Hubungi:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Sila klik di sini untuk Bahagian 1

Sila klik di sini untuk Bahagian 3

Cistanche boleh meningkatkan daya ingatan

Memandangkan penemuan ini, kami seterusnya memeriksa sama ada ekspresi miR-466f-3p hippocampal terkawal dalam tikus semasa pembelajaran spatial daningatanpembentukan juga mempengaruhi morfologi neuron dalam vivo. Secara ketara, kami mendapati bahawa ketumpatan tulang belakang purata neuron hippocampal tikus GLN adalah lebih tinggi daripada tikus PLN, seperti yang didedahkan oleh impregnasi Golgi daripada piramid.

Rajah 3. Kesan pengubahan tahap ekspresi miR-466f-3p hippocampal pada prestasi MWM tetikus

(A) Garis masa eksperimen tugas MWM, analisis ekspresi, atau pengukuran elektrofisiologi otak tetikus selepas suntikan lentivirus.

(B) Panel kiri: ungkapan dsRed dalam hippocampus tetikus. Perwakilan pembesaran rendah dan tinggi JIKA imej hippocampus daripada tikus yang dijangkiti lentivirus rekombinan yang menyatakan dsRed-sahaja sebagai kawalan (lajur kiri imej) atau miR-466f-3p tambah dsRed (kanan lajur imej). Kawasan berkotak dua imej teratas dibesarkan dan ditunjukkan di bawah. Bar skala, 100 mm. Garis putus-putus menunjukkan sempadan DG. Nukleus telah dicemari dengan DAPI. GCL, lapisan sel granul; ML, lapisan molekul. Histogram kanan, tahap ekspresi relatif miR-466f-3p dalam hippocampus tetikus yang dijangkiti dengan kawalan ekspresi lentivirus atau miR-466f-3p, seperti yang diuji oleh RT-qPCR ( n=16 setiap kumpulan).

(C) Prestasi MWM tikus yang dijangkiti lentivirus rekombinan berbeza, dibungkus dengan penggunaan lima plasmid berbeza yang menyatakan dsRed sahaja, miR-466f-3p, mut-miR-466f{ {5}}p, dan miR/SCR-span, masing-masing, ke dalam hippocampus mereka (n=13, 26, 16, 19 dan 11 setiap kumpulan, masing-masing). Panel kiri: kependaman melarikan diri semasa latihan. Panel kanan: kependaman melarikan diri individu pada sesi ke-6.

Data yang ditunjukkan dalam (B) dibentangkan sebagai min ± SD, dan data yang ditunjukkan dalam (C) dibentangkan sebagai min ± SEM. Kepentingan statistik dinilai dengan ujian t tidak berpasangan (B), ANOVA dua hala dengan perbandingan post hoc Bonferroni (C, panel kiri), atau ANOVA satu dengan ujian post hoc Tukey (C, panel kanan). Perbezaan statistik: #p < 0.05,="" **/##p="">< 0.01="" dan="" ****p="">< 0.0001;="" *mir-466f-3p="" berbanding="" yang="" lain;="" #mir-span="" berbanding="">

neuron dalam hippocampus tetikus GLN dan PLN (Rajah S3). Penemuan ini menunjukkan bahawa regulasi hippocampal miR-466f-3p menggalakkan pertumbuhan neurit dan pembentukan tulang belakang dendritik, yang serupa dengan induksi ketumpatan tulang belakang yang diperhatikan dalam hippocampus tikus GLN berbanding tikus PLN.

miR-466f-3p memodulasi pembelajaran spatial tetikus daningatanprestasi, serta keplastikan sinaptik

Untuk menyiasat sama ada miR-466f-3p secara positif mengawal pembelajaran spatial tetikus daningatanpembentukan, kami menggunakan pendekatan jangkitan lentivirus rekombinan untuk mengekspresikan miRNA dalam hippocampus tetikus. Tikus dianalisis 7 hari selepas suntikan lentivirus ke DG (Rajah 3A). Imej perwakilan tahap ekspresi pinggul miR-466f-3p sememangnya dinaikkan dalam kumpulan ekspresi berlebihan miR-466f-3p berbanding kumpulan kawalan (histogram kanan dalam Rajah 3B). Kami mendapati bahawa tikus dengan ekspresi berlebihan hippocampal miR-466f- 3p dan tertakluk kepada tugas MWM mempamerkan latensi melarikan diri 88 ± 5 saat dalam sesi pertama dan 19 ± 1 saat dalam sesi ke-6 (merah garis titik, Rajah 3C), yang lebih baik daripada tikus kawalan vektor (garis hitam) atau tikus kawalan mutan (garis bulatan merah) dan serupa dengan latensi melarikan diri tikus GLN yang diterangkan dalam Rajah 1A. Secara selari, kami meneliti kesan kehilangan fungsi miR-466f-3p pada pembelajaran spatial daningatandengan menghalang miR-466f-3p menggunakan miR-span. Terutama, prestasi MWM tikus di mana hippocampal miR-466f-3p terperangkap oleh miR-span adalah serupa dengan tikus PLN, iaitu, mereka tidak belajar mencari platform walaupun dengan sesi terakhir (garisan persegi hijau pejal,

Rajah 3C). Tambahan pula, tikus yang disuntik dengan lentivirus nampaknya tidak mengganggu keplastikan homeostatik, kerana beberapa tikus dalam setiap kumpulan telah belajar atau sekurang-kurangnya sedang dalam proses pembelajaran semasa sesi lepas (Rajah 3C, histogram kanan).

Memandangkan ekspresi berlebihan miR-466f-3p dalam hippocampus tetikus meningkatkan pembelajaran mereka daningatankeupayaan, kami menganalisis elektrofisiologi perbandingan neuron hippocampal berbudaya yang menyatakan tahap miR-466f-3 yang berbeza. Arus postsynaptic excitatory miniature (mEPSC) daripada neuron hippocampal DIV14 yang mengekspresikan miR-466f-3p atau mut-miR-466f-3p, miR-sponge atau kawalan secara berlebihan ialah direkodkan menggunakan pengapit tampalan seluruh sel. Walaupun tiada perbezaan yang ketara dalam amplitud mEPSC, kenaikan Tau, atau pereputan Tau antara empat set sampel, frekuensi mEPSC neuron yang terlalu mengekspresikan miR-466f-3p adalah jauh lebih tinggi berbanding dengan kumpulan lain (Rajah 4A), menunjukkan bahawa reseptor glutaminergik pascasinaptik telah diaktifkan dengan lebih kuat apabila miR-466f- 3p berlebihan.

Kami kemudian mengukur potensiasi jangka panjang (LTP) untuk menentukan secara langsung peranan miR-466f-3p dalam keplastikan sinaptik dalam vivo. Kami menyuntik tikus hippocampus dengan virus rekombinan seperti yang diterangkan dalam Rajah3dan kemudian terdorong LTPinhippocampalslices oleh rangsangan tetan (tiga tren rangsangan frekuensi tinggi [3xHFS]) dari laluan cagaran Schaffer. Kami mendapati bahawa protokol kami mendorong LTP dalam semua kumpulan, seperti yang dibuktikan oleh peningkatan berterusan dalam potensi postsynaptic excitatory medan (fEPSPs) di rantau cornu ammonis 1 (CA1) (Rajah 4B, panel kiri). LTP lebih kuat dalam hirisan miR-466f-3p-overexpressing (188 peratus ± 2 peratus garis dasar pada 40–50 min selepas rangsangan, min ± SEM) berbanding mutan (169 peratus ± 1 peratus garis dasar), span SCR (173 peratus ± 3 peratus garis dasar) dan kepingan yang dijangkiti virus kawalan (159 peratus ± 2 peratus garis dasar), sebagai perencatan miR-466f-3p oleh miR-sponge mengurangkan LTP (128 peratus ± 1 peratus garis dasar) berbanding kawalan (Rajah 4B, panel kanan). Kami juga mengukur LTP kumpulan GLN dan PLN selepas latihan. Data masing-masing juga mendedahkan perbezaan yang ketara dalam cerun fEPSP di rantau CA1 antara kumpulan GLN dan PLN (Rajah 4C). Oleh itu, tahap miR-466f-3p yang tinggi meningkatkan LTP dan keplastikan sinaptik yang seterusnya, boleh menggalakkan pembelajaran daningatankeupayaan tikus. Bersama-sama, data yang dibentangkan dalam Rajah 2, 3 dan 4 menunjukkan bahawa miR-466f-3p memainkan peranan positif yang kritikal dalam pembelajaran spatial daningatanpembentukan, mungkin dengan meningkatkan pembentukan tulang belakang, LTP, dan kekuatan keplastikan sinaptik.

MRNA Mef2a ialah sasaran pengawalseliaan miR-466f-3p

Kami menjalankan analisis bioinformatik untuk mengenal pasti mRNA sasaran yang berpotensi dikawal oleh pengikatan miR-466f-3p kepada 30 UTR mereka. Antara calon yang kami kenal pasti ialah pengekodan mRNA Mef2a MEF2A. Menariknya, ungkapan MEF2A sebelum ini didapati dikurangkan selepas latihan MWM, dan overexpression faktor ini memberi kesan negatif terhadap prestasi tikus (Cole et al., 2012). Oleh itu, kami menggunakan ujian wartawan luciferase untuk memeriksa sama ada miR-466f-3}p mengawal terjemahan mRNA Mef2a dengan mengikat 30 UTRnya. Kami memasukkan jujukan Mef2a 30 UTR jenis liar atau mutan di hiliran SV40-cDNA luciferase (Luc) dipacu promoter, menghasilkan psiCHECK plasmid pelapor2-MEF2A 30 UTR atau psiCHECK2- mut-MEF2A 30 UTR (Rajah 5A). Seperti yang ditunjukkan dalam histogram kiri Rajah 5B, ungkapan bersama miR-466f-3p melemahkan ungkapan luciferase yang diarahkan oleh Mef2a 30 UTR. Kesan ini nampaknya bergantung pada interaksi antara miR-466f-3p dan Mef2a 30 UTR sejak mutasi sama ada tapak pengikatan miR-466f-3p yang diramalkan pada Mef2a 30 UTR (50-UGU- GUAU-30) atau kawasan benih miR-466f-3p (50-AUACACA-30) mengiktiraf Mef2a 30 UTR telah membatalkan kesan perencatan miR-466f-3p pada aktiviti luciferase (Rajah 5B, histogram tengah). Tambahan pula, ekspresi bersama span miR, tetapi bukan span CR, turut menghapuskan kesan penindasan miR-466f-3p pada aktiviti luciferase (Rajah 5B, histogram kanan). Terutamanya, ekspresi berlebihan miR-466f-3p mahupun miR-span tidak mempunyai sebarang kesan ke atas tahap mRNA Mef2a dalam neuron hippocampal primer (Rajah 5C), tetapi mereka mengurangkan atau meningkatkan, masing-masing, tahap protein MEF2A (Rajah 5D). Kami juga mendapati bahawa ekspresi berlebihan miR-466f-3p atau miR-sponge, masing-masing, menurunkan atau mengawal selia tahap mRNA protein berkaitan sitoskeletal (Arc) terkawal aktiviti dalam neuron hippocampal primer (Rajah 5C) , yang merupakan sasaran hiliran yang diketahui dikawal secara positif oleh MEF2A (Flavell et al., 2006)

Kami juga melakukan penghibridan in situ pendarfluor (FISH) untuk mengesan miR-466f-3p dan menggabungkannya dengan pelabelan IF MEF2A dalam neuron hippocampal primer DIV14 tanpa atau dengan rawatan forskolin. Forskolin dikenali untuk mendorong LTP kimia dan mengaktifkan adenylyl cyclase, dengan itu meningkatkan tahap cAMP intraselular. Kami memerhatikan kolokalisasi nuklear MEF2A dengan miR-466f- 3p, seperti yang digambarkan oleh imej perwakilan dalam Rajah 5E. Walau bagaimanapun, selepas rangsangan forskolin, isyarat miR-466f-3p meningkat dalam kedua-dua soma dan dendrit, manakala isyarat MEF2A dalam

nukleus berkurangan, seperti yang ditunjukkan oleh perubahan timbal balik keamatan MEF2A dan isyarat Merah Cepat, masing-masing, bagi sel neuron individu (Rajah 5E). Ringkasnya, data dalam Rajah 5A–5E menunjukkan bahawa miR-466f-3p secara negatif mengawal ekspresi protein MEF2A dengan mengikat kepada 30 UTR mRNA Mef2a dan seterusnya menindas terjemahannya.

Selaras dengan keputusan yang diterangkan di atas, kami mendapati bahawa tahap hippocampal protein MEF2A telah dikurangkan dalam tikus GLN selepas latihan MWM, tetapi tidak dalam tikus PLN (Rajah 5F). Tambahan pula, tahap relatif MEF2A dalam tikus GLN individu (titik) dan tikus PLN (segi dua) berkorelasi songsang dengan tahap miR-466f-3p (R=0.60, Rajah 5G). Oleh itu, corak heterogen pembelajaran spatial daningatankeupayaan dimodulasi oleh peningkatan stokastik miR- 466f-3p stokastik dalam tikus individu dan akibatnya penurunan MEF2A apabila rangsangan aktiviti neuron.

Pengaktifan stokastik CREB hippocampal dan regulasi transkrip yang berbangkit bagi kelompok miR- 466-669 semasa latihan MWM

Kami telah menyiasatmekanisme olehwhichmiR-466f-3p dalam hippocampus tetikus boleh dikawal selia secara stokastik oleh tugas MWM. Terdapat tiga prekursor miRNA yang mengekod miR-466f-3p, yang kesemuanya tergolong dalam kelompok miR-466-669 khusus tikus yang terletak dalam intron 10 gen hosnya, mSfmbt2 (Inoue et al ., 2017) (Rajah 6A). Menariknya, berbeza dengan miR-466f-3p, tiada perbezaan yang ketara dalam tahap ekspresi mSfmbt2 antara kumpulan GLNandPLN(Rajah6B), menunjukkan bahawa kelompok miR-466-669 mungkin mengekod transkrip berasingan bukannya menjadi sebahagian daripada transkrip utama mSfmbt2. Sehubungan itu, kami mereka bentuk beberapa set primer untuk mengenal pasti transkrip utama yang diduga bagi kelompok miR-466-669 oleh RT-qPCR. Seperti yang digambarkan dalam rajah 6A, serpihan PCR yang panjang ( tambah 282 hingga 2,381), bersama dengan satu siri jalur qPCR yang bertindih, iaitu A ( tambah 282 hingga 115), B ( 131 hingga 406), C ( 388 hingga 686), D ( 662 hingga 1,028), E ( 1,004 hingga 1,299), F ( 1,242 hingga 1,629), G ( 1,605 hingga 2,029), dan H ( 2,005 hingga 2,381), boleh dikesan dalam hippocampus tikus, tetapi bukan bahagian I ( 2,37). ) (data tidak ditunjukkan). Data ini menyokong bahawa gugusan miR-466-669 mengekodkan transkrip panjang berhampiran kira-kira 2,388 bp hulu bagi prekursor miRNA pertama (iaitu, pra-mir-466m, dilambangkan tambah 1dalamRajah6A). Hebatnya, sama dengan apa yang kami temui untuk miR-466f-3p, tahap purata transkrip ini dalam hippocampus tikus GLN adalah lebih tinggi daripada tikus PLN (Rajah 6C). Justeru, pembelajaran dipertingkatkan daningatankeupayaan tikus GLN adalah disebabkan oleh pengaktifan transkrip kluster miR-466-669.

Pengaktifan CREB nuklear melalui fosforilasi semasa tugas MWM atau dalam bentuk pembelajaran lain adalah langkah kritikal untuk menukar jangka pendek kepada jangka panjang.ingatan(Lisman et al., 2018; Roger-son et al., 2014). Oleh itu, kami menyiasat sama ada tahap miR-466f-3p yang berbeza-beza dalam kalangan tikus individu yang menjalani tugas MWM mungkin dikaitkan dengan status pengaktifan CREB. Untuk meneroka idea ini, mula-mula kita mengkaji tahap fosforilasi CREB hippocampal dalam tikus individu. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 6D, pengaktifan CREB (dengan fosforilasi pada residu S-133) telah dipertingkatkan dalam tikus GLN berbanding tikus PLN dan HC. Kami juga mengesahkan bahawa miR-466f-3p sememangnya diekspresikan bersama pCREB dalam neuron dengan melakukan miRNA ISH digabungkan dengan pewarnaan IF pCREB dan MAP2 dalam neuron hippocampal primer (Rajah S2A). Tambahan pula, tahap transkrip utama kluster miR- 466-669 berkorelasi positif dengan pCREB dalam tikus GLN (R=0.52), manakala tahap transkrip utama berkorelasi negatif dengan pCREB dalam tikus PLN (R=0 .71) (Rajah 6E). Kami menyemak korelasi antara tahap faktor aktif lain, kinase terkawal isyarat fosfo-ekstraselular (pERK) dan tahap transkrip utama gugusan miR-466-669. Kami mendapati bahawa kedua-dua jenis tikus yang dilatih MWM menunjukkan korelasi positif antara isyarat kluster miR-466-669 dan pERK (masing-masing R=0.59 dan 0.48; Rajah S4A), dan tiada perbezaan dalam pERK/ Ungkapan tERK antara dua kumpulan tersebut (Rajah S4B). Untuk memperjelaskan lagi kesan pengaktifan CREB pada transkripalupregulationofthemiR-466-669clusterand, akibatnya,

inductionofmiR-466f-3p,weusedaspecificCREBinhibitor,666- 15 (Xie et al., 2015), dalam kombinasi dengan rawatan forskolin bagi neuron hippocampal primer DIV14. Forskolin dikenali untuk mengaktifkan fosforilasi CREB (Malhotra et al., 2015). Kami mendapati bahawa prarawatan neuron hippocampal primer dengan 666-15 menyekat pengaktifan CREB yang disebabkan oleh forskolin (Rajah 6F) dan mengurangkan tahap miR-466f-3p dan miR-466-669 gugusan transkrip (Rajah 6G dan 6H). Pada masa yang sama, tahap mRNA bagi gen sasaran pCREB yang diketahui nurr1 dan homer1a (Bridi et al., 2017; Jensen et al., 2017) juga dikurangkan selepas 666-15 rawatan (Rajah 6H). Secara keseluruhan, Rajah 6 menunjukkan bahawa pengaktifan stokastik CREB dalam hippocampus subpopulasi tikus baka yang menjalani tugas MWM mendorong transkripsi kelompok miR-466-669 dan, akibatnya, aruhan miR-466f{{23 }}p, dengan itu meningkatkan pembelajaran spatial mereka daningatankeupayaan untuk melaksanakan tugas dengan lebih baik.

PERBINCANGAN

Kami telah meneroka kemungkinan peranan miRNA dalam memodulasi keupayaan pembelajaran spatial yang berbeza-beza daningatanantara tikus C57BL/6J inbred. Kami mencadangkan pengaktifan stokastik CREB dan akibatnya pengawalseliaan miR-466f-3p hippocampal menyumbang kepada pembelajaran spatial yang lebih besar daningatankeupayaan subkumpulan tikus ujian kami, mungkin disebabkan oleh miR-466f-3p pengantaraan perencatan translasi mRNA Mef2a yang mengekodingatanpengatur negatif MEF2A. Penemuan kami menyediakan senario yang menunjukkan peranan fungsi dan evolusi miRNA khusus dalam mengawal selia kognisi melalui induksi stokastik paksi CREB-pCREB-miR-466f-3p-MEF2A oleh rangsangan persekitaran.

Tugas MWM telah digunakan secara meluas untuk mengkaji keupayaan berbeza-beza pembelajaran spatial daningatanuntuk tikus. Dalam keadaan biasa, tikus menggunakan isyarat distal untuk mengorientasikan diri mereka, membolehkan mereka belajar dan menghafal lokasi platform tersembunyi dalam tugasan. Kebanyakan tikus C57BL/6J inbred ujian kami (62 peratus ) mempamerkan corak kependaman melarikan diri biasa, mencari platform dalam masa 30 s mengikut sesi ke-3-6 (Rajah 1A, GLN). Sebaliknya, sekumpulan tikus (38 peratus) tidak mempelajari tugas itu walaupun pada sesi ke-6 (PLN). Terutama, kami juga telah menundukkan tikus kepada dua ujian pengecaman lain. Yang pertama ialah ujian pengecaman objek baru (NOR), yang merupakan percubaan tunggal berdasarkan penerokaan semula jadi tanpa peneguhan atau tekanan untuk memotivasikan tingkah laku (Leger et al., 2013). Korelasi antara tugas NOR dan MWM dari segi prestasi tetikus adalah lemah (R {{1{{20}}}}.13), yang serupa dengan korelasi antara persembahan NOR dan tahap ekspresi hippocampal daripada miR-466f-3p (R=0.01; data tidak ditunjukkan). Ujian NOR juga mendedahkan tiada perbezaan dalam indeks diskriminasi antara kumpulan MWM GLN dan PLN (0.36 ± 0.25 berbanding 0.29 ± 0.18; Rajah S1B). Pembelajaran spatial yang lain daningatan-tugas bergantung yang telah kami gunakan ialah Barnes maze (BM), yang serupa dengan MWM. Ia berdasarkan andaian bahawa tikus yang diletakkan di dalam persekitaran yang tidak menyenangkan harus belajar dan mengingati lokasi kotak melarikan diri yang terletak di bawah permukaan platform. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah S1C, kami telah mendapati bahawa prestasi tetikus dalam percubaan probe BM juga berkorelasi positif dengan tahap ekspresi hippocampal miR-466f-3p. Oleh itu, aruhan paksi CREB-pCREB-miR-466f-3p-MEF2A dalam hippocampus semasa pembelajaran daningatanpembentukan adalah bergantung kepada konteks ruang.