Bahagian 2:Verbascoside Melindungi Pankreas -Sel Menentang ER-Tekanan

Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com

Alessandra Galli 1, tambah , Paola Marciani 1, tambah , Algerta Marku 1, Silvia Ghislanzoni 1, Federico Bertuzzi 2, Rafaella Rossi 3, Alessia Di Giancamillo 3 , Michela Castagna 1 dan Carla Perego 1,*

Sila Klik di sini kembali ke Bahagian 1

3.4 Modulat Verbascoside -Aktiviti dan Dinamik Mitokondria Sel

Ujian daya maju MTT mencadangkan kemungkinan kesan daripadaverbascosidesecara langsung pada mitokondria yang memastikan gandingan rembesan insulin kepada keadaan pemakanan dan kemandirian sel dalam jenis sel ini. Bentuk dan potensi membran adalah penanda kesihatan mitokondria [42]. Kami mula-mula menilai potensi membran mitokondria dengan melabelkan sel dengan MitoSpyw Orange CMTMRos, pewarna telap yang kepekatannya bergantung pada potensi membran mitokondria dalaman, manakala MitoSpyw Green FM digunakan untuk menormalkan data kepada jisim mitokondria (Rajah 4A, B). Potensi membran mitokondria dalamverbascoside-sel yang dirawat telah meningkat berbanding dengan kawalan dalam kedua-dua keadaan basal dan tekanan. Menariknya,verbascosidemetabolit memberikan kesan yang berbeza. Asid kafe tidak meningkatkan potensi mitokondria, manakala hydroxytyrosol menyebabkan kemerosotan dos bergantung kepada fungsi mitokondria, dalam persetujuan dengan data tentang daya maju sel, kesan sedemikian lebih jelas selepas pendedahan H2O2 (Rajah S3).

verbascoside daripada cistanche

Memandangkan fungsi ini berkait rapat dengan morfologi, kami mengukur diameter Feret, luas dan pekeliling mitokondria. Tekanan oksidatif akut menggalakkan pembelahan mitokondria yang meluas, dengan itu menghasilkan mitokondria bulat yang lebih kecil [42]. Di bawah keadaan tekanan H2O2, mitokondria sel yang dirawat verbascoside lebih memanjang dan menunjukkan permukaan yang meningkat daripada yang dikawal (Rajah 4C, D dan Rajah S4). Pekeliling mitokondria adalah lebih rendah dalam sel yang dirawat verbascoside daripada dalam kawalan dan perbezaan lebih jelas dalam sel yang dirawat H2O2 (Rajah S3), sekali lagi mengesahkan peranan perlindungan polifenol.

Keupayaan organel ini untuk mengubah suai bentuknya sebagai tindak balas kepada keadaan pemakanan atau keadaan tekanan adalah di bawah kawalan peristiwa gabungan dan pembelahan dan memerlukan motilitas mitokondria [39]. Penjejakan pergerakan mitokondria membawa kami untuk mengira jarak terkumpul perjalanan dan analisis mendedahkan peningkatan ketara dinamik mitokondria dalam sel yang dirawat verbascoside jika dibandingkan dengan kawalan, sudah dalam keadaan asas (Rajah 4E, F dan Video S1-S4). Kesannya lebih ketara selepas rawatan H2O2, sesungguhnya pra-rawatan verbascoside hampir sepenuhnya mengembalikan kesan tekanan oksidatif ke atas dinamik mitokondria.

Diambil bersama data ini sangat menyokong peranan utama verbascoside dalam memastikan dinamik mitokondria yang penting untuk menggalakkan penyesuaian pantas organel ini kepada keadaan tekanan.

3.5 Kesan Verbascoside terhadap Kemandirian dan Fungsi Manusia Langerhans

Memandangkan potensi translasi bagiverbascosideaplikasi dalam kesihatan manusia, kami mengesahkan kesannya ke atas pulau terpencil manusia Langerhans, model yang lebih relevan untuk kajian fisiopatologi dan farmakologi pada -sel. Pulau kecil yang terpencil dirawat dengan 16 uM verbascoside selama 5 hari dan potensi membran mitokondria dinilai. Seperti yang dilaporkan dalam Rajah 5A, sementara potensi organel terjejas dalam mengawal pulau kecil manusia selepas pendedahan H2O2, potensi membran dalaman mitokondria dalam pulau kecil pra-rawatan verbascoside tidak berkurangan dengan ketara, menyokong hipotesis peranan perlindungan verbascoside terhadap ROS yang disebabkan - disfungsi sel. Analisis ungkapan penanda tekanan ER menunjukkan pengurangan penting bagi pecahan P-eIF2 dalam dua persediaan pulau kecil yang berbeza yang dikekalkan dalam 16 uM verbascoside, mengesahkan downregulation laluan ini juga dalam sampel manusia (Rajah 5D). Kesan berfaedah rawatan polifenol telah disokong oleh peningkatan kandungan insulin yang diperhatikan di pulau kecil yang dirawat verbascoside jika dibandingkan dengan kawalan (Rajah 5B). Penyerakan data dalam eksperimen kami tidak membenarkan menunjukkan sebarang perbezaan ketara rembesan insulin yang dirangsang glukosa (GSIS) di pulau kecil yang dirawat verbascoside, walaupun trend positif kelihatan jelas di bawah kedua-dua keadaan basal dan tekanan (Rajah 5C).

4. Perbincangan

Tekanan oksidatif dan keradangan adalah asas disfungsi sel yang berlaku semasa T2D [43,44] oleh itu, makanan berfungsi, nutraseutikal, dan fitokimia telah disiasat sebagai alat untuk mencegah diabetes jenis 2 [45]. Dalam kerja ini, kami memberi tumpuan kepada verbascoside, yang diketahui mempunyai aktiviti anti-radang dan anti-oksida dalam neuron [18]. Walaupun kerumitan struktur yang tinggi, verbascoside dan isoverbascoside telah ditemui dalam plasma darah tikus yang diberi ekstrak Lippia citriodora bersama beberapa metabolit [20]. Selain itu, pengumpulan sel verbascoside dan verbascoside telah dikesan dalam barisan sel kanser payudara SKBR3 [23] dan kajian yang dijalankan ke atas sel Caco-2 menunjukkan bahawa jumlah sederhana verbascoside dan isoverbascoside kekal utuh dan boleh diakses secara biologi selepas pencernaan in vitro. proses. Tambahan pula, Caco-2 boleh mengambil kedua-dua molekul melalui pengangkutan pantas dan linear dalam julat 10 hingga 100 uM [22]. Tiada data telah dilaporkan tentang bioavailabiliti verbascoside pada manusia, namun kajian yang dinyatakan di atas menunjukkan bahawa verbascoside yang tidak dimetabolismekan boleh melintasi halangan usus, beredar dalam plasma darah, dan memberikan kesan antioksidan pada sel-sel endokrin. pankreas.

Kami menemui peranan perlindungan yang bergantung kepada dos (0.8–16 uM) verbascoside pada sel klon dan manusia, kedua-duanya di bawah keadaan basal dan tekanan. Kesan ini disebabkan oleh verbascoside itu sendiri dan bukan metabolitnya asid kafein dan hydroxytyrosol, yang sebenarnya kelihatan sitotoksik pada kepekatan 16 uM. Kepekatan yang terbukti aktif dalam eksperimen kami adalah selaras dengan yang diterangkan dalam haiwan yang diberi makan verbascoside [20].

Walaupun kami tidak tahu sama ada verbascoside bertindak secara ekstraselular dengan mengikat kepada reseptor membran atau dihayati oleh endositosis dan berfungsi secara intrasel, data kami mengesahkan bahawa verbascoside mempunyai sifat antioksidan dan anti-radang, dan melindungi sel-sel daripada disfungsi berkaitan tekanan ER dengan mengurangkan UPR dan menggalakkan dinamik mitokondria.

Sesungguhnya, kami mengesan penurunan ketara kandungan ROS dalam sel yang dirawat verbascoside yang selanjutnya disahkan oleh pengurangan peroksidasi lipid yang diukur melalui ekspresi HNE dan akrolein. Tidak seperti kebanyakan polifenol tumbuhan, aktiviti penyingkiran ROS verbascoside terutamanya mengikuti secara tidak langsung (melalui regulasi enzim penyingkiran ROS) dan bukannya laluan langsung. Malah, ia meningkatkan transkripsi gen beberapa enzim antioksidan melalui pengaktifan laluan Nrf2 (NF-E2-faktor 2) dan melalui mekanisme yang bergantung kepada AhR (reseptor hidrokarbon aril) [24,29]. Oleh itu, kami mendapati peningkatan ekspresi SOD1 dalam sel yang dirawat verbascoside.

Homeostasis ROS sangat relevan dalam patologi sel. Disebabkan kekurangan enzim antioksidan, pengeluaran ROS yang tinggi tidak dapat dinetralkan dan tekanan ER yang menggalakkan salah lipatan protein disebabkan. Tekanan ER membawa kepada pengurangan transkripsi dan terjemahan insulin melalui pengaktifan UPR [44,46]. Laluan ini mempunyai tujuan utama untuk memulihkan fungsi ER melalui pemrograman semula ekspresi gen, namun, apabila terlalu dirangsang, ia mencetuskan apoptosis. Data kami mencadangkan bahawa tindakan penting verbascoside adalah untuk mengurangkan UPR, membenarkan pengubahsuaian yang diperlukan untuk membaiki disfungsi ER, tanpa menyebabkan apoptosis. Mengikut kemungkinan ini, ekspresi protein BIP, HSP70 dan PERK telah dikurangkan dalam sel-sel yang dirawat verbascoside, dan pengaktifan laluan PERK telah dilemahkan sebagai tindak balas kepada tekanan ER yang disebabkan oleh tunicamycin. Tindakan serupa telah dilaporkan untuk tyrosol dalam talian sel insulinoma NIT-1 [47].

Terutama menarik ialah keupayaan verbascoside untuk memodulasi pengaktifan cawangan PERK UPR. Dalam sel laluan ini diperlukan untuk mengekalkan homeostasis rembesan basal dan kelangsungan hidup sel, dan ia sangat dinyahkawal selia dalam diabetes [41,48]. Lebih menarik lagi, varian biasa di PERK menyumbang kepada risiko prediabetes dan mutasi resesif dalam gen EIF2AK3 (pengekodan PERK) mendasari kerentanan kepada sindrom Wolcott-Rallison yang dicirikan oleh diabetes yang bergantung kepada insulin neonatal kekal [49,50].

Pengurangan laluan inflamasi IKB -NFKB juga dikesan dalam sistem kami dengan kehadiran verbascoside. NFKB mewakili laluan inflamasi utama dalam -sel dan pengaktifannya yang berterusan memulakan lata kejadian yang memuncak dalam kematian sel. Dalam -sel tertekan, pengurangan ekspresi NFKB melindungi sel pankreas daripada agen diabetogenik [27,51], seterusnya menyokong aplikasi verbascoside dalam pencegahan diabetes. Menariknya, isyarat PERK mengaktifkan faktor transkripsi NFR2 (terlibat dalam homeostasis redoks) dan NFKB, sekali gus menjelaskan kesan anti-oksidan dan anti-radang verbascoside [40,52].

Data kami juga mendedahkan peranan penting verbascoside pada aktiviti dan dinamik mitokondria.

Penanda kualiti operasi mitokondria adalah dinamiknya, satu proses yang dicirikan oleh kitaran gabungan dan peristiwa pembelahan yang diselaraskan yang mengawal nombor mitokondria, pengedaran, morfologi dan potensi membran [39]. Selaras dengan kemungkinan ini, verbascoside meningkatkan potensi membran mitokondria tc3 di bawah keadaan basal dan tekanan. Sekali lagi, kesannya adalah disebabkan oleh verbascoside dan bukan metabolitnya, kerana asid kafein tidak meningkatkan fungsi mitokondria dan hidroksitirosol secara signifikan mengurangkan potensi organel. Peningkatan dinamik mitokondria dan perubahan dalam morfologi mereka diperhatikan dengan menjejaki pergerakan mitokondria, dengan itu mencadangkan bahawa verbascoside menggalakkan program mito-morfosis. Pembentukan semula rangkaian mitokondria selular menjejaskan perhimpunan super-kompleks rantai pernafasan, sekali gus mengubah bukan sahaja metabolisme sel tetapi juga keadaan redoksnya dan membolehkan sel-sel mengatasi tekanan oksidatif dan keradangan dengan lebih baik [5,37,39].

Walaupun mekanisme molekul masih tidak diketahui, kita boleh membuat hipotesis bahawa verbascoside, seperti polifenol lain, melindungi DNA mitokondria dengan mengurangkan kepekatan ROS [53] dan menghalang pembukaan liang peralihan kebolehtelapan mitokondria [54], memastikan aktiviti mitokondria fisiologi. Satu lagi kemungkinan yang menarik ialah pengubahsuaian dinamik dan aktiviti mitokondria sekali lagi dimediasi oleh tindakan verbascoside pada UPR. Malah, penyelidikan baru-baru ini dalam bidang mitokondria menunjukkan bahawa tapak interaksi ER-mitokondria memainkan peranan penting dalam kawalan dinamik dan aktiviti mitokondria sebagai tindak balas kepada tekanan oksidatif dan PERK terlibat dalam fenomena [55]. Kebanyakan kajian in vitro dengan polifenol dilakukan dalam sel sel, selalunya berasal dari tumor, yang berbeza daripada sel asal dari segi metabolisme dan pengeluaran ROS. Kami di sini memberikan bukti bahawa verbascoside memberi kesan perlindungan juga pada pulau terpencil manusia Langerhans, sasaran akhir campur tangan dalam diabetes. Menariknya, polifenol mengurangkan pengaktifan isyarat PERK yang sudah berada dalam keadaan asas, dengan itu meningkatkan kandungan insulin dan mencegah disfungsi mitokondria yang dimediasi tekanan oksidatif. Ia masih perlu dijelaskan sama ada kesan polifenol pada kandungan insulin mencerminkan keupayaan kompaun untuk mencegah kematian sel, untuk mengurangkan tekanan ER atau mengawal secara langsung ekspresi gen insulin, seperti yang ditunjukkan untuk sebatian polifenol lain [56]. Data ini amat relevan memandangkan kemungkinan penggunaan verbascoside sebagai terapi pelengkap dalam rawatan diabetes.

5. Kesimpulan

Kajian in vitro yang dilaporkan di sini mengenai sel klon dan manusia menunjukkan bahawa verbascoside memberikan kesan perlindungan terhadap disfungsi yang berkaitan dengan tekanan ER, mengurangkan pengaktifan cawangan PERK UPR dan meningkatkan dinamik mitokondria. Oleh kerana gangguan homeostasis ER mencetuskan kerosakan sel dan diabetes, data ini memberikan rasional untuk kemungkinan penggunaan verbascoside sebagai nutraseutikal dalam pencegahan dan rawatan penyakit. Namun, banyak isu perlu diselesaikan untuk aplikasi klinikal verbascoside yang berkesan. Walaupun banyak kajian makmal, kajian klinikal yang boleh dipercayai yang mengesahkan kesan kesihatan verbascoside in vivo adalah terhad. Tambahan pula, meningkatkan kestabilan dan bioavailabilitinya adalah wajib untuk aplikasi masa depan sebatian ini dalam kesihatan manusia. Dari sudut ini, verbascoside adalah molekul yang menarik kerana perancahnya mempunyai tapak reaktif yang berbeza yang boleh diubah suai oleh kimia gabungan. Kami menjangkakan bahawa maklumat yang terhasil daripada kajian ini akan membuka ruang untuk modulasi terapeutik tekanan oksidatif dan keradangan dalam keadaan patologi dengan menggunakan sebatian semula jadi.

Bahan Tambahan: Perkara berikut boleh didapati dalam talian di http://www.mdpi.com/2227-9059/8/12/582/s1. Rajah S1: Kesan asid kafein dan hidroksitirosol pada daya maju sel. Rajah S2: Kesan verbascoside pada tekanan ER yang disebabkan oleh tunicamycin. Rajah S3: Kesan asid kafein dan hydroxytyrosol pada potensi membran mitokondria. Rajah S4: Analisis imej kuantitatif mitokondria dalam sel yang dirawat dengan asid kafein dan hydroxytyrosol. Video S1, S2 Video: Dinamik mitokondria direkodkan di bawah keadaan asas, jika tiada (S1) atau kehadiran (S2) verbascoside. Video S3, S4: Dinamik mitokondria direkodkan di bawah keadaan tegasan oksidatif, jika tiada (S3) atau kehadiran (S4) verbascoside.

Sumbangan Pengarang: Pengkonsepan, AG, PM dan CP; penyusunan data, AG dan PM; analisis rasmi, AG dan PM; pemerolehan pembiayaan, CP; siasatan, MC; metodologi, AM dan SG; sumber, FB, RR dan ADG; penyeliaan, CP; pengesahan, AM, SG dan MC; visualisasi, AG dan AM; penulisan—draf asal, AG; penulisan—semakan dan penyuntingan, PM, AM, FB, RR, ADG, MC dan CP Semua pengarang telah membaca dan bersetuju dengan versi manuskrip yang diterbitkan.

Pembiayaan: Penyelidikan ini tidak menerima pembiayaan luar.

Penghargaan: Kami ingin mengucapkan terima kasih kepada Carlo Corino dan Mario Dell'Agli atas reagen dan perbincangan yang membantu.

Konflik Kepentingan: Pengarang mengisytiharkan tiada percanggahan kepentingan.

Rujukan

1. Cho, NH; Shaw, JE; Karuranga, S.; Huang, Y.; da Rocha Fernandes, JD; Ohlrogge, AW; Malanda, B. IDF Diabetes Atlas: Anggaran global kelaziman diabetes untuk 2017 dan unjuran untuk 2045. Diabetes Res. Clin. Berlatih. 2018, 138, 271–281. [CrossRef]

2. Leslie, RD; Palmer, J.; Schlott, NC; Lernmark, A. Diabetes di persimpangan: Perkaitan klasifikasi penyakit kepada patofisiologi dan rawatan. Diabetologia 2016, 59, 13–20. [CrossRef] [PubMed]

3. Tokarz, VL; MacDonald, PE; Klip, A. Biologi sel fungsi insulin sistemik. J. Biol Sel. 2018, 217, 2273–2289. [CrossRef] [PubMed]

4. Perego, C.; Da Dalt, L.; Pirillo, A.; Galli, A.; Catapano, AL; Norata, metabolisme Kolesterol GD, fungsi sel pankreas dan kencing manis. Biochim. dan Biophys. Acta (BBA) Mol. Asas Dis. 2019, 1865, 2149–2156. [CrossRef] [PubMed]

5. Galli, A.; Algeria, M.; Marciani, P.; Schulte, C.; Leonardi, C.; Milani, P.; Mafoli, E.; Tedeschi, G.; Perego, C. Membentuk Pembezaan dan Fungsi Sel Pankreatik: Pengaruh Mekanotransduksi. Sel 2020, 9, 413. [CrossRef]

6. Ashcroft, FM; Rorsman, P. Diabetes Mellitus dan Sel: Sepuluh Tahun Terakhir. Sel 2012, 148, 1160–1171. [CrossRef] [PubMed]

7. Rosengren, AH; Braun, M.; Mahdi, T.; Anderson, SA; Travers, SAYA; Shigeto, M.; Zhang, E.; Almgren, P.; Ladenvall, C.; Axelsson, AS; et al. Mengurangkan Eksositosis Insulin dalam Pankreas Manusia -Sel Dengan Varian Gen Dihubungkan dengan Diabetes Jenis 2. Diabetes 2012, 61, 1726–1733. [CrossRef] [PubMed]

8. Polonsky, KS Dinamik rembesan insulin dalam obesiti dan diabetes. Int. J. Obes. 2000, 24, S29–S31. [CrossRef]

9. Roden, M.; Shulman, GI Biologi integratif diabetes jenis 2. Alam Semula Jadi 2019, 576, 51–60. [CrossRef]