik, 3,39, dan 41 dibandingkan dengan transkrip Pkdl buah pinggang endogen tikus kawalan normal yang dipadankan dengan umur daripada latar belakang genetik yang sama (C5BI 6I ×CBA/DE, sampel RNA buah pinggang diperolehi daripada tikus transgenik sebelum penyakit buah pinggang peringkat akhir. Transkrip daripada endo dan Tg kedua-duanya adalah -14.2 kb panjang. Ekspresi berlebihan sistematik transkrip diperhatikan dalam buah pinggang semua tikus transgenik berbanding kawalan bukan transgenik. GAPDH digunakan sebagai kawalan dalaman untuk pemuatan. Kuantifikasi ekspresi buah pinggang dalam tikus transgenik ini berjulat daripada 2- hingga 15-kali ganda berbanding tahap Pkd1endogen daripada tikus kawalan yang ditetapkan secara sewenang-wenangnya pada 1. (b) Perwakilan skematik transgen dan primer SBPkdl-. adalah digunakan untuk menguatkan jumlah Pkdl termasuk endogen dan transgen (exon 1 dan exon 2) dan hanya transgen Pkd1 (B. exon 2) oleh PCR masa nyata dan analisis RT-PCR, RT-PCR separa kuantitatif bagi ekspresi transgen SBPkdlAc dikira dalam buah pinggang. dan tambahan tisu buah pinggang. Penilaian separa kuantitatif wakil SBPkdl.Ac transgene (Tg) ditunjukkan yang merangkumi sampel tisu buah pinggang (K) daripada satu tetikus bagi ketiga-tiga garisan transgenik (3. 39, dan 41) dan tisu ekstrarenal. H, hati; Lu, paru-paru; B. otak; Li, hati; dan S. limpa daripada tetikus garisan 39. Ekspresi transgen mudah dikesan dalam buah pinggang semua tikus transgenik, manakala ia rendah hingga tidak dapat dikesan dalam tisu ekstrarenal. Ungkapan daripada transgene SBPkd1rAc menghasilkan amplikon 307-bp tertentu, manakala kawalan dalaman S16 menghasilkan amplikon 102-bp. M,100-penanda bp; H, O, kawalan negatif untuk penguatan PCR. (c) Analisis ekspresi PCR masa nyata bagi SBPkdlr. Transgen ditentukan daripada beberapa tikus bebas. Transgen SBPkdl.Ac daripada tiga baris tetikus transgenik 3 (n=5),39(n =7), dan 41 (n=5)menunjukkan bahawa baris 39 dan 41 mempunyai yang paling tinggi. tahap ekspresi buah pinggang. Ekspresi transgen SBPkdlrAc dalam tisu ekstrarenal daripada tikus (n=3) daripada tiga garisan transgenik telah dinilai oleh PCR masa nyata. Berbanding dengan buah pinggang setiap garis transgenik(100 peratus ), analisis tisu ekstrarenal menunjukkan bahawa tahap ekspresi transgen secara konsisten lebih rendah sebanyak 10- kepada 1,000-kali ganda dalam otak, jantung, hati, pankreas , limpa, dan paru-paru. (d) Ekspresi gen c-mc endogen dalam buah pinggang SBPkdl.Ac oleh RT-PCR semikuantitatif. Ilustrasi skematik menunjukkan primer yang digunakan untuk menguatkan c-Myc. Seperti yang dijangkakan, ekspresi c-Myc adalah minimum dalam buah pinggang bukan transgenik dewasa (kawalan). Sebaliknya, peningkatan ekspresi c-Mye dikesan dalam semua buah pinggang SBPkdlrAc dewasa bagi tiga baris, seperti yang diperhatikan dalam buah pinggang SBM transgenik dewasa yang digunakan sebagai kawalan positif. Amplikon c-Myc ialah 250 bp; amplikon S16, kawalan dalaman, ialah 102 bp.M,100-penanda bp.

Kuantifikasi tahap ekspresi transgen secara khusus telah dijalankan oleh PCR masa nyata dan RT-PCR semikuantitatif dalam tiga baris transgenik pada usia dewasa dengan menggunakan primer di rantau 5'tidak diterjemahkan (B, promoter globin) dan dalam exon 2 PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1)(Gamb.3b). SBPKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) Ekspresi RAC dalam tikus transgenik dibandingkan dengan produk gen protein ribosom S16 sebagai standard dalaman. Keadaan yang digunakan untuk penguatan RT-PCR semikuantitatif berada dalam julat linear. Ekspresi transgen oleh PCR masa nyata dan RT-PCR semikuantitatif secara konsisten dan khusus menunjukkan ekspresi tertinggi dalam buah pinggang bagi semua garis transgenik berbanding dengan organ lain (Rajah 3b dan c). Tahap ekspresi buah pinggang untuk sampel individu boleh dihasilkan semula dengan mana-mana teknik pengesanan yang digunakan. Tahap tertinggi PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) ekspresi renal transgen diukur untuk baris 39 dan 41. Untuk memantau sama ada peningkatan PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) terhasil daripada transgen atau gen endogen, kumpulan tikus yang sama daripada tiga garisan transgenik dibandingkan untuk PKD1 buah pinggang ( penyakit buah pinggang polikistik 1) ekspresi transgen dan untuk PKD1 buah pinggang (penyakit buah pinggang polikistik 1) jumlah (transgen dan endogen) ekspresi oleh PCR masa nyata. Menariknya. baris 39 dan 41 berbanding baris 3 menunjukkan peningkatan PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1)ekspresi buah pinggang transgen adalah serupa atau lebih tinggi daripada PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) jumlah ekspresi buah pinggang, menunjuk kepada transgen sebagai bertanggungjawab secara khusus untuk ekspresi teraruh ini. Dalam pelbagai organ (termasuk jantung, paru-paru, otak, hati, pankreas, dan limpa), SBPKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) RAC; transgene menunjukkan ekspresi yang sangat lemah sekali-sekala dikesan dalam limpa dan paru-paru, dengan sedikit ekspresi tidak dapat dikesan dalam organ lain (Rajah 3b). Kuantifikasi oleh PCR masa nyata menunjukkan tahap 10-hingga 1,000-kali ganda lebih rendah bagi ekspresi transgen dalam tisu ekstrarenal berbanding dengan ekspresi buah pinggang (Rajah 3c). Elemen kawal selia "SB" transgene SBPkdlrAc memberikan ekspresi buah pinggang keutamaan; pengedaran organ tertentu ini juga ditentukan apabila digunakan dalam transgen yang dikaitkan dengan c-Myc (SBM) dan c-fos(SBF)(36, 38). c-Mye, pengesan hiliran PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) laluan isyarat dalam SBPkdlrAc: tikus. Untuk mendapatkan gambaran tentang mekanisme patogenetik intraselular tikus transgenik SBPkdlrAc, kami seterusnya berusaha untuk memantau tahap ekspresi buah pinggang c-Myc berdasarkan pemerhatian terdahulu kami terhadap penyahkawalseliaan c-Myc dalam ADPKD manusia (penyakit buah pinggang polikistik dominan autosomal) buah pinggang (22). Analisis buah pinggang telah dijalankan daripada ketiga-tiga garisan transgenik 3(n=4).39(n=7),dan 41 (n =4) ​​serta kawalan (n {{9 }}).Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah.3d, terdapat ekspresi besar c-Mye endogen yang diinduksi dalam tikus SBPkdlrAa berbanding dengan tikus kawalan yang sama umur. Menariknya, tahap ekspresi c-Myc dalam beberapa buah pinggang SBPkdlrAG, khususnya baris 39, mencapai tahap yang setanding dengan yang diperhatikan dalam model tetikus transgenik PKD SBM yang dihasilkan oleh ekspresi c-Myc buah pinggang.

Anomali buah pinggang dalam SBPKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) ARC mice similar to PKD. To characterize the phenotype caused by the transgene expression, gross and histologic examinations were undertaken on transgenic kidneys. Adult kidneys from all transgenic lines were affected bilaterally. Kidneys contained numerous cortical cysts that varied from microscopic to macroscopic in size (Fig.4a and b). SBPkdlrAc. kidneys were pale, a typical finding in PKD. On histologic examination, all transgenic founder mice and progenies (n = 25;n>6 untuk setiap baris)menghasilkan berbilang sista tiub(T)dan glomerular(G)(Rajah 4d,f, dan g). Sista diperhatikan dalam tubulus dari kawasan kortikal dan medulla serta mengumpul tubul dari papilla (Rajah 4d dan e). Tikus transgenik menunjukkan hiperplasia epitelium tiub (anak panah) yang melibatkan kedua-dua tubul sista dan bukan sistik serta hipertrofi yang kerap (Rajah 4g dan h). tetapi keterukan berbeza-beza antara tikus individu. Fibrosis celahan (F). infiltrat limfoid perivaskular, dan tuangan protein (P) kerap diperhatikan (Rajah 4d dan e)

Rajah 4

Untuk menentukan dengan lebih tepat tapak penyetempatan peningkatan PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1)ekspresi dalam buah pinggang, kami menjalankan penghibridan in situ menggunakan probe exon 36-45 yang digunakan sebelum ini(16). Isyarat hibridisasi telah disetempatkan secara khusus kepada sel epitelium yang melapisi sista dan tubul hiperplastik serta sista glomerular. Di samping itu, beberapa isyarat dilihat di atas epitelium tubul bukan sistik atau sedikit diluaskan, berkemungkinan mengenal pasti tubul yang ditakdirkan untuk menjalani perubahan sista pada masa hadapan (Rajah 4i dan j). Analisis histologi buah pinggang juga dijalankan ke atas tikus transgenik semasa lahir (n=8), hari ke-10 (P10)(n=3), P20(n=5), P35(n{). {10}}),dan P45(n= 3)berbanding dengan rakan sampah negatif kumpulan umur yang sama (n =2 hingga 4). Menariknya, semua tikus transgenik yang baru lahir menunjukkan dilatasi tiub dan glomerular berbanding dengan mengawal sampah negatif (Rajah 4k dan 1), menunjukkan bahawa anomali buah pinggang dimulakan dalam utero seperti yang diperhatikan dalam tikus SBM dan dalam ADPKD (penyakit buah pinggang polikistik dominan autosomal) pesakit. Dilatasi tiub dan glomerular meningkat dalam saiz dan bilangan dengan usia yang progresif. Dengan P35, tikus transgenik menunjukkan hiperplasia yang lebih teruk dan bukti glomerulosklerosis Perubahan fungsi fisiologi buah pinggang dalam tikus SBPkdlrsc. Fungsi fisiologi buah pinggang semua tikus transgenik menunjukkan ciri yang serupa dengan PKD, manakala rakan sampah bukan transgenik tidak pernah menghidap penyakit ini. Dalam beberapa bulan selepas kelahiran, haiwan yang terjejas mengalami kekurangan buah pinggang kronik. Haiwan ini dipantau untuk parameter fungsi buah pinggang dengan pengukuran paras serum dan air kencing. nitrogen urea darah (BUN) dan kreatinin, osmolaliti air kencing, protein air kencing, dan perkumuhan ion (Jadual 1). Semua tetikus dari tiga baris berbanding dengan kawalan menunjukkan kecacatan menumpukan, penemuan biasa dalam ADPKD (penyakit buah pinggang polikistik dominan autosomal). dan seterusnya menunjukkan penurunan BUN kencing. kreatinin, protein, dan kepekatan besi. Transgenik SBPKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1)rAc.pengasas dan keturunan (n=6)daripada setiap baris dipantau secara kualitatif untuk proteinuria pada sampel air kencing oleh SDS-PAGE(Rajah 5). Tikus yang lebih tua daripada 2 bulan menunjukkan proteinuria tidak selektif yang berkembang dengan usia. Di samping itu, tahap BUN serum dan kreatinin serum telah meningkat, mendedahkan kekurangan buah pinggang (Jadual 2). Oleh kerana kekurangan buah pinggang kronik biasanya membawa kepada perubahan dalam parameter hematologi, ini telah diperiksa dalam tikus transgenik SBPkdlAc berumur 3 hingga 14 bulan (Jadual 2). Tikus transgenik ini adalah anemia seperti yang dibuktikan oleh jumlah sel darah merah yang berkurangan dengan ketara, dengan hemoglobin dan hematokrit mencapai separuh paras normal. Parameter sel darah merah yang lain, seperti peratusan retikulosit, tidak terjejas, seperti yang dijangkakan apabila disebabkan oleh kecacatan buah pinggang. Haiwan ini secara konsisten mati akibat kegagalan buah pinggang pada -5.9± umur 2.8 bulan (n {{12} }) untuk talian transgenik 39 dan pada usia yang lebih tua,-14.6± 3.1 bulan (n= 20)dan-11.7 ±6.5 bulan (n=7) , untuk baris 3 dan 41, masing-masing.

KESAN CISTANCHE: MERAWAT PENYAKIT BUAH PINGGANG

PERBINCANGAN

Di sini kami melaporkan pengasingan dan pencirian PKD1 murine (penyakit buah pinggang polikistik 1)-BAC. PKD1 ini (penyakit buah pinggang polikistik 1) gen telah ditanda dan elemen pengawalseliaan digantikan untuk menyasarkan ekspresi khusus kepada buah pinggang oleh dua peristiwa penggabungan semula homolog berturut-turut. Tikus transgenik yang dihasilkan dengan gen SBPkdlrAG novel ini menunjukkan peningkatan 2-hingga 15-lipat ganda dalam ekspresi PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) dan menghasilkan semula perubahan morfologi buah pinggang awal yang tipikal PKD. Kekurangan buah pinggang jelas kelihatan pada usia pertengahan, dan tikus mati lebih awal akibat kegagalan buah pinggang. Keputusan kami juga menunjukkan bahawa mekanisme overexpression PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) yang bertanggungjawab untuk fenotip ini dimediasi oleh pengaktifan isyarat c-Myc dalam vivo. Kajian ini menunjukkan bahawa PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) murine berfungsi dalam buah pinggang adalah mencukupi untuk menghasilkan fenotip buah pinggang PKD.

Sejak murine PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) gen tidak diduplikasi seperti yang berlaku pada manusia (27), kami telah mengenal pasti dan mengasingkan klon BAC secara langsung yang mengandungi keseluruhan PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) gen. Pencirian lengkap 129/Sv murine PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1)-BAC. perbandingan tidak langsung dengan dua strain tikus baka lain mengesahkan integriti lokus PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1). PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1)-BACinsert mengandungi-37 hingga 39 kb jujukan hulu dan hiliran daripada gen PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1). Analisis kami menunjukkan bahawa PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) gen dalam BAC ini adalah lokus jenis liar murine yang boleh digunakan untuk kajian lanjut.

Walaupun terdapat bukti kukuh bahawa pembentukan sista dalam ADPKD (penyakit buah pinggang polikistik dominan autosomal) boleh disebabkan oleh kehilangan heterozigositi berikutan ketidakaktifan somatik PKD1 normal (penyakit buah pinggang polikistik 1) alel(3.21.32), terdapat juga bukti yang tidak senonoh untuk ekspresi polycystin-1 yang berterusan atau meningkat dalam epitelium tiub sista (22.29). Pemerhatian terakhir menimbulkan persoalan sama ada overexpression PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) per se adalah punca terdekat sisogenesis yang mencukupi. Dalam tikus transgenik yang mengandungi PKD1 manusia (penyakit buah pinggang polikistik 1), TSC2. RAB26. Gen NTHL1 dan SLC9A3R2, hanya minoriti tikus yang mengembangkan sista dan tidak ada yang mempunyai ekspresi transgen yang dapat dikesan pada masa dewasa walaupun terdapat 30 salinan transgen (31). Dalam tikus transgenik itu. adalah sukar untuk mewujudkan peranan yang jelas untuk PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) overexpression dalam cystogenesis. Model kami berbeza, kerana dua hingga sembilan salinan jenis liar PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) sahaja, tanpa gen bersebelahan, telah disepadukan dalam tikus transgenik. Oleh kerana gen PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) mempunyai fungsi penting dalam pelbagai organ atau tisu, seperti yang diterangkan untuk banyak tikus dengan ablasi gen PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1), ekspresi berlebihan sistemik PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) boleh membawa kepada kesan mengelirukan tambahan. Oleh itu, kami telah menangani peranan PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1)perolehan fungsi menggunakan pendekatan yang mensasarkan PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) khusus kepada buah pinggang. Dengan penggabungan semula homolog, kami mula-mula menggantikan kawasan kawal selia huluan PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) dengan elemen pengawalseliaan terhad buah pinggang "SB", dengan itu menghalang penurunan ekspresi gen yang biasanya dilihat untuk PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1)pada masa dewasa serta peraturan gelung maklum balas sekunder yang berpotensi(36,38). Kedua, kami telah menandakan murine PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) transgen(Pkdlr)dengan mutasi titik senyap dalam exon 10tetapi tidak memasukkan tag epitope untuk memastikan bahawa protein "jenis liar" berfungsi sepenuhnya dengan struktur dan integriti yang dipelihara akan dihasilkan. Daripada BAC yang diubah suai ini, serpihan SBPkdlrAG telah dibersihkan daripada gen Tsc2 dan vektor BAC untuk mengelakkan gangguan oleh gen Tsc2, yang juga boleh mendorong fenotip sista (8.20.28). serta untuk mengelakkan kesan perencatan jujukan prokariotik(5).

Empat tikus pengasas SBPkdlrActransgenik berbeza dan tiga garis bebas telah dihasilkan dengan PKD1 buah pinggang tertentu (penyakit buah pinggang polikistik 1)-ekspresi yang dipertingkatkan. Terutama yang menarik ialah penembusan lengkap fenotip dalam tikus transgenik ini. SBPKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) Pengasas rAc dan garis tetikus berkongsi beberapa ciri fisiopatologi yang sama dengan ADPKD (penyakit buah pinggang polikistik dominan autosomal). Ini termasuk perkembangan sista dalam korteks, medulla, dan glomeruli bersama-sama dengan hiperplasia epitelium, fibrosis interstisial, dan keradangan interstisial fokal.

Oleh kerana fenotip PKD secara konsisten diperhatikan dalam semua tikus pengasas transgenik yang berbeza dan integrasi transgen ke dalam genom tikus adalah fenomena rawak, fenotip tidak boleh terhasil daripada kesan kedudukan kromosom tetapi hanya daripada peningkatan PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1)ekspresi. Sememangnya, ekspresi transgen PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) dalam semua baris telah ditunjukkan sebagai dihadkan buah pinggang. seperti yang diperhatikan sebelum ini untuk transgen lain yang dikawal oleh unsur "SB" (36, 38). Selain itu, peningkatan PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) ini disebabkan oleh transgen dan bukan oleh PKD1 endogen tidak langsung (penyakit buah pinggang polikistik 1) pengaktifan. Oleh itu, keputusan kami memberikan bukti jelas bahawa peningkatan fungsi PKD1 jenis liar (penyakit buah pinggang polikistik 1) boleh menghasilkan pelbagai sista buah pinggang. Yang penting, amalan SBPKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) ini merupakan model tetikus pertama yang dihasilkan oleh ekspresi berlebihan tunggal ortolog tetikus PKD1 manusia (penyakit buah pinggang polikistik 1) gen.

Tikus SBPkdl-Ac menunjukkan bahawa PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1)ekspresi berlebihan ialah mekanisme patogenetik utama sisogenesis buah pinggang. Yang penting, tahap ekspresi transgen tertinggi dalam buah pinggang kelihatan berkorelasi dengan perkembangan dan keterukan fenotip. Kami juga mendapati bahawa PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) berlebihan dalam pembangunan SBPKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1)-Ac fenotip berkemungkinan memberi isyarat pengaktifan c-Myc dalam vivo. Boleh dibayangkan, pengaktifan ini juga boleh terus melalui polycystin-1 C-terminal ekor yang sedang mengalami pembelahan proteolitik dan translokasi nuklear (7), Memandangkan ekspresi renal c-Myc yang dipertingkatkan dalam tikus dewasa ditunjukkan untuk mendorong PKD, ia akan sangat konsisten untuk menyokong c-Myc sebagai pengesan hiliran utama PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) laluan isyarat Keputusan ini juga berkorelasi dengan penemuan sebelumnya kami tentang peningkatan ekspresi c-Myc dalam buah pinggang semua ADPKD manusia (penyakit buah pinggang polikistik dominan autosomal) yang dianalisis (22), Secara keseluruhannya, keputusan ini menunjukkan bahawa c-Mye adalah pengantara utama PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1)sistogenesis.

Keputusan kami daripada PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1)model keuntungan fungsi, bersama-sama dengan murine PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) haploinsufficiency dan kehilangan fungsi, menunjukkan bahawa mana-mana PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) disregulasi boleh membawa kepada sisogenesis (2.19.23-26.31.40). Ketidakseimbangan PKD1 yang teruk (penyakit buah pinggang polikistik 1) pada tikus yang disebabkan oleh PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) ablasi atau overexpression transgenik menyebabkan permulaan awal dan perkembangan pesat sista buah pinggang dan menjejaskan sebahagian besar tubulus. Sebaliknya, PKD1 yang lebih ringan (penyakit buah pinggang polikistik 1) ketidakseimbangan seperti haploinsufficiency membawa kepada perkembangan PKD yang lebih perlahan dengan lebih banyak sista fokus. Perkembangan paradoks yang jelas bagi fenotip serupa melalui disregulasi polycystin{0}} yang bertentangan boleh dijelaskan oleh hasil yang biasa, iaitu ketidakseimbangan kepekatan protein relatif yang boleh mengubah pembentukan atau fungsi kompleks multiprotein polycystin aktif. Secara keseluruhan, keputusan kami dan penyiasat lain berpendapat bahawa mekanisme pembentukan sista dalam ADPKD (penyakit buah pinggang polikistik dominan autosomal) berkemungkinan timbul daripada tiga mekanisme patogenetik: keuntungan fungsi, kehilangan fungsi, dan kesan dos gen.

Novel SBPkdlrAc; tikus membentuk model cystogenesis buah pinggang yang kuat yang boleh memberikan gambaran utama tentang patofisiologi PKD, PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) laluan transduksi isyarat, dan rakan kongsi berinteraksi. Kajian model ini juga boleh membawa kepada pembangunan strategi terapeutik baru untuk memulihkan keseimbangan protein normal dalam PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) kompleks multimerik.

Cistanche merawat penyakit buah pinggang dan meningkatkan fungsi buah pinggang

RUJUKAN

1. Blouin, MJ, H.Beachemin, A Wright, M E. De Paepe, M. Surrette, AM. Beau. B. Nakamoto, CN. Ou, G. Stamatoyannopoulos, dan M. Trudel. 2000. Pembetulan genetik penyakit sel sabit: pandangan menggunakan model tetikus transgenik Nat. Med.17-182.

2 Boulter, C, S.Mulroy, S. Webb, S. Fleming, K. Brindle, dan R. Sandford. 2001. Kardiovaskular, rangka. dan kecacatan buah pinggang pada tikus dengan gangguan sasaran PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1)gen. Proc. Natl.Acad. Sci. Amerika Syarikat 9812174-12179.

3. Brasier,JL, dan EPHenske.1997. Kehilanganpenyakit buah pinggang polikistik(PKD1）wilayah kromosom 1φp13 dalam sel sista buah pinggang menyokong model kehilangan fungsi untuk patogenesis sista. J. Clin. Investig.99:194-199.

4. Burn, TC, TD Connars, W. R Dackowski, LR.Petry,TJVan Raay, JMMilhalland, M. Venet, G. Milker,R ML Hakim,G. ML Landes,KW Klinger,F. Qiam, LF. Onuchic, T. Watnick GGGermino, dan N. A Doggett.1995.Anay sis bagi jujukan genomik untukpenyakit buah pinggang polikistik dominan autosomalgen meramalkan kehadiran ulangan yang kaya dengan leucine. Hum Mol, Genet.4-575-58.

5. Chada, K, J.Magram, K. Raphael, G.Radice, E. Lacy, dan F.Costantini. 1985. Ekspresi spesifik gen -globin asing dalam sel eritroid tikus transgenik Alam 337-380.

6. Chauvet, V, F.Qian, N. Bought,Y.Cai B.Phakdeekitacharoen, LF.Onuchi, T. Attie-Bitach, L. Guicharnaud, O.Devuryst,GG Germino, dan M.-C. Gubler.2002. Ekspresi transkrip dan protein PKDI danPKD2 dalam embrio manusia dan semasa perkembangan buah pinggang yang normal. Am. J.Pathol. 160973-983.

7.Chaurvet,V, X Tian, ​​H.Husson, DH Grimm,T.Wang T.Hiesberger, P. Igarashi, AMBennett, O.braghimov-Beskrovnaya,S.Somlo, dan MJ Caplan.2004 Rangsangan mekanikal mendorong pembelahan dan nuklear translokasi pobeystin-1 C terminal.J. Cin.Investig 114:1433-1443.

8. Cheadle, JP, MPReeve, JR Sampson, dan DJ Kwiatkowski 2000. Kemajuan genetik molekul dalam sklerosis tuberous. Hum. Genet10797-114.

9. Konsortium, EPKD1993. Pengenalpastian dan pencirian gen sklerosis tuberous pada kromosom 16.Cell75:1305-1315.

10. Konsortium, EPKD1994.Thepenyakit buah pinggang polikistik 1gen mengekod semua yang boleh ditranskripsikan dalam kawasan pendua pada kromosom 16 Sel 7781-894.

11. Konsortium, L PK D 1995.Penyakit buah pinggang polikistik: struktur lengkap PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik1) gen dan proteinnya. P 81:289-298

12. Couillard, M., R Guilkume, N Tanj, V.DAgati, dan M. Trudel.2002. c-Myc-Induced apoptosis inpenyakit buah pinggang polikistikadalah bebas daripada interaksi FasL/Fas. Kanser Re. 62:2210-2214.

13. De Paepe, M Land M Trudy 1904, Model glomerulopati sel sabit manusia. Buah Pinggang Int. 46:1337-1345.

14. GengL,Y, Segal B.PekseL N.Den Y. Pei,F.Carone, H G. Rennke, AM Glücksman-Kuis, MCSchneider, M Ericsson, STReeders dan J.Zhou. 1996. Pengenalpastian dan penyetempatan poliester, PKD1 (penyakit buah pinggang polikistik 1) produk gen. J. Clin. menyiasat. 98-2674-2682