BahagianⅡ: Pengasingan Berpandukan Dereplikasi Diglikosida Bersubstitusi Phenylpropanoid Baharu Daripada Cistanche Salsa Dan Aktiviti Perencatannya terhadap NO Pengeluaran dalam Makrofaj
Mar 04, 2022
Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com
Kumpulan 3-metilbutenyl, substruktur aglikon, telah dicadangkan oleh korelasi COZY H-2 dengan H-1a dan H-1b dan korelasi HMBC antara H{{ 4}} dan H-5 dan karbon olefin, pada kC 120.7 (C-2) dan 136.4 (C-3). Dua gugus gula telah ditubuhkan oleh analisis spektrum NMR dan analisis spektrum HPLC bagi hidrolisat asid, dengan corak serpihan MS. Konfigurasi mutlak mereka ditentukan sebagai D-glukosa dan L-rhamnose menggunakan analisis HPLC asid hidrolisat [17]. Bahagian gula ini ditakrifkan sebagai -glukosa dan a-rhamnose dengan menggabungkan pemalar proton anomerik. Spektrum 1H-1H COZY menunjukkan korelasi berjujukan dari H-13 ke H-63 dan dari H-133 ke H-633 (Rajah 4).
Proton glukosa yang diubah suai pada kH 4.70 (H-43) mencadangkan penggantian asil pada glukosa. Daripada spektrum HMBC, korelasi antara H-43 dan C-9333 mengesahkan kedudukan pengganti caffeoyl. Korelasi HMBC antara H-13 dan C-1 (kC 64.5) dan antara H-33 (kH 3.68) dan C-133 (kC 101.2) mencadangkan kedudukan setiap substituen . Sehubungan itu, struktur 6 telah ditentukan sebagai 3-methylbutenyl-O- -L-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)-caffeoyl- -D- glukosa-piranosida dan dinamakan cistansalside B.
Cistansalside C (12), serbuk amorf berwarna perang, ditentukan untuk mempunyai formula molekul C26H38O13 oleh ( tambah )-HR-ESI-QTOF-MS, yang menunjukkan puncak pada m/z 581.2213 [M tambah Na] tambah (calcd). .untuk C26H38O13Na, 581.2205). Satu ion ciri pada m/z 163 mencadangkan bahawa substituen caffeoyl wujud dalam struktur. Ion serpihan pada m/z 325 dan m/z 471 mencadangkan kewujudan unit rhamnose dan unit glukosa.
Perbandingan spektrum NMR 12 dengan 6 menunjukkan bahawa ia adalah serupa kecuali untuk struktur aglikon. Dalam spektrum NMR 12, dua karbon parafin pada kC 38.0 (C-2) dan 24.4 (C-3) diperhatikan dan bukannya dua karbon olefin pada kC 12{{16 }}.7 (C-2) dan 136.4 (C-3) dalam aglikon 6. Kumpulan metil germinal (kH 0.88) dalam aglikon 12 dianjak ke atas medan relatif kepada H-4 dan H-5 (kH 1.71 dan 1.63) dalam aglikon 6 (Jadual 2). Aglikon 12 dicadangkan sebagai 3-kumpulan metil butil, yang disahkan oleh spektrum 1H dan COZY NMR. Puncak 3-kumpulan metil butil diperhatikan pada 3.81 (1H, m, H-1a), 3.48 (1H, m, H-1b), 1.71 (1H, m , H-3), 1.44 (2H, m, H-2) dan 0.88 (H-4, 5).
Dua gugus gula telah disahkan semula oleh analisis HPLC bagi asid hidrolisat dan analisis spektrum NMR serta corak serpihan MS. Konfigurasi mutlak gula telah dikenal pasti sebagai D-glukosa dan L-rhamnose menggunakan analisis HPLC asid hidrolisat [17]. Bahagian A -glukosa dan bahagian a-rhamnose telah disahkan dengan pemalar gandingan proton anomerik. Spektrum 1H-1H COZY menunjukkan korelasi berjujukan dari H-13 ke H-53, dari H-133 ke H-333 dan dari H{{11} } hingga H-433 (Rajah 4).
Kedudukan substituen telah disahkan melalui analisis HMBC. Dalam spektrum HMBC, korelasi antara H-13 dan C-1 (kC 67.2), antara H-33 (kH 3.68) dan C-133 (kC 101.2) dan antara H-43 (kH 4.70) dan C-9333 (kC 165.7) telah dikesan. Akibatnya, struktur 12 telah ditubuhkan sebagai 3-metil butil-OaL-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)-caffeoyl- -D-glucose-pyranoside dan bernama cistansalside C.
Cistansalside D (17), serbuk perang amorfus, telah ditentukan untuk mempunyai formula molekul C31H38O14 oleh mod positif ESI-QTOF-MS resolusi tinggi, yang menunjukkan puncak ion tambah pada m/z 657.2147 [M tambah Na] tambah (kira. untuk C31H38O14Na, 657.2154). Ion serpihan termasuk [M tambah H x Aglycone x Rha x Acetyl Glc] tambah ion pada m/z 147, a [M tambah H x Aglycone x Rha] tambah ion pada m/z 351 dan [M tambah H x Aglycone] ion tambah pada m/z 497 turut dikesan. Satu ion ciri pada m/z 147 mencadangkan bahawa substituen kumarayl terdapat dalam strukturnya. Ion serpihan pada m/z 351 dan m/z 497 mencadangkan kewujudan unit rhamnose dan unit glukosa digantikan asetil.
Cistansalside daripadaherba cistanche
Spektrum 13C-NMR mendedahkan kehadiran 31 atom karbon. Dua proton anomerik pada kH 4.61 (1H, m, H-13) dan 4.60 (1H, s, H{{10}}) diperhatikan dalam spektrum 1H dan HSQC . Spektrum 1H-NMR menunjukkan kehadiran kumpulan metil pada 1.97 (3H, s, asetil-CH3), trans-olefin pada kH 7.55 (1H, d, J=15.9 Hz, H{{ 25}}) dan 6.34 (1H, d, J=15.9 Hz, H-8333) dan dua gelang benzena yang digantikan para pada kH 7.53 (2H, d, J=6. 9 Hz, H-3333, 5333) dan 6.79 (2H, d, J=6.9 Hz, H{-2333, 6333)/ kH 6.98 (2H, d, J {{5 0}}.0 Hz, H-2, 6) dan 6.65 (2H, d, J=8.0 Hz, H-3, 5) (Jadual 2) . Daripada spektrum HMBC NMR, korelasi antara karbon karbonil pada kc 165.5 (C-9333) dan H-8333 dan antara H-2333, 6333 dan C-7333 (kc 145.4) mencadangkan kumpulan (E)-coumaroyl. Korelasi HMBC antara puncak metil proton dan karbon karbonil pada kc 169.0 mengesahkan kehadiran kumpulan asetil.
4-Kumpulan hidroksifenil telah dicadangkan berdasarkan korelasi HMBC antara H-3, 5, dan karbon aromatik kuaternari pada kC 155.6 (C-4) dan 128.6 (C-1) . Kumpulan etil terhidroksilasi telah disahkan oleh isyarat COZY NMR pada kH 2.66 (2H, t, J=6.1 Hz, H-7), 3.90 (1H, m, H-8a ) dan 3.54 (1H, m, H-8b). Korelasi HMBC antara H-7 dan C-1 (kC 128.6) dan C-2, 6 (kC 129.7) mencadangkan 4-kumpulan hidroksifeniletil, sebagai substruktur aglikon.
Dua bahagian gula, yang dicadangkan daripada corak serpihan MS, telah disahkan semula oleh analisis HPLC bagi asid hidrolisat dan spektrum NMR. D-glukosa dan L-rhamnose telah dijelaskan menggunakan analisis HPLC asid hidrolisat [17]. Bahagian A -glukosa dan bahagian a-rhamnose telah ditubuhkan dengan menggabungkan pemalar proton anomerik. Spektrum 1H-1H COZY menunjukkan korelasi berjujukan dari H-13 ke H-53 dan dari H-133 ke H-633 (Rajah 4).
Daripada spektrum 1H-NMR, anjakan medan bawah H-23 (kH 4.69) dan H-43 (kH 4.80) mencadangkan kedudukan digantikan asil pada glukosa. Sambungan antara glukosa dan dua kumpulan asil telah disahkan oleh korelasi HMBC antara H-43 (kH 4.80) dan C-9333 dan antara H-23 dan karbonil karbon bagi kumpulan asetil (kC 169.0 ). Kedudukan aglikon dan rhamnose diberikan oleh korelasi HMBC antara H-33 (kH 3.95) dan C-1333 dan antara H-8 dan C-13. Sehubungan itu, struktur 17 telah ditetapkan sebagai 4-hydroxyphenylethyl-2-O-acetyl-O- -L-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)- coumaroyl- -D-glucopyranoside dan dinamakan cistansalside D.
Cistansalside E (18) telah diasingkan sebagai serbuk coklat amorf. Formula molekulnya ditentukan sebagai C31H38O14 oleh data 13C-NMR dan mod positif puncak ESI-QTOF-MS resolusi tinggi pada m/z 657.2166 [M tambah Na] tambah (kira. untuk C31H38O14Na, 657.2154). Selain itu, ion serpihan termasuk ion caffeoyl pada m/z 163, ion tambah [M tambah H x Aglycone x Rha] pada m/z 367 dan ion [M tambah H x Aglycone] pada m/z 513 juga dikesan. Ion serpihan mencadangkan kewujudan unit rhamnose dan unit glukosa digantikan asetil.
Spektrum 1H-NMR mencadangkan kehadiran dua proton anomerik pada kH 4.63 (1H, d, J=8.2 Hz, H-13) dan 4.60 (1H, s, H-133 ) dan dua proton glukosa digantikan asil pada kH 4.71 (1H, dd, J=8.9, 8.2 Hz, H-23) dan 4.81 (1H, dd, J=9.7 , 9.5 Hz, H-43). Spektrum 1H dan HMBC mencadangkan kewujudan kumpulan asetil pada kH 1.94 (3H, s, asetil-CH3), bahagian (E)-caffeoyl pada kH 7.48 (1H, d, J=15.9 Hz, H-7333), 7.02 (1H, d, J=1.6 Hz, H-2333), 6.98 (1H, dd, J=8.1, 1.6 Hz, H-6333), 6.76 (1H,d, J=8.1 Hz, H-5333) dan 6.21 (1H, d, J=15.9 Hz, H{ {67}}) dan gelang benzena mono diganti pada kH 7.29 (2H, m, H-3, 5), 7.21 (2H, m, H-2, 6) dan 7.20 (1H, m, H-4) (Jadual 2). Kumpulan fenilmetil, substruktur aglikon, telah dicadangkan oleh korelasi HMBC antara H-7 (2H, kH 2.80, m) dan C-1 (kC 138.8) dan antara H-7 dan C -2, 6 (kC 128.9) dan isyarat NMR COZY bagi H-7 dengan H-8a (1H, kH 3.99, m) dan H-8b (1H, kH 3.63, m).
Dua gugus gula telah disahkan semula oleh analisis HPLC bagi asid hidrolisat dan analisis spektrum NMR. Konfigurasi mutlak gula telah dijelaskan menggunakan analisis HPLC bagi asid hidrolisat, yang telah disahkan sebagai D-glukosa dan L-rhamnose [17]. Bahagian A -glukosa dan bahagian -rhamnose telah ditubuhkan dengan menggabungkan pemalar proton anomerik. Spektrum 1H-1H COZY menunjukkan korelasi berjujukan dari H-13 ke H-53, dari H-133 ke H-233 dan dari H{{11} } hingga H-333 (Rajah 4).
Daripada spektrum HMBC, korelasi antara H{{0}} dan C-8 (kC 69.4), antara H-23 dan karbon karbonil kumpulan asetil (kC 169.1), antara H-33 (kH 3.95) dan C-133 (kC 102.0) dan antara H-43 (kH 4.81) dan C-9333 (kC 165.6) mengesahkan kedudukan substituen dalam struktur. Oleh itu, struktur 18 ditentukan sebagai phenylethyl-2-O-asetil-OaL-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)-caffeoyl- -D-glucopyranoside dan bernama cistansalside E.
Kebanyakan substituen trans-cinnamoyl telah diisomerkan kepada cis-isoform secara in vitro. Cahaya telah dilaporkan menukarkan derivatif asid trans-sinamik kepada cis-isoform [18,19]. Keseimbangan penukaran trans-cis bagi substituen cinnamoyl diperhatikan untuk mengekalkan kira-kira 70 peratus daripada isolat dalam trans-isoform. Untuk proton olefin dalam bentuk cis, memuncak pada kira-kira 6.90 ppm(d, J=12~13 Hz, H-7333) dan 5.80 ppm (d, J=12~13 Hz, H-8333) boleh ditetapkan dalam spektrum 1H-NMR, manakala puncak pada kira-kira 7.55 ppm (d, J=15.8 Hz, H-7333) dan 6.40 ppm (d, J { {28}}.8 Hz, H-8333)dicerap untuk perubahan [20]. Dalam spektrum 1H-NMR campuran trans-cis, puncak untuk dua proton olefin (H-7333 dan H-8333) diperhatikan dalam nisbah 7:3 (trans:cis). Puncak 13C-NMR bagi bentuk cis adalah serupa dengan penjelmaan.
Bahan-bahan berkesan daripada cistanche: acteosides
Semua pencilan telah diuji untuk kesan perencatannya pada pengeluaran NO yang disebabkan oleh LPS dalam RAW
Semua isolat telah diuji untuk kesan perencatannya pada pengeluaran NO yang disebabkan oleh LPS dalam sel RAW 264.7. Dexamethasone digunakan sebagai kawalan positif dan IC50nya ialah 7.0 uM. Daripada sebatian yang diuji, sebatian 5 (IC50 42.7 o 6.6 uM), 11 (IC50 37.3 o 2.2 uM), 13 (IC50 40.{{2{{ 24}}}} o 4.0 uM) dan 18(IC50 27.9 o 0.8 uM) menunjukkan aktiviti perencatan sederhana pada NO sintase teraruh, manakala sebatian lain tidak aktif dalam ujian ini (IC50 nilai > 100 uM). Untuk mengesahkan sama ada sebatian ini mempunyai sitotoksisiti, daya maju sel diukur menggunakan ujian MTT. Akibatnya, tiada seorang pun daripada mereka menunjukkan sitotoksisiti yang ketara (Tambahan Rajah S6-1). Empat sebatian ini dipilih untuk menilai aktiviti perencatan mereka terhadap laluan NF-λB dalam sel RAW 264.7 yang dirangsang LPS. Rangsangan sel RAW 264.7 dengan LPS menyebabkan fosforilasi I入B dan NF-入B (p65) selepas 0.5 jam pengeraman. Fosforilasi NF- 入 B (p65) telah dikurangkan dengan ketara melalui prarawatan dengan sebatian 11, 13 dan 18 seperti yang ditunjukkan oleh analisis western blot (Rajah 5). Oleh itu, sebatian 11, 13 dan 18 mungkin memberikan kesan anti-radang melalui perencatan NF-入B dalam makrofaj.
Rajah 5.Kesan empat sebatian pada fosforilasi I入B dan NF-入B (p65) dalam sel RAW 264.7 yang dirangsang LPS. (A) Blot barat telah dijalankan dalam LPS dan sel RAW 264.7 yang dirawat sampel; (B, C) Isyarat imunoblot dikira menggunakan perisian Molecular Analyst/PC densitometri (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Analisis densitometrik isoform terfosforilasi dilaporkan. NF- 入 B dalam sel RAW 264.7 telah dinormalkan kepada kandungan -aktin.
3. Bahan dan Kaedah
3.1. Eksperimen Am Prosedur
Putaran optik diukur dengan polarimeter digital Jasco P-2000 (Jasco, Tokyo, Jepun). Spektrum UV telah direkodkan pada spektrometer Chirascan plus Circular Dichroism (Chirascan, APL, UK). Spektrum IR telah dirakam menggunakan spektrofotometer Jasco FT/IR-4200. Pengionan elektrospray resolusi tinggi spektrometri jisim quadrupole-time-of-flight (HR-ESI-qTOF-MS) telah dilakukan pada Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS yang dilengkapi dengan siri Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Inc. , Palo Alto, CA, USA) dan lajur yang digunakan ialah lajur Jasco SFCpak Crest C18T-5 (id 150 4.6 mm, 5 um). Perisian MassHunter Workstation digunakan untuk pemerolehan data.
Spektrum NMR 1D (1H dan 13C) dan 2D (1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) diperoleh dengan Jeol LA 300 (Jeol, Tokyo, Jepun), Bruker AVANCE-400, Bruker Spektrometer AVANCE-500, Bruker AVANCE-600 dan Bruker AVANCE 800 HD digandingkan dengan cryoprobe (Bruker, Ettlingen, Jerman). DMSO-d6 (Cambridge Isotope Laboratories, Di Cistanche Andover, MA, USA) digunakan sebagai pelarut NMR dan puncak rujukan (kH 2.50 dan kC 39.5). Kromatografi lajur (CC) dilakukan menggunakan Sephadex LH-20 (25–100 um; Pharmacia, Uppsala, Sweden) atau Kieselgel 60 gel silika (40–63 um, 230–400 mesh, Art. 9385; Merck, Darmstadt , Jerman). Kromatografi lapisan nipis (TLC) telah dijalankan pada plat Kieselgel 60 silika gel F254 pra-bersalut (Art. 5715; Merck). Tompok pada TLC dikesan menggunakan lampu UV pada 254 nm dan 365 nm (VL-4.LC, 365/254; Vilber Lourmat, Torcy, Perancis). Kromatografi cecair tekanan sederhana (MPLC) dilakukan pada lajur kilat silika RediSep 120 g (Isco, Lincoln, NE, USA) dan gel silika Kiesegel 60 (40–63 um, 230–400 mesh, Art. 9385; Merck) menggunakan Rakan kombiflash (Isco). Sistem kromatografi cecair tekanan tinggi (HPLC) ialah HPLC Gilson yang dilengkapi dengan pam Gilson 321 dan pengesan UV.VIS 151 (Gilson, Middleton, WI, USA), menggunakan lajur ODS separuh persediaan (Luna 5 um C18 (2) 100 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Phenomenex Inc., Torrance, CA, USA; Hypersil GOLD™ aQ 175 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Thermo Scientific™, Hennigsdorf, Jerman; Inno C18 lajur 120 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Young Jin Biochrom Co., Ltd., Seongnam, Korea). Sistem RP-HPLC analitik ialah sistem perikatan Waters 2695 dengan pengesan a996 Photodiode Array (PDA) (Waters Corp, Milford, MA, USA), dan lajur yang digunakan ialah lajur Hypersil™ BDS C18 (130 Å, id 150: 4.6 mm, 5 um, Thermo Scientific™). Asid formik dibeli daripada Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. (Seoul, Korea). Pelarut gred HPLC telah dibeli daripada Fisher Scientific Korea Ltd. (Seoul, Korea). H2SO4, Na2CO3, dan pelarut gred pertama untuk pengekstrakan, pecahan dan pengasingan telah dibeli daripada Daejung Chemical & Metals Co. Ltd. (Seoul, Korea). L- dan D-cysteine methyl ester hydrochloride dan o-tolylisothiocyanate telah dibeli dari Tokyo Chemical Industry (Tokyo, Jepun).
3.2. Tumbuhan bahan
Keseluruhan tumbuhan daripadasalsa cistanche, yang dikutip dari Shinjang Uyghur, diimport melalui Syarikat Pemborong Farmaseutikal Daerim (Cheongju, Korea). Mereka telah dikenal pasti oleh Prof. Dr. Jehyun Lee (Dongguk University, Seoul, Korea). Spesimen baucar (SNUPH2016-03) telah disimpan di Herbarium of Medicinal Plant Garden, College of Pharmacy, Seoul National University.
3.3. Pengekstrakan dan Pengasingan
Seluruh tumbuhan kering daripadasalsa cistanche(5.7 kg) dicincang dan diekstrak tiga kali dengan MeOH (2{16}} L) pada suhu bilik dengan sonikasi selama 99 minit. Selepas penyingkiran pelarut dalam vakuo, Ekstrak mentah (1.35 kg) digantung dalam H2O (5 L), kemudian dibahagikan dengan EtOAc (5 L). Sisa EtOAc (55.3 g) diasingkan kepada 16 pecahan (E01-16) pada kromatografi gel silika yang dielusi dengan CHCl3/MeOH (50:1–0:1, sistem kecerunan langkah).
E08 (611.7 mg) tertakluk kepada kromatografi cecair tekanan sederhana gel silika (25 g) dan dicairkan dengan CHCl3/MeOH (18:1–0:1, sistem kecerunan langkah) dan memberikan 11 pecahan (E08a-k). Daripada E08g, sebatian 13 (0.7 mg) dan 18 (0.6 mg) telah ditulenkan menggunakan lajur Luna 5 um HPLC dan elusi isokratik dengan 28 peratus aq. MeCN. Pembersihan HPLC (Hypersil GOLD, 25 peratus aq. MeCN) daripada E08h (138.5 mg) sebatian berperabot 7 (10.6 mg), 8 (17.2 mg), 14 (13.4 mg) dan 17 (4.9 mg).
E09 (1.15 g) telah ditulenkan lagi pada lajur silika-MPLC (20} g) yang dicairkan dengan CHCl3/MeOH (10:1–0:1, langkah- sistem kecerunan) untuk memberikan 11 subfraksi (E09a-k). E09e (398.7 mg) telah tertakluk kepada Sephadex LH-20 (MeOH) dan menghasilkan lapan subfraksi (E09e1-8). E09e6 kemudiannya disucikan menggunakan lajur Hypersil GOLD HPLC (22 peratus aq. MeCN) untuk menghasilkan kompaun 11 (0.4 mg). Daripada E09e7, kompaun 5 (0.6 mg) telah disucikan dengan elusi isokratik daripada lajur Luna 5 um HPLC dengan 40 peratus aq. MeOH.
E10 (1.20} g) dipisahkan kepada sembilan pecahan (E10ai) pada lajur Sephadex LH-20 yang dicairkan dengan MeOH. Daripada E1{31}}g (147.5 mg), sebatian 4 (13.4 mg), 9 (8.0 mg) dan 15 (5.0 mg) telah diasingkan melalui pemisahan HPLC (Inno, 23 peratus aq. MeCN). Pecahan E10h (470.0 mg) telah ditulenkan pada lajur Hypersil GOLD dengan elusi isokratik (40 peratus aq. MeOH) untuk menghasilkan sebatian 1 (3.8 mg), 10 (42.1 mg) dan 16 (3.0 mg).
E11 (2.96 g) telah tertakluk kepada Sephadex LH-20 elusi dengan MeOH untuk memberikan sembilan pecahan (E11a-i). E11e dipisahkan oleh kartrij Sep-Pak C18 yang mengelusi secara berperingkat dengan 10 peratus , 20 peratus , 30 peratus , 50 peratus dan 100 peratus aq. MeOH untuk menghasilkan tujuh pecahan (E11e1-7), diikuti oleh Luna 5 um HPLC (28 peratus aq. MeCN) untuk memberikan sebatian 3 (3.4 mg), 6 (1.4 mg) dan 12 (1.2 mg).
E12 (19.0 g) tertakluk kepada silika MPLC (120 g) menggunakan sistem kecerunan langkah CHCl3/MeOH untuk memberikan enam pecahan (18:1–0:1 , E12a-f). E12f telah dikromatografi pada lajur Sephadex LH-20 (MeOH), menghasilkan tujuh pecahan (E12f1-7). Pembersihan HPLC (Hypersil GOLD, 25 peratus aq. MeCN) daripada kompaun berperabot E12f7 2 (3.3 mg). Semua pelarut yang digunakan untuk HPLC ialah 0.05 peratus penimbal asid formik. Kadar alir biasa untuk kromatografi HPLC dan MPLC ialah 3 dan 40 mL/min, masing-masing.
3.4.Pencirian
Cistansalside A (5): serbuk amorf berwarna perang; [ |20 x33.7 (c 0.1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 332 (3.18); IR (kemas) vmax 3359, 1748, 1705, 1602, 1516 cmx1; Data 1H-NMR (800 MHz) dan 13C-NMR(200 MHz), lihat Jadual 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M tambah Na] tambah 645.2146 (kira untuk C30H38O14Na, 645.2154).
Cistansalside B (6): serbuk amorf coklat; [ |20 x72.9 (c 0.1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 333 (3.32); IR (kemas) vmax 3400, 1705, 1603, 1516 cmx1; Data 1H-NMR (500 MHz) dan 13C-NMR (125 MHz), lihat Jadual 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M tambah Na] tambah 579.2054 (kira untuk C26H36O13Na, 579.2048).
Cistansalside C (12): serbuk amorf coklat; [ |20 x61.6 (c 0.1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 337 (3.25); IR (kemas) vmax 3359, 1704, 1602, 1508 cmx1; Data 1H-NMR (800 MHz) dan 13C-NMR (200 MHz), lihat Jadual 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M tambah Na] tambah 581.2213 (kira untuk C26H38O13Na, 581.2205).
Cistansalside D (17): serbuk amorf coklat; [ |20 x51.1 (c 0.1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 221 (3.53), 315 (3.52); IR (kemas) vmax 3358, 1746, 1722, 1603, 1516, 1232, 1157, 1039 cmx1; Data 1H-NMR(400 MHz) dan 13C-NMR (75 MHz), lihat Jadual 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M tambah Na] tambah 657.2147 (kira untuk C31H38O14Na, 657.2154).
Cistansalside E (18): serbuk amorf coklat; [ |20 x59.2 (c 0.1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 336 (3.22); IR (kemas) vmax 3370, 1741, 1712, 1602, 1231, 1157 cmx1; Data 1H-NMR (800 MHz) dan 13C-NMR(200 MHz), lihat Jadual 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M tambah Na] tambah 657.2166 (kira untuk C31H38O14Na, 657.2154)
3.5.HPLC-QTOF-MS Analisis
Analisis spektrometri jisim kromatografi telah dilakukan pada sistem LC siri Infiniti Agilent 1260 (Agilent Technologies, Inc., USA). Lajur analisis ialah lajur SFCpak Crest C18T-5 (id 15{{10}} : 4.6 mm, 5 um, Jasco, Jepun). Fasa mudah alih terdiri daripada 0.1 peratus (v/v) asid format dalam MeCN (A) dan air (B) menggunakan elusi kecerunan 0–35 min (23 peratus A), 35–45 min ( 23–28 peratus A), 45–75 min (28 peratus A) dan 75–80 min (90 peratus A). Kadar aliran dikekalkan pada 0.3 mL/min. Penyerapan diukur pada 320 nm. Keadaan sumber ESI adalah seperti berikut: kadar aliran gas pengeringan (N2), 10 L/min; suhu gas pengeringan, 350 darjah; nebulizer, 30 psig; kadar aliran gas sarung, 12.0 L/min; suhu gas sarung, 350 darjah; kapilari, 4000 V; skimmer, 60 V; RF oktapole, 750 V; voltan pemecah, 180 V; mod positif. Sistem ini dikendalikan di bawah perisian stesen kerja Masshinter. Julat jisim ditetapkan pada m/z 50–1000.
3.6.Asid Hidrolisis
Sebatian telah dihidrolisiskan menggunakan 1 N H2SO4 (100 uL) yang dipanaskan dengan mandi air pada 90 darjah selama2 jam, kemudian dineutralkan dengan larutan Na2CO3 tepu akueus. Selepas larutan dikeringkan di bawah aliran N2, produk dan gula piawai (D-Glc, L-Glc, L-Rha) telah dilarutkan dalam piridin (100 uL) yang mengandungi L-cysteine methyl ester hydrochloride (0.5 mg). Sampel L-rhamnose telah dilarutkan dalam piridin (100 uL) yang mengandungi D-sistein metil ester hidroklorida (0.5 mg). Selepas itu, mereka dipanaskan pada 60 darjah selama 1 jam. Penyelesaian telah dirawat dengan 1 uL (1.11 mg) o-tolylisothiocyanate, yang dipanaskan semula pada 60 darjah selama 1 jam. Setiap campuran akhir dianalisis secara langsung dengan analisis RP-HPLC (lajur Hypersil™ BDS C18, 17 peratus aq. MeCN, 0.8 mL/min, 40 min, 35 darjah). TR bagi puncak pada 21.9 dan 40.4 min bertepatan dengan terbitan thiocarbamoyl thiazolidine bagi D-glukosa dan L-rhamnose, masing-masing.
3.7. sel budaya
Makrofaj Murine, RAW 264.7, diperoleh daripada Institut Penyelidikan Biosains dan Bioteknologi Korea (Daejeon, Korea), dan ditanam dalam medium RPMI yang mengandungi 10 peratus serum lembu janin dan 100 U/mL penisilin/streptomisin sulfat. Sel telah diinkubasi dalam atmosfera CO2 5 peratus yang dilembapkan pada 37 darjah.
3.8.Ubat dan Bahan Kimia
RPMI, penicillin dan streptomycin telah dibeli daripada HyClone (Logan, UT, USA). Albumin serum lembu dan LPS dibeli dari Sigma (St. Louis, MO, Amerika Syarikat).
3.9.Pengukuran TIADA Pengeluaran
Kepekatan nitrit dalam medium kultur diukur sebagai penunjuk penghasilan NO mengikut tindak balas Griess. Sel-sel telah disemai pada 2: 105 sel/telaga dalam 96-plat kultur telaga. Selepas pra-pengeraman sel RAW 264.7 selama 18 jam, sel tersebut telah dirawat terlebih dahulu dengan sebatian (50 uM, 10 uM, 5 uM atau 1 uM) dan dirangsang dengan LPS (500 ng/mL) selama 24 h. Sebatian ujian terlarut dalam DMSO. Sel juga dirawat dengan 0.05 peratus DMSO sebagai kawalan kenderaan. Sel RAW 264.7(2: 105 sel/telaga) telah dikultur dalam 96-plat perigi menggunakan RPMI tanpa fenol merah dan prarawat dengan sampel selama 0.5 jam. Pengeluaran NO selular disebabkan oleh penambahan LPS kepekatan akhir 500 ng/mL dan pengeraman 24 jam. Selepas pengeraman, 100 uL media terkondisi dicampur dengan jumlah reagen Griess yang sama dan diinkubasi selama 15 minit. Penyerapan campuran pada 540 nm diukur dengan pembaca mikroplat ELISA (Benchmark, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, Amerika Syarikat). Nilai yang diperolehi dibandingkan dengan kepekatan standard natrium nitrit terlarut dalam RPMI, dan kepekatan nitrit dalam media terkondisi sel yang dirawat sampel telah dikira.
3.10.3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide (MTT) Assay for Cell Viability
Sel telah disemai ke dalam {{0}}plat perigi pada ketumpatan 5: 104 sel/telaga dan diinkubasi dengan media bebas serum dengan kehadiran sampel. Sebatian ujian terlarut dalam DMSO. Sel juga dirawat dengan 0.05 peratus DMSO sebagai kawalan kenderaan. Selepas pengeraman selama 24 jam, 10 uL MTT (5 mg/mL dalam garam) ditambah dan pengeraman diteruskan selama 4 jam lagi. Dehidrogenase suksinat mitokondria dalam sel hidup menukarkan MTT menjadi kristal formazan yang kelihatan semasa pengeraman. Hablur formazan kemudiannya dilarutkan dalam dimetil sulfoksida dan penyerapan diukur pada 540 nm menggunakan pembaca plat mikro ujian imunosorben berkaitan enzim (ELISA) (Tanda Aras, Makmal Bio-Rad). Daya maju sel relatif dikira berbanding dengan penyerapan kumpulan kawalan yang tidak dirawat. Semua eksperimen dilakukan dalam tiga kali ganda.
3.11.Analisis Immunoblot
Ekspresi protein dinilai oleh western blotting mengikut prosedur standard. Secara ringkas, sel RAW264.7 telah dikultur dalam 6{{2{0}} hidangan kultur mm (2: 106/mL), diikuti dengan prarawatan 50 uM sebatian . Sel telah dibasuh dua kali dalam PBS sejuk ais (pH 7.4), pelet sel telah digantung semula dalam penimbal lisis pada ais selama 15 minit, dan serpihan sel kemudiannya dikeluarkan dengan sentrifugasi. Kepekatan protein ditentukan menggunakan reagen ujian protein Bio-Rad mengikut arahan pengilang. Protein (20–30 ug) dicampur 1:1 dengan 2: penimbal sampel (20 peratus gliserol, 4 peratus SDS, 10 peratus 2- ME, 0.05 peratus bromophenol blue, dan 1.25 M Tris [pH 6.8]), dimuatkan pada 8 atau 15 peratus gel SDS-PAGE, dan dijalankan pada 150 V selama 90 minit. Protein selular telah dipindahkan ke membran Immunoblot polyvinylidene diuoride (Bio-Rad) menggunakan sistem pemindahan separuh kering Bio-Rad mengikut arahan pengilang. Membran kemudian diinkubasi semalaman dengan antibodi utama p-NF-入B, NF-入B, pI入B dan -actin masing-masing (Abcam, Cambridge, UK) dalam salin penampan Tris yang mengandungi 5 peratus susu skim dan 0.1 peratus Tween 20. Keesokan harinya, bintik-bintik itu dibasuh tiga kali dengan garam penampan Tris (0.1 peratus Tween 20) dan diinkubasi selama 1 jam dengan antibodi anti-IgG sekunder terkonjugasi HRP (dicairkan 1:2000–1 :20,000). Tompokan itu dibasuh lagi tiga kali dengan garam Tris-buffered (0.1 peratus Tween 20), dan jalur imunoreaktif dibangunkan menggunakan substrat chemiluminescent ECL Plus (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, Amerika Syarikat).
3.12.Analisis Statistik
Data eksperimen dibentangkan sebagai min o SEM. Tahap keertian statistik ditentukan oleh analisis varians (ANOVA) diikuti dengan ujian-t Dunnett untuk pelbagai perbandingan. Nilai p kurang daripada 0.05 dianggap signifikan.
Ekstrak salsa cistanche
4. Kesimpulan
Dalam kajian ini, kami mengasingkan dan menjelaskan struktur lima glikosida digantikan fenilpropanoid baharu, dinamakan cistansalside AE (5, 6, 12, 17, dan 18), di samping mengasingkan dan mengenal pasti 13 sebatian yang diketahui, menggunakan strategi penyahplikasian. Sebatian yang diketahui telah ditentukan sebagai lipedoside AI (1) [21], 23-acetylacteoside (2) [22], isocistanoside C (3) [15], osmanthuside B (4) [21], epimeridinoside A ( 7) [15], cistanoside D (8) [23], salsaside B (9) [6], tubuloside E (10) [16], cistanoside M (11) [15], isomartynoside (13) [24], salsaside C (14) [6], jionoside C (15) [25] dan salsaside F (16) [6]. Struktur mereka telah ditubuhkan melalui analisis data spektroskopi yang luas dan dengan perbandingan dengan data yang dilaporkan dalam kesusasteraan. Ia telah disahkan bahawa struktur yang diramalkan secara tentatif bagi glikosida digantikan dengan fenilpropanoid dipadankan dengan betul dengan struktur sebenar mereka.
Manfaat ekstrak salsa Cistanche
Rujukan
1. Shimamura, H.; Miyazawa, M.; Enomoto, K.; Nakamura, S.-I.; Kameoka, H. Penindasan Aktiviti Pengaruh SOS bagi Trp-P-1 oleh Asid Lemak daripada Cistanche salsa dalam Ujian umu Salmonella Typhimurium TA1535/pSK1002. Nat. Prod. Lett. 1997, 10, 261–265. [CrossRef]
2. Jeon, E.; Chung, K.-S.; An, H.-J. Kesan Anti-Proliferasi salsa Cistanches pada Perkembangan Hiperplasia Prostatik Benign. boleh. J. Physiol. Pharmacol. 2016, 94, 104–111. [CrossRef] [PubMed]
3.Xu, C.; Jia, X.; Xu, R.; Wang, Y.; Zhou, Q.; Sun, S. Diskriminasi Pantas Herba Cistanches oleh cap jari makro inframerah berbilang langkah digabungkan dengan pemodelan bebas lembut bagi analogi kelas (SIMCA). Spectrochim. Acta Bahagian A Mol. Biomol. SpectrosCistanche2013, 114, 421–431. [CrossRef] [PubMed]
4. Jiang, Y.; Li, SP; Wang, YT; Chen, XJ; Tu, PF Pembezaan Herba Cistanches dengan cap jari dengan kromatografi cecair berprestasi tinggi-diod array pengesanan-spektrometri jisim. J. Chromatogr. 2009, 1216, 2156–2162. [CrossRef] [PubMed]
5. Kobayashi, H.; Karasawa, H.; Miyase, T.; Fukushima, S. Kajian tentang Konstituen Cistanchis Herba. V. Pengasingan dan Struktur Dua Glikosida Phenylpropanoid Baharu, Cistanosides E dan F. Chem. Pharm. lembu jantan. 1985, 33, 1452–1457. [CrossRef]
6.Lei, L.; Jiang, Y.; Liu, X.-M.; Tu, P.-F.; Wu, L.-J.; Chen, F.-K. Glycosides baharu daripada Cistanche salsa. Helv. Chim. Acta 2007, 90, 79–85. [CrossRef]
7. Kartbaeva, EB; Sakipova, ZB; Ibragimova, LN; Kapsalyamova, EN; Ternynko, II Kajian komposisi sebatian fenolik Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck, tumbuh di Republik Kazakhstan. J. Chem. Pharm. Res. 2015, 7, 120–122.
8. Liu, J.-Y.; Guo, Z.-G.; Zeng, Z.-L. Pengumpulan glikosida phenylethanoid yang dipertingkatkan dengan penyusuan prekursor kepada budaya penggantungan salsa Cistanche. Biokim. En. J. 2007, 33, 88–93. [CrossRef]
9. Maruyama, S.; Akasaka, T.; Yamada, K.; Tachibana, H. Ekstrak salsa Cistanche bertindak serupa dengan protein terikat
polisakarida-K (PSK) pada pelbagai jenis garisan sel. J. Tradit. Med. 2008, 25, 166–169.
10. Tian, X.-F.; Pu, X.-P. Glikosida phenylethanoid daripada salsa Cistanches menghalang apoptosis yang disebabkan oleh 1-metil-4-ion phenylpyridinium dalam neuron. J. Ethnopharmacol. 2005, 97, 59–63. [CrossRef] [PubMed]
11.Michel, T.; Halabalaki, M.; Skaltsounis, AL Konsep Baharu, Pendekatan Eksperimen dan Strategi Dereplikasi untuk Penemuan Fitoestrogen Novel daripada Sumber Semula Jadi. Planta Med. 2013, 79, 514–532. [CrossRef] [PubMed]
12.De Medeiros, LS; Abreu, LM; Nielsen, A.; Ingmar, H.; Larsen, TO; Nielsen, KF; Rodrigues-Filho, E. Pengasingan berpandukan dereplikasi depside theaflavin ST dan lecanora DF daripada kulat endofit Setophoma sp. Fitokimia 2015, 111, 154–162. [CrossRef] [PubMed]
13.Rakotondraibe, LH; Rasolomampianina, R.; Park, H.-Y.; Li, J.; Slebodnik, C.; Brodie, PJ; Blasiak, LC; Bukit, R.; TenDyke, K.; Shen, Y.; et al. Sebatian antiproliferatif dan antiplasmodial daripada spesies Streptomyces terpilih. Bioorg. Med. Kimia. Lett. 2015, 25, 5646–5649. [CrossRef] [PubMed]
14.Jiang, Y.; Liu, F.-J.; Wang, Y.-M.; Li, H.-J. Pengasingan berpandukan nyahreplikasi bagi saponin triterpenoid hepatoprotektif novel daripada Semen Celosiae oleh kromatografi cecair berprestasi tinggi ditambah pula dengan spektrometri jisim sebaris pengionan semburan empat kali ganda-masa-terbang. J. Pharm. Berbiomed. dubur. 2017, 132, 148–155. [CrossRef] [PubMed]
15.Zhang, J.; Li, C.; Che, Y.; Wu, J.; Wang, Z.; Cai, W.; Li, Y.; Ma, Z.; Tu, P. Strategi berasaskan LTQ-Orbitrap untuk perubatan Cina tradisional yang disasarkan penemuan kelas, pengenalpastian dan penyelidikan omiknya: Kajian kes pada glikosida phenylethanoid dalam tiga spesies Herba Cistanches yang berbeza. RSC Adv. 2015, 5, 80816–80828. [CrossRef]
16. Yoshizawa, F.; Deyama, T.; Takizawa, N.; Usmanghani, K.; Ahmad, M. The Constituents of Cistanche tubulosa (Schrenk) Hook. f. II. Pengasingan dan Struktur Glikosida Phenylethanoid Baharu dan Glikosida Neolignan Baharu. Kimia. Pharm. lembu jantan. 1990, 38, 1927–1930. [CrossRef]
17. Tanaka, T.; Nakashima, T.; Ueda, T.; Tomii, K.; Kouno, I. Memudahkan Diskriminasi Enantiomer Aldose oleh HPLCistancheChem Fasa Terbalik. Pharm. lembu jantan. 2007, 55, 899–901. [CrossRef] [PubMed]
18. Wong, WS; Guo, D.; Wang, XL; Yin, ZQ; Xia, B.; Li, N. Kajian asid cis-cinnamic dalam Arabidopsis thaliana. Fisiol Tumbuhan. Biokim. 2005, 43, 929–937. [CrossRef] [PubMed]
19.Kahnt, G. Trans-Cis-Equilibrium of Hydroxycinnamic Acids semasa Penyinaran Larutan Berair pada pH Berbeza. Fitokimia 1967, 6, 755–758. [CrossRef]
