Bahagian 5:Memetakan Interaksi Epigenomik Dan Transkripmik Semasa Pembentukan Ingatan Dan Ingatan Dalam Ensembel Engram Hippocampal

ali.ma@wecistanche.com

Sila klik di sini untuk Bahagian 6

Sila klik di sini untuk Bahagian 5

Data Lanjutan Rajah 2: DAR yang stabil kebanyakannya diperkaya untuk tanda penambah

(a) Aliran kerja untuk pembelahan sitometri aliran bagi populasi neuron yang berbeza dari hippocampus, semasaingatanpembentukan dan pengambilan semula. Plot FACS perwakilan menunjukkan ekspresi semua populasi (panel kiri). Pemilihan lanjut dibuat pada nukleus tunggal dan NeuN plus / DAPI tambah populasi (panel tengah). Terakhir, pemilihan dibuat pada subpopulasi berpagar; GFP tambah (dilaraskan kepada ~2.5 peratus daripada semua sel), ARC tambah /GFP tambah (~0.15 peratus daripada semua sel) dan nukleus diisih kepada 1.5 ml tiub Eppendorf yang disalut dengan 200ul 1 peratus PBS.

Klik untukSerbuk ekstrak cistanche meningkatkan daya ingatan

(b) Rajah Venn (kiri) dan jadual (kanan), menggambarkan pertindihan antara DAR yang dikenal pasti dalam perbandingan berpasangan yang berbeza semasaingatanpembentukan dan ingatan.

(c) Analisis statistik berasaskan pensampelan semula telah dilakukan untuk menentukan sama ada pengayaan keadaan kromatin berbanding pelepasan ChromHMM (diperhatikan) adalah signifikan secara statistik. Pengayaan yang dijangkakan telah dikira dengan melakukan 10,000 set rawak pertindihan (permutasi) antara 'semua tapak yang boleh diakses' dan 'semua tapak pengubahsuaian histon (iaitu semua pelepasan)' lokus dan dibentangkan sebagai histogram dalam angka itu. Saiz sampel setiap set rawak ditentukan oleh saiz DAR dari setiap negeri. Purata dan sisihan piawai sampel telah dikira (Jadual Tambahan 3). Bilangan pertindihan yang diperhatikan antara DAR dan setiap pelepasan dikira dan dibentangkan sebagai garisan. z-skor telah dikira sebagai fallows; Z=(nilai diperhatikan (X) – min sampel (μ))/(sisihan piawai sampel (σ)). z-skor Basal lwn Awal; SE 10.5, KAMI 6.9. Stabil; SE 16.9, WE 12.7, semua p < 0.0001,="" z-skor="" awal="" lwn="" lewat;="" sp="" 91.7,="" wp="" 38.7.="" lewat="" lwn.="" diaktifkan="" semula;="" sp="" 26.8,="" wp="" 28.9,="" semua=""><0.0001. p-values="" (two-sided)="" were="" calculated="" from="" the="" z-table.="" a="" full="" analysis="" is="" reported="" in="" supplement="" table="">

(d) Carta pai menunjukkan peratusan keadaan penambah yang berbeza, untuk semua kawasan stabil. Pertindihan setiap rantau yang stabil dilakukan dengan data H3K4me1 dan H3K27ac ChIP-seq yang diterbitkan sebelum ini, diperoleh 1j selepas FS21. Keadaan penambah dikelaskan sebagai 'primed' – bertindih dengan kawasan yang ditandakan dengan hanya H3K4me1, 'aktif' – dengan H3K4me1/ H3K27ac atau 'laten' – tiada pertindihan.

(e) Motifs identified from nucleosome-free regions (NFR) on the ATAC-seq tracks from each state (Basal, Activated -early, Activated -late, and Reactivated). Peaks were divided into positions that were annotated to promoters (5kb from TSS) and enhancers (>5kb daripada TSS). Saiz bulatan menunjukkan peratusan pengayaan (1–50 peratus ). Warna menunjukkan –log(nilai-P).

Data Lanjutan Rajah 3: Penyebuan diselaraskan keadaan epigenetik semasaingatanpengekodan dan

(a) Sifat interaksi yang dikesan Chicago dalam setiap fasa (Basal, Diaktifkan -awal, Diaktifkan -lewat, dan Diaktifkan Semula). Tetapan lalai dan ambang skor 5 telah digunakan dalam panggilan interaksi yang ketara, dilakukan bersama pada semua replika.

(b) Carta pai mewakili peratusan semua interaksi yang dikesan Chicago yang ditandakan oleh sama ada H3K27ac/H3K4me1 (67.5 peratus markah penambah), H3K4me3/H3K9ac (46.2 peratus markah penganjur), atau H3K27me3 (1.1 peratus markah menindas).

(c) Imej pelayar epigenome WashU, merangkumi ~ rantau 500 Kb di sekitar gen Eif4e2. Arka menunjukkan penambah biasa biasa (segi empat tepat merah) dan unik (anak panah) yang berinteraksi dengan penganjur (segi empat tepat biru).

(d) Contoh interaksi yang dipanggil oleh Chicago. Plot yang menunjukkan semua kiraan bacaan daripada bait-other-end (enhancer), dalam 500–700 kb (hulu dan hiliran) Grink3 dan Penganjur Wwc2. Interaksi ketara yang dikesan oleh Chicago (skor Lebih besar daripada atau sama dengan 5) ditunjukkan dalam warna merah dan interaksi sub-ambang (3 Kurang daripada atau sama dengan skor < 5)="" ditunjukkan="" dalam="" warna="" biru.="" garis="" kelabu="" menunjukkan="" kiraan="" dijangka="" dan="" garis="" putus-putus="" sempadan="" atas="" selang="" keyakinan="" 95="" peratus.="" (e)="" analisis="" pengayaan="" bertindih="" antara="" penambah="" berinteraksi="" dan="" dar,="" menggunakan="" prosedur="" pilih="" atur="" pada="" 10,000="" set="" rawak="" tapak="" yang="" boleh="" diakses.="" histogram="" membentangkan="" taburan="" pensampelan="" rawak="" tapak="" boleh="" diakses="" untuk="" setiap="" keadaan="" (basal="" lwn.="" diaktifkan="" -="" awal,="" diaktifkan="" -awal="" lwn="" diaktifkan="" -lewat,="" diaktifkan="" -lewat="" lwn.="" diaktifkan="" semula,="" stabil).="" bilangan="" lokus="" bertindih="" dibentangkan="" dalam="" garis="" berwarna="" daripada="" neuron="" basal,="" diaktifkan="" -awal,="" diaktifkan="" -lewat="" dan="" diaktifkan="" semula.="" dar="" bas="" lwn.="" diaktifkan="" -awal="" (skor="" z;="" 7.1,="" 7.7,="" 8.5,="" 10.9).="" dar="" diaktifkan="" -awal="" lwn.="" diaktifkan="" -lewat="" (z-skor;="" −0.1,="" −0.8,="" −2.4,="" −3.2).="" dar="" diaktifkan="" -lewat="" vs.="" diaktifkan="" semula="" (0.4,="" 1.8,="" 0.4,="" -0.2).="" dar="" stabil="" (skor="" z;="" 1.7,="" 2.0,="" 6.5,="">

Data Lanjutan Rajah 4: Perubahan kromatin yang berlaku semasa fasa awal membolehkan

(a) Analisis pertindihan antara nama gen daripada analisis pembezaan berpasangan dan data yang diterbitkan sebelum ini bagi i) sel granul DG diaktifkan 1 jam selepas pendedahan novel32 ii) 24 jam selepas FS20 dan iii) selepas rangsangan berpanjangan (6j) kortikal kultur tetikus neuron dengan KCl33. Analisis telah dijalankan oleh pakej GeneOverlap R.

(b) Bacaan eksonik (merah) dan intronik (biru) dikira secara berasingan merentas semua keadaan dan dibandingkan dengan aktiviti transkrip seperti yang diukur oleh DEseq2. Bacaan telah dinormalisasi (RPKM) dan perubahan log2FC dibentangkan untuk setiap keadaan. plot biola menunjukkan min,

julat antara kuartil, dan minimum dan maksimum, ANOVA sehala (parametrik, tidak berpasangan), Basal lwn Awal; F (5, 248)=389.9. Awal vs Lewat; F (5, 2374)=2183. Lewat lwn. Diaktifkan semula. F (5, 1357) {{10}}.5, Semua Ps < 0.0001.="" perbandingan="" berbilang="" bonferroni.="" ns="tidak" ketara,="" ***p=""><>

( c ) Nisbah Exon / Intron diukur dalam setiap kelompok merentas semua keadaan (skala Log2FC). plot biola menunjukkan min, julat antara kuartil dan minimum dan maksimum, ANOVA sehala (parametrik, tidak berpasangan), F (5, 1143)=260.2, P<0.0001. bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test.="" n.s="non-significant," ***p="" <="">

(d) Analisis pertindihan antara DAR dan DEG semasa berbezaingatanfasa. DAR di kawasan Intergenik dan intron dipetakan ke gen masing-masing dengan peta interaksi pc-HiC. Analisis pertindihan telah dijalankan oleh pakej GeneOverlap R. Nilai-P (nombor) dan nisbah kemungkinan (warna) daripada ujian tepat Fisher dibentangkan dalam peta haba. ns - tidak penting.

(e) Korelasi Pearson antara nilai log2FC DARs dan log2FC DEGs yang dianotasi ke rantau itu (kawasan intergenik dipetakan melalui set data pc-HiC). Perubahan kebolehaksesan Chromatin dibandingkan dengan bacaan eksonik yang dihuraikan (garisan merah), bacaan intronik (garisan biru) dan jumlah perubahan transkrip (kedua-dua bacaan intronik dan eksonik) seperti yang diukur oleh Desq2 (garisan kelabu). Semua nilai r dan p dilaporkan dalam jadual tambahan 9.

Data Lanjutan Rajah 5: Perubahan transkripsi dalam neuron lewat-diaktifkan berkorelasi lebih tinggi

(a) Bacaan eksonik (merah) dan intronik (biru) dikira secara berasingan merentas semua keadaan bagi setiap kluster yang dikenal pasti dalam Rajah 5B. Bacaan telah dinormalisasi (RPKM) dan perubahan log2FC dibentangkan untuk setiap kelompok.

(b) Nisbah ekson/intron diukur dalam setiap kelompok merentas semua keadaan. Plot biola menunjukkan min, julat antara kuartil dan minimum dan maksimum, n=3 sampel bebas biologi ANOVA sehala (parametrik, tidak berpasangan), Dw –Kluster Lewat; F (3, 968)

652) = 93.97, P<0.0001. reactivation="" -cluster;="" f="" (3,="" 1600)="485.2,"><0.0001. bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test="" to="" deseq2="" reads.="" ***p="" <="">

Dipanjangkan Data Rajah. 6: Berbeza sementara transkripsi program adalah menjadi disegerakkan kepada

cara bergantung dengan kehadiran tamoxifen. Di panel kanan, imej IHC yang mewakili DG. Hijau – AAV-eYFP, Merah – Arka endogen. Bar skala mewakili 50 μm.

(b) Penilaian morfologi tulang belakang semasa berbezaingatanfasa. Panel kanan menunjukkan satu aci eYFP ditambah dendritik dengan pelbagai jenis duri (Stubby, Nipis, Cendawan, Cendawan Dibesarkan). Bar skala mewakili 5 μm. boxplot menunjukkan min, julat antara kuartil dan minimum dan maksimum, Diaktifkan -awal: n=4 tikus /5 bahagian setiap haiwan, Diaktifkan -lewat: n=4 tikus /4 bahagian setiap haiwan, Diaktifkan semula: n=4 tikus /2 bahagian setiap haiwan. ANOVA sehala (parametrik, tidak berpasangan), Stubby; F (2, 36)=2.313, P=0.1135. Nipis; F (2, 36)=35.12, P<0.0001. mushroom;="" f="" (2,="" 36)="38.42," p="" <="" 0.0001.="" bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test,="" ***p="" <="">

(c) Imej perwakilan IHC dan kuantifikasi tahap protein bagi dua ahli keluarga EIF; (kiri) Eif2a dan (kanan) Eif3e. Bar skala mewakili 10 μm. Data untuk aci dendritik dibentangkan sebagai nisbah antara nombor dan panjang (μM). n=4 tikus /5 bahagian setiap haiwan, boxplot menunjukkan min, julat antara kuartil dan minimum dan maksimum, ANOVA sehala (parametrik, tidak berpasangan) dengan ujian perbandingan berbilang Bonferroni, ns - tidak signifikan, Eif2a Shaft; F (2, 20)=4.484, P=0.0246. Soma; F (2, 21)=19.58, P < 0.0001.="" (diaktifkan="" -awal="" lwn.="" diaktifkan="" -lewat="" *p="0.0142," diaktifkan="" -awal="" lwn.="" diaktifkan="" semula="" *p="">< 0.0001,="" diaktifkan="" -lewat="" lwn.="" diaktifkan="" semula="" *p="0.0303)." aci="" eif3e;="" f="" (2,="" 14)="1.983," p="0.1745." soma;="" f="" (2,="" 23)="8.309," p="0.0019," (diaktifkan="" -awal="" lwn.="" diaktifkan="" semula="" *p="0.0057," diaktifkan="" -lewat="" lwn="" diaktifkan="" semula="" *p="" {{="">

(d) Carta pai membentangkan peratusan duri cendawan yang diperbesarkan (Dh Lebih besar daripada atau sama dengan 3Dn) dan duri cendawan daripada neuron Diaktifkan -lewat dan Diaktifkan Semula.

(e) Imej perwakilan (panel kiri) dan kuantifikasi (panel kanan) tahap mRNA Gria1, semasa fasa berbezaingatan. Data dibentangkan sebagai nisbah antara beberapa puncta dan panjang aci dendritik. Bar skala mewakili 10 μm. N=4 tikus /5 bahagian setiap haiwan, boxplot menunjukkan min, julat antara kuartil dan minimum dan maksimum, Aci; ANOVA sehala (parametrik, tidak berpasangan) F (2, 15)=10.41, P=0.0015. Ujian berbilang perbandingan Bonferroni, **P=0.0011. panel bawah - Soma; ANOVA sehala F (2, 12)=0.13, P=0.88.

Data Lanjutan Rajah 7: Interaksi dengan penambah gabungan yang berbeza membawa kepada arah

(a) Gambar rajah Venn menunjukkan peratusan pertindihan antara kebolehcapaian kromatin (DAR) merentas semuaingatanfasa (BAS lwn. Diaktifkan -awal, bulatan grid hijau muda; Diaktifkan -awal lwn. Diaktifkan -lewat, bulatan grid hijau gelap; Diaktifkan -lewat lwn. Diaktifkan semula, bulatan grid oren) dan jumlah perubahan transkrip daripada semua kelompok yang dikenal pasti (Dw – lewat, Naik –lewat, Stabil, Pengaktifan semula, bulatan grid biru). DAR intergenik dan intron dipetakan ke gen masing-masing dengan peta interaksi pc-HiC. Peratusan pertindihan dikira daripada semua DEG yang dikenal pasti dalam kelompok (n=1095).

(b) Analisis pertindihan antara DAR (berpasangan) dan DEG daripada setiap kelompok. DAR intergenik dan intron dipetakan ke gen masing-masing dengan peta interaksi pc-HiC.

Analisis pertindihan telah dijalankan oleh pakej GeneOverlap R. Nilai-P dan nilai Jaccard (warna) daripada ujian tepat Fisher dibentangkan pada peta haba (kiri). Peratusan pertindihan dikira daripada semua DEG yang dikenal pasti dalam kelompok (kanan).

( c ) Imej perwakilan kromatin dan perubahan transkrip lokus Gabrb3 dari kluster Dw-late. Walaupun interaksi keadaan awal adalah antara penganjur dan penambah dengan pengaktif transkrip (Ap1), interaksi keadaan lewat adalah dengan penindas transkrip (Slug). Jejak pelayar genom IGV atas (ungu - Basal, hijau muda - Diaktifkan -awal, hijau gelap - Diaktifkan -lewat dan oren - Diaktifkan semula) membentangkan perubahan transkrip (ncRNA-seq), trek tengah menunjukkan dinamik kebolehaksesan kromatin (ATAC-seq) pada promoter (segi empat tepat merah) dan penambah (segi empat tepat kelabu). Interaksi penggalak yang ketara diwakili sebagai arka (runut penyemak imbas WashU). Motif terkini trek bawah yang dikenal pasti melalui alat HOMER (Slug, Ap1 dan Rehat).

(d) Plot pengagregatan untuk motif individu. Nilai pengayaan (motif setiap bp/ setiap puncak) enam motif terpilih (dua penindas, dua pengaktif, dan dua bivalen) dinilai di sekitar pusat puncak (-/ tambah 4000bp) daripada setiap kelompok.

Data Lanjutan Rajah 8: Model cadangan kebolehcapaian kromatin, interaksi penambah-penambah dan dinamik transkrip neuron engram memori hippocampal

kawasan, yang mempunyai motif pengaktif transkrip. Pengaturcaraan semula penambah-penambah ini menghasilkan peningkatan ekspresi gen yang mungkin membolehkan penstabilaningatan. Ingat - neuron engram yang diaktifkan semula menggunakan subset interaksi penambah-penambah prima, yang dikaitkan dengan perubahan transkrip yang terlibat dalam pengangkutan mRNA ke petak sinaptik dan terjemahan protein. Faktor transkripsi – TF, E(1–3) – penambah berbeza yang berinteraksi dengan penganjur yang sama, Merah - penindas transkrip, Biru - pengaktif transkrip.

Bahan Tambahan

Rujuk versi Web di PubMed Central untuk bahan tambahan.

Ucapan terima kasih

Kami mengucapkan terima kasih kepada E. Niederst, J. Penney, S. Barker, RT Stott, M. Victor, A. Watson, N. Dedic, E. Lockshin, dan ahli L.HT Lab atas perbincangan dan cadangan yang berguna. Kami mengucapkan terima kasih kepada pengurus makmal Y. Zhou, E. McNamara atas penyelenggaraan koloni tikus. Kami berterima kasih kepada P. Autissier (Institut Whitehead) untuk bantuan dengan FACS. Pembiayaan: Kerja-kerja ini disokong oleh geran NIH RF1AG062377, AF1AG054012, RO1NS102730, RF1AG064321, The JPB Foundation, The Alana Down Syndrome Research Foundation, The LuMind Down Syndrome Research Foundation, the Cure Alzheimer's Fund CIRCUITS and Renee consortium. Yayasan Keluarga Belfer kepada LH.T. Kerja ini turut disokong sebahagiannya oleh geran NIH R01AG058002, U01NS110453, R01AG062335, UG3NS115064 kepada MK dan LH.T dan R01AG067151, R01MH109978, R01AG062335, UG3NS115064 kepada MK dan LH.T dan R01AG067151, R01MH109978, U01MH119509, U01MH119509, U01MH101H509, U01MH119509, U01MH101H509, U01MH119509, U01MH101H509, U01MH101H509, U01MH101H509, U01MH101H509, U01MH101H509, Alzheimer2 . HSM disokong oleh Dana Wellcome Burroughs dan persekutuan pasca doktoral UNCF-Merck. C. A disokong oleh Yayasan JPB. RMR disokong oleh geran NIH T32 5T32HD09806. Kit penyediaan perpustakaan Hi-C diterima sebagai hadiah murah hati daripada DovetailTM (v.1.03, Dovetail Genomics, Chicago, Amerika Syarikat). Kami berterima kasih kepada pasukan Dovetail untuk perbincangan dan cadangan yang berguna.