Bahagian 2: Peraturan Epigenetik Gen Sirkadian Per1 Menyumbang Kepada Perubahan Berkaitan Usia dalam Ingatan Hippocampal

Hubungi: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Sila klik di sini untuk Bahagian 1

Kejatuhan Per1 menjejaskan jangka panjangingatanpada tikus muda.Seterusnya, untuk menguji sama ada regulasi Per1 dalam hippocampus dorsal diperlukan untuk jangka panjangingatanpembentukan, kami memasukkan siRNA yang menyasarkan Per1 ke dalam hippocampus dorsal tikus muda 48 jam sebelum 10-min latihan OLM. Infusi Per1 siRNA menghasilkan pengurangan ketara protein PER1 dalam hippocampus dorsal, seperti yang diukur 2 jam selepas sesi ujian akhir (Rajah 4d, Rajah Tambahan 5). Pengurangan protein PER1 yang agak sederhana ini (~30 peratus ) menghasilkan terjejas terukingatanpembentukan untuk OLM; tikus yang diselitkan dengan Per1 siRNA tidak menunjukkan peningkatan yang ketara dalam DI antara latihan dan ujian dan menunjukkan dengan ketara kurang keutamaan untuk objek bergerak semasa ujian berbanding tikus kawalan (Rajah 4e) tanpa kesan ke atas jumlah penerokaan objek pada ujian (Rajah 4f) dan tiada perbezaan dalam pergerakan semasa sesi pelaziman pra-latihan (Tambahan Rajah 8c). Ini menunjukkan, buat kali pertama, bahawa gangguan tempatan gen jam sirkadian teras secara selektif dalam hippocampus boleh menjejaskaningatanpembentukan.

Ekspresi berlebihan Per1 bertambah baikingatanpada tikus yang semakin tua. Akhirnya,untuk menentukan sama ada ekspresi berlebihan Per1 dalam hippocampus dorsal adalah mencukupi untuk memperbaiki berkaitan usiaingatankemerosotan, kami secara tempatan mengimbangi Per1 menggunakan dua kaedah pelengkap. Pertama, kami menggunakan lentivirus yang menyatakan Per1 jenis liar dengan tag epitope v5 (pLVX-v5Per1) (Rajah 5a, Rajah Tambahan 6a). Untuk mengesahkan bahawa plasmid ini lebih mengekspresikan Per1, kami mengalihkan sel HT22 dengan pLVX-v5Per1 atau pLVX-EV dan mengukur ekspresi mRNA Per1. Pada kedua-dua 24 dan 48 jam selepas pemindahan, mRNA Per1 telah meningkat dengan ketara dalam sel yang ditransfeksi dengan pLVX-v5Per1 berbanding dengan sel yang ditransfeksi dengan plasmid kawalan (Rajah 5b). Transfeksi pLVX-v5Per1 juga membawa kepada peningkatan ketara dalam mRNA untuk Per2 (ahli keluarga jam Period yang berinteraksi dengan Per1) pada 24 jam (Tambahan Rajah 6b), walaupun peningkatan ini jauh lebih kecil daripada peningkatan yang diperhatikan dalam Per1 (pada 24 jam, Per1: 466-peningkatan kali ganda berbanding EV, Per2: 1.6-peningkatan kali ganda berbanding EV). Ekspresi berlebihan Per1 tidak menjejaskan transkripsi gen hiliran terdekat Hes7, bagaimanapun (Tambahan Rajah 6c).

Untuk menentukan sama ada ekspresi berlebihan Per1 bertambah baikingatanprestasi dalam tikus yang semakin tua, pLVX-v5Per1 telah dimasukkan ke dalam hippocampus dorsal 18-mo tikus 2 minggu sebelum tingkah laku. Tikus pLVX-v5Per1 menunjukkan peningkatan yang ketaraingatanuntuk OLM pada ujian berbanding kawalan pLVX-EV (vektor kosong) (Rajah 5c). Hanya tikus pLVX-v5Per1 menunjukkan peningkatan yang ketara dalam keutamaan untuk objek bergerak dalam keadaan rehat berbanding latihan tanpa perbezaan kumpulan yang diperhatikan dalam jumlah penerokaan pada ujian (Rajah 5d) atau dalam pergerakan semasa pelaziman (Tambahan Rajah 8d).

Mengikut tingkah laku, tisu hippocampal daripada subset haiwan telah diproses untuk penjujukan RNA untuk mengesahkan kehadiran transkrip pLVX-EV dan pLVX-v5Per1 dalam kumpulan yang sesuai dalam vivo (Tambahan Rajah 7a, b, f, g).

Untuk melengkapkan pendekatan ini, kami juga menggunakan sistem CRISPR/dCas9 Synergistic Activation Mediator (SAM)33 untuk memacu pengaktifan transkrip Per1 dalam hippocampus dorsal. Sistem ini terdiri daripada tiga komponen lentiviral: secara pemangkinCas9 (dCas9) tidak aktif bergabung dengan domain pengaktifan transkrip VP64 dengan teg GFP (dCas9-VP64-GFP), RNA panduan tunggal (sgRNA) yang diubah suai yang menyasarkan Per1 dengan dua aptamer RNA MS2 yang boleh ambil komponen ketiga, protein gabungan MS2- double transcriptional activator (MS2-p65-HSF1)(Gamb. 5e). Haiwan kawalan menerima sgRNA kawalan yang tidak mempunyai 20 jujukan nukleotida yang diperlukan untuk menyasarkan sistem SAM kepada Per1 (dirujuk sebagai ctrl sgRNA). Pemasangan komponen ini pada promoter Per1 membolehkan tiga domain effector (VP64, p65 dan HSF1) memacu transkripsi Per1. Untuk mengesahkan, keberkesanan Rajah 5 Ekspresi berlebihan Per1 dalam hippocampus dorsal memperbaiki kecacatan berkaitan usia di lokasi objekingatan. Skema binaan lentivirus yang digunakan untuk mengekspresikan v{{0}}teg Per1 (pLVX-v5Per1) berbanding kawalan vektor kosong (pLVX-EV). b Per1 mRNA meningkat dengan ketara 24 dan 48 jam selepas pemindahan pLVX-v5Per1 dalam sel HT22 berbanding sel yang ditransfeksi dengan EV (ANOVA dua hala: Interaksi Titik Masa Kumpulan x (F(1,8)=52.8, p < {{20}}.0{{40}}}1),="" ujian="" pos="" hoc="" sidak,="" ***p="">< 0.001,="" n="3," 3,="" 3,="" 3).="" c="" 18-mo="" tikus="" yang="" diberi="" infusi="" hippocampal="" plvx-v5per1="" menunjukkan="" ingatan="" yang="" lebih="" baik="" untuk="" olm="" berbanding="" tikus="" yang="" diberi="" virus="" kawalan="" plvx-ev="" (anova="" dua="" hala:="" interaksi="" virus="" x="" sesi,="" (f(1,29)="" {{34="" }}.15,="" p="">< 0.05),="" ujian="" post="" hoc="" sidak,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001,="" n="16," 15,="" semua="" lelaki).="" d="" jumlah="" penerokaan="" adalah="" serupa="" untuk="" kedua-dua="" kumpulan="" pada="" ujian="" (t(29)="0.57," p="0.57)." e="" skema="" sistem="" crispr/dcas9="" synergistic="" activation="" mediator="" (sam)="" yang="" digunakan="" untuk="" memacu="" transkripsi="" per1.="" atas:="" komponen="" individu="" sam.="" bawah:="" komponen="" dipasang="" pada="" promoter="" per1,="" memacu="" transkripsi="" per1.="" f="" per1="" mrna="" telah="" meningkat="" dengan="" ketara="" 48="" jam="" selepas="" pemindahan="" komponen="" crispr-sam="" dalam="" sel="" ht22="" berbanding="" sel="" yang="" ditransfeksi="" dengan="" kawalan="" sgrna="" (anova="" dua="" hala:="" interaksi="" titik="" masa="" kumpulan="" x="" (f(1,8)="14.77" ,="" p="">< 0.01),="" ujian="" post="" hoc="" sidak,="" **p="">< 0.001,="" n="3,3,3,3)." g="" 18-mo="" tikus="" yang="" diberi="" infusi="" hippocampal="" sistem="" crispr-sam="" dengan="" sgrna="" yang="" menyasarkan="" per1="" menunjukkan="" dengan="" ketara="" lebih="">ingatanuntuk OLM berbanding tikus kawalan EV dengan kawalan sgRNA (ANOVA dua hala: Interaksi Virus x Sesi (F(1,30)=5.83, p < 0.05)="" ,="" ujian="" post="" hoc="" sidak,="" ***p="">< 0.001,="" n="17," 15,="" semua="" lelaki).="" h="" jumlah="" penerokaan="" adalah="" serupa="" untuk="" kedua-dua="" kumpulan="" pada="" ujian="" (t(30)="0.41," p="0.68)." data="" dibentangkan="" sebagai="" min="" ±="" sem="" dalam="" sistem="" crispr-sam,="" kami="" mengalihkan="" sel="" ht22="" dengan="" ketiga-tiga="" plasmid,="" menuai="" sel="" 24="" atau="" 48="" jam="" kemudian,="" dan="" mengukur="" ekspresi="" mrna="" per1.="" menjelang="" 48="" jam="" selepas="" pemindahan,="" mrna="" per1="" telah="" meningkat="" dengan="" ketara="" dalam="" kumpulan="" yang="" diberi="" per1="" sgrna="" berbanding="" dengan="" kawalan="" (rajah="" 5f),="" mengesahkan="" bahawa="" sistem="" crispr-sam="" berkesan="" memacu="" ekspresi="" mrna="" per1.="" kami="" memerhatikan="" tiada="" perubahan="" dalam="" ekspresi="" untuk="" sama="" ada="" per2="" mrna="" (tambahan="" rajah="" 6e)="" atau="" hes7="" mrna="" (tambahan="" rajah="" 6f),="" menunjukkan="" bahawa="" sistem="" crispr-sam="" memacu="" overexpression="" terpilih="" gen="" sasaran,="">

Seterusnya, 18-mo tikus diberi infusi intra-hippocampal lentivirus CRISPR-SAM (Tambahan Rajah 6d) dan dilatih dalam OLM 2 minggu kemudian. Seperti yang diperhatikan dengan ekspresi berlebihan pLVX- v5Per1 kami, ekspresi berlebihan Per1 pengantara CRISPR-SAM telah bertambah baik dengan ketaraingatanprestasi dalam tikus yang diselitkan Per1 sgRNA berbanding haiwan kawalan (Rajah 5g) tanpa menjejaskan jumlah penerokaan (Rajah 5h) atau pergerakan semasa pelaziman (Tambahan Rajah 8e). Hanya tikus yang diberi Per1 sgRNA menunjukkan peningkatan yang ketara dalam keutamaan untuk objek bergerak dalam keadaan rehat berbanding latihan, menunjukkan keadaan utuh.ingatanuntuk lokasi objek (Gamb. 5g). Mengikut tingkah laku, tisu hippocampal daripada subset haiwan telah diproses untuk penjujukan RNA untuk mengesahkan kehadiran transkrip CRISPR dalam kumpulan yang sesuai dalam vivo (Tambahan Rajah 7c-g). Bersama-sama, keputusan ini menunjukkan bahawa ekspresi berlebihan Per1 dalam hippocampus dorsal adalah mencukupi untuk memperbaiki kecacatan berkaitan usia dalam ingatan lokasi objek jangka panjang. Oleh itu, Per1 adalah gen utama yang penting untuk pembentukan ingatan jangka panjang, dikawal oleh HDAC3, dan terjejas dalam otak yang semakin tua.

Perbincangan

Keputusan kami menunjukkan bahawa pemadaman atau gangguan repressive histon deacetylase HDAC3 boleh memperbaiki kecacatan berkaitan usia dalam kedua-dua jangka panjangingatandan keplastikan sinaptik. Selanjutnya, pemadaman HDAC3 memulihkan ekspresi yang disebabkan oleh pengalaman gen sirkadian Per1 dalam hippocampus dorsal. Memandangkan ekspresi PER1 hippocampal adalah penting untuk pembentukan ingatan jangka panjang (Rajah 4) dan ekspresi berlebihan Per1 dalam hippocampus memperbaiki gangguan ingatan yang berkaitan dengan usia (Rajah 5), PER1 ialah mekanisme berpotensi yang melaluinya pemadaman HDAC3 bertambah baik.ingatandan keplastikan sinaptik dalam tikus yang semakin tua. Secara lebih luas, gangguan berkaitan umur Per1 mungkin menghubungkan kemerosotan berkaitan usia dalam kedua-dua ingatan jangka panjang dan ritmik sirkadian, bergantung pada struktur.

Satu penemuan utama daripada kajian semasa ialah kecacatan berkaitan usia dalam LTP hippocampal boleh diperbaiki dengan pemadaman atau gangguan HDAC3. Ini selaras dengan kerja baru-baru ini dari makmal Sajikumar yang menunjukkan bahawa sekatan farmakologi HDAC3 juga boleh memperbaiki kecacatan berkaitan usia dalam LTP34 hippocampal bersekutu. Menariknya, kami mendapati bahawa kepingan daripada haiwan HDAC3flox/flox dan HDAC3(Y298H) lama gagal mencapai tahap potensiasi yang sama seperti hirisan daripada haiwan HDAC3flox/flox atau HDAC3(Y298H) muda (Rajah 2c, f), mencadangkan bahawa otak yang semakin tua mungkin mempunyai siling keplastikan yang lebih rendah daripada otak muda. Satu penjelasan yang mungkin untuk perbezaan potensi ini ialah kehilangan hubungan sinaptik yang berkaitan dengan usia dalam CA122 boleh menurunkan siling keplastikan dalam hippocampus yang semakin tua, kerana sinaps yang lebih sedikit akan menjadi tepu lebih cepat daripada sinaps yang agak banyak dalam DH muda. Jika ini berlaku, mengukuhkan protokol rangsangan atau menyediakan serangan rangsangan jarak35 tidak seharusnya meningkatkan lagi LTP dalam hippocampus yang semakin tua, kerana tiada sinapsis tambahan tersedia. Kerja lanjut akan diperlukan untuk menentukan mekanisme yang mendasari perbezaan ini.

Keputusan penjujukan RNA kami menunjukkan bahawa hanya subset kecil gen yang memenuhi kriteria untuk dipulihkan dalam otak yang semakin tua dengan pemadaman HDAC3 (Rajah 3e). Oleh itu, daripada menyusun semula profil ekspresi gen otak muda, memadam HDAC3 dalam otak penuaan memulihkan ekspresi yang disebabkan oleh pengalaman beberapa gen utama yang sangat penting untuk pembentukan ingatan jangka panjang, termasuk Per1. Per1 nampaknya dikawal secara langsung oleh HDAC3, kerana pemadaman fokus ekspresi Per1 akibat pengalaman HDAC3 yang dipulihkan dan HDAC3 dikeluarkan secara fizikal daripada promoter Per1 sebagai tindak balas kepada latihan OLM. Selanjutnya, ungkapan Per1 diperlukan untukingatan, kerana siRNA-pengantara knock-down protein PER1 dalam DH terjejas jangka panjangingatanpembentukan pada tikus muda, dan ekspresi berlebihan bertambah baikingatanuntuk OLM dalam tikus penuaan. Terutama, kedua-dua sistem lentiviral yang digunakan untuk mengekspresikan Per1 secara berlebihan hanya memindahkan sebilangan kecil sel di kawasan CA1b hippocampus dorsal (Tambahan Rajah 6a, d), menjadikannya perlu untuk mengesahkan kehadiran binaan ini dengan penjujukan RNA (lihat kaedah ). Seperti yang ditunjukkan oleh kerja terdahulu bahawa kawasan tepat hippocampus dorsal ini penting untuk OLM36, ini menunjukkan bahawa walaupun perubahan fokus kecil Per1 dalam struktur berkaitan memori boleh memberi kesan kepada pembentukan memori jangka panjang. Ini melanjutkan penyelidikan terdahulu yang menunjukkan bahawa pemadaman tidak spesifik Per1 di seluruh otak boleh menjejaskan pembentukan ingatan pada tikus muda6,28,29. Oleh itu, penindasan pengantara HDAC{12}}yang tidak normal terhadap Per1 dalam otak yang semakin tua adalah peristiwa penting yang boleh membawa kepada gangguan berkaitan usia dalam pembentukan ingatan jangka panjang dan ritmik sirkadian. Walaupun kajian ini jelas menunjukkan bahawa Per1 ialah gen penting yang melaluinya HDAC3 mengawal ingatan jangka panjang dalam otak yang semakin tua, gen lain berkemungkinan besar menyumbang kepada kesan peningkatan memori daripada pemadaman HDAC3. Gen lain yang dicadangkan untuk mengantara kesan HDAC3 pada keplastikan dan ingatan sinaptik termasuk NF-κB34, FMRP37, dan Nr4a226. Dalam kajian semasa, kami mengenal pasti tiga gen tambahan (Rajah 3f: Nr4a1, Egr1, Tsc22d3) yang, seperti Per1, menunjukkan ekspresi terjejas dalam otak penuaan yang diperbaiki oleh pemadaman HDAC3. Bagaimana gen berbeza ini secara unik menyumbang kepada kesan peningkatan memori pemadaman HDAC3 pada masa ini tidak jelas. Terutama, semua gen ini antara muka dengan laluan CBP/CREB, yang penting untuk pembentukan ingatan jangka panjang38,39 dan kedua-duanya atas dan hiliran PER16,28. Memandangkan PER1 adalah huluan fosforilasi CREB6, kemungkinan HDAC{45}}penindasan pengantara Per1 mengurangkan fosforilasi CREB, akhirnya menjejaskan transkripsi gen pengantara CREB seperti Fmrp40,41 dan ahli keluarga gen Nr4a Nr4a1 dan Nr4a226. Memahami dinamik kompleks antara HDAC3, PER1, dan pemain molekul lain ini akan menjadi matlamat penting penyelidikan masa depan.

Dalam kajian semasa, kami menggunakan dua kaedah pelengkap untuk mengekspresikan Per1 secara berlebihan dalam otak penuaan: overexpression konstruk cDNA Per1 penuh menggunakan pLVX-v5Per1 dan pengaktifan transkrip Per1 endogen menggunakan sistem CRISPR-SAM. Walaupun ekspresi berlebihan pengantara pLVX mendorong peningkatan besar dalam mRNA Per1 (Rajah 5b), ini disertai dengan peningkatan dalam Per2, ahli keluarga Period yang lain (Tambahan Rajah 6b). Ekspresi gen hiliran Hes7, bagaimanapun, tidak berubah oleh pLVX-v5Per1 (Tambahan Rajah 6c). Sistem CRISPR-SAM, sebaliknya, menghasilkan peningkatan yang lebih halus dalam mRNA Per1 yang mengelakkan peningkatan luar sasaran sama ada ekspresi Per2 atau Hes7 (Tambahan Rajah 6e-f). Memandangkan kedua-dua pendekatan sama-sama bertambah baik untuk jangka panjangingatandalam tikus yang semakin tua, tidak mungkin peningkatan luar sasaran dalam Per2 yang diperhatikan dengan pLVX-v5Per1 adalah punca peningkatan yang diperhatikan dalam ingatan jangka panjang.

Kesan sirkadian pada jangka panjangingatansecara tradisinya dipercayai berpunca daripada disregulasi dalam SCN, yang kemudiannya mendorong perubahan dalam struktur periferi yang terlibat dalam pembentukan ingatan, seperti hippocampus dorsal. Sedikit yang diketahui tentang peranan gen jam sirkadian individu dalam DH, walaupun terdapat hubungan yang jelas antara ritmik sirkadian dan pembentukan ingatan jangka panjang. Ingatan berkait rapat dengan masa dalam sehari, kerana lata gen yang berkaitan dengan keplastikan menunjukkan ayunan sirkadian3,6 daningatanboleh diperolehi dengan lebih mudah pada tempoh tertentu kitaran sirkadian. Sebagai contoh, penyesuaian ketakutan konteks diperoleh dengan lebih kuat pada waktu siang, apabila tahap fosforilasi MAPK memuncak3. Selanjutnya, didokumentasikan dengan baik bahawa penuaan disertai dengan pecahan irama sirkadian, mungkin disebabkan oleh perubahan dalam jam sirkadian pusat, nukleus suprachiasmatic (SCN) (untuk semakan1). Bagaimana gangguan dalam jam sirkadian ini berkaitan dengan gangguan berkaitan usia dalamingatanadalah soalan terbuka. Keputusan kami menunjukkan bahawa HDAC3 mengehadkan Per1 yang disebabkan oleh pengalaman dalam hippocampus penuaan, mungkin menyumbang kepada gangguan yang diperhatikan dalam ingatan jangka panjang. Oleh itu, penindasan epigenetik Per1 mungkin mewakili antara muka penting antara gangguan berkaitan usia dalam kedua-dua ritmik sirkadian dan pembentukan ingatan jangka panjang.

Daripada gen jam sirkadian kanonik teras, Per1 secara unik bersedia untuk secara dramatik mempengaruhi hippocampal jangka panjangingatan. Per1 nampaknya sebahagian besarnya terlibat dalam laluan keluaran SCN dan memainkan peranan penting dalam jam persisian di hilir SCN, seperti hippocampus42. Selanjutnya, kerja baru-baru ini menunjukkan bahawa Per1 boleh "meminjam" pembentukan memori spatial sepanjang kitaran siang / malam dengan mengawal fosforilasi CREB6,28,29. Sesungguhnya, regulasi mRNA Per1 hippocampal telah diperhatikan selepas pembelajaran konteks atau spatial dalam sekurang-kurangnya tiga kajian RNA-seq lain, termasuk kerja dalam tikus, menunjukkan bahawa Per1 biasanya dikawal selia selepas pembelajaran merentas spesies20, 43, 44. Bersama-sama dengan hasil kajian semasa, kerja ini menunjukkan bahawa ekspresi PER1 adalah sangat penting untuk pembentukan memori jangka panjang hippocampal; pengurangan dalam PER1 yang berlaku pada waktu malam29 atau dengan penuaan boleh menjejaskan hippocampalingatan. Sehingga kini,

penyelidikan yang membabitkan Per1 dalamingatanpembentukan secara eksklusif bergantung pada kalah mati global yang mengganggu ekspresi Per1 dalam jam sirkadian teras dan kawasan lain sebagai tambahan kepada struktur berkaitan memori seperti hippocampus6,28,29,45,46, menjadikannya mustahil untuk menentukan sama ada PER1 hippocampal diperlukan secara khusus untuk pembentukan ingatan. Sesungguhnya, pemadaman Per1 global memang menjejaskan ritmik sirkadian dalam beberapa laporan42. Di sini, kami menunjukkan buat kali pertama bahawa mengurangkan ekspresi PER1 secara langsung dalam hippocampus dorsal boleh menjejaskaningatanpada tikus muda manakala ekspresi berlebihan tempatan Per1 dalam hippocampus dorsal boleh meningkatkan ingatan pada tikus yang semakin tua. Memandangkan pemadaman terpilih HDAC3 (yang mengawal Per1) dalam hippocampus dorsal tidak mempunyai kesan ke atas corak aktiviti sirkadian dalam kajian semasa (Tambahan Rajah 4), malah lesi elektrolitik hippocampus dorsal tidak mencukupi untuk menjejaskan ritmik sirkadian47, nampaknya tidak mungkin bahawa memanipulasi Per1 dalam hippocampus dorsal menjejaskan fungsi jam sirkadian pusat. Namun begitu, ada kemungkinan peningkatan yang disebabkan oleh pengalaman dalam Per1 atau overexpression yang dimediasi virus Per1 boleh menjejaskan ayunan sirkadian pemain molekul lain, seperti gen jam lain, dalam neuron hippocampal, walaupun tanpa menjejaskan corak aktiviti sirkadian. Memahami cara Per1 berfungsi untuk mengubah pembentukan memori, termasuk mengenal pasti rakan kongsi yang berpotensi berinteraksi ini, akan menjadi sasaran kerja masa hadapan.

Bersama-sama, keputusan ini menunjukkan bahawa gen jam sirkadian teras Per1 memainkan peranan penting dalam tempataningatanstruktur untuk mengubah pembentukan ingatan, peranan yang bebas daripada fungsinya dalam SCN. Secara umumnya, ini mencabar hipotesis tradisional bahawa sirkadian berubahingatanpembentukan didorong oleh perubahan dalam jam sirkadian teras dan sebaliknya menyokong hipotesis bahawa gen jam sirkadian memainkan peranan yang lebih autonomi dalam sel hippocampal, mungkin mengawal pembentukan memori berdasarkan masa hari6.

Kaedah

tikus. Tikus dewasa muda berumur antara 2 dan 4 bulan pada masa ujian dan tikus yang menua berumur antara 18 dan 20 bulan. Semua tikus adalah C57BL/6J atau dikekalkan pada latar belakang C57BL/6 (HDAC3 tambah / tambah dan HDAC3flox/tikus). Tikus mempunyai akses percuma kepada makanan dan air dan lampu dikekalkan pada kitaran terang/gelap 12 jam. Semua ujian tingkah laku dilakukan semasa kitaran cahaya. Semua eksperimen telah dijalankan mengikut garis panduan Institut Kesihatan Kebangsaan AS untuk penjagaan dan penggunaan haiwan dan telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi Universiti California, Irvine.

Pembedahan. Tikus telah dibius dengan isoflurane (terinduksi, 4 peratus ; dikekalkan1.5–2.0 peratus ) dan diletakkan dalam stereotaxic. Jarum suntikan diturunkan ke hippocampus dorsal pada kadar 0.2 mm/15 s (AP, −2.0 mm; ML, ± 1.5 mm, DV, − 1.5 mm berbanding Bregma ). Dua minit selepas mencapai kedalaman sasaran, 1.0 ul virus atau siRNA telah diselitkan secara dua hala ke dalam DH pada kadar 6 ul/j. Untuk infusi lentiviral CRISPR-SAM, satu koktel daripada tiga virus telah diselitkan kepada volum akhir 1.5 μL setiap hemisfera pada kadar yang sama. Jarum suntikan kekal di tempatnya selama dua minit selepas suntikan untuk membolehkan virus meresap. Penyuntik kemudiannya dinaikkan 0.1 mm dan dibenarkan duduk selama satu minit lagi sebelum dikeluarkan pada kadar 0.1 mm setiap 15 saat. Infusi virus dilakukan 2 minggu sebelum analisis tingkah laku manakala siRNA knockdown dilakukan 2d sebelum latihan13. Untuk semua eksperimen suntikan, haiwan secara rawak diberikan kepada keadaan suntikan yang berbeza (kecuali tikus HDAC3 tambah / tambah dan HDAC3 flox / flox, yang semuanya disuntik dengan AAV-CaMKII-Cre). Untuk semua eksperimen tingkah laku, haiwan dalam setiap keadaan virus secara rawak ditugaskan kepada kumpulan homecage/terlatih dan semua keadaan (objek, kotak, dll.) telah diimbangi antara kumpulan.

Pengeluaran AAV. AAV2.1-CaMKII-Cre telah dibeli daripada Penn Vector Core(titer: 1.81 × 1013 GC/ml). Untuk AAV2.1-HDAC3(Y298H)-v5, kami menguatkan HDAC3 jenis liar daripada cDNA hippocampal dan mengklonkan produk kepada pAAV- IRES-hrGFP (Agilent) yang diubah suai di bawah kawalan promoter CMV dan intron -globin. Teg 3×-FLAG, elemen IRES dan hrGFP telah dialih keluar daripada vektor dan digantikan dengan teg V5, membenarkan gabungan C-terminal kepada HDAC3 (plasmid MW91). Untuk mencipta mutasi titik, kami menukar nukleotida kepada kod bagi sisa histidin sebagai ganti tirosin pada asid amino 298 (plasmid MW92). Untuk kawalan vektor kosong, urutan pengekodan HDAC3 tidak hadir, tetapi semua elemen lain kekal (plasmid MW87). AAV dibuat oleh Teras Vektor Penn dan titer akhir ditentukan oleh qPCR (AAV-HDAC3(Y298H): 6.48 × 1012 GC/ml; AAV-EV: 1.35 × 1013 GC/ml).

Pengeluaran lentivirus. Untuk sistem CRISPR/dCas9 Synergistic Activation Mediator (SAM), plasmid lentiviral telah dibeli daripada Addgene untuk dCas9- VP64-GFP (#61422-LVC) dan MS2- Binaan P65-HSF1_Hygro (#61426-LVC) (titer Lebih besar daripada atau sama dengan 8× 106 TU/ml). Untuk sgRNA Per1, kami mengklon dan memasukkan jujukan panduan antisense yang sepadan dengan elemen CRE dalam promoter Per1 (AGAGGGAGGTGACGTCAAAG) ke dalam tulang belakang pengklonan Addgene sgRNA(MS2) (#61427). Kawalan sgRNA adalah sama, kecuali tiada urutan panduan diklon ke dalam plasmid. Lentivirus untuk kedua-dua Per1 sgRNA (titer: 6.8 × 107 IFU/ml) dan kawalan sgRNA (3.5 × 107 IFU/ml) telah dihasilkan oleh USC School of Pharmacy Lentiviral Laboratory.

Untuk binaan overexpression pLVX-V5Per1, kami menguatkan wildtype penuh penuh Per1 daripada plasmid Addgene pCMV-Sport2-mPer1 (#16203) dan mengklonkan produk kepada pLVX-EF1 -IRES-mCherry yang diubah suai tulang belakang (Takara, #631987). Unsur-unsur IRES dan mCherry telah dialih keluar dan digantikan dengan tag V5, membolehkan gabungan N-terminal kepada PER1 (plasmid MW206). Untuk kawalan vektor kosong (EV), urutan pengekodan PER1 tidak hadir tetapi semua elemen lain kekal (Plasmid MW93). Lentivirus untuk pLVX-v5Per1 (titer: 1.3 × 108 IFU/ml) dan pLVX-EV (titer: 1.5 × 108 IFU/ml) telah dihasilkan oleh USC School of Pharmacy Lentiviral Laboratory. Semua binaan lentiviral telah dinyatakan di bawah promoter EF1.

Pengesahan Kultur Sel pLVX-v5Per1 dan CRISPR-SAM. Untuk mengesahkan bahawa pLVX-v5Per1 menghasilkan ekspresi berlebihan mRNA Per1, sel HT22 tetikus (Salk Institute, La Jolla, CA, #T09031) telah ditransfeksi dengan pLVX-v5Per1 atau pLVX- EV (Rajah 5a) menggunakan Lipofectaine LTX (Invitrogen). Begitu juga, untuk mengesahkan bahawa sistem CRISPR-SAM boleh memacu transkripsi Per1 dengan berkesan, sel HT22 telah dipindahkan dengan dCas9-VP64 (lenti MS2-P65_HSF1_Blast was hadiah daripada Feng Zhang Addgene plasmid #61425), MS2-P65-HSF1 (lenti dCAS-VP64_Blast ialah hadiah daripada Feng Zhang, Addgene plasmid #61426), dan sama ada Per1 sgRNA (Per1 sgRNA) atau sgRNA kawalan bukan sasaran (ctrl sgRNA) (lenti sgRNA (MS2)_tulang belakang zeo ialah hadiah daripada Feng Zhang, Addgene plasmid #61427) menggunakan Lipofectamine LTX (Invitrogen). Sel dituai selepas 24 atau 48 jam, dilisiskan, dan mRNA diasingkan seperti yang diterangkan di atas. qRT-PCR dilakukan seperti yang diterangkan di atas menggunakan primer dan probe Per1, Per2, dan Hes7 yang disenaraikan dalam Jadual S4.

siRNA. Untuk percubaan knockdown Per1, Accell SMARTpool kecil mengganggu RNA (siRNA; Dharmacon, GE) yang menyasarkan Per1 telah dicairkan kepada jumlah kepekatan akhir 10 μM dalam ddH20 dan diselitkan ke dalam DH (1.0 ul/sisi). SiRNA kumpulan bukan sasaran Accell digunakan sebagai kawalan (jumlah kepekatan, 10 μM) dan diselitkan dengan cara yang sama. Untuk eksperimen siRNA, tikus dikendalikan dan dibiasakan seperti yang diterangkan di atas dan pembedahan dilakukan sehari selepas hari terakhir pelaziman. Tikus diberi pemulihan sehari penuh selepas pembedahan dan dilatih pada hari berikutnya (~ 48 jam selepas pembedahan) untuk memastikan sasaran kejatuhan maksimum. Untuk memastikan knockdown, tikus telah dikorbankan ~1 jam selepas ujian dan tumbukan dari hippocampus dorsal diproses dengan western blots untuk memastikan knockdown protein PER1.

Lokasi objek dan pengecaman objekingatantugasan. Untuk lokasi objek dan tugas ingatan pengecaman objek, tikus dikendalikan selama 2 minit/hari selama 4 hari dan kemudian dibiasakan dengan konteks selama 5 minit/hari selama enam hari berturut-turut tanpa kehadiran objek. Semasa latihan, tikus didedahkan kepada dua objek yang sama (bikar 100 ml, tin rempah atau pemegang lilin kaca) dan dibenarkan meneroka selama 10 minit. Semasa ujian pengekalan (24 jam kemudian untuk jangka panjangingatanatau 60 m kemudian untuk ingatan jangka pendek), tikus dibenarkan meneroka selama 5 minit. Untuk lokasi objekingatan, salah satu daripada dua objek biasa telah dialihkan ke lokasi baharu. Untuk pengecaman objekingatan, lokasi objek kekal malar tetapi salah satu objek telah digantikan dengan item baharu. Pelaziman untuk ingatan pengecaman objek bermula sekurang-kurangnya seminggu selepas selesai ujian OLM dan konteks baharu serta objek yang tidak dikenali telah digunakan48. Penerokaan dijaringkan apabila kepala tetikus berorientasikan ke arah objek dan datang dalam jarak 1 cm atau apabila hidung menyentuh objek. Jumlah masa penerokaan direkodkan (t) dan keutamaan untuk item novel dinyatakan sebagai indeks diskriminasi (DI=(tnovel -tfamiliar) / (tnovel tambah tfamiliar) x 100 peratus ). Untuk sesi latihan, objek yang ditetapkan untuk dipindahkan pada ujian digunakan sebagai objek baru untuk membolehkan latihan dan ujian DI dibandingkan secara langsung. Tikus yang meneroka kedua-dua objek selama kurang daripada 2 s semasa ujian atau 3 s semasa latihan telah dikeluarkan daripada analisis lanjut. Tikus yang menunjukkan keutamaan untuk satu objek semasa latihan (DI > ± 20) juga dialih keluar. Sesi pembiasaan dianalisis (untuk menentukan jarak perjalanan dan kelajuan) menggunakan perisian analisis tingkah laku ANY-maze (Stoelting Co). Semua pelaziman, latihan, ujian, dan pemarkahan dilakukan oleh penguji yang buta terhadap kumpulan eksperimen.

Ketakutan konteks kepada keadaan. Untuk penyesuaian ketakutan kontekstual, tikus pertama kali dikendalikan selama 5 hari. Semasa pemerolehan, tikus didedahkan kepada konteks selama 2 minit dan 28 saat diikuti oleh kejutan 2 saat (0.75 mA), protokol yang biasanya menghasilkan ingatan jangka panjang yang teguh12,20. Tikus kekal dalam konteks selama 30 saat tambahan sebelum dialih keluar. Tikus telah dikorbankan 60 m selepas latihan bersama-sama dengan kawalan homecage yang dikendalikan tetapi tidak dilatih. Tingkah laku pembekuan diukur menggunakan perisian Ethovision 11 (Noldus)12.

Labirin tambah tinggi. Labirin tambah telah dijalankan oleh seorang penguji buta terhadap kumpulan eksperimen. Seminggu selepas ORM selesai, subset tikus telah diuji pada labirin tambah. Dua lengan labirin terbuka (30 × 5 cm) dan dua lengan ditutup (30 × 5 × 15 cm), disambungkan oleh platform tengah (5 × 5 cm). Maze itu dinaikkan 40 cm di atas lantai. Tikus diuji selama 5 minit pada radas, yang terdiri daripada meletakkan setiap tetikus ke platform tengah menghadap salah satu lengan terbuka. Di antara subjek, labirin dibersihkan dengan 70 peratus etanol. Peratusan masa yang dihabiskan dalam tangan tertutup dan terbuka telah dijaringkan menggunakan perisian ANY-maze.

Analisis irama sirkadian. Tikus muda ({{0}}) dan penuaan (18-bln) HDAC3 plus / plus dan HDAC3flox/ox dibiakkan dan ditempatkan di bawah kitaran terang/gelap (LD) selama 12 jam. Dua minggu selepas infusi AAV-CaMKII-Cre (diterangkan di atas), tikus dipindahkan ke bilik entrainment LD 12 jam terpencil selama 7 hari. Tikus kemudian dipindahkan ke dalam bilik analisis aktiviti yang dilindungi cahaya, di mana aktiviti lokomotor dianalisis menggunakan pengesan gerakan rasuk optik (Philips Respironics). Aktiviti ini dipantau selama 2 minggu kitaran LD di dalam bilik yang dilindungi cahaya sebelum tikus ditukar kepada kegelapan malar (DD) selama 3 minggu tambahan. Pemantauan aktiviti diteruskan sepanjang fasa DD untuk menentukan sama ada pemadaman HDAC3 dalam DH menjejaskan irama sirkadian endogen. Data dikumpul menggunakan Minimitter VitalView 5.0 dan perisian Clocklab (Actimetrics) digunakan untuk menentukan permulaan aktiviti bebas. Nilai Tau telah dikira dengan mendapatkan kecerunan permulaan ini dan mengira kesesuaian kuasa dua terkecil dengan perisian Clocklab49,50.

Imunohistokimia. Selepas selesai tingkah laku, tikus telah dislokasi dengan terkehel serviks dan otak mereka dikeluarkan dan dibekukan dalam isopentana ais sejuk. Kepingan dua puluh mikrometer dikumpulkan di seluruh kampus pinggul dorsal, dicairkan pada slaid dan disimpan pada −80 darjah. Slaid telah dibetulkan dengan 4 peratus paraformaldehid (10-min), telap dalam 0.01 peratus Triton X-100 dalam 0.1 M PBS (5-min) , dan disekat selama 1 jam dengan 8 peratus serum kambing biasa (Jackson). Slaid diinkubasi semalaman (4 darjah ) dalam antibodi arnab kepada HDAC3 (1:250, Abcam, klon Y415, ab32369) atau V5 (1:1000, Abcam, ab9116), atau antibodi ayam kepada GFP (1:250, Aves Labs, #GFP1010). Keesokan harinya, slaid dicuci dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu bilik dengan Alexa 488 anti-arnab kambing (HDAC3 dan V5; 1:1000, ThermoFisher, #A-11008) atau Alexa 488 anti-ayam kambing (GFP ; 1:1000, ThermoFisher, #A-11039) dalam gelap. Slaid kemudian dibasuh dengan PBST dan diinkubasi selama 50 m dalam NeuroTrace 530/615 (1:50; ThermoFisher, #N21482), pewarna nissl pendarfluor. Untuk memadamkan autofluoresensi tidak spesifik51, kepingan kemudian dibasuh dalam PBS dengan 0.01 peratus Triton, dibilas dalam air, dan diinkubasi selama 10-min dalam 10 mM CuSO4 dalam penimbal ammonium asetat 50 mM. Kepingan dibilas sekali lagi dalam air, dibasuh dalam PBS, dan ditutup dengan medium pelekap Antifade VectaShield (Makmal Vektor).

Semua imej telah diperoleh dengan Pengimbas Olympus VS110 dengan objektif apokromatik 20x (apertur berangka 0.75) dengan perisian pengimbas VS110. Semua kumpulan rawatan diwakili pada setiap slaid dan semua imej pada slaid telah ditangkap dengan masa pendedahan yang sama di bawah keadaan tidak tepu. Keamatan imunolabel dikira dengan ImageJ dengan mensampel ketumpatan optik lapisan sel dalam CA1 dan menolak sampel pendarfluor latar belakang dalam imej yang sama. Untuk semua eksperimen AAV, haiwan yang gagal mengekspresikan virus di kawasan CA1 hippocampus dorsal dikecualikan daripada analisis. Pengimejan dan pengiraan telah dilakukan oleh penguji buta terhadap keadaan eksperimen.

Penghapusan Barat. Untuk mengesahkan kejatuhan PER1, siRNA Per1 dan tikus siRNA kawalan telah dikorbankan 2 jam selepas ujian dan otak dibekukan dengan kilat. Otak dibelah korona dan pukulan DH 1 mm dikumpulkan daripada kepingan 500 μm. Tumbukan telah dihomogenkan dalam penimbal T-PER (Thermo Fisher) dengan protease Halt dan perencat fosfatase (Thermo Fisher) menggunakan homogenizer Dounce. Lisat protein dikira menggunakan ujian Bradford (BioRad) yang diubah suai dan 5{31}} jumlah lisat protein dimuatkan ke dalam setiap lorong 7.5 peratus gel NuPAGE Bis-Tris (Thermo Fisher). Gel berjalan selama 50 minit pada 200 volt dan blots dipindahkan semalaman pada 15 V pada 4 darjah ke membran nitroselulosa (Novexi, LC2001). Keesokan harinya, membran diinkubasi dalam penampan penyekat selama 1 jam (5 peratus susu tanpa lemak dalam garam Tris-buffered dengan 0.01 peratus Tween 20), dibasuh (0.1 peratus Tween 20 dalam TBS) dan kemudian diinkubasi dalam antibodi primer (1:500, arnab anti-Per1, Thermo Fisher #PA1-524) dalam penimbal antibodi primer (3 peratus BSA dalam TBS dengan 0.1 peratus Tween) semalaman pada 4 darjah . Membran kemudiannya dibasuh dan diinkubasi dalam antibodi tikus konjugasi HRP kepada arnab (1:10,000, Makmal Jackson, khusus rantai ringan, #211-032-171) selama 1 jam. Membran telah dibasuh dan dibangunkan menggunakan Substrat Chemiluminescent Pierce SuperSignal West Pico (Pierce, 34077). Pendedahan berbilang filem telah digunakan untuk mengesahkan kelinearan. Tompok telah dicuci dan dilucutkan selama 10 m dengan Restore Western Blot Stripping Buffer (Thermo Fisher #21059), dicuci semula, dan kemudian disiasat semula semalaman (4 darjah ) dengan antibodi arnab kepada GAPDH (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, SC25778 ). Blot PER1 dan GAPDH penuh panjang ditunjukkan dalam Rajah Tambahan 5. Ketumpatan optik relatif dikira daripada filem yang diimbas menggunakan ImageJ (Institut Kesihatan Kebangsaan AS) oleh seorang penguji yang buta terhadap keadaan eksperimen. Semua nilai telah dinormalisasi kepada tahap ekspresi GAPDH.

qRT-PCR. Tisu dikumpulkan dari pukulan DH (diterangkan di atas) dan dibekukan pada −80 darjah sehingga pemprosesan. RNA telah diasingkan menggunakan RNeasy Minikit (Qiagen, #74104) dan cDNA dicipta menggunakan kit Sintesis cDNA Transkriptor First Strand (Roche, 04379012001). Primer dan probe diperoleh daripada Roche Universal ProbeLibrary (Jadual S4) dan digunakan untuk pemultipleksan dalam mesin Roche Light-Cycle 480 II (Roche). Semua nilai telah dinormalkan kepada Gapdh. Analisis dan statistik telah dilakukan menggunakan algoritma proprietari Roche dan perisian REST 2009 berdasarkan kaedah Pfafff52,53.

RNA sequencing. RNA was isolated from dorsal hippocampus punches as described above, using the RNeasy Minikit (Qiagen, 74104). RNA quality was assessed by Bioanalyzer and samples with an RNA integrity number >9 telah dimasukkan dalam analisis kami. Perpustakaan cDNA untuk setiap kumpulan telah disediakan mengikut Panduan Penyediaan Sampel RNA TruSeq (Illumina). Dua ratus lima puluh nanogram jumlah RNA daripada setiap tetikus telah disucikan dengan manik magnet poli-T oligo-dipasang dan dipecahkan haba. cDNA untaian pertama dan kedua kemudiannya disintesis dan ditulenkan. Selepas hujungnya tumpul, hujung 3′ diadenilasi untuk mengelakkan penyambungan templat semasa pengikatan penyesuai. Bagi setiap kumpulan, set penyesuai unik telah ditambahkan pada hujung cDNA dan perpustakaan telah dikuatkan oleh PCR. Kualiti perpustakaan telah dinilai oleh Bioanalyzer dan dikira menggunakan qRT-PCR dengan lengkung standard yang disediakan daripada perpustakaan penjujukan komersial (Illumina). Sampel telah dimultiplekskan, dengan setiap kumpulan tingkah laku diwakili dalam setiap sel aliran penjujukan. 10 nM setiap perpustakaan dikumpulkan dalam empat perpustakaan multipleks dan dijujukan pada instrumen Illumina HiSeq 2500 semasa penjujukan 50 bp bacaan tunggal, dikendalikan oleh Kemudahan Genomic High- Throughput di University of California, Irvine. Data penjujukan yang terhasil untuk setiap perpustakaan telah diproses pasca untuk menghasilkan fail FastQ. Data kemudiannya dinyahgandakan dan ditapis menggunakan perisian Illumina CASAVA 1.8.2 serta perisian dalaman. Bacaan berkualiti rendah (ujian kualiti standard Illumina yang gagal) dan bacaan kawalan yang berjaya diselaraskan dengan genom kawalan PhiX telah dialih keluar daripada analisis. Kualiti jujukan yang tinggal dinilai selanjutnya menggunakan skor kualiti PHRED yang dihasilkan dalam masa nyata semasa langkah panggilan asas bagi larian penjujukan (Tambahan Rajah 3a).

Penjajaran kepada genom rujukan dan transkriptom. Bacaan daripada setiap eksperimen telah diselaraskan secara berasingan dengan genom rujukan dan transkriptom yang sepadan menggunakan penjajaran bacaan pendek ELAND v2e (Illumina) dan Bowtie24. Bacaan yang diselaraskan secara unik oleh kedua-dua alatan kepada ekson atau persimpangan sambatan yang diketahui dengan tidak lebih daripada dua ketidakpadanan pada mana-mana serpihan 25 bp bacaan telah dimasukkan dalam transkrip. Bacaan diselaraskan secara unik, tetapi dengan lebih daripada dua ketidakpadanan pada mana-mana serpihan 25 bp bacaan telah dialih keluar daripada analisis. Begitu juga, bacaan yang sepadan dengan beberapa lokasi dalam genom rujukan telah dialih keluar daripada analisis. Peratusan bacaan yang diberikan kepada genom rujukan dan transkriptom menggunakan protokol ini dilaporkan untuk setiap kumpulan replika (Tambahan Rajah 3b). Ini menghasilkan purata kira-kira 30 juta bacaan bagi setiap sampel.

Untuk mengesahkan kehadiran plasmid pLVX dan CRISPR-SAM berikutan infusi lentiviral, kami menjalankan penjujukan RNA pada sampel hippocampal daripada subset tiga haiwan setiap kumpulan mengikut tingkah laku. Oleh kerana bilangan sel yang dijangkiti lentivirus dalam vivo adalah terlalu kecil untuk mengesan kehadiran transkrip yang sesuai menggunakan RT-qPCR (Tambahan Rajah 6a, d), kami menggunakan RNA-seq sebagai kaedah yang lebih sensitif untuk mengesan kehadiran daripada transkrip ini. Versi kemas kini pemasangan genom dan anotasi genom telah dibina dengan melampirkan jujukan dan anotasi binaan plasmid pada genom tetikus mm10 asal dan kepada anotasi genom tetikus mm10, masing-masing. Menggunakan alat penjajaran bacaan TopHat dalam Tuxedo Suite54, bacaan dipetakan ke genom dan hanya hits yang unik kepada transkrip plasmid berbanding dengan genom rujukan tikus endogen dianggap "bacaan dipadankan" kepada binaan plasmid. Bilangan bacaan yang dipadankan kemudiannya dikira untuk setiap konstruk untuk setiap sampel.

Ekspresi gen dan analisis pembezaan. Tahap ekspresi gen dikira secara langsung daripada hasil penjajaran baca untuk setiap replika. Nilai RPKM standard55, bacaan setiap kilobase model ekson bagi setiap juta bacaan dipetakan) telah diekstrak untuk setiap gen yang diliputi oleh data penjujukan dan setiap replika digunakan dalam kajian ini.

Analisis transkrip pembezaan dilakukan menggunakan Cyber ​​T56,57 merentas setiap pasangan kumpulan (homecage berbanding 60 m selepas latihan) untuk mengenal pasti gen yang dikawal ke atas atau ke bawah selepas OLM. Sebagai tambahan kepada 18-tetikus HDAC3 plus / plus dan HDAC3flox/ox sebulan yang dilatih untuk kajian semasa, memproses data penjujukan RNA secara identik daripada {{10}}tikus jenis liar C57 bulan ( homecage dan OLM-dilatih dengan cara yang sama seperti kajian semasa) daripada kajian terdahulu20 digunakan untuk analisis pembezaan. Bilangan haiwan (replika biologi) untuk setiap kumpulan ialah: HDAC muda tambah / tambah HC: 6, HDAC3 muda tambah / tambah OLM: 6, HDAC3 lama tambah / tambah HC: 6, HDAC3 tambah / tambah OLM Lama: 6, Tua HDAC3ox/ox HC: 8, HDAC3ox/ox OLM lama: 8. Tiada replika teknikal digunakan. Ambang nilai p yang digunakan untuk menentukan ungkapan pembezaan ialah 0.05 untuk semua kumpulan. Kadar Penemuan Palsu (FDR) seperti yang diukur oleh nilai q Benjamini & Hochberg (BH) telah digunakan untuk membetulkan ujian berbilang, dengan ambang FDR 0.15. Set gen yang dikawal selia selepas pengalaman (berbanding dengan homecage) untuk 3 kumpulan ini (jenis liar muda, HDAC tambah / tambah penuaan, atau HDAC3flox/lox penuaan) telah bersilang untuk menentukan gen biasa kepada dua atau lebih kumpulan. Pengayaan setiap kumpulan untuk ekspresi khusus tisu, istilah Ontologi Gen58, dan laluan KEGG59,60 dinilai menggunakan DAVID61, berdasarkan gen yang dinyatakan secara berbeza selepas tingkah laku. Visualisasi data dilakukan menggunakan "matplotlib" untuk python dan "ggplot" untuk R.

Imunopresipitasi kromatin. ChIP dilakukan pada pukulan DH berdasarkan protokol dari kit Millipore ChIP11,12,62. Tisu dikait silang dengan 1 peratus formaldehid (Sigma), dilisiskan dan disonikasi, dan kromatin diimunopresipitasi semalaman dengan 2 ul anti-H4K8Ac (Millipore #17-10099) atau 4 ul anti-HDAC3 (Millipore #{{ 13}}) atau jumlah yang setara dengan Normal Rabbit Serum (kawalan negatif H4K8Ac, Millipore) atau IgG anti-tikus (kawalan negatif HDAC3, Millipore). Selepas mencuci, kromatin telah dicairkan daripada manik dan berpaut silang terbalik dengan kehadiran proteinase K sebelum penulenan lajur DNA. Urutan primer untuk penganjur setiap gen telah direka oleh program Primer 3 (Jadual S4). Lima ul input, anti-H4K8Ac IgG/anti-HDAC3 IgG, atau anti-arnab/tikus IgG immunoprecipitate daripada setiap haiwan telah diperiksa dalam salinan. Untuk menormalkan data ChIP-qPCR, kami menggunakan kaedah input peratus. Sampel input telah dilaraskan kepada 100 peratus dan kedua-dua sampel IP dan IgG dikira sebagai peratus daripada input ini menggunakan formula 100*AE^(input terlaras – Ct(IP)). Pengayaan lipatan kemudiannya dikira sebagai nisbah ChIP kepada purata IgG. Keluk piawai dalam plat menentukan kecekapan penguatan (AE).

Penyediaan kepingan dan rakaman. Tikus muda (kira-kira 3-bulan) dan penuaan (18-bulan) telah diselitkan dengan virus secara stereotaksis. Untuk percubaan pertama, tikus HDAC3 tambah / tambah muda dan tua dan HDAC3flox/flox telah diselitkan dengan AAV-CaMKII- Cre secara dua hala ke dalam DH. Untuk eksperimen kedua, tikus wildtype C57 muda dan tua telah diselitkan dengan AAV-HDAC3(Y298H) ke dalam DH satu hemisfera dan kawalan AAV-EV ke hemisfera lain. Dua minggu selepas infusi (untuk membolehkan ekspresi virus yang optimum)2, hirisan hippocampal melintang (320 μm) diletakkan di dalam ruang rakaman antara muka dengan cecair serebrospinal tiruan yang dipanaskan terlebih dahulu (31 ± 1 darjah) (124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM KH2PO4, 1.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3, dan 10 mM D-glukosa). Kepingan terus direndam pada kadar 1.75–2 ml seminit manakala permukaan kepingan didedahkan kepada panas, dilembapkan 95 peratus O2/5 peratus CO2. Rakaman bermula selepas sekurang-kurangnya 2 jam pengeraman.

Potensi postsynaptic excitatory field (fEPSPs) direkodkan daripada stratum radiatum CA1b menggunakan pipet kaca tunggal (2–3MΩ) yang diisi dengan 2 M NaCl. Denyutan stimulasi (0.05 Hz) dihantar ke unjuran kolateral-komisar Schaffer menggunakan elektrod perangsang bipolar (wayar nichrome berpintal, 65 μm) yang diletakkan dalam CA1c. Keamatan semasa telah diselaraskan untuk mendapatkan 50 peratus tindak balas fEPSP maksimum. Selepas garis dasar yang stabil diwujudkan, LTP diinduksi dengan satu kereta api lima letusan theta, di mana setiap letusan (empat nadi pada 100 Hz) dihantar 200 ms antara satu sama lain (iaitu, pada frekuensi theta). Keamatan rangsangan tidak meningkat semasa TBS. Data dikumpul dan didigitalkan oleh NAC 2.0 Neurodata Acquisition System (Theta Burst).

Analisis statistik. Analisis statistik telah dijalankan seperti yang ditunjukkan dalam teks dan lagenda angka menggunakan Prisma 6 (GraphPad). Pendekatan analitik kami adalah berdasarkan karya yang diterbitkan sebelum ini12,20,63,64. Tiada kaedah statistik digunakan untuk pra-menentukan saiz sampel, tetapi saiz sampel kami adalah serupa dengan yang biasa digunakan dalam bidang, termasuk yang dilaporkan dalam penerbitan sebelumnya12,20,64,65. Taburan data diandaikan normal, dengan varians yang sama diperhatikan di kalangan kumpulan, tetapi ini tidak diuji secara rasmi. Apabila eksperimen mempunyai dua kumpulan untuk dibandingkan, ujian-t Pelajar dua ekor digunakan. Apabila dua faktor dibandingkan, (seperti umur dan genotip atau sesi dan kumpulan), data dianalisis dengan ANOVA dua hala diikuti oleh ujian post hoc perbandingan berbilang Sidak. Semua analisis adalah dua hujung, dengan nilai 0.05 diperlukan untuk kepentingan. Bar ralat dalam semua rajah mewakili SEM. Untuk semua eksperimen, nilai ± 2SD daripada min kumpulan dianggap terpencil dan dialih keluar daripada analisis.

Ketersediaan data. Data yang menyokong penemuan kajian ini boleh didapati daripada pengarang yang berkaitan atas permintaan yang munasabah. Data penjujukan RNA telah disimpan dalam Omnibus Ekspresi Gen NCBI dan boleh diakses melalui nombor penyertaan Siri GEO GSE94832.

Rujukan

1. Deibel, SH, Zelinski, EL, Keeley, RJ, Kovalchuk, O. & McDonald, RJ Perubahan epigenetik dalam nukleus supraciasmatic dan hippocampus menyumbang kepada penurunan kognitif yang berkaitan dengan usia. Oncotarget 6, 23181–23203 (2015).

2. Gerstner, JR & Yin, JC Circadian irama dan pembentukan ingatan. Nat. Rev. Neurosci. 11, 577–588 (2010).

3. Eckel-Mahan, KL et al. Ayunan sirkadian aktiviti MAPK hippocampal dan cAmp: implikasi untuk kegigihan ingatan. Nat. Neurosci. 11, 1074– 1082 (2008).

4. Chaudhury, D. & Colwell, CS Circadian modulasi pembelajaran dan ingatan dalam tikus bersyarat. perangai. Otak Re. 133, 95– 108 (2002).

5. Kondratova, AA & Kondratov, RV Jam sirkadian dan patologi otak penuaan. Nat. Rev. Neurosci. 13, 325–335 (2012).

6. Rawashdeh, O., Jilg, A., Maronde, E., Fahrenkrug, J. & Stehle, JH Period1 mengawal modulasi sirkadian isyarat berkaitan memori dalam hippocampus tetikus dengan mengawal selia ulang-alik nuklear kinase CREB pP90RSK. J. Neurochem. 138, 731–745 (2016).

7. Penner, MR, Roth, TL, Barnes, CA & Sweatt, JD Hipotesis epigenetik tentang disfungsi kognitif yang berkaitan dengan penuaan. Neurosci Penuaan Depan. 2, 9 (2010).

8. Peleg, S. et al. Asetilasi histon yang diubah dikaitkan dengan kemerosotan ingatan yang bergantung kepada usia pada tikus. Sains 328, 753–756 (2010).

9. Snigdha, S. et al. Perencatan H3K9me3 meningkatkan ingatan, menggalakkan pembentukan tulang belakang, dan meningkatkan tahap BDNF dalam hippocampus yang berumur. J. Neurosci. 36, 3611–3622 (2016).

10. Spiegel, AM, Sewal, AS & Rapp, PR Sumbangan epigenetik kepada penuaan kognitif: merungkai jangka hayat dan jangka hayat. Belajar Mem. 21, 569–574 (2014).

11. Malvaez, M. et al. HDAC3-inhibitor terpilih meningkatkan kepupusan tingkah laku mencari kokain secara berterusan. Proc. Natl Acad. Sci. USA 110, 2647–2652 (2013).

12. Kwapis, JL et al. Ketakutan konteks dan pendengaran dikawal secara berbeza oleh aktiviti HDAC3 dalam subnukleus sisi dan basal amygdala. Neuropsychopharmacology 42, 1284– 1294 (2017).

13. McQuown, SC et al. HDAC3 ialah pengawal selia negatif kritikal pembentukan ingatan jangka panjang. J. Neurosci. 31, 764–774 (2011).

14. Bieszczad, KM et al. Perencatan deacetylase histon melalui RGFP966 melepaskan brek pada keplastikan kortikal deria dan kekhususan pembentukan ingatan.J. Neurosci. 35, 13124– 13132 (2015).

15. Lahm, A. et al. Membongkar aktiviti pemangkin tersembunyi deasetilase histon kelas IIa vertebrata. Proc. Natl Acad. Sci. USA 104, 17335– 17340 (2007).

16. Sun, Z. et al. Fungsi bebas deacetylase HDAC3 dalam transkripsi dan metabolisme memerlukan penekan reseptor nuklear. Mol. Sel 52, 769–782(2013).

17. Alaghband, Y. et al. Peranan yang berbeza untuk domain deacetylase HDAC3 dalam hippocampus dan korteks prefrontal medial dalam pembentukan dan kepupusan ingatan. Neurobiol. Belajar. Mem. 145, 94– 104 (2017).

18. Nott, A. et al. Histone deacetylase 3 bersekutu dengan MeCP2 untuk mengawal FOXO dan tingkah laku sosial. Nat. Neurosci. 19, 1497– 1505 (2016).

19. Norwood, J., Franklin, JM, Sharma, D. & D'Mello, SR Histone deacetylase 3 adalah perlu untuk perkembangan otak yang betul. J. Biol. Kimia. 289, 34569–34582(2014).

20. Vogel-Ciernia, A. et al. Subunit pengawalseliaan kromatin khusus neuron BAF53b diperlukan untuk keplastikan sinaptik dan ingatan. Nat. Neurosci. 16, 552–561 (2013).

21. Alberini, CM Transkripsi faktor dalam ingatan jangka panjang dan keplastikan sinaptik. Fisiol. Wahyu 89, 121–145 (2009).

22. Barnes, CA Potentiasi jangka panjang dan otak penuaan. Philos. Trans. R. Soc. London. B 358, 765–772 (2003).

23. Speir, ML et al. Pangkalan data Pelayar Genom UCSC: kemas kini 2016. Asid Nukleik Res. 44, D717–D725 (2016).

24. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M. & Salzberg, SL Penjajaran ultrafast dan cekap ingatan bagi jujukan DNA pendek kepada genom manusia. Biol Genom. 10, R25 (2009).

25. Rowe, WB et al. Analisis ekspresi hippocampal mendedahkan persatuan terpilih laluan segera-awal, neuroenergetik, dan myelinogenik dengan gangguan kognitif pada tikus tua. J. Neurosci. 27, 3098–3110 (2007).

26. McNulty, SE et al. Peranan pembezaan untuk Nr4a1 dan Nr4a2 dalam lokasi objek berbanding ingatan jangka panjang pengecaman objek. Belajar Mem. 19, 588–592 (2012).

27. Vecsey, CG, Park, AJ, Khatib, N. & Abel, T. Kesan kekurangan tidur dan penuaan pada ingatan jangka panjang dan jauh pada tikus. Belajar Mem. 22, 197–202 (2015).

28. Rawashdeh, O. et al. PERIOD1 menyelaras irama hippocampal dan pemprosesan memori dengan waktu siang. Hippocampus 24, 712–723 (2014).

29. Jilg, A. et al. Dinamik temporal ekspresi gen jam hippocampal tetikus menyokong pemprosesan memori. Hippocampus 20, 377–388 (2010).

30. Eckel-Mahan, KL Sirkadian ayunan dalam hippocampus menyokong pembentukan memori dan kegigihan. Mol Depan. Neurosci. 5, 46 (2012).

31. Guzowski, JF, Setlow, B., Wagner, EK & McGaugh, JL Ekspresi gen yang bergantung kepada pengalaman dalam hippocampus tikus selepas pembelajaran spatial: perbandingan gen awal segera Arka, c-fos, dan zif268. J. Neurosci. 21, 5089–5098 (2001).

32. Kouzarides, T. Pengubahsuaian Chromatin dan fungsinya. Sel 128, 693–705(2007).

33. Konermann, S. et al. Pengaktifan transkrip skala genom oleh kompleks CRISPR-Cas9 yang direka bentuk. Alam 517, 583–588 (2015).

34. Sharma, M., Shetty, MS, Arumugam, TV & Sajikumar, S. Perencatan deacetylase 3 Histone mewujudkan semula penandaan sinaptik dan tangkapan dalam penuaan melalui pengaktifan faktor nuklear kappa B. Sci. Rep. 5, 16616 (2015).

35. Kramar, EA et al. Bukti sinaptik untuk keberkesanan pembelajaran jarak. Proc. Natl Acad. Sci. USA 109, 5121–5126 (2012).

36. Barrett, RM et al. Kalah mati fokus hippocampal CBP memberi kesan kepada pengubahsuaian histon tertentu, potensiasi jangka panjang, dan ingatan jangka panjang. Neuropsychopharmacology 36, 1545– 1556 (2011).

37. Franklin, AV, Rusche, JR & McMahon, LL Peningkatan potensiasi jangka panjang pada sinaps sel granula laluan-perforan medial-dentate yang disebabkan oleh perencatan terpilih histon deacetylase 3 memerlukan protein terencat akal X Fragile. Neurobiol. Belajar. Mem. 114, 193– 197 (2014).

38. Silva, AJ, Kogan, JH, Frankland, PW & Kida, S. CREB dan ingatan. Annu. Rev. Neurosci. 21, 127– 148 (1998).

39. Kida, S. & Serita, T. Peranan fungsional CREB sebagai pengawal selia positif dalam pembentukan dan peningkatan ingatan. Otak Re. lembu jantan. 105, 17–24 (2014).

40. Smith, KT, Nicholls, RD & Reines, D. Gen yang mengekodkan protein pengikat X RNA yang rapuh dikawal oleh faktor pernafasan nuklear 2 dan keluarga faktor transkripsi CREB. Asid Nukleik Res. 34, 1205– 1215 (2006).

41. Wang, H. et al. Peranan CREB dalam peraturan FMRP oleh reseptor glutamat metabotropik kumpulan I dalam korteks cingulate. Mol. Otak 5, 27 (2012).

42. Cermakian, N., Monaco, L., Pando, MP, Dierich, A. & Sassone-Corsi, P. Irama tingkah laku yang diubah dan ekspresi gen jam pada tikus dengan mutasi yang disasarkan dalam gen Period1. EMBO J. 20, 3967–3974 (2001).

43. Halder, R. et al. Perubahan metilasi DNA dalam gen keplastikan mengiringi pembentukan dan penyelenggaraan ingatan. Nat. Neurosci. 19, 102– 110 (2016).

44. Duke, CG, Kennedy, AJ, Gavin, CF, Day, JJ & Sweatt, JD Penyusunan semula epigenomik yang bergantung kepada pengalaman dalam hippocampus. Belajar Mem. 24, 278–288 (2017).

45. Sakai, T., Tamura, T., Kitamoto, T. & Kidokoro, Y. Gen jam, tempoh, memainkan peranan penting dalam pembentukan ingatan jangka panjang dalam Drosophila. Proc. Natl Acad. Sci. USA 101, 16058– 16063 (2004).

46. ​​Abarca, C., Albrecht, U. & Spanagel, R. Pemekaan dan ganjaran kokain adalah di bawah pengaruh gen dan irama sirkadian. Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 9026–9030 (2002).

47. Phan, TX, Chan, GC, Sindreu, CB, Eckel-Mahan, KL & Storm, DR Ayunan harian MAP (protein diaktifkan mitogen) kinase dan aktiviti adenilil siklase dalam hippocampus bergantung kepada nukleus supraciasmatik. J. Neurosci. 31, 10640– 10647 (2011).

48. Vogel-Ciernia, A. & Wood, MA Memeriksa lokasi objek dan ingatan pengecaman objek dalam tikus. Curr. Protoc. Neurosci. 69, 1– 17 (2014).

49. Orozco-Solis, R. et al. Jam sirkadian dalam hipotalamus ventromedial mengawal perbelanjaan tenaga kitaran. Metab Sel. 23, 467–478 (2016).

50. Eckel-Mahan, K. & Sassone-Corsi, P. Fenotaip irama sirkadian dalam tikus. Curr. Protoc. Biol tikus. 5, 271–281 (2015).

51. Schnell, SA, Staines, WA & Wessendorf, MW Pengurangan autofluoresensi seperti lipofusin dalam tisu berlabel pendarfluor. J. Histochem. Cytochem. 47, 719–730 (1999).

52. Pfaffl, MW Model matematik baharu untuk pengiraan relatif dalam RT-PCR masa nyata. Asid Nukleik Res. 29, e45 (2001).

53. Pfaffl, MW, Horgan, GW & Dempfle, L. Alat perisian ungkapan relatif (REST) ​​untuk perbandingan mengikut kumpulan dan analisis statistik ekspresi relatif menghasilkan PCR masa nyata. Asid Nukleik Res. 30, e36 (2002).

54. Trapnell, C. et al. Analisis ekspresi gen dan transkrip berbeza bagi eksperimen RNA-seq dengan TopHat dan Cufflinks. Nat. Protoc. 7, 562–578 (2012).

55. Mortazavi, A., Williams, BA, McCue, K., Schaeffer, L. & Wold, B. Memetakan dan mengukur transkriptom mamalia oleh RNA-Seq. Nat. Kaedah 5, 621–628 (2008).

56. Kayala, MA & Baldi, P. Pelayan web Cyber-T: analisis pembezaan data pemprosesan tinggi. Asid Nukleik Res. 40, W553–W559 (2012).

57. Baldi, P. & Long, AD Rangka kerja Bayesian untuk analisis data ekspresi microarray: ujian-t yang teratur dan inferens statistik perubahan gen. Bioinformatik 17, 509–519 (2001).