Xican Li 1,2,*,† ID , Yulu Xie 1,2,†, Ke Li 3,4, Aizhi Wu 1,2,*, Hong Xie 1,2, Qian Guo 1,5,

Penghui Xue 1, Yerkingul Maleshibek 1, Wei Zhao 6, Jiasong Guo 7 dan Dongfeng Chen 3,4

Hubungi:joanna.jia@wecistanche.com

1 Pusat Pengajian Perubatan Herba Cina, Universiti Perubatan Cina Guangzhou, Guangzhou 510006, China; xieyulu1900@163.com (YX); xiehongxh1@163.com (HX); 15622178307@163.com (QG); 15228738137@163.com (PX); pandiphd@163.com (YM)

2 Makmal Penyelidikan & Pembangunan Inovatif TCM, Universiti Perubatan Cina Guangzhou,

Guangzhou 510006, China

3 Pusat Pengajian Sains Perubatan Asas, Universiti Perubatan Cina Guangzhou, Guangzhou 510006, China; ys1090992678@163.com (KL); chen888@gzucm.edu.cn (DC)

4 Pusat Penyelidikan Perubatan Integratif Asas, Universiti Perubatan Cina Guangzhou,

Guangzhou 510006, China

5 Pusat Pengajian Sains Perubatan Asas, Universiti Farmaseutikal Guangdong, Guangzhou 510007, China

6 Sekolah Perubatan Zhongshan, Universiti Sun Yat-sen, No. 74 Zhongshan Road. 2, Guangzhou 510080, China; zhaowei23@mail.sysu.edu.cn

7 Jabatan Histologi dan Embriologi, Universiti Perubatan Selatan, Guangzhou 510515, China;

† Pengarang ini memberi sumbangan yang sama kepada karya ini.

Diterima: 24 Januari 2018; Diterima: 20 Februari 2018; Diterbitkan: 23 Februari 2018

Abstrak: Kajian ini cuba meneroka peranan sisa gula dan mekanisme fenolikfenilpropanoidantioksidan. Acteoside, bersama-sama dengan apioside forsythoside B dan rhamnoside

poliumoside, telah disiasat secara perbandingan menggunakan pelbagai ujian antioksidan. Dalam tiga ujian berasaskan pemindahan elektron (ET) (FRAP, CUPRAC, PTIO·-scavenging pada pH 4.5), paras antioksidan relatif secara kasarnya ditentukan sebagaiacteoside >forsythoside B > poliumoside. Perintah sedemikian juga diperhatikan dalam

H tambah -pemindahan PTIO·-pengujian pemusnahan pada pH 7.4, dan dalam tiga penyimpangan radikal yang melibatkan pelbagai laluan, iaitu, ABTS tambah ·-pembuangan, DPPH·-pembuangan dan ·O2.-pembuangan. Dalam spektrum UV-vis, setiap satu daripadanya menunjukkan anjakan merah pada 335 364 nm dan dua puncak lemah (480 dan 719 nm), apabila dicampur dengan Fe2 tambah; walau bagaimanapun,acteosidememberikan penyerapan yang paling lemah.

Dalam analisis kromatografi cecair berprestasi ultra ditambah dengan pengionan elektrospray quadrupole time-of-flight spektrometri jisim tandem (UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS), tiada puncak pembentukan tambah radikal (RAF) ditemui. Ujian MTT mendedahkan bahawa poliumoside mempamerkan daya maju tertinggi sel stem mesenchymal yang berasal dari sumsum tulang bertekanan oksidatif. Kesimpulannya,acteoside, forsythoside B, dan poliumoside mungkin terlibat dalam pelbagai laluan untuk melaksanakan tindakan antioksidan, termasuk ET, H plus -transfer, atau Fe2 plus -chelating, tetapi bukan RAF. Pemindahan ET dan H plus mungkin dihalang oleh bahagian rhamnosyl dan apiosyl; walau bagaimanapun, potensi Fe2 tambah -kelat boleh dipertingkatkan dengan dua sisa gula (terutamanya bahagian rhamnosyl). Kesan umum bahagian rhamnosyl dan apiosyl adalah untuk meningkatkan kesan antioksidan atau sitoprotektif.

Kata kunci:acteoside; apiosyl; forsythoside B;fenilpropanoidglikosida; poliumoside; rhamnosyl

cistanche mempunyai kesan anti-pengoksidaan

1. Pengenalan

Baru-baru ini, acteoside (verbascoside, Rajah 1), sejenis fenolikfenilpropanoidglikosidayang berlaku di vervain dan tumbuhan lain [1], didapati meningkatkan kecekapan pemindahan nuklear sel somatik anjing (SCNT) semasa proses pengklonan anjing [2]. Di samping itu, acteoside boleh melindungi sel neuroblastoma manusia SH-SY5Y terhadap kerosakan akibat -amyloid [3] dan fibroblas kulit manusia terhadap kerosakan akibat sinar-X [4]. Apioside forsythoside B (Rajah 1) juga diedarkan dalam tumbuhan [5], dan telah diperhatikan untuk memberikan kesan neuroprotektif yang kuat dengan tetingkap masa terapeutik yang menggalakkan [6]. Kesan berfaedah ini pada sel dan tisu dianggap dikaitkan dengan perlindungan beberapa biomolekul, seperti lipid dan DNA. Malah, acteoside dan analog cistanoside F telah ditunjukkan untuk menghalang peroksidasi lipid mitokondria dalam tikus [7]. Pengoksidaan lipid diketahui sebagai hasil daripada tekanan oksidatif selular dan akhirnya daripada spesies oksigen reaktif (ROS).

Rajah 1. Struktur (kiri) dan model bola dan kayu berasaskan penyesuaian keutamaan (kanan) bagi tiga model semula jadifenilpropanoidglikosida(acteoside, forsythoside B, dan poliumoside).

Dari aspek perlindungan DNA, acteoside dan derivatifnya boleh membaiki radikal DNA dengan cepat, seperti 2'-deoxyadenosine-5'-monophosphate (dAMP) dan 2'-deoxyguanosine-5'-monophosphate (dGMP) [ 8]. Radikal deoxynucleotide sekunder ini boleh merosakkan sel secara oksidatif yang membawa kepada mutagenesis dan karsinogenesis [9]. Kajian biofizikal menunjukkan bahawa acteoside dan derivatifnya boleh berlabuh ke dalam alur kecil DNA dan dengan cepat membaiki kerosakan DNA oksidatif tersebut [10]. Model bola-stick berasaskan konformasi keutamaan mencadangkan (Rajah 1, kanan) bahawa molekul-molekul ini adalah prolat dan boleh mencapai gelung DNA dengan mudah, dan dengan itu, mereka dapat dengan cepat membaiki kerosakan radikal DNA [8].

Walau bagaimanapun, dari sudut pandangan biokimia, pembaikan pada dasarnya dipenuhi melalui laluan ROS-scavenging (iaitu, antioksidan). Seperti yang dinyatakan sebelum ini, penjanaan kation radikal deoxynucleotide adalah akhirnya daripada serangan ROS, termasuk radikal bebas (cth, ·OH radikal [11]) dan molekul oksidan (cth, H2O2 [12]). ROS-scavenging dianggap berkesan menurunkan status oksidatif selular [13,14] dan meningkatkan kualiti sel stem [12,15]. Oleh itu, adalah perlu untuk mengkaji keupayaan antioksidan mereka dan membincangkan mekanisme yang mungkin.

Dalam kajian ini, tiga fenolikfenilpropanoidglikosida(acteoside, forsythoside B, dan poliumoside) telah disiasat secara perbandingan menggunakan pelbagai ujian antioksidan, termasuk 2-fenil-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl{{6 }}ujian penghapusan radikal oksida (PTIO·), ujian kuasa antioksida pengurang ion ferik (FRAP), ujian kapasiti antioksidan pengurangan kupri (CUPRAC), 2,2→-azino-bis(3-ethylbenzene-thiazoline{{13 }}ujian penghapusan radikal asid sulfonik (ABTS tambah ·),

1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazine (DPPH·) assay, dan ·O2.-scavenging assay serta analisis spektra UV Fe2 plus -chelating. Selepas itu, produk tindak balas mereka dengan DPPH· ditentukan menggunakan kromatografi cecair berprestasi ultra ditambah dengan analisis spektrometri jisim tandem (UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS) pengionan elektrospray empat kali ganda masa penerbangan. Akhirnya, kesan sitoprotektif mereka terhadap sel stem mesenchymal (bmMSCs) yang berasal dari sumsum tulang telah dianggarkan menggunakan

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-ujian difenil (MTT). Seperti yang dilihat dalam Rajah 1, perbezaan antara tiga fenolikfenilpropanoidglikosida(iaitu, acteoside, forsythoside B, dan poliumoside) ialah jenis glikosida: forsythoside B ialah apioside acteoside, manakala poliumoside ialah rhamnoside acteoside. Oleh itu, kajian perbandingan ini juga membantu dalam memahami peranan apiosyl dan rhamnosyl dalamantioksidankesan.

kesan pemutihan cistanche pada kulit kepada anti-pengoksidaan

2. Keputusan

2.1. Ujian Pengurangan Logam (FRAP & CUPRAC)

Dalam kajian itu, kami menjalankan dua ujian pengurangan logam, iaitu, ujian FRAP dan ujian CUPRAC. Seperti yang digambarkan dalam Suppl. 1, acteoside dan derivatifnya meningkatkan peratusan relatif FRAP (atau Cu2 tambah -kuasa pengurangan) pada 0–10 g/L dalam cara yang bergantung kepada dos. Susunan paras pengurangan logam relatif mereka berkurangan secara kasar dalam susunan acteoside > forsythoside B > poliumoside (Jadual 1).

Jadual 1. Nilai IC50 acteoside, forsythoside B, dan poliumoside dalam pelbagaiantioksidanujian.

2.2. PTIO·-Scavenging Assay

Ujian PTIO·-scavenging baru-baru ini dibangunkan oleh makmal kami [16]. Ia boleh digunakan untuk menilai tahap antioksidan dan untuk meneroka laluan antioksidan. Seperti yang ditunjukkan dalam Suppl. 1, acteoside dan derivatifnya boleh berjaya menghilangkan PTIO· pada pH 4.5 dan pH 7.4. Walau bagaimanapun, menurut nilai IC50 dalam Jadual 1, tahap PTIO·-scavenging relatif mereka pada nilai pH yang sama adalah berbeza antara satu sama lain. Selain itu, setiap acteoside dan derivatifnya mempamerkan tahap PTIO·-scavenging yang berbeza antara pH 4.5 dan pH 7.4. Secara amnya, tahap PTIO·-scavenging pada 7.4 adalah lebih tinggi daripada tahap pH 4.5.

2.3. ABTS plus ·-Scavenging dan DPPH·-Scavenging Assays

ABTS plus ·-scavenging dan DPPH·-scavenging kini digunakan secara meluas untuk kajian antioksidan bagi sebatian atau ekstrak tulen. Seperti yang dilihat dalam Suppl. 1, acteoside dan derivatifnya bergantung kepada kepekatan meningkatkan ABTS campur ·-pembalasan atau DPPH·-peratus peratusan.

Walau bagaimanapun, dari segi nilai IC50 dalam Jadual 1, paras ABTS tambah ·-scavenging relatifnya didapati dalam susunan acteoside > forsythoside B > poliumoside > Trolox. Perintah yang sama juga boleh diperhatikan dalam ujian DPPH·-scavenging.

2.4. UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS Analisis DPPH· Produk Reaksi

Hasil tindak balas DPPH· dengan setiap tigafenilpropanoidglikosidatelah diterokai menggunakan analisis UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS. Dalam analisis (Suppl. 2), tiada satu pun daripada tiga glikosida fenilpropanoid menghasilkan puncak produk RAF. Sebagai perbandingan, asid kafeik didapati menghasilkan produk dimer (m/z 359–360, Suppl. 2).

2.5. Analisis UV-Vis-Spectra bagi Produk Fe2 plus -Chelating

Oleh kerana spektrum UV-vis boleh mencirikan kompleks logam, kajian itu menggunakan spektra UV-vis untuk menganalisis kemungkinan tindak balas Fe2 tambah -chelating dengan tigafenilpropanoid glikosida. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2, setiap daripadanya boleh menghasilkan anjakan bathochromic (335 nm●364 nm) dalam spektrum UV. Sementara itu, setiap daripada mereka boleh memberikan dua puncak vis-spektra yang lemah dalam spektrum yang boleh dilihat (480 nm dan 719 nm) dan membawa kepada penampilan hijau muda. Walau bagaimanapun, keamatan puncak adalah dalam urutan menurun poliumoside > forsythoside B > acteoside.

2.6. Pyrogallol Autooxidation Assay untuk Superoxide Anion (·O2.) Scavenging

Ujian autooksidasi pyrogallol telah diperbaiki oleh makmal kami pada tahun 2012 [17]. Ia telah digunakan untuk menganggar potensi ·O2.-pembuangan dalam kajian ini. Seperti yang dilihat dalam Suppl. 1, semua acteoside dan derivatifnya boleh bergantung kepada dos meningkatkan peratusan penyusutan O2. Walau bagaimanapun, bioaktiviti relatif menurun dalam susunan poliumoside > forsythoside B > acteoside, mengikut nilai IC50 dalam Jadual 1.

2.7. Kesan Sitoprotektif terhadap bmMSC Bertekanan Oksidatif (Ujian MTT)

Untuk menilai kesan sitoprotektif acteoside dan derivatifnya, kami melakukan ujian MTT. Dalam ujian, bmMSC telah rosak oleh reagen oksidatif H2O2, bmMSC yang rosak kemudiannya dirawat oleh acteoside dan derivatifnya. Nilai A490nm digunakan untuk menilai kesan sitoprotektif relatif. Seperti yang dilihat dalam Jadual 2, setiap acteoside dan derivatifnya bergantung kepada dos meningkatkan nilai A490nm. Walau bagaimanapun, pada kepekatan yang sama, poliumoside memberikan nilai A490nm tertinggi.

3. Perbincangan

Tindakan antioksidan sebatian fenolik semulajadi diketahui terlibat dalam pemindahan elektron (ET) [18,19]. Oleh itu, beberapa ujian pengurangan logam berasaskan ET telah digunakan secara meluas untuk menilai tahap antioksidan fenolik, seperti ujian FRAP dan CUPRAC. Garis panduan ujian FRAP hendaklah dipenuhi dengan pH kurang daripada 3.6. Persekitaran berasid sedemikian telah berjaya menekan pengionan H tambah daripada fenolik; oleh itu, ujian FRAP dianggap sebagai proses ET semata-mata [20,21]. Keberkesanan acteoside dan derivatifnya dalam ujian FRAP membayangkan bahawa, apabila acteoside dan derivatifnya bertindak sebagaiantioksidan, mereka mungkin menggunakan laluan ET untuk melaksanakan tindakan antioksidan mereka.

Selain itu, kami juga melakukan ujian CUPRAC dalam penimbal pH 7.4. Seperti yang dilihat dalam Suppl. 1, acteoside dan derivatifnya bergantung kepada dos meningkatkan peratusan kuasa pengurangan Cu2 tambah mereka, menunjukkan bahawa mereka boleh kekal berpotensi ET pada pH fisiologi. Walau bagaimanapun, potensi ET mereka menurun dalam susunan berikut: acteoside > forsythoside B > poliumoside (Jadual 1). Dinamik ini jelas menunjukkan bahawa bahagian apiosyl dalam forsythoside B dan bahagian rhamnosyl dalam poliumoside menurunkan potensi ET.

cistancheadalah perencat tyrosinase

Untuk menguji kemungkinan bahawa ET berlaku semasa proses penghapusan radikal mereka, PTIO radikal bebas berpusat oksigen telah diperkenalkan dalam kajian. Bukti voltammetri kitaran mendedahkan bahawa PTIO·-scavenging di bawah pH 5.0 ialah tindak balas elektron-redoks tunggal [22]. Pemerhatian bahawa acteoside dan derivatifnya boleh menghilangkan radikal PTIO· secara cekap pada pH 4.5, mencadangkan kemungkinan ET semasa proses penghapusan radikal mereka. Jelas sekali, penemuan ini menyokong lagi keputusan yang dinyatakan di atas daripada ujian FRAP dan CUPRAC, dan keputusan sebelumnya bahawa elektron penderma (e) adalah ciri fenolik.antioksidan[23]. Walau bagaimanapun, pada pH fisiologi 7.4, esei PTIO -scavenging bukan sekadar laluan ET tetapi juga termasuk laluan pemindahan proton- (H tambah). Semasa proses, PTIO telah dicadangkan untuk menerima H tambah daripada fenolik untuk menghasilkan puncak produk ([PTIO-H] tambah ) [16]. Oleh kerana H tambah -pemindahan sentiasa disertai dengan ET dalam mekanisme langkah demi langkah atau segerak [24], produk realistik (atau akhir) ialah molekul [PTIO-H] [22]. PTIO·-scavenging pada pH 7.4 (Bekalan 1) membayangkan bahawa acteoside dan derivatifnya mempunyai potensi pemindahan H tambah juga. Nilai IC50 (Jadual 1) menunjukkan bahawa

potensi pemindahan H tambah -berada dalam susunan menurun acteoside > forsythoside B > poliumoside. Jelas sekali, bahagian apiosyl dan rhamnosyl juga melemahkan potensi pemindahan H tambah semasa proses antioksidan.

Seperti yang telah dibincangkan sebelum ini, semasa proses antioksidan fenolik, ET biasanya disertai dengan pemindahan proton (H tambah) untuk membentuk beberapa mekanisme antioksidan [24], seperti pemindahan hidrogen-atom (HAT) [23,25-27], elektron berjujukan. -pemindahan proton (SEPT) [26,27], pemindahan elektron tunggal kehilangan proton berurutan (SPLET) [26], dan pemindahan elektron berganding proton (PCET) [24–26,28].

Sebagai contoh, ABTS plus ·-scavenging, tindak balas yang didominasi oleh pemindahan elektron tunggal (SET) [29], juga telah terbukti dipengaruhi oleh tahap H tambah baru-baru ini [30]. Oleh itu, ABTS plus ·-scavenging adalah ujian antioksidan berasaskan pelbagai laluan [21,31]. Fakta bahawa acteoside dan derivatifnya boleh menghilangkan radikal ABTS plus · menunjukkan bahawa tindakan antioksidannya juga boleh dimediasi melalui pelbagai laluan. Hipotesis ini selanjutnya disahkan oleh bukti daripada ujian DPPH·-scavenging, tindak balas yang terdiri daripada laluan berbilang HAT, ET, SEPT, dan PCET [26,32]. Walau bagaimanapun, analisis kuantitatif berdasarkan nilai IC50 (Jadual 1) mendedahkan bahawa dalam aspek ABTS tambah ·-pengapuran dan DPPH·-pengapuran berasaskan pelbagai laluan, acteoside adalah lebih baik daripada apioside forsythoside B dan rhamnoside poliumoside. Oleh itu, boleh disimpulkan bahawa bahagian apiosyl dan rhamnosyl akhirnya menghalang potensi pelbagai laluan (terutamanya ET dan H tambah -pemindahan) semasa proses penghapusan radikal bebas. Seperti yang dinyatakan oleh pengarang dan lain-lain [14,26], semasa proses antioksidan, tindak balas RAF juga mungkin berlaku. Untuk mengesahkan kemungkinan RAF, bagaimanapun, tigafenilpropanoidglikosidabersama-sama asid kafeik dikaji menggunakan analisis UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS. Asid kafeik didapati menghasilkan produk dimer, manakala tigafenilpropanoidglikosidatidak menghasilkan kemuncak produk RAF.

Penemuan ini jelas menunjukkan bahawa tigafenilpropanoidglikosidatidak boleh melalui laluan RAF untuk menggunakan tindakan antioksidan mereka. Oleh kerana tiga glikosida fenilpropanoid boleh dianggap sebagai ester asid kafeik (Rajah 1), perbezaan antara asid kafeik dan ester asid kafeik juga menunjukkan bahawa bahagian yang besar boleh menghalang penjanaan RAF.

Diambil bersama, dari aspek penghapusan radikal bebas, acteoside dan derivatifnya mungkin melalui pelbagai laluan untuk menggunakan tindakan antioksidannya. Laluan antioksidan ini sekurang-kurangnya terlibat dalam ET dan H plus -transfer (tetapi bukan RAF). Penemuan kami sebahagiannya disokong oleh kajian teori bahawa acteoside boleh menggunakan tindakan antioksidan melalui laluan SPLET. Dalam proses itu, acteoside mungkin mula-mula menyahprotonasi (H tambah -pemindahan) untuk menghasilkan anion. Penyahprotonan dianggap berlaku dalam bahagian katekol dengan keasidan yang lemah. Selepas itu, anion menderma elektron untuk menimbulkan bentuk radikal fenoksi [33]. Radikal fenoksi dengan konjugasi pu bagaimanapun stabil sedikit sebanyak. Sudah tentu, dalam hal ini, kerja eksperimen selanjutnya diperlukan pada masa akan datang.

Perlu dinyatakan bahawa tekanan oksidatif selular juga boleh berpunca daripada logam peralihan (terutamanya Fe2 plus ). Ion Fe2 tambah, bagaimanapun, boleh mengubah molekul H2O2 menjadi radikal · OH yang paling berbahaya melalui tindak balas Fenton (Fe2 tambah tambah H2O2 ● Fe3 tambah tambah ·OH tambah OH.). Oleh itu, pengecilan paras Fe2 plus dengan berkesan boleh menghalang radikal ·OH untuk membebaskan tekanan oksidatif selular. Malah, pengkelat besi oleh fenolik semula jadiantioksidankini telah dibangunkan menjadi terapi yang berkesan untuk beberapa penyakit tekanan oksidatif [34,35].

Dalam kajian ini, acteoside dan derivatifnya telah dicadangkan sebagai Fe2 plus -chelators yang berkesan dengan perubahan dalam spektroskopi dan warna larutan (Rajah 2). Namun begitu, acteoside adalah lebih rendah daripada dua glukosida dalam mengelat Fe2 plus dan forsythoside B dengan bahagian apiosyl adalah lebih rendah daripada poliumoside dengan bahagian rhamnosyl. Berdasarkan perbandingan konformasi keutamaan mereka (Rajah 1, kanan), adalah dicadangkan bahawa bahagian apiosyl (atau rhamnosyl) boleh membantu ligan utama (fenilpropanoidkumpulan) dalam mengelat Fe2 plus . Kesan sinergistik sedemikian sudah pasti menguatkan keupayaan Fe2 plus -chelating dan membesarkan puncak UV-vis. Walau bagaimanapun, rhamnosyl lebih berkesan daripada apiosyl dalam keupayaan Fe2 plus -chelating. Perbezaan ini boleh dikaitkan dengan fakta bahawa rhamnosyl berlaku dalam bentuk heksosiklik (iaitu,/-L-rhamnopyranosyl), manakala apiosyl berada dalam bentuk pentacyclic (iaitu, -D-apiofuransyl). Bentuk heksosiklik diketahui lebih besar dan lebih stabil. Oleh itu, rhamnosyl hexocyclic adalah lebih berkesan berbanding apiosyl pentacyclic dalam keupayaan Fe2 plus -chelatingnya.

Untuk menguji sama ada acteoside dan derivatifnya boleh menghilangkan ROS, kami menjalankan ujian autooksidasi pyrogallol. Seperti yang dilihat dalam Suppl. 1, semua boleh mengais ·O2 dengan cekap. radikal, ROS tipikal yang berlaku dalam sel. Walau bagaimanapun, bioaktiviti relatif menurun dalam urutan poliumoside > forsythoside B > acteoside. Perintah ini juga selari dengan kesan sitoprotektif (Jadual 2). Penemuan ini menunjukkan bahawa kesan am bahagian rhamnosyl atau apiosyl adalah untuk meningkatkan kesan ROS-scavenging atau cytoprotektif.

cistanchemempunyaifungsidaripadapemutihankulit

4. Bahan dan Kaedah

4.1. Bahan Kimia dan Haiwan

Acteoside (nombor CAS: 61276-17-3, 97 peratus ), forsythoside B (nombor CAS: 81525-13-5, 97 peratus ) diperoleh daripada BioBioPha (Kunming, China, Suppl. 3). Poliumoside (nombor CAS: 94079-81-9, 97 peratus ) telah diasingkan oleh pasukan kami daripada herba tradisional Cina Callicarpa pei HT Chang (Bekalan 3). DPPH·, (o)-6-hidroksil-2,5,7,8-tetramethlychromane-2-asid karboksilik (Trolox), 2,9-dimetil{{ 16}},10-phenanthroline (neocuproine), 2,4,6-tripyridyltriazine (TPTZ) dan pyrogallol telah dibeli daripada Sigma-Aldrich Shanghai Trading Co. (Shanghai, China). (NH4)2ABTS [2,2→-azinobis (3-ethylbenzene-thiazoline-6-asid sulfonik garam diammonium)] diperoleh daripada Amresco Chemical Co. (Solon, OH, USA). PTIO· radical telah dibeli daripada TCI Development Co., Ltd. (Shanghai, China). Asid kafeik telah dibeli daripada Institut Kebangsaan untuk Kawalan Produk Farmaseutikal dan Biologi (Beijing, China). Medium Eagle yang diubah suai Dulbecco (DMEM), serum lembu janin (FBS), dan trypsin telah dibeli dari Gibco (Grand Island, NY, Amerika Syarikat). Kit ujian Annexin V/propidium iodide (PI) telah dibeli daripada Invitrogen (Carlsbad, CA, Amerika Syarikat). Semua reagen lain adalah gred analitik.

Tikus Sprague-Dawley (SD) berumur 4 minggu diperolehi dari Pusat Haiwan Universiti Perubatan Cina Guangzhou. Protokol eksperimen ini dilakukan di bawah pengawasan Jawatankuasa Etika Haiwan Institusi di Universiti Cina Guangzhou (Nombor kelulusan 20170306A).

4.2. Ujian Pengurangan Logam (FRAP & CUPRAC)

Ujian pengurangan logam termasuk ujian kuasa pengurangan Fe3 tambah dan ujian kuasa pengurangan Cu2 tambah. Ujian pengurangan Fe3 plus telah ditubuhkan oleh Benzie dan Strain dan secara rasmi dinamakan FRAP [20]. Protokol eksperimen ujian ini telah diterangkan dalam laporan sebelumnya [9]. Secara ringkas, reagen FRAP telah disediakan baru dengan mencampurkan 10 mM TPTZ, 20 mM FeCl3, dan penimbal 0.25 M asetat pada nisbah 1:1:10 pada pH 3.6. Sampel ujian (x=4-20 L, 0.05 mg/mL) telah ditambah kepada (20. x) L 95 peratus etanol diikuti oleh 80 L reagen FRAP. Selepas pengeraman 30-min pada suhu ambien, penyerapan diukur pada 595 nm menggunakan pembaca plat mikro (Multiskan FC, Thermo Scientific, Shanghai, China). Kuasa pengurangan relatif sampel dikira menggunakan formula berikut:

di mana Amax ialah penyerapan maksimum campuran tindak balas dengan sampel, dan Amin ialah penyerapan minimum dalam ujian. A ialah penyerapan sampel.

Kuasa pengurangan Cu2 tambah juga boleh mencirikan tahap antioksidan dan oleh itu dipanggil CUPRAC. Ujian ini dijalankan mengikut kaedah yang diterbitkan sebelum ini [36]. Secara ringkas, 12 L larutan berair CuSO4 (10 mmol/L), 12 L larutan etanol neocuproine (7.5 mmol/L) dan (75 . x) L larutan penimbal CH3COONH4 (0. 1 mol/L, pH 7.5) telah ditambah ke dalam telaga dengan volum sampel yang berbeza (0.05 mg/mL, 4–20 L). Penyerapan pada 450 nm selepas 30 minit diukur menggunakan pembaca plat mikro yang disebutkan di atas. Kuasa CUPRAC relatif dikira menggunakan formula untuk FRAP. Amax ialah penyerapan maksimum campuran tindak balas dengan sample, dan Amin ialah penyerapan minimum dalam ujian. A ialah penyerapan sampel.

cistanchemempunyai kesan pemutihan kulit

Sila klik di sini untuk Bahagian 2