Bahagian 2:Memetakan Interaksi Epigenomik Dan Transkripmik Semasa Pembentukan Ingatan Dan Ingatan Dalam Ensembel Engram Hippocampal

untuk maklumat lanjut:ali.ma@wecistanche.com

Sila klik di sini untuk bahagian 1

Program transkrip yang berbeza dari ensembel engram semasa pembentukan dan ingatan ingatan

Untuk menjelaskan bagaimana perubahan dalam kebolehcapaian kromatin dan interaksi penambah promoter mempengaruhi ekspresi gen, kami melakukan RNA-seq nuklear (nRNA-seq) daripada semua subpopulasi neuron. Analisis gen yang dinyatakan secara berbeza (DEG) kami menunjukkan jumlah perubahan yang rendah pada fasa awal jika dibandingkan dengan neuron keadaan basal (Basal vs. Awal, 88 DEG, Rajah 5a, Jadual Tambahan 8). Ini amat tidak dijangka memandangkan tahap organisasi kromatin yang meluas diperhatikan pada titik masa ini (Rajah 2a). Sebaliknya, neuron dari fasa lewat menunjukkan bilangan DEG yang lebih tinggi walaupun terdapat lebih banyak persamaan dalam kebolehcapaian kromatin pada titik masa ini (Rajah 5a). Untuk mengesahkan penemuan transkrip kami, kami membandingkan keputusan kami dengan data yang diterbitkan sebelum ini bagi sel granul DG diaktifkan 1 jam selepas pendedahan novel32, 24 jam selepas FS20, dan selepas rangsangan berpanjangan (6j) neuron kortikal kultur tikus dengan KCl33 (Data Lanjutan Rajah 4a). ). Menariknya, walaupun perbandingan ini mendedahkan pertindihan yang ketara antara gen terkawal daripada set data kami dan 1 jam selepas pendedahan novel32 (P=0.006) atau 24 jam selepas FS20 (P=0.0005), kami tidak melihat sebarang pertindihan ketara dengan gen yang dikawal selia dalam sel engram yang diaktifkan semula dan set data lain, mengesahkan landskap transkrip unik sel engram yang diaktifkan semula semasa penarikan semula.

Klik untukFaedah cistanche dan kesan sampingan untuk ingatan

Seterusnya, kami mengambil kesempatan daripada pendekatan pengiraan yang diterbitkan sebelum ini34 yang mengukur perubahan dalam bacaan RNA (exon) dan pra-mRNA (intron) matang. Seperti yang dijangkakan, perubahan eksonik berkorelasi dengan perubahan transkrip global seperti yang diukur oleh DEseq2 (kedua-dua bacaan exon dan intron), merentasi semuaingatanfasa (Data Lanjutan Rajah 4b). Walau bagaimanapun, pengukuran nisbah ekson/intron, menunjukkan bahawa transkrip yang diubah (terkawal naik dan turun) semasaingatanpenyatuan (Awal vs. Lewat) kebanyakannya didorong oleh bacaan intronik, menunjukkan bahawa profil transkrip ini kebanyakannya mencerminkan transkrip tidak matang yang memerlukan langkah tambahan pemprosesan RNA (Data Lanjutan Rajah 4c). Sebaliknya, gen terkawal semasa penarikan balik (Lewat vs. Diaktifkan semula) kebanyakannya didorong daripada transkrip eksonik, sekali gus mencerminkan keadaan RNA yang lebih matang (Data Lanjutan Rajah 4c).

Untuk menyelaraskan percanggahan antara perubahan kromatin yang diperhatikan dan keadaan transkrip dalam setiap subpopulasi, kami melakukan analisis korelasi DAR dan DEG, yang dikenal pasti semasa titik masa yang berbeza bagiingatanpembentukan dan ingatan. Untuk analisis ini, DAR pada kawasan bukan pengekodan (intergenik dan intronik) telah dipetakan kepada penganjur masing-masing dengan menggunakan data pc-HiC kami. Secara keseluruhannya, kami mendapati korelasi yang rendah (P=2.81 × 10−2) antara kebolehcapaian kromatin pembezaan dan perubahan ekspresi gen yang berlaku pada fasa awal (Basal vs. Awal, Data Lanjutan Rajah 4d). Keputusan ini selaras dengan kerja sebelumnya21, melaporkan bahawa pengubahsuaian histon mempunyai sedikit korelasi dengan perubahan transkrip semasaingatanpemerolehan. Tanpa diduga, kami melihat pertindihan dan persamaan yang lebih kuat antara perubahan kromatin yang berlaku semasaingatanpengekodan (Awal) dengan landskap transkrip yang diubah semasa penyatuan memori (Lewat) dan neuron engram diaktifkan semula (P {{0}}.13 × 10−8, 2.42 × 10 −7, masing-masing, Data Lanjutan Rajah 4d). Untuk mengesahkan lagi analisis ini, kami melakukan korelasi Pearson antara nilai log2FC daripada DAR dan nilai log2FC DEG yang diberi anotasi ke rantau itu (kawasan intergenik dipetakan melalui set data pc-HiC, Data Lanjutan Rajah 4e, Jadual Tambahan 9) . Analisis kami mendedahkan bahawa perubahan kromatin awal (Basal vs. Awal, DAR) berkorelasi dengan ketara dengan pengawalan rendah gen dalam fasa lewat (Awal vs. Lewat, Data Lanjutan Rajah 4e, garis kelabu, r=− 0.14, p < 0.0001).="" selain="" itu,="" selepas="" menghuraikan="" deg="" kepada="" bacaan="" intronik="" dan="" eksonik,="" kami="" mendapati="" bahawa="" korelasi="" sebahagian="" besarnya="" didorong="" oleh="" bacaan="" intronik="" (intron="" r="-0.21," p="">< 0.0001,="" exons="" r="−0.09," p="" {{="" 29}}.02).="" sebaliknya,="" perubahan="" kromatin="" awal="" (basal="" vs.="" awal,="" dar)="" menunjukkan="" korelasi="" positif="" dengan="" deg="" daripada="" sel="" yang="" diaktifkan="" semula,="" yang="" kebanyakannya="" didorong="" oleh="" bacaan="" eksonik="" (intron="" r="-0.007," p="0.73" ,="" exon="" r="0.11," p="0.04)." data="" ini="" memberikan="" bukti="" lanjut="" untuk="" peristiwa="" penyebuan="" dan="" lag="" transkrip,="" di="" mana="" perubahan="" kromatin="" yang="" berlaku="" semasa="" fasa="" awal="" membolehkan="" perubahan="" transkrip="" diperhatikan="" pada="" titik="" masa="" kemudian,="" terutamanya="" dalam="" sel="" engram="" yang="" diaktifkan="">

Ingatanpengekodan, penyatuan, dan penarikan balik adalah proses dinamik yang memerlukan beberapa gelombang transkripsi gen tertangguh12,32,33. Oleh itu, untuk mengenal pasti program transkrip yang berbeza di semuaingatanfasa, kami menilai ekspresi setiap gen daripada neuron tidak diaktifkan (Basal) hingga awal (Diaktifkan awal), lewat (Diaktifkan-lewat), dan neuron yang diaktifkan semula semasa penarikan semula (Diaktifkan semula). Semua gen yang dinyatakan pembezaan (DEGs, n=1095) yang memenuhi kriteria cutoff (nilai p < 0.01,="" log2(perubahan="" kali="" ganda)=""> 1) dikelompokkan secara tidak berat sebelah (k-min) (Rajah 5b,c). Empat kluster utama telah dikenalpasti; i) 260 gen

yang dikawal ke bawah pada fasa lewat (kluster Dw-late), ii) 207 gen yang dikawal selia pada fasa lewat (kluster Up-late), iii) 186 gen yang dikawal selia pada fasa awal, dan dikekalkan sepanjang semuaingatanfasa (kelompok stabil) dan iv) 438 gen

yang dikawal secara unik dalam neuron yang diaktifkan semula, semasaingataningat semula (kelompok pengaktifan semula). Sama seperti perbandingan berpasangan kami, perubahan transkrip dalam neuron lewat diaktifkan berkorelasi lebih tinggi dengan bacaan intronik, dan landskap transkrip neuron diaktifkan semula nampaknya lebih matang dan mempersembahkan korelasi yang lebih tinggi dengan bacaan eksonik (Data Lanjutan Rajah 5a, b).

Kami seterusnya melakukan analisis ontologi gen (GO) untuk setiap kluster (Rajah 5d), untuk mengenal pasti laluan diperkaya dalam pelbagaiingatanfasa. Tanda tangan transkrip kluster akhir telah diperkaya untuk gen yang terlibat dalam mengawal selia 'Fungsi sinaps perencatan', yang telah ditunjukkan memainkan peranan dalam keceriaan neuron35,36 (Rajah 5e). Dalam kelompok Up-late, kami memerhatikan set gen yang terlibat dalam peraturan transkripsi positif atau negatif, seperti keluarga onkogen fibrosarcoma muskuloaponeurotik v-maf, protein B (Mafb), jari zink keluarga siput 2 (Snai2), dan RE{{ 8}}menyenyapkan faktor transkripsi (Rehat) (Gamb. 5e). Menariknya, kami mendapati bahawa 15 peratus (32/207) daripada penganjur gen di pelabuhan kluster Dw –late sama ada Snai2 (nilai p - 1 × 10−9) atau Rehat (nilai p - 1 × 10−3) tapak pengikat. Dinamik pengawal selia transkrip ini menunjuk ke arah kemungkinan interaksi antara kelompok Dw- dan Up-late. Terutama, didapati bahawa ensembel neuron yang berbeza secara fungsional wujud dalam satuingatanengram, di mana ensembel yang bergantung kepada FBJ osteosarcoma onkogene (Fos)- dan neuron PAS domain protein 4 (Npas4) menjalani pengubahsuaian sinaptik yang berbeza selepas CFC dan memacu tingkah laku berpandukan memori dalam arah yang bertentangan37. Telah ditunjukkan bahawa input sinaptik rangsangan menggalakkaningatangeneralisasi dan perencatan menggalakkan diskriminasi ingatan. Walaupun ensembel yang berbeza ini tidak dapat dibezakan dalam kajian semasa, pemerhatian ini mungkin menjelaskan ekspresi dua arah pengawal selia transkrip positif atau negatif, serta gen yang dikawal ke atas dan ke bawah yang terlibat dalam keseronokan neuron.

Cistanche boleh meningkatkan daya ingatan

Kluster Stabil kebanyakannya diperkaya untuk transkrip yang terlibat dalam sitoskeletal, pembentukan semula akson, dan bergantung kepada hippocampalingatan38, termasuk neurofilamen polipeptida ringan dan berat (Neal, Neath) dan myosin, polipeptida berat 10, bukan otot (Myh10) (Rajah 5d, e). Untuk menggambarkan dan menjejaki perubahan berkaitan sitoskeletal pada dendrit dan duri, wartawan gelung-eYFP (bergantung kepada TAM) dihantar oleh virus berkaitan adeno (AAV) ke dalam tikus DG ofArc-CreERT2 (Data Lanjutan Rajah 6a). Data kami mendedahkan bahawa neuron Teraktif-lewat dan Diaktifkan semula mempunyai bilangan cendawan dan duri nipis yang jauh lebih tinggi (P< 0.0001,="" extended="" data="" fig.="" 6b),="" with="" no="" significant="" changes="" in="" dendritic="" shaft="" diameter="" (p="0.6)," when="" compared="" to="" the="" activated="" -early="">

Tandatangan transkrip unik neuron engram yang diaktifkan semula (kelompok pengaktifan semula) kebanyakannya dicirikan oleh kategori 'pengangkutan/pengikatan RNA' dan 'mekanisme translasi protein' (Rajah 5d). Program transkrip ini termasuk ekspresi tinggi ahli keluarga kinesin 5a dan c (Kif5a, Kif5c), inisiasi terjemahan eukariotik (Eif) faktor 3 subunit A, D (3a, 3d), faktor 4 subunit H (Eif4h), faktor 5 subunit A ( Eif5a) dan protein ribosom (Rpl27a, Rpl35, Rpl36, Rps19, Rps24, Rosa) (Rajah 5d, e), yang sebelum ini dilaporkan memainkan peranan penting dalam pengangkutan mRNA ke petak sinaptik dan kawalan autonomi terjemahan tempatan39 . Untuk mengesahkan lagi penemuan ini pada tahap translasi, kami mengukur ekspresi protein dan penyetempatan tiga ahli dari keluarga Eif oleh imunohistokimia (IHC). Ahli Serval Eif sebelum ini dilaporkan terlibat secara khusus dalam terjemahan dalam petak sinaptik39, oleh itu, kami menganalisis secara berasingan ekspresi protein pada soma dan aci dendrit neuron diaktifkan (Rajah 5f). Neuron yang diaktifkan semula mempunyai ekspresi protein Eif3e yang lebih tinggi dalam soma, berbanding dengan neuron Diaktifkan-awal dan -akhir (Data Lanjutan Rajah 6c). Sebaliknya, Eif4e jauh lebih banyak dalam aci neuron Diaktifkan semula, jika dibandingkan dengan neuron Aktif-awal dan -akhir (Ps<0.05, fig.="" 5f),="" providing="" further="" evidence="" for="" increased="" protein="" synthesis="" in="" those="" neurons.="" cistanche="" can="" improve="">ingatan.

Peningkatan jentera terjemahan memudahkan perubahan dalam bentuk, saiz dan bilangan tulang belakang, menghasilkan keplastikan sinaptik yang dipertingkatkan39–41. Tambahan pula, duri dengan diameter kepala yang lebih besar lebih berkemungkinan mengandungi ribosom untuk sintesis protein tempatan, ketumpatan postsynaptic yang lebih besar, yang menambat lebih banyak reseptor glutamat AMPA dan menjadikan sinaps ini berfungsi lebih kuat41,42. Selaras dengan laporan tersebut, neuron yang diaktifkan semula membentangkan bilangan diameter kepala yang diperbesarkan yang lebih tinggi (51 peratus daripada semua duri cendawan), berbanding kumpulan Diaktifkan -lewat (18 peratus) (Data Lanjutan Rajah 6d). Selain itu, kami mendapati peningkatan ketara dalam kedua-dua reseptor glutamat 1, ionotropik, AMPA1 (Gria1) mRNA (Data Lanjutan Rajah 6e), dan tahap protein Gria1 hanya dalam aci dendritik neuron Diaktifkan Semula, berbanding dengan Activated -early dan - neuron lewat (Rajah 5g). Secara kolektif, data ini menyokong hipotesis bahawa program transkrip yang dipisahkan secara sementara sedang disegerakkan untuk mengekalkan keceriaan neuron, perubahan struktur, terjemahan protein dan keplastikan sinaptik, merentasi jangka hayat ensembel engram.

Elemen kawal selia dengan kesan transkrip yang bertentangan berinteraksi dengan penganjur apabila ingatan berkembang daripada pengekodan kepada ingatan

Kami seterusnya bertanya bagaimana interaksi penambah-penambah jarak jauh dan keadaan kromatin boleh membawa kepada perubahan ekspresi gen yang diselaraskan yang diperhatikan dalam setiap kelompok transkrip. Untuk mencapainya, kami mengukur kebolehcapaian kromatin berbanding penambah yang berinteraksi dengan penganjur, daripada setiap kluster transkrip (Rajah 6a–c). Di samping itu, skor interaksi penambah tersebut telah diplot bersama terhadap kebolehcapaian kromatin dan ekspresi gen masing-masing (Jadual Tambahan 10).

Cistanche boleh meningkatkan daya ingatan

Secara keseluruhannya, semua kluster menunjukkan peningkatan yang ketara dalam kebolehcapaian kromatin pada penambah. Yang penting, kami mendapati bahawa kebolehcapaian kromatin berlaku sebelum penyusunan semula kromatin 3D dan pengubahan ekspresi gen, memberikan sokongan lanjut terhadap ketinggalan transkrip (Rajah 6a–c, Data Lanjutan Rajah 7a, b). Khususnya, dalam kelompok Reactivation-, analisis kami mendedahkan proses dwifasa, di mana fasa awalingatanpembentukan membawa kepada peristiwa penyebuan, di mana penambah menjadi lebih mudah diakses tetapi gagal menunjukkan perubahan yang diharapkan dalam ekspresi gen. Pengaktifan semula sel-sel engram dikaitkan dengan penyusunan semula interaksi penambah-penambah, di mana penambah utama dibawa berhubung dengan penganjur masing-masing dalam frekuensi yang lebih tinggi, dan lonjakan transkrip diperhatikan (Rajah 6a-c). Cistanche boleh bertambah baikingatan.

Sebelum ini telah dicadangkan bahawa interaksi penambah-penambah adalah sangat dinamik, dan interaksi dengan penambah gabungan yang berbeza membawa kepada perubahan arah dalam ekspresi gen, bergantung kepada sama ada penambah mempunyai motif penindas atau pengaktif14, 18.Cistanche boleh bertambah baikingatan.

Untuk menyiasat lebih lanjut, kami menggunakan krom untuk mengasingkan genom secara tidak berat sebelah ke dalam keadaan berbeza yang ditakrifkan oleh lokasi motif yang mengikat sama ada pengaktif transkrip1 (tindak balas pertumbuhan awal 1 (Egr1), Ap1), penindas transkripsi43,44 (pleiomorphic adenoma gen-seperti 1 (Plagl1). ), hipermetilasi dalam kanser 2 (Hic2), protein pengikat metil CpG 2 (Mecp2), Snai2 dan Rest,) atau TF yang memberi kesan dua arah pada transkripsi dan terlibat dalam seni bina genom 3D25,44,45 (faktor pengikat CCCTC ( CTCF), faktor transkripsi E2F 1 (E2f), Yy1). Ini mengenal pasti tiga keadaan gabungan berbeza tapak pengikat TF (penindas kuat, bivalen dan pengaktif kuat, Rajah 6d, e). Menariknya, kluster dengan pengurangan ekspresi gen (Dw-late) menunjukkan korelasi yang semakin meningkat daripada pengekodan kepada pengambilan dengan penambah yang mempunyai penindas transkrip dan motif bivalen (Rajah 6d, peta haba atas; Data Lanjutan Rajah 7c, d). Data ini menunjukkan bahawa walaupun terdapat kebolehcapaian kromatin yang diperhatikan, gen dikawal ke bawah disebabkan oleh penindasan yang muncul daripada elemen pengawalseliaan ini. Cistanche boleh bertambah baikingatan.

Sebaliknya, dalam kelompok Pengaktifan Semula, kami memerhatikan peningkatan pengayaan untuk penambah yang mempunyai pengaktif transkrip bersama-sama dengan motif yang menambat struktur gelung (Data Lanjutan Rajah 7c,d). Oleh itu, nampaknya apabila aktiviti neuron, beberapa penganjur boleh menggunakan pelbagai jenis penambah yang berbeza untuk mewujudkan interaksi penambah-penambah novel yang boleh menyelaraskan ekspresi gen secara berbeza. Dalam model ini, penganjur gen terkawal turun berinteraksi dengan penambah yang mempunyai penindas transkrip, manakala gen terkawal adalah hasil daripada interaksi penambah penganjur yang membawa pengaktif transkrip berhubung rapat dengan penganjur masing-masing. Secara kolektif, data kami mendedahkan pemrograman semula berurutan kebolehcapaian kromatin, seni bina genom 3D dan interaksi penambah penganjur sepanjang pembentukan engram (Data Lanjutan Rajah 8).