BAHAGIAN Ⅱ: Prakondisi Metformin Dan Pasca Kondisi Untuk Mengurangkan Kecederaan Reperfusi Lskemia dalam Model Perfusi Mesin Normotermik Mesin Ex Vivo Terpencil dan Buah Pinggang Babi
Mar 26, 2022
Hubungi:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Tobias M.Huink,Leonie H.Venemal,Rene A.Posma,Nynke J.de Vries, Andrie C.Westerkampl,& et al.
PENGENALAN
Pemindahan buah pinggang adalah rawatan pilihan untuk pesakit dengan penyakit buah pinggang peringkat akhir. Malangnya, permintaan adalah lebih tinggi daripada ketersediaan organ.2 Kekurangan ini telah mengakibatkan peningkatan penggunaan organ kualiti suboptimum daripada pendermaan selepas kematian peredaran darah (DCD) penderma.5 Buah pinggang daripada penderma DCD lebih terdedah kepada kecederaan reperfusi iskemia(IRl), yang dikaitkan dengan insiden tertangguh fungsi cantuman yang lebih tinggi, yang menjejaskan hasil jangka pendek dan jangka panjang.45 IRI disebabkan oleh kemerosotan aliran darah dan reoksigenasi seterusnya, yang mengakibatkan penjanaan spesies oksigen reaktif (ROS), memulakan lata tindak balas selular yang memudaratkan.67 Keterukan iskemia berkorelasi kuat dengan kegagalan cantuman buah pinggang awal selepas pemindahan buah pinggang dan menyumbang kepada peningkatan morbiditi. Oleh itu, iskemia panas (W) semasa pengambilan organ dan implantasi, dan masa iskemia sejuk semasa pemeliharaan, masing-masing, harus diminimumkan. Strategi perfusi mesin boleh memainkan peranan penting dalam mengurangkan IRI dengan membekalkan oksigen semasa fasa iskemia dalam pendermaan organ. Selain itu, ia menyediakan platform untuk menambah agen pelindung yang mungkin sebelum reperfusi (prasyarat) atau semasa reperfusi (pasca-kondisi) dan merupakan kaedah yang sesuai untuk menilai fungsi dan kecederaan buah pinggang jangka pendek.9-11
Biguanidametforminadalah ubat antihiperglisemik oral yang paling banyak digunakan untuk merawat pesakit diabetes jenis 2. Mekanisme tindakan dan kesan pleiotropik daripadametforminterutamanya terhasil daripada perencatan kompleks 1 dalam rantai pernafasan mitokondria.12-14 Oleh itu,metforminboleh melemahkan IRI melebihi tindakan menurunkan glukosa dan telah dicadangkan sebagai agen pelindung organ semasa keadaan di mana IRI berlaku, seperti pemindahan.15,16
Matlamat kajian ini adalah untuk menilai potensi kesan berfaedah prakondisi dan pascakondisi denganmetforminpada IRI dalam dua model ex vivo normothermic machine perfusion (NMP) terpencil yang berbeza menggunakan buah pinggang tikus dan babi.
BERKHASIAT BUAH PINGGANG:CISTANCHE HERBA NAGA
KAEDAH
Kajian tikus
Haiwan.Tikus Lewis jantan seberat 270-300 g telah digunakan (Harlan Laboratories, Boxmeer, Belanda). Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi Universiti Groningen meluluskan protokol kajian (DEC6708C). Haiwan itu mendapat penjagaan mengikut Undang-undang Belanda mengenai Eksperimen Haiwan, mengikut Prinsip Penjagaan Haiwan Makmal Institut Kesihatan Kebangsaan.
Reka bentuk eksperimen, pengambilan organ dan pemeliharaan.Sebanyak 31 ekor tikus dibahagikan kepada 6 kumpulan (n=5-6 setiap kumpulan; Rajah 1). Dalam semua kumpulan, 15 minit W dan 24 jam pemeliharaan sejuk telah digunakan untuk menyebabkan kecederaan iskemia. Prakondisi dilakukan dengan pemberian 300 mg/kgmetformin(1,1-dimethylbiguanide hydrochloride; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) dilarutkan dalam salin (0.9 peratus NaCl) atau salin sahaja melalui gavage oral 12 dan 2 jam sebelum nefrectomy. Saline, 30 mg/Lmetforminatau 300 mg/Lmetformintelah ditambahkan pada minyak wangi sebagai ejen postconditioning. Kepekatan 300 mg/kg berat badan dipilih, kerana dos ini menghasilkan serummetforminkepekatan yang sepadan dengan yang terdapat pada manusia semasa penyelenggaraanmetforminterapi.17
Perolehan buah pinggang dilakukan dengan perubahan kecil pada prosedur DCD, seperti yang diterangkan sebelum ini.18 Ringkasnya, tikus telah dibius dengan 2-5 peratus isoflurane dan laparotomi dilakukan melalui hirisan garis tengah. Antikoagulasi, menggunakan 500 IU heparin (Leo Pharma, Ballerup, Denmark), diberikan melalui vena zakar dorsal. Selepas 15 minit WI, nefrektomi buah pinggang kiri dilakukan. Arteri renal dan ureter di kanulasi. Buah pinggang disiram in situ dengan 10 mL garam (37 darjah ) dan 5 mL 4 darjah Penyelesaian Penyimpanan Sejuk Universiti Wisconsin (UW) (Bridge to Life, Columbia, SC). Setelah dikeluarkan, buah pinggang disiram dengan 5 mL UW sekali lagi dan disimpan dalam UW selama 24 jam pada suhu 4 darjah .
Perfusi mesin normothermik.Kaedah NMP tikus telah diterangkan secara meluas sebelum ini.18 Secara ringkas, NMP dilakukan selama 90 minit menggunakan pam penggelek (Ismatec ISM404, Zürich, Switzerland). Tekanan perfusi ditetapkan pada 102 mmHg, dikawal pada arteri renal. Dalam kumpulan kawalan, cecair perfusi terdiri daripada 100 mL William's Medium E ditambah dengan 30 mmol/L HEPES, 50 g/L albumin, dan 7 mmol/L kreatinin (semua Sigma-Aldrich). Dalam kumpulan eksperimen, sama ada 30 atau 300 mg/Lmetformintelah ditambah kepada minyak wangi. Cecair perfusi telah dioksigenkan dengan 95 peratus oksigen dan 5 peratus karbon dioksida dengan aliran 0.5 L/ min. Suhu cecair perfusi dikekalkan pada 37 darjah menggunakan mandi air dan penukar haba (Julabo, Seelbach, Jerman). Aliran direkodkan setiap 10 minit, menggunakan penderia aliran yang ditentukur (ME1PXN Inline, Transonic Systems, Ithaca, NY). Selepas NMP, biopsi buah pinggang direndam serta-merta dalam 4 peratus formaldehid atau dibekukan dalam nitrogen cecair dan seterusnya disimpan pada suhu -80 darjah .
Rajah 1Perwakilan skematik kumpulan eksperimen. Kumpulan mengandungi 5-7 buah pinggang. HMP, perfusi mesin hipotermia; NMP, perfusi mesin normotermik; WIT, masa iskemia hangat.
Kajian babi
Haiwan.Buah pinggang daripada babi Belanda Landrace betina dikumpulkan dari rumah penyembelihan. Haiwan itu terpegun dan dibuang mengikut prosedur standard tempatan. Semasa exsanguination, kira-kira 1 L darah dikumpulkan dalam bekas yang mengandungi 25,000 IU heparin tak terpecah (Leo Pharma). Oleh kerana bahan buangan rumah sembelih telah digunakan, tiada kelulusan jawatankuasa etika haiwan diperlukan.
Reka bentuk eksperimen, pengambilan organ dan pemeliharaan.Untuk mendorong kecederaan iskemia, 30 minit WI digunakan. Selepas tempoh ini, buah pinggang disiram dengan 180 mL garam pada 4 darjah. Sejurus selepas siram, biopsi kortikal telah diambil (Invivo, Best, The Netherlands) dan disimpan dalam 4 peratus formaldehid penimbal. Untuk menampung pengangkutan dari rumah penyembelihan ke makmal dan sebagai teknik pemuliharaan, arteri renal dikanulasi dan buah pinggang disambungkan pada persediaan perfusi mesin hipotermik (HMP) yang dikawal tekanan berdenyut (Pengangkutan Bantuan Buah Pinggang; Bantuan Organ, Groningen, Belanda. ). Buah pinggang telah diserap pada 4 darjah menggunakan 500 mL UW Machine Perfusion Solution selama 3 jam (Bridge to Life, London, UK) dengan atau tanpa penambahan 2 mgmetformin, dengan tekanan arteri purata 25 mmHg. Oksigen (100 peratus ) telah dibekalkan kepada pengoksigen (Hilite LT1000; Medos Medizintechnik AG, Stolberg, Jerman) dengan kadar aliran tetap 0.1 L/min.
Perfusi mesin normothermik.Buah pinggang telah ditolak menggunakan persediaan NMP ex vivo selama 4 jam yang diterangkan sebelum ini. Dalam kajian kami, meningkatkan dosmetforminatau garam ditambah menggunakan pam infusi. Ringkasnya, selepas HMP, arteri renal disannulasi dan disiram. Ureter telah dikanulasi untuk pengumpulan air kencing. Selepas itu, buah pinggang ditimbang, dan biopsi diambil dan disimpan dalam 4 peratus formaldehid penampan untuk analisis lanjut. Selepas itu, buah pinggang diletakkan dalam litar NMP yang dikawal tekanan ex vivo. NMP telah dilakukan dengan 500 mL leukosit habis,(BioR 02 plus; Fresenius Kabi, Bad Homburg, Jerman) autologous, beroksigen (karbogen, aliran 0.5L/min) darah selama 4 jam pada tekanan arteri purata sebanyak 80 mmHg. Sebatian lain yang ditambah kepada cecair perfusi disediakan dalam Jadual S1. Dalam kumpulan eksperimen,metformindilarutkan dalam larutan laktat Ringer (20 mg/mL; Baxter, Utrecht, Belanda) diselitkan menggunakan pam infusi yang dikawal oleh perisian tersuai di mana profil infusi boleh ditakrifkan (Alaris; CareFusion, Rolle, Switzerland). Setiap 30 minit semasa NMP , kelajuan infusi telah ditingkatkan mengikut jadual yang telah ditetapkan (Jadual S2). Jadual ini adalah berdasarkan data farmakokinetik manusia yang menunjukkan bahawametforminkelegaan adalah empat kali ganda lebih tinggi daripada kelegaan kreatinin.19 Dalam kumpulan kawalan, buah pinggang diperas tanpa penambahanmetformin. Bagi setiap eksperimen, aliran itu direkodkan menggunakan probe aliran clampon (ME7PXL; Sistem Transonik), yang dipasang pada tiub berhampiran dengan arteri buah pinggang. Siasatan aliran ini telah ditentukur untuk tiub yang digunakan. Setiap 15 minit semasa NMP, air kencing dikumpul dan digantikan dengan isipadu larutan Ringer laktat yang sepadan, yang juga direkodkan. Suhu cecair perfusi dikekalkan pada 37 darjah menggunakan penukar haba bersepadu, disambungkan kepada mandi air (Julabo). Sampel darah dan air kencing diambil selepas 15 dan 60 minit dan setiap jam berikutnya untuk analisis biokimia. Apabila NMP telah selesai, biopsi telah diambil dan disimpan dalam 4 peratus penimbal formaldehid, atau disejuk beku dan disimpan pada-80 darjah untuk analisis lanjut.
MENINGKATKAN FUNGSI BUAH PINGGANG SUPPLEMEN CISTANCHE
Kedua-dua kajian
Analisis biokimia.Sampel minyak wangi dan air kencing telah disentrifugasi (1,300 g selama 10 minit dalam model tikus dan 1,000 g selama 12 minit dalam model babi, masing-masing, kedua-duanya pada 4 darjah ) dan supernatan disimpan pada {{7} } ijazah . Lactate dehydrogenase (LDH), aspartate aminotransferase (ASAT), dan kreatinin ditentukan dalam perfusate, dan kreatinin dalam air kencing, masing-masing, oleh Pusat Makmal Pusat Perubatan Universiti Groningen menggunakan analisis biokimia standard. Jumlah protein yang dikumuhkan dalam air kencing tikus diukur menggunakan Pierce BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), manakala jumlah kepekatan protein dalam air kencing babi diukur menggunakan analisis biokimia standard di Pusat Makmal.
Tindak balas rantai polimerase kuantitatif masa nyata.Tindak balas rantai polimerase masa nyata (PCR) telah dijalankan mengikut prosedur standard pada sistem PCR Masa Nyata Tagman Applied Biosystems 7900HT, seperti yang diterangkan sebelum ini.20Penguatan serpihan gen yang terlibat dalam pengawalan nada vaskular (endothelin 1 (EDN-1, pengekodan untuk ET-1); endothelial nitric oxide synthase (eNOS); dan Krüppel-like factor 2 (KLF-2), pengaktifan endothelial (Von Willebrand factor (wWF);molekul lekatan sel vaskular 1(VCAM -1) dan IL-6), dan protein renjatan haba 70(HSP-70) telah dilakukan dengan set primer yang disenaraikan dalam Jadual S3. Ringkasnya, jumlah RNA telah diekstrak daripada bahagian buah pinggang menggunakan TRlzol (Life Technologies, Gaithersburg, MD). CDNA yang diperoleh daripada tikus digunakan sebagai rujukan dalaman semasa PCR untuk menguji kecekapan primer. Ekspresi gen telah dinormalisasi dengan min kandungan mRNA -actin. Keputusan dinyatakan sebagai 2- △ACT, di mana nilai CT mewakili perbezaan antara nilai ambang kitaran.
Rajah 2Parameter perfusi dan fungsi buah pinggang dinilai semasa dan selepas perfusi mesin normotermik buah pinggang tikus dan babi. Jumlah pelepasan kreatinin buah pinggang tikus (a) dan babi (b). Jumlah pengeluaran air kencing (c, d) dan jumlah protein yang dikumuhkan dalam air kencing (e, f) buah pinggang tikus dan babi, masing-masing. Data dipersembahkan sebagai min ± ralat piawai bagi min. Kumpulan mengandungi 5-7 buah pinggang. *P < 0.05="" dan="" **p=""><>
Pemarkahan morfologi.Biopsi yang disimpan dalam 4 peratus formaldehid dibenamkan dalam parafin dan dipotong menjadi kepingan 4 μm. Coupes kemudiannya diwarnai dengan asid berkala Schiff dan dijaringkan pada nekrosis sel tubular proksimal (dari ringan hingga teruk: 1-5), edema (dari ringan hingga teruk:1-4), dan vakuolasi sel tubular proksimal ( bermula dari ringan hingga teruk: 1-4).21 Penilaian histopatologi dilakukan secara buta oleh dua penyelidik. Pakar patologi klinikal bebas dengan pengalaman luas dalam menilai tanda-tanda histopatologi kecederaan selepas perfusi mesin organ tikus dan babi mengesahkan markah.
Pengiraan.Rintangan vaskular intrarenal (IVR) dikira dengan membahagikan tekanan arteri min dengan aliran (dinyatakan dalam mmHg/mL min). Kelegaan kreatinin dikira untuk menganggarkan kadar penapisan glomerular menggunakan persamaan berikut:[kreatinin dalam air kencing]* aliran air kencing/[kreatinin dalam perfusi].
Analisis statistik.Semua data dinyatakan sebagai min± ralat piawai bagi min. Apabila membandingkan dua kumpulan pada satu titik masa, perbezaan telah dinilai menggunakan ujian-t Pelajar yang tidak berpasangan. Perbezaan untuk jumlah pengeluaran air kencing, skor morfologi dan ekspresi gen telah diuji menggunakan analisis varians. Semua ujian statistik adalah dua hujung dan P Kurang daripada atau sama dengan 0.05 dianggap signifikan secara statistik. SPSS Statistics versi 23(IBM, Armonk, NY) telah digunakan untuk semua analisis. Kawasan di bawah lengkung (AUC) telah dikira mengikut peraturan trapezoid, dan digunakan untuk menganggarkan jumlah pelepasan kreatinin, jumlah jumlah protein yang dikumuhkan dalam air kencing, dan jumlah tahap ASAT dan LDH dalam perfusate.
Nota: Herba perubatan Cina tradisional cistanche (juga dikenali sebagai "herba naga" dan "ginseng padang pasir"), tumbuh hanya di padang pasir yang gersang dan hangat. Sebagai salah satu daripada sembilan herba abadi, Cistanche (cistanche tubulosa/cistanche deserticola/desertliving cistanche/cistanche salsa) mengandungi bahan-bahan berkesan yang kaya seperti echinacoside, acteoside, total phenylethanoid glycosides, flavonoid, polisakarida, dsb. bahan-bahan berharga ini yang menjadikan cistanche herba berkhasiat dan bahan makanan untuk imuniti manusia, organ dalaman, dan sel otak dan neuron, dsb. Kajian farmakologi moden telah mengesahkan kesan cistanche (manfaat cistanche): meningkatkan imuniti; meningkatkan fungsi seksual dan fungsi buah pinggang; anti-keletihan; anti penuaan; meningkatkan ingatan; penyakit anti-Parkinson; penyakit anti-Alzheimer; antioksida; mudah-sembelit; anti-radang; menggalakkan pertumbuhan tulang, memutihkan kulit; melindungi hati; dan lain-lain.