Bahagian 2: Kesan Acteoside Sebagai Pelindung Sel Untuk Menghasilkan Anjing Klon

Ji Hye Lee1☯, Ju Lan Chun1☯, Keun Jung Kim1 , Eun Young Kim1 , Dong-hee Kim1, Bo Myeong Lee1 , Kil Woo Han1 , Kang-Sun Park1 , Kyung-Bon Lee2 , Min Kyu Kim1*

Hubungi:joanna.jia@wecistanche.com

Sila klik di sini untuk bahagian 1

Sila klik di sini untuk Bahagian 3

acteoside in cistanche (4)

Acteosidedalamcistancheada banyakkesihatanfaedah

Analisis statistik

Data dianalisis menggunakan statistik IBM SPSS (SPSS Inc., Chicago, IL USA) dengan ANOVA sehala dan ujian perbezaan ketara secara jujur Tukey. Perbezaan dianggap signifikan secara statistik apabila nilai P kurang daripada 0.05.

Keputusan

Kesan acteoside pada penyegerakan kitaran sel

Kesan daripadaacteosidepada penyegerakan kitaran sel telah disiasat menggunakan pengisihan sel diaktifkan pendarfluor (FACS) (Jadual 1). Fibroblas janin anjing dirawat dengan pelbagai kepekatanacteoside(10, 30, 50 μM) untuk tempoh yang berbeza (24, 48, 72 jam), dan sel telah diasingkan kepada peringkat G0/G1, peringkat S dan peringkat G2/M mengikut FACS. Keputusan FACS dibandingkan dengan sel-sel yang disegerakkan oleh kebuluran serum dan perencatan sentuhan. Kebuluran serum menghasilkan kadar penyegerakan kitaran sel tertinggi (88.2 peratus ) pada peringkat G0/G1 berbanding dengan perencatan sentuhan (84.6 peratus ) danacteosiderawatan (80.8–84.5 peratus ).Acteosiderawatan untuk penyegerakan kitaran sel G0/G1 24 jam pada kecekapan terendah (80.8, 81.1 dan 82.0 peratus ).Acteosideadalah paling berkesan dalam mendorong penyegerakan kitaran sel G0/G1 pada kepekatan 30 μM dan tempoh rawatan selama 48 jam (84.5 peratus ). Walau bagaimanapun, tidak terdapat perbezaan yang ketara antara kepekatan dan tempohacteosiderawatan dalam induksi penyegerakan kitaran sel G1/G0. secara keseluruhan,acteosiderawatan tidak menunjukkan perbezaan yang ketara berbanding kebuluran serum dan perencatan sentuhan dari segi penyegerakan kitaran sel G{{{0}}/G1. Juga tidak terdapat perbezaan dalam penyegerakan kitaran sel pada peringkat S di kalangan ketiga-tiga kumpulan. Di samping itu, bahagian sel yang ditangkap pada peringkat G2/M adalah serupa dengan sel yang ditangkap pada peringkat G0/G1.

Jadual 1. Kesan perencatan sentuhan, kebuluran serum, danacteosiderawatan pada penyegerakan kitaran sel dalam fibroblas janin anjing.

Rajah 1. Tahap ROS dalam fibroblas janin anjing. Penyegerakan kitaran sel oleh (A) perencatan sentuhan, (B) kebuluran serum, dan (C) 30 μM rawatan acteoside selama 48 jam. Histogram menunjukkan tahap ROS yang dikesan dalam fibroblas janin anjing.

Kesan acteoside pada ROS dan apoptosis

Kesan daripadaacteosidepada ROS ditentukan oleh FACS menggunakan carboxy-H2DCFDA, penunjuk tekanan oksidatif yang diaktifkan dalam sel apabila esterase mengeluarkan kumpulan asetat antara sel (Rajah 1). ROS dikesan pada tahap yang lebih rendah dalam sel yang dirawat acteoside daripada sel yang disegerakkan oleh kebuluran serum atau perencatan sentuhan. Tahap ROS adalah jauh lebih rendah dalam kumpulan rawatan acteoside (42.8 peratus ) berbanding kumpulan perencatan sentuhan dan serum kelaparan (masing-masing 54.3 dan 99.5 peratus) (Jadual 2).

Untuk memahami kesan daripadaacteosidepada kelangsungan hidup dan kematian sel, apoptosis telah disiasat dalam sel selepas induksi penyegerakan kitaran sel. Kadar kemandirian sel yang dirawat acteoside (94.8 ± 1.2 peratus ) adalah jauh lebih tinggi daripada kedua-dua kumpulan perencatan sentuhan dan kebuluran serum (87.3 ± 0.5 peratus ) (Rajah 2D). Kadar apoptosis dalam kumpulan kebuluran serum

(52.1 ± 5.3 peratus ) adalah jauh lebih tinggi daripada kumpulan rawatan perencatan sentuhan dan acteoside (Rajah 2E). Apoptosis yang diperhatikan dalam kumpulan perencatan sentuhan ialah 10.6 peratus, yang juga jauh lebih tinggi daripada kumpulan rawatan acteoside (4.2 peratus) (Rajah 2E). Di samping itu, terdapat kurang nekrosis yang ditemui dalam sel yang dirawat acteoside berbanding dengan kumpulan perencatan sentuhan (Rajah 2F).

acteoside in cistanche

Cistanchedeserticola acteoside boleh meningkatkanimunitidan mengurangkanapoptosis

Kesan acteoside pada pembangunan in vitro embrio pemindahan nuklear anjing

Untuk menyiasat kesan acteoside dalam pembangunan embrio SCNT, sel penderma nuklear telah dipindahkan ke dalam oosit enukleasi anjing selepas penyegerakan kitaran sel olehacteoside. Seperti yang ditunjukkan dalam Jadual 3, tidak terdapat perbezaan yang ketara dalam perkembangan embrio awal daripada nuklear

Jadual 2. Kuantifikasi ROS

Rajah 2. Kadar kemandirian sel, apoptosis, dan nekrosis fibroblas janin anjing. Sel apoptosis dalam perencatan sentuhan (A), (B) kelaparan serum dan (C) 30 μMacteosiderawatan untuk kumpulan 48 jam ditentukan oleh FACS; Analisis kuantitatif keputusan FACS bagi (D) survival sel, (E) apoptosis, dan (F) nekrosis. Eksperimen ini diulang empat kali secara bebas. (H<>

sel penderma dengan kaedah penyegerakan kitaran sel yang berbeza sama ada perencatan sentuhan atau rawatan acteoside. Walau bagaimanapun, hanya embrio SCNT taring yang direkayasa menggunakan sel penderma nuklear yang disegerakkan pada peringkat G0/G1 dengan acteoside yang dibangunkan melangkaui 10-peringkat embrio sel.

Pengeluaran anjing klon menggunakan sel yang dikultur denganacteoside

Lima puluh tujuh embrio taring klon yang dihasilkan menggunakan sel penderma terhalang sentuhan telah dipindahkan secara pembedahan ke dalam oviduk 6 penerima. Tiada seorang pun daripada 6 penerima yang menghasilkan zuriat

Jadual 3. Perkembangan in vitro embrio pemindahan nuklear anjing.

Jadual 4. Pengeluaran anjing klon oleh SCNT.

atau pun hamil. Tiga puluh lapan embrio taring klon yang dihasilkan daripada sel penderma yang dirawat acteoside juga dipindahkan melalui pembedahan ke dalam oviduk 3 penerima. Kehamilan telah disahkan dalam salah satu daripada tiga ibu tumpang, yang akhirnya melahirkan, melalui pembedahan cesarean, kepada anak anjing yang sihat seberat 354 g (Jadual 4 dan Rajah 3). Untuk menentukan asal usul genom, penguatan mikrosatelit dilakukan dengan gen anjing klon. Mikrosatelit ialah jujukan berulang tandem pendek yang digunakan dalam skrin genom untuk mengesan keturunan dan analisis kaitan dalam keluarga. Tujuh penanda mikrosatelit digunakan untuk mengenal pasti asal usul genom dalam anjing klon (Jadual 5). Anjing yang diklon dan sel penderma yang digunakan untuk mengklon anjing itu mempunyai penanda mikrosatelit yang sama, manakala penderma oosit dan pengganti hanya berkongsi alel separa (Jadual 5). Dalam ujian keturunan ibu, anjing klon dan oosit penerima mempunyai urutan DNA mitokondria (mtDNA) yang sama, menunjukkan bahawa mtDNA anjing klon itu diperoleh daripada penderma oosit (Jadual 6).

acteoside in cistanche (2)

acteosidedalam cistanche

Perbincangan

Penyegerakan kitaran sel penderma adalah faktor penting untuk meningkatkan kecekapan SCNT [43]. Kadar perkembangan embrio SCNT dan kecekapan pengklonan pengeluaran haiwan