BAHAGIANⅠ:Kesan Pelindung Novel Ekstrak Cistanche Tubulosa Terhadap Retinopati Degeneratif Disebabkan Cahaya Biru Bercahaya Rendah
Mar 04, 2022
Hubungi: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com
Man-Ru Wu Cheng-Hui Lin Jau-Der Hob George Hsiao, Yu-Wen Cheng
Pusat Pengajian Farmasi, Kolej Farmasi, Universiti Perubatan Taipei, Taipei, Jabatan Oftalmologi, Universiti Perubatan Taipei, Taipei, Jabatan Farmakologi, Pusat Pengajian Perubatan, Kolej Perubatan, Universiti Perubatan Taipei, Taipei, Institut Sains Perubatan Siswazah, Kolej Perubatan, Universiti Perubatan Taipei, Taipei, Ph.D. Program dalam Penyelidikan dan Pembangunan Bioteknologi, Kolej Farmasi, Universiti Perubatan Taipei, Taipei, Taiwan
Abstrak
Latar Belakang/Matlamat:Fototoksisiti akibat cahaya diod pemancar cahaya biru (BLL) memainkan peranan penting dalam penyakit okular dan menyebabkan degenerasi retina dan apoptosis dalam sel epitelium pigmen retina manusia (RPE).Ekstrak cistanche tubulosa (CTE)adalah ubat tradisional Cina dengan banyak sifat perlindungan yang bermanfaat; walau bagaimanapun, beberapa kajian telah mengkaji peranan pelindung mata CTE. Dalam kajian ini, kami menyiasat mekanisme yang mendasari kesan CTE pada apoptosis yang disebabkan oleh BLL secara in vitro dan in vivo. Kaedah: Sel RPE digunakan dalam kajian in vitro semasa dan daya maju sel ditentukan oleh 3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-2,{{6} } ujian difeniltetrazolium bromida. Ekspresi protein berkaitan apoptosis ditentukan oleh analisis blot barat dan pewarnaan imunofluoresensi. Tikus Brown Norway digunakan untuk memeriksa pendedahan kepada BLL yang tersedia secara komersial dalam vivo. Pewarnaan hematoxylin dan eosin, terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL), dan western blot assays digunakan untuk memeriksa ubah bentuk morfologi retina. Keputusan: CTE menghalang kerosakan hidrogen peroksida-, tertbutil hidroperoksida-, natrium azida- dan BLL dengan ketara. Selanjutnya, CTE mengurangkan ekspresi penanda apoptosis seperti caspase terbelah-3 dan pewarnaan TUNEL selepas pendedahan BLL dengan menyahaktifkan laluan apoptosis, seperti yang ditunjukkan melalui pewarnaan imunofluoresen. Di samping itu, CTE menghalang fosforilasi yang disebabkan oleh BLL kinase terminal c-Jun N, kinase berkaitan isyarat tambahan 1/2, dan p38 dalam sel RPE. Dalam vivo, pentadbiran lisan CTE menyelamatkan 60-pengurangan akibat pendedahan BLL berkala hari dalam ketebalan retina dan mengurangkan bilangan sel TUNEL-positif dalam model tikus Norway coklat. Kesimpulan: CTE adalah agen profilaksis yang berpotensi terhadap fototoksisiti yang disebabkan oleh BLL
pengenalan
Kajian mengenai degenerasi makula berkaitan usia (AMD) telah melaporkan bahawa 8.7 peratus penduduk dunia menghidap penyakit ini [1]. AMD ialah penyakit neurodegeneratif yang menyebabkan ubah bentuk fotoreseptor, atrofi epitelium pigmen retina (RPE), apoptosis sel ganglion, dan kehilangan penglihatan pusat dalam populasi warga tua, dan menjadi beban sosial global. AMD dikelaskan sama ada dalam bentuk kering atau basah [2, 3]. Penambahbaikan dalam teknologi telah menyebabkan orang ramai menghabiskan lebih banyak masa menggunakan peranti digital moden, dan akibatnya, orang ramai terdedah kepada pelepasan cahaya biru (BL) dalam tempoh yang lama. Walau bagaimanapun, isu fototoksisiti yang disebabkan oleh BL dalam retina tidak disiasat dengan baik. Pendedahan berlebihan kepada BL panjang gelombang pendek (450–495 nm) mengakibatkan penjanaan spesies oksigen reaktif (ROS), seperti radikal superoksida dan hidroksil, yang menyebabkan peningkatan dalam penggunaan oksigen dan mendorong kerosakan DNA mitokondria. Pengumpulan ROS mengakibatkan tekanan oksidatif dan pengumpulan meluas retinoid adduct, yang merosakkan retina lagi [4]. Penyelidikan telah menunjukkan bahawa tekanan oksidatif adalah faktor utama dalam patogenesis AMD kering [5]. Tambahan pula, penyinaran BL mengurangkan ekspresi enzim antioksidan retina, seperti superoksida dismutase dan katalase, dengan mengantara interaksi protein Bax/Bcl-2 dan menggalakkan pengeluaran ROS endogen. Oleh itu, sel RPE dan mitokondria segmen luar fotoreseptor mengalami kecederaan akibat penyinaran BL [6, 7]. Sebagai tambahan kepada penjanaan ROS, penyinaran BL mengaktifkan kinase protein diaktifkan mitogen (MAPKs), yang memainkan peranan penting dalam survival sel dan apoptosis. protein pro-apoptosis berkaitan apoptosis yang bergantung kepada mitokondria, seperti Bax dan caspase-3, diaktifkan oleh penyinaran cahaya diod pemancar BL (BLL) melalui jalur kinase (JNK) dan p38 c-Jun N-terminal dalam RPE dan sel ganglion retina [8]. Selain itu, laluan anti-oksidatif yang bergantung kepada phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt dan faktor nuklear erythroid 2-faktor 2 (Nrf2) adalah komponen sistem pertahanan sel RPE [{{34} }].
Ekstrak cistanche tubulosa (CTE)mengandungi derivatif phenylethanoid glikosida dan telah digunakan sebagai ubat tradisional Cina selama beberapa dekad. Echinacoside, acteoside, dan isoacteoside adalah tiga sebatian aktif utama CTE yang dicirikan sebagai mempunyai sifat neuroprotektif, peningkatan ingatan, pengawalseliaan imun dan fibrosis anti-hati [13, 14]. Echinacoside ialah penghapus ROS dan melindungi daripada apoptosis yang disebabkan oleh 1-metil-4-fenilpiridinium (MPP tambah) dalam model haiwan penyakit Parkinson [15, 16]. Acteoside melindungi daripada neurotoksisiti akibat amiloid{10}}dan mengurangkan keradangan yang dirangsang lipopolysaccharide, yang dikaitkan dengan pemindahan Nrf2 daripada sitoplasma ke nukleus dan mengikat unsur tindak balas antioksidan. Terapi sedia ada untuk AMD basah, seperti pegaptanib, ranibizumab, bevacizumab, dan aflibercept, digunakan untuk menghalang angiogenesis yang berlebihan [17, 18]. Walau bagaimanapun, tiada rawatan berkesan wujud untuk AMD kering, disebabkan oleh pelbagai komplikasi patologi penyakit ini.
Dalam kajian ini, kami menunjukkan kesan perlindungan CTE dalam sel RPE dan tikus Brown Norway (BN). Di samping itu, kami menggunakan pendedahan BLL pencahayaan rendah jangka panjang kepada kedua-dua model in vitro dan in vivo untuk menilai kesan perlindungan CTE. Kami mendapati bahawa CTE mengurangkan ekspresi protein berkaitan apoptosis selepas pendedahan kepada BLL. Selain itu, CTE mengurangkan bilangan terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labelling (TUNEL)- sel positif dalam retina tikus BN selepas pendedahan jangka panjang kepada BLL bercahaya rendah. Kajian ini memberikan pandangan lanjut tentang kesan anti-apoptosis novel CTE dan maklumat mengenai strategi baharu untuk rawatan degenerasi retina.
Ekstrak cistanche tubulosa (CTE): phenylethanoid glycoside
Bahan dan Kaedah
Bahan kimia dan produk
CTE telah disediakan dengan murah hati oleh Syarikat Farmaseutikal Sinphar (Yilan, Taiwan). Kit pengesanan kematian sel in situ (No. Kucing 11-684-817-910) telah dibeli dari Roche (Mannheim, Jerman).
Kultur sel RPE
Sel RPE (ARPE{{0}} dan ATCC® CRL-2302™) telah dibeli daripada American Type Culture Collection (Manassas, VA) dan dikultur dalam medium Eagle's diubah suai Dulbecco (Gibco, Grand Island, NY) ditambah dengan 10 peratus serum lembu janin dalam suasana lembap sebanyak 5 peratus CO2 pada 37 darjah . Sel ARPE-19 pada laluan 19–30 dikekalkan pada 10-sm hidangan kultur sel (Oren Saintifik, Braine-l'Alleud, Belgium). Setelah lulus dengan 0.05 peratus asid trypsin-etilenediamine tetraacetic (Gibco), sel-sel telah disalut semula pada nisbah 1:4. Sebelum ujian, sel ARPE-19 telah disemai pada 48-plat perigi (Oren Saintifik) untuk analisis daya maju sel pada ketumpatan 1.0 ×105 sel/mL dan pada 6-sm hidangan (Oren Saintifik ) untuk analisis western blotting pada ketumpatan 2.0 × 105 sel/mL selama 24 jam. Selepas sel ARPE-19 mencapai 80 peratus pertemuan, percubaan berikut telah dilakukan.
Rawatan ubat dan ujian daya maju sel
Sel RPE pada laluan 19–30 telah disemai pada 48-plat perigi dan dirawat bersama selama 24 jam dengan kepekatan CTE, hidrogen peroksida (H2O2), tert-butil hidroperoksida (t-BHP) dan natrium azida yang berbeza ( NaN3). Sel-sel tersebut kemudiannya dikultur dengan 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) pada kepekatan akhir 1 mg /mL dan diinkubasi selama 30 minit. Dimetil sulfoksida (200 µL) kemudiannya ditambah kepada setiap telaga untuk membubarkan sel. Penyerapan diukur pada 570 nm menggunakan pembaca ujian imunosorben berkaitan enzim spektrofotometer Sunrise™ (MRX-TC; Dynex Technologies, Chantilly, VA). Nilai telah diperbetulkan untuk penyerapan latar belakang dengan menolak tempat kosong yang sesuai. Data adalah daripada lima ujian bebas.
Protokol pendedahan BL in vitro
Sumber cahaya dan plat sel diletakkan pada jarak 25 cm, seperti yang diterangkan dalam kajian terdahulu kami [19]. Pencahayaan diukur dengan meter cahaya (LM-81LX; Lutron Electronic Enterprise, Taipei, Taiwan). BLL memuncak pada 460 nm (60 lux) untuk masa yang dinyatakan (0–48 jam), bergantung pada reka bentuk eksperimen.
Western blotting
Selepas 0–48-j rawatan bersama dengan pendedahan CTE dan BLL, sel-sel telah dibasuh dua kali dengan garam penimbal fosfat ais sejuk (PBS) dan digantung semula dalam penimbal lisis ujian radioimunopresipitasi (1 peratus Nonidet P-40, 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM Na3VO4, 1 mM etilena glikol-bis ( -aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid, 1 mM NaF , dan koktel perencat protease/fosfatase). Lisat sel diperoleh melalui sentrifugasi pada 12, 000 × g selama 35 minit, dan supernatan dikumpul untuk menentukan kepekatan protein melalui reagen Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Jumlah sampel protein yang sama telah diasingkan oleh elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida 10-12 peratus dan kemudian dipindahkan ke membran polivinilidena difluorida. Selepas membran disekat dengan 5 peratus susu tanpa lemak dan diinkubasi dalam garam penimbal Tris dengan Tween 20 (TBST) selama 1 jam, imunoblotting dilakukan dengan antibodi primer khusus untuk caspase terbelah-3, phospho-JNK, JNK , fosfo-p38, p38, kinase berkaitan isyarat fosfo-ekstraselular (ERK), ERK, Bcl-2, Bax, protein berkaitan Fas dengan domain kematian (FADD), caspase-8 (GeneTex, Irvine , CA), Fas-ligand (Abcam, Cambridge, UK), dan b-actin (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO). Blot kemudian diinkubasi dengan antibodi sekunder konjugasi peroksidase lobak kuda (1: 6000 dalam TBST; Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) selama 1 jam pada suhu bilik. Menggunakan kit chemiluminescence yang dipertingkatkan (Millipore, Billerica, MA), keamatan jalur pada setiap blot dianalisis dengan perisian Image J selepas menormalkan kepada b-actin.
Imunofluoresensi
Sel RPE telah ditetapkan dengan 4 peratus paraformaldehid dalam PBS selama 15 minit. Triton X-100 dalam PBS (0.2 peratus ) kemudiannya ditambah pada sel selama 15 minit, diikuti dengan 5 peratus serum lembu janin dalam PBS selama 30 minit; sel kemudian diinkubasi dengan antibodi caspase-3 anti-dibelah pada nisbah 1:250 selama 24 jam (Teknologi Isyarat Sel, Danvers, MA). Antibodi sekunder IgG anti-arnab kambing (Dylight 594) digunakan pada nisbah 1:200 (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Nukleus sel telah diwarnai dengan 4′-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; AAT Bioquest, Sunnyvale, CA). Perubahan dalam pendarfluor diperhatikan dengan sistem pengimejan mikroskop spektrum confocal CS SP5 laser (Leica, Teban Gardens, Singapura).
pewarnaan TUNEL
Serpihan DNA, yang boleh dikesan oleh ujian TUNEL, adalah ciri penting apoptosis. Kami menggunakan Kit Pengesanan Kematian Sel Dalam Situ (No. Kucing 11-684-817-910; Roche) untuk mengukur kematian sel RPE terprogram apoptosis mengikut protokol pengeluar. Secara ringkas, kami membetulkan sel RPE dengan 4 peratus paraformaldehid dan melabelkan pecahan DNA dalam tindak balas enzim untuk mengesan sel TUNEL-positif, yang dibentangkan dengan noda pendarfluor hijau. Sel-sel bernoda kemudiannya diimbas dan dianalisis dengan Sistem Pengimejan FAXS-plus Tisu (TissueGnostics, Vienna, Austria). Sepuluh ribu peristiwa telah dikira di rantau RPE berpagar, dan kami menganalisis imej untuk bilangan sel TUNEL-positif dengan perisian TissueQuest/HistoQuest (TissueGnostics).
Eksperimen haiwan
Tikus BN jantan (300–350 g berat badan) telah dibeli dari Pusat Haiwan Makmal Kebangsaan (Taipei, Taiwan) dan disimpan selama 2–3 bulan. Tikus dikekalkan dalam 12-j/12-h kitaran terang/gelap pada 26 ± 1 darjah, nisbah kelembapan relatif 35–47 peratus dan akses ad libitum kepada air dan makanan. Tikus yang tidak dirawat telah dikekalkan dalam gelap untuk berfungsi sebagai kawalan. Protokol kajian telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penggunaan Penjagaan Haiwan Institusi Universiti Perubatan Taipei (nombor kelulusan: LAC-2016-0442). Semua prosedur eksperimen yang melibatkan penggunaan haiwan mematuhi kenyataan Persatuan Penyelidikan dalam Penglihatan dan Oftalmologi untuk kegunaan haiwan dalam penyelidikan eksperimen oftalmik dan penglihatan.
Model tikus yang disebabkan oleh BLL degenerasi retina
Kami menggunakan model degenerasi retina yang disebabkan oleh pendedahan BLL jangka panjang bercahaya rendah berkala, seperti yang diterangkan dalam kajian terdahulu kami [19]. Secara ringkas, tikus BN dibahagikan kepada tiga kumpulan: kumpulan kawalan, yang disimpan dalam keadaan gelap; kumpulan terdedah BLL, yang terdedah kepada BLL berkala dalam gelap tanpa pelebaran murid (460 nm, 150 lux) selama 3 jam sehari selama 60 hari; dan kumpulan terdedah BLL yang dirawat CTE ditambah BLL, yang telah dirawat terlebih dahulu dengan CTE (100 mg/kg berat badan) selama 14 hari dan kemudian dirawat bersama dengan pendedahan BLL berkala selama 3 jam sehari selama 60 hari. Semua tikus dikembalikan ke koloni haiwan dan kitaran cahaya/gelap biasa (250 lux, 12 h/12 h) disambung semula pada penghujung tempoh eksperimen.
Analisis statistik
Perbezaan ketara dikira menggunakan analisis varians sehala diikuti dengan ujian post hoc Tukey dan ujian perbandingan berganda. Kepentingan statistik ditentukan oleh nilai-p bagi<>
Produk cistanche tubulosa
Keputusan
CTE melindungi sel RPE daripada kerosakan tekanan oksidatif
Untuk menilai sitotoksisiti CTE melalui ujian MTT, beberapa kepekatan CTE ({{{{20}}}}-500 ug/mL) telah digunakan pada sel RPE. Rawatan CTE tidak mempunyai kesan toksik yang jelas terhadap daya maju sel RPE pada mana-mana kepekatan yang diuji (Rajah 1A). Oleh itu, 50 dan 100 ug/mL CTE telah digunakan dalam eksperimen seterusnya. Untuk menyiasat kesan anti-apoptosis CTE, induktor oksidatif yang berbeza (H2O2, t-BHP, dan NaN3) telah ditadbir bersama dengan CTE ke sel RPE selama 24 jam. H2O2, NaN3, dan t-BHP mengurangkan daya maju sel dan sel RPE yang rosak dalam cara yang bergantung kepada dos (bar dikerat, Rajah 1B, 1C, dan 1D); daya maju sel adalah jauh lebih rendah dalam sel yang dirawat dengan 0.03 mM H2O2, 0.3 mM NaN3, dan 0.3 mM t-BHP berbanding kumpulan kawalan.
Walau bagaimanapun, rawatan bersama dengan 50 dan 100 ug/mL CTE melemahkan kerosakan sel RPE yang disebabkan oleh H2O2-, NaN3- dan t-BHP dan membalikkan penurunan daya maju sel (bar hitam, Rajah 1B, 1C dan 1D). Data di atas mencadangkan bahawa CTE menyelamatkan sel RPE daripada kerosakan tekanan oksidatif.
CTE menghalang kematian sel RPE yang disebabkan oleh BLL
Dalam kajian terdahulu kami, kami mendapati bahawa BLL adalah sitotoksik kepada sel RPE, yang dikaitkan dengan perubahan dalam ungkapan Bcl-2 dan Bax. Dalam kajian ini, kami selanjutnya mengkaji kesan perlindungan CTE pada kerosakan sel RPE yang disebabkan oleh BLL. Kami meletakkan dua plat LED elektrik biru dalam inkubator kultur sel. Jarak antara sumber cahaya dan plat sel ialah 25 cm, dan keamatan BLL ialah 60 lux, seperti yang diukur dengan meter cahaya (Rajah 2A). Ujian MTT menunjukkan bahawa pendedahan BLL untuk tempoh masa yang berbeza (6-48 jam) menyebabkan kematian sel RPE dalam cara yang bergantung pada masa (Rajah 2B). Pengurangan yang disebabkan oleh BLL dalam daya maju sel selepas 24 dan 48 jam telah dilemahkan dengan ketara apabila sel dirawat bersama dengan CTE (100 ug/mL) (Rajah 2C). Data ini mencadangkan bahawa CTE melindungi sel RPE daripada fototoksisiti yang disebabkan oleh BLL.
CTE menghalang apoptosis yang disebabkan oleh BLL dalam sel RPE dengan mengawal selia laluan Bcl-2/Bax dan Fas/FasL
Berdasarkan potensi kesan perlindungan CTE dalam sel RPE, kami selanjutnya menyiasat kemungkinan penglibatan CTE dalam proses ini. Dua laluan isyarat apoptosis telah diperiksa, iaitu, laluan Bax/Bcl{{0}} dan ligan Fas/Fas (FasL), dan protein yang berkaitan (cth, pro-caspase-8 dan pro-caspase -3;Rajah 3A dan 3B). Pendedahan BIL (6–48 jam) didapati mengimbangi ekspresi protein Bax/Bcl-2, FasL dan FADD dalam cara yang bergantung kepada masa (Rajah 3A). Selain itu, BLL mengecilkan ekspresi protein procaspase-3 dan procaspase-8, menghasilkan lebih banyak bentuk belahan caspase-3 dan caspase-8 selepas pendedahan BLL, yang konsisten dengan kami kajian lepas [19]. Untuk menilai kesan perlindungan CTE selanjutnya, kepekatan CTE yang berbeza digunakan pada sel RPE yang terdedah kepada BLL (Rajah 3B). Selepas 48-j pendedahan BLL, CTE (50 µg/mL) menurunkan nisbah Bax/Bcl-2. Selanjutnya, CTE (100 µg/mL) menurunkan ekspresi protein FasL dan FADD, tetapi dengan ketara meningkatkan tahap prokaspase-8 dan prokaspase-3 (Gamb. 3C dan 3D). Kajian telah menunjukkan bahawa pengaktifan caspase-3 ialah penanda apoptosis dalam sel RPE [20]. Untuk mengesahkan kesan perlindungan CTE dengan lebih lanjut, kami melakukan pewarnaan imunofluoresen pada caspase terbelah-3. Pendedahan BIL selama 48 jam didapati mendorong belahan caspase-3 dan translokasi ke dalam nukleus, mengakibatkan apoptosis sel RPE (anak panah kuning, Rajah 4A). Walau bagaimanapun, apabila sel yang terdedah kepada BLL dirawat bersama dengan CTE (100 µg/mL), ekspresi tercetus BLL bagi caspase terbelah-3 telah dihalang. Untuk memahami kesan anti-apoptosis CTE dengan lebih baik, kami menggunakan pewarnaan TUNEL untuk mengesan serpihan DNA dalam sel RPE. Selepas 48-j pendedahan BLL, sel TUNEL-positif meningkat daripada 1.78 ± 0.36 peratus kepada 23.82 ± 0.33 peratus ; kesan ini telah dilemahkan oleh rawatan bersama dengan CTE (23.82 ± 0.33 peratus kepada 2.22 ± 0.11 peratus; Rajah 4B, 4C, dan 4D). Keputusan ini menunjukkan bahawa rawatan CTE sangat melindungi sel RPE daripada apoptosis yang disebabkan oleh BLL dengan mengantara laluan Bax/Bcl-2 dan FasL/FADD.
CTE menghalang fosforilasi yang disebabkan oleh BLL protein tindak balas tekanan dalam sel RPE
Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa laluan MAPK, seperti ERK, JNK, dan p38 MAP, diaktifkan dalam sel RPE dan dalam retina selepas terdedah kepada cahaya ultraviolet atau BL [21, 22]. Oleh itu, untuk menyiasat kesan pengawalseliaan CTE pada laluan tindak balas tekanan MAPK selepas pendedahan BLL, 100 µg/mL CTE digunakan pada sel RPE di bawah masa pendedahan BLL yang berbeza (Rajah 5A). Analisis Western blot menunjukkan bahawa ERK, JNK, dan p38 terfosforilasi telah diaktifkan apabila pendedahan BLL, tetapi terhalang dengan ketara apabila rawatan bersama dengan CTE dalam sel RPE (Rajah 5B). Keputusan di atas menunjukkan bahawa CTE menghalang kerosakan sel RPE yang disebabkan oleh BLL, yang mungkin dikaitkan dengan perencatan MAPK dalam sel RPE.
CTE menyelamatkan kerosakan retina akibat BLL selepas pendedahan berkala jangka panjang dalam model tikus
Untuk menilai kesan perlindungan CTE, kami mendedahkan tikus BN kepada pendedahan BLL jangka panjang selama 60 hari dan menilai kesan CTE. Seperti yang ditunjukkan dalam skema yang dibentangkan dalam Rajah 6A, tikus BN dibahagikan kepada tiga kumpulan: kumpulan kawalan, kumpulan terdedah BLL dan kumpulan CTE tambah BLL (Rajah 6A). Dalam kumpulan CTE plus BLL, tikus BN secara berterusan ditambah dengan CTE (100 mg/kg berat badan) melalui gavage oral sekali sehari selama 14 hari sebelum pendedahan BLL. Pada hari 0, tikus BN telah dirawat bersama dengan CTE (100 mg/kg berat badan) dan terdedah kepada BLL selama 3 jam sehari selama 60 hari. Selepas 60 hari pendedahan BLL, haiwan itu dikorbankan untuk analisis blot barat dan pewarnaan imunohistokimia. Dalam kumpulan CTE tambah BLL, ungkapan protein procaspase{13}} dalam homogenat mata tikus adalah lebih tinggi selepas rawatan CTE berbanding kumpulan BLL (Rajah 6B dan 6C). Data ini menggambarkan bahawa CTE menghalang cahaya rendah jangka panjang yang disebabkan oleh fototoksisiti retina dan apoptosis yang disebabkan oleh BLL dengan menghalang pengaktifan caspase terbelah-3. Pewarnaan imunohistokimia memberikan lebih banyak bukti mengenai kesan perlindungan CTE pada struktur dan laluan fisiologi retina (Rajah 7). Selanjutnya, selepas pendedahan BLL kami mendapati bahawa lapisan neuron dalam telah berkurangan dan memerhatikan ubah bentuk morfologi pada lapisan neuron luar (ONL), termasuk segmen dalam / segmen luar dalam kedua-dua retina pusat dan periferal, yang konsisten dengan kajian terdahulu kami ( Rajah 7B). Yang penting, CTE menghalang ubah bentuk sel RPE, kerosakan sel neuron dan penipisan keseluruhan retina dalam kumpulan CTE ditambah BLL (Rajah 7C). Selanjutnya, kami tidak memerhatikan sel TUNEL-positif dalam retina tengah dan periferi tikus normal (Rajah 8Ab dan 8Bb). Sebaliknya, selepas pendedahan BLL selama 60 hari, sel TUNEL-positif dikesan dengan kerap dalam ONL retina pusat dan periferi (Rajah 8Ae dan 8Be). Pewarnaan DAPI terhadap ONL retina pusat telah berkurangan dengan ketara dalam kumpulan BLL (Rajah 8Ad). Walau bagaimanapun, kehadiran sel TUNEL-positif telah dilemahkan dan pewarnaan DAPI pada retina pusat dan periferal ONL telah meningkat dalam kumpulan CTE ditambah BLL (Rajah 8Ai dan 8Bi).
Produk cistanche tubulosa
Bahagian seterusnya Ⅱ akan diteruskan
