Bahagian 1:Verbascoside Melindungi Pankreas -Sel Menentang ER-Tekanan
Mar 05, 2022
Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com
Alessandra Galli 1, tambah , Paola Marciani 1, tambah , Algerta Marku 1, Silvia Ghislanzoni 1, Federico Bertuzzi 2, Rafaella Rossi 3, Alessia Di Giancamillo 3 , Michela Castagna 1 dan Carla Perego 1,*
Abstrak:
Bukti epidemiologi yang besar menunjukkan bahawa diet yang kaya dengan polifenol melindungi daripada menghidap diabetes jenis 2. Glikosida phenylethanoidverbascoside/acteoside, sebatian tumbuhan polifenol yang meluas, mempunyai beberapa sifat biologi termasuk aktiviti antioksidan, anti-radang dan neuroprotektif yang kuat. Tujuan penyelidikan ini adalah untuk menguji kemungkinan kesan daripadaverbascosidepada sel pankreas, sasaran yang tidak pernah diuji sebelum ini. Tetikus dan sel manusia telah diinkubasi denganverbascoside(0.8–16 uM) sehingga lima hari dan gabungan teknik biokimia dan pengimejan digunakan untuk menilai kemandirian dan fungsi sel-sel di bawah keadaan yang mendorong tekanan normal atau retikulum endoplasma (ER). Kami menemui kesan perlindungan yang bergantung kepada dosverbascosideterhadap tekanan oksidatif dalam sel klon dan manusia. Kajian mekanistik mendedahkan bahawa polifenol melindungi -sel daripada disfungsi pengantara tekanan ER, memodulasi pengaktifan cawangan kinase retikulum endoplasma (PERK) seperti protein kinase RNA bagi tindak balas protein terungkap dan menggalakkan dinamik mitokondria. Akibatnya, peningkatan daya maju, fungsi mitokondria dan kandungan insulin dikesan dalam sel-sel ini. Kajian-kajian ini memberikan bukti bahawaverbascosidemeningkatkan keupayaan sel-sel untuk mengatasi tekanan ER, penyumbang penting disfungsi sel dan kegagalan dalam keadaan diabetes dan menyokong potensi terapeutik verbascoside dalam diabetes.
Kata kunci:
verbascoside; polifenol; sel penghasil insulin; kencing manis; UPR; tekanan oksidatif; ER-tekanan; PERK; anti-radang; mitokondria
1. Pengenalan
Diabetes adalah gangguan kronik yang menjejaskan ratusan juta orang [1]. Etiologi yang berbeza mencirikan diabetes Jenis 1 (T1D) dan Jenis 2 (T2D) yang kedua-duanya menunjukkan kekurangan insulin [2]. Insulin mengawal kepekatan glukosa plasma merangsang pengambilan glukosa dalam otot dan sel lemak dan memodulasi metabolisme glukosa hati. Ketersediaan nutrien, hormon, dan input saraf mengawal rembesan insulin pankreas dan mengekalkan kepekatan glukosa darah dalam julat fisiologi [3-5]. Oleh itu, disfungsi sel-sel membawa kepada diabetes yang dicirikan oleh hiperglikemia puasa.
T2D ialah keadaan progresif di mana rintangan insulin dan salah fungsi sel-sel dikaitkan bersama dan bukti terkini meningkatkan minat dalam peranan utama kritikal -sel kepada status hiperglisemik [6,7]. Dalam subjek obes bukan diabetes - sel mengimbangi rintangan insulin dengan peningkatan rembesan hormon. Walau bagaimanapun, dalam sesetengah subjek, apabila keadaan mereka merosot, insulinemia menurun dan tahap glukosa meningkat kepada hiperglisemia [8,9].
Glukosa ialah modulator terpenting bagi fungsi sel. Rangsangan glukosa menjejaskan pengawalan gen dan ekspresi protein yang terlibat dalam banyak fungsi sel seperti glikolisis, sintesis insulin dan rembesan [10]. Rembesan insulin yang disebabkan oleh glukosa bergantung pada metabolisme oksidatif untuk menghasilkan adenosin trifosfat (ATP) dan tahap rendah spesies oksigen reaktif (ROS) dihasilkan secara fisiologi. Walau bagaimanapun, sel -sel tidak dilengkapi dengan enzim penghapus dan kelemahan ini menjadikannya sangat terdedah kepada tekanan oksidatif [11,12]. Apabila tekanan oksidatif meningkat -penghasilan insulin sel menurun, dan -sel menghasilkan sitokin yang menyalakan kerosakan sel melalui keradangan dan apoptosis [13]. Menariknya, walaupun jisim sel yang dikurangkan sebelum ini telah dikaitkan dengan kematian sel, kajian baru-baru ini mencadangkan peranan utama dediferensiasi sel [14,15]. Sudah menjadi jelas bahawa beberapa peringkat memandu ke T2D. Penghinaan metabolik dan oksidatif menyebabkan tekanan retikulum endoplasma (ER) yang membawa kepada kemerosotan sintesis dan rembesan insulin, proses inflamasi mengikuti pembebasan sitokin dan kehilangan sel mungkin berlaku melalui apoptosis dan deferensiasi. Pengetahuan ini adalah asas untuk membangunkan strategi rawatan yang sesuai, kerana tekanan oksidatif dan keradangan boleh diatasi, dan keplastikan sel pankreas membolehkan kemungkinan untuk mengembalikan sel stem kepada sel-sel seperti yang dibuktikan pada tikus [16].
Baru-baru ini, kelemahan sel-sel kepada tekanan oksidatif telah berjaya mendorong penggunaan antioksidan diet untuk mencegah diabetes [17]. Antara makanan antioksida yang paling menarik, minyak zaitun terkenal dengan khasiatnya yang bermanfaat sejak zaman Yunani kuno. Minyak zaitun mengandungi sejumlah besar asid lemak tak tepu (MUFA) dan beberapa polifenol seperti tyrosol, hydroxytyrosol, oleuropein, dan verbascoside.
Verbascoside, juga dikenali sebagai acteoside, ialah glikosida fenilethanoid yang diekstrak daripada Olea europea, tumbuhan spesies Verbascum, dan 23 keluarga tumbuhan lain [18–20]. Ia juga boleh didapati daripada produk sampingan minyak zaitun (ia diperkaya dengan air sisa kilang zaitun yang diperoleh daripada pemprosesan buah zaitun) atau dihasilkan melalui pendekatan kejuruteraan metabolik dan biologi sintetik [21].
Tiada data telah dilaporkan mengenai bioavailabiliti verbascoside pada manusia. Kajian yang dijalankan ke atas tikus, sel SKBR3 dan Caco-2 mencadangkan bahawa verbascoside yang tidak dimetabolismekan boleh merentas halangan usus, beredar dalam plasma darah dan memberikan kesan antioksidan [20,22,23]. Tidak seperti kebanyakan polifenol tumbuhan, verbascoside terutamanya bertindak pada sel melalui modulasi transkripsi gen pelbagai enzim dan faktor pengawalseliaan, dengan kesan antioksidan dan anti-radang [24-30].
Walaupun banyak kesan berfaedah verbascoside untuk kesihatan manusia diketahui, tiada data tentang kesannya pada sel pankreas. Oleh kerana tekanan oksidatif dan keradangan adalah berdasarkan patogenesis T2D, kami menyiasat sama ada rawatan verbascoside mungkin meningkatkan daya maju sel dan
berfungsi dalam keadaan mendorong tekanan ER dan kami mencirikan mekanisme molekul tindakannya. Data kami mendedahkan bahawa verbascoside menghalang -sel tekanan oksidatif dan inflamasi memodulasi pengaktifan tindak balas protein terungkap dan menggalakkan dinamik mitokondria, dengan itu mengakibatkan peningkatan daya maju sel dan kandungan insulin.
2. Bahan-bahan dan cara-cara
2.1. Kultur dan Bahan Sel
Sel tc3 tetikus (disediakan dengan baik oleh Prof. Hanahan—Jabatan Biokimia dan Biofizik, University of California, San Francisco, CA [31]) telah dikultur dalam medium RPMI 1640 (Euroclone SpA, ECB90 0, Pero MI, Itali) ditambah dengan 10 peratus (v/v) serum betis janin yang tidak diaktifkan haba (Euroclone SpA, ECS0180L, Pero MI, Itali), 1 peratus (v/v) penicillin-streptomycin (EuroClone SpA, ECB3001D, Pero MI, Itali) dan 1 peratus (v/v) L-glutamin (EuroClone SpA, ECB300D, Pero MI, Itali). Pulau kecil manusia Langerhans telah diasingkan di Milan (Niguarda Ca' Granda) daripada penderma multiorgan kadaver mengikut prosedur yang diterangkan oleh Ricordi et al. [32]; mereka dibiakkan dalam medium kultur RPMI yang mengandungi 5.5 mmol/L glukosa, 10 peratus serum lembu janin yang tidak diaktifkan haba, 0.7 mM Glutamine, 50 unit/mL penisilin dan 50 ug/mL streptomycin (EuroClone, SpA, Pero MI, Itali). Empat penyediaan pulau kecil yang berbeza digunakan, ketulenan pulau adalah 80 ± 10 peratus. Pengasingan pulau kecil dan kajian pulau kecil telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika hospital Niguarda Ca' Granda di Milan (11.12.2009). sel tc3 telah dirawat dengan 0.8, 1.6, dan 16 uM verbascoside (Carbosynth, OV08034, Compton, UK), asid kafeik dan hydroxytyrosol (hadiah jenis Prof. Dell'Agli, Jabatan Sains Farmakologi dan Biomolekul, Universita degli Studi di Milano, Milan, Itali) dalam medium RPMI lengkap selama 5 hari, manakala pulau kecil manusia dengan 16 uM verbascoside. Sel yang dirawat metanol/etanol digunakan sebagai kawalan. Untuk mendorong tekanan oksidatif, sel telah dirawat dengan H2O2 (Sigma Aldrich, H1009, St. Louis MO, Amerika Syarikat) 500 uM dalam medium RPMI lengkap selama 20 minit sebelum analisis, manakala rawatan dengan tunicamycin 2 ug/mL (T7765, Sigma Aldrich ) selama 7 jam dilakukan untuk mendorong tekanan ER.
2.2. Pengesanan Daya Tahan Sel melalui Ujian MTT
Sel disalut dalam 96 plat berbilang telaga, dan lima hari selepas rawatan verbascoside ia diinkubasi dengan 0.5 mg/mL MTT (3-(4,5-dimethyltiazol{{7} }yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (Sigma-Aldrich, M5655, St. Louis, MO, Amerika Syarikat) selama 4 jam dalam suasana lembap yang mengandungi 5 peratus CO2 pada 37 oC. Selepas pengeraman, sel-sel telah digantung semula dengan perlahan dalam 100 uL DMSO (Euro-Clone SpA, BK12611S, Pero MI, Itali) dan penyerapan pada 540 nm dikesan dengan pembaca plat mikro (Tanda Aras, pembaca plat mikro, Makmal Bio-Rad, Hercules CA, Amerika Syarikat) [33]. Eksperimen telah dilakukan dalam tiga kali ganda dan data dinyatakan sebagai peningkatan kali ganda ke atas sampel kawalan.
2.3. Pengesanan Kematian Sel melalui Sitometri Aliran
Lima hari selepas pengeraman dengan 16 uM verbascoside, -sel telah dipisahkan dengan pengeraman 7 minit dengan trypsin/EDTA, dikumpulkan dan disentrifugasi; pelet digantung semula secara perlahan-lahan dalam garam rendah garam penampan fosfat. Sel telah diwarnai dengan kiraan MuseTM dan reagen daya maju (Millipore, MCH100102, Burlington MA, Amerika Syarikat) mengikut protokol pengilang dan dianalisis melalui sitometri aliran. Eksperimen telah dilakukan dalam tiga kali ganda dan data dinyatakan sebagai peratusan sel mati berbanding jumlah keseluruhan.
2.4. Generasi ROS
ROS intraselular dinilai dengan DCFDA (2/,7/-dichlorofuorescein diacetate) (Sigma Aldrich, D6883, St. Louis, MO, Amerika Syarikat), satu probe telap membran yang menjadi pendarfluor apabila diikat pada ROS [34]. sel tc3 telah dimuatkan dengan 15 uM DCFDA dalam penampan Krebs-Ringer (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM KH2PO4, 25 mM HEPES-NaOH pH 7.4 dan 2 mM CaCl2)
ditambah dengan 11 mM glukosa selama 1 jam pada 37 oC. Kandungan ROS dikesan selama 30 minit dalam keadaan basal dan tegasan dengan pembaca plat mikro (485/528 nm Ex/Em) (TECAN Infinite⑧ F500, Tecan Group Ltd. Männedorf, Switzerland). Nilai min dan sisihan piawai adalah berdasarkan tiga eksperimen bebas.
2.5. Western Blotting
sel tc3 dikumpulkan dan dilarutkan dalam penampan RIPA (150 mM NaCl, 50 mM Tris HCl pH 7.6, 1 mM EDTA, 1 peratus TERGITOLw NP40, 0.5 peratus deoksikolat) ditambah dengan aprotinin (Sigma Aldrich, A4529, St. Louis, MO, USA), PMSF (Sigma Aldrich, 10837091001, St. Louis, MO, USA) dan perencat Roche (Sigma Aldrich, 5892953001, St. Louis, MO, USA) selama 40 minit pada 4 oC. Kepekatan protein ditentukan oleh ujian Bradford [35] dengan menggunakan Reagen Bradford (Sigma Aldrich, B6916, St. Louis, MO, Amerika Syarikat), 30 ug protein diselesaikan oleh 10 peratus SDS-PAGE dan dipindahkan ke membran nitroselulosa (Millipore, Burlington). MA, Amerika Syarikat). Antibodi utama digunakan selama 2 jam dalam penampan penyekat dengan 5 peratus susu tanpa lemak atau 5 peratus larutan BSA; antibodi utama berikut digunakan: anti-aktin tetikus (Novus International Inc., NB600501, St. Louis, MO, USA), anti-akrolein tetikus (Abcam, ab48501,Cambridge, UK), anti-BIP tetikus (hadiah baik Prof. Borgese Nica, Institut Neurosains, CNR, Milan, Itali), arnab anti-HNE ( -diagnostic International Inc., HNE11S, San Antonio, TX, USA), tetikus anti-HSP70 (Enzo Life Sciences Inc. ., C92F3A-5, Farmingdale, NY, USA), arnab anti-phospho-IKB (Ser32) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, USA), tetikus anti-IKB (Cell Signaling Technology Inc. ., 4814, Danvers, MA, USA), arnab anti-phospho-NFKB p65 (Ser 536) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, USA), arnab anti-NFkB p65 (Cell Signaling Technology Inc., 8242, Danvers MA, USA), biri-biri anti-SOD1 (Merck, KGaA, Darmstadt, Germania), arnab anti-PERK (Cell Signaling Technology Inc., 3192, Danvers, MA, USA), arnab anti-eIF2 (Cell Signaling Technology Inc., 5324, Danvers, MA, USA) dan arnab anti-P-eIF2 (Ser 51) (Cell Signaling Technology Inc., 3597, Danvers, MA, USA). Antibodi sekunder HRP-conjugated (Dako Agilent, Santa Clara, CA, USA) digunakan pada pencairan 1:5000. Protein dikesan dengan menggunakan sistem pengesanan ECL (Euro-Clone SpA, Pero MI, Itali) dengan menggunakan sistem Imej Odyssey Fc (LI-COR Biotechnology GmbH, Bad Homburg, Jerman) dan ketumpatan jalur dikira oleh perisian Image Studiow Lite (LI). -COR Biosciences, Lincoln, NE, Amerika Syarikat) [36]. Eksperimen telah dilakukan dalam tiga kali ganda dan data dinyatakan sebagai peningkatan kali ganda ke atas sampel kawalan.
2.6. Potensi Membran Mitokondria
sel tc3 dan pulau kecil manusia Langerhans telah diinkubasi dengan 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milan, Itali) atau 100 uM MitoSpyw Green FM (BioLegend, 424805, Campoverde Srl, Milan, Itali) untuk 370 min. oC; Keamatan pendarfluor dikesan dengan pembaca plat mikro TECAN Infinite⑧ F500 (551/576 nm Ex/Em untuk MitoSpyw Orange CMTMRos; 490/516 nm Ex/Em untuk MitoSpyw Green) (TECAN Infinite⑧ F500, Tecan Group Ltd., Switzerland). Sel telah diinkubasi dengan 500 uM H2O2 selama 20 minit dan keamatan pendarfluor dikesan seperti yang diterangkan sebelum ini. Nilai min dan sisihan piawai adalah berdasarkan tiga eksperimen yang berbeza.
2.7. Morfologi dan Dinamik Mitokondria
sel tc3 telah dimuatkan dengan 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milan, Itali) dalam 11 mM glukosa Krebs-Ringer bufer pada 37 oC selama 30 minit. Sampel diletakkan di dalam ruang pengimejan dan medan rawak diimej dengan menggunakan penapis rhodan mikroskop Axio Observer Z1 (Zeiss, Oberkochen Germany). Untuk menilai morfologi mitokondria, parameter berikut dianalisis dengan menggunakan perisian penganalisis zarah ImageJ: luas (um2), pekeliling (4mArea2/Perimeter2) dan diameter maksimum Feret (um) [37].
Untuk eksperimen selang masa, pengimejan sel tunggal telah dijalankan pada 1 bingkai sesaat selama 30 saat di bawah keadaan terkawal atau tekanan oksidatif. Untuk mengukur jarak terkumpul mitokondria (um2), imej mula-mula diperbetulkan untuk pelunturan foto, kemudian video dianalisis dengan menggunakan Plug-in Image-Pro Plus (penjejakan objek) sedia ada (Media Cybernetics, Rockville, MD, Amerika Syarikat). Sehingga dua belas
sel telah digambarkan dalam tiga eksperimen bebas dan data dibentangkan sebagai nilai min dan sisihan piawai.
2.8. Rembesan Insulin
Pulau Langerhans terpencil manusia telah disemai dalam 96-plat perigi pada ketumpatan 20 pulau setiap telaga dan, selepas 5 hari rawatan, kandungan insulin dan rembesan diukur dalam basal (3.3 mM glukosa) dan dirangsang (16.7 mM glukosa ) keadaan melalui immunoassay ELISA (Mercodia, 10-1113-01, Uppsala, Sweden).
2.9. Analisis Statistik
Semua analisis statistik telah dilakukan dengan GraphPad Prism 8.0 pada replika biologi bebas. Min antara dua kumpulan telah dinilai dengan menggunakan ujian-t Pelajar dua hujung dan nilai p < 0.05="" telah="" diambil="" sebagai="" bukti="" kepentingan="" statistik.="" purata="" antara="" tiga="" atau="" lebih="" kumpulan="" dibandingkan="" dengan="" analisis="" varians="" (anova),="" diikuti="" dengan="" ujian="" perbandingan="" post-hoc="" (tukey's)="" berganda.="" ujian="" statistik="" yang="" digunakan,="" nilai="" p="" tepat="" dan="" bilangan="" replika="" (n)="" ditunjukkan="" dalam="" legenda="" rajah="" individu.="" bar="" ralat="" dalam="" rajah="" memaparkan="" min="" ±="" sd="" atau="" min="" ±="" se,="" seperti="" yang="">
3. Keputusan
3.1. Verbascoside Meningkatkan Daya Daya -Sel
Oleh kerana tiada data mengenai kesan verbascoside pada sel-sel, kami melakukan ujian MTT untuk menilai daya maju sel dan seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1A, trend bergantung kepada dos positif diperhatikan. Oleh itu, untuk kajian lanjut, kami memilih kepekatan 16 uM yang secara statistik telah terbukti berkesan untuk meningkatkan daya maju sel-sel. Melalui sitometri aliran kami mengkaji kesan pengeraman lima hari verbascoside terhadap kemandirian sel dalam keadaan basal dan selepas 2{{21} } min pra-rawatan dengan 500 uM H2O2. Dalam keadaan basal, verbascoside tidak menjejaskan kemandirian sel, menunjukkan bahawa peningkatan daya tahan sel yang diperhatikan dalam ujian MTT mungkin disebabkan oleh aktiviti mitokondria yang lebih baik. Manakala, selepas pendedahan H2O2, pra-rawatan verbascoside 16 uM secara signifikan mengurangkan kematian sel akibat tekanan oksidatif (Rajah 1B, C). Verbascoside ialah molekul kompleks yang boleh diubah suai dengan menghidrolisis enzim [18]. Untuk menguji sama ada metabolit verbascoside boleh bertanggungjawab terhadap kesan perlindungan yang diperhatikan, sel tc3 dirawat dengan asid hidroksitirosol dan kafeik (0.8 dan 16 uM) selama 5 hari. Kedua-dua metabolit tidak meningkatkan daya maju sel, sebaliknya kesan sitotoksik, lebih relevan selepas pendedahan H2O2, dikesan untuk kepekatan 16 uM (Rajah S1). Penemuan ini membuktikan bahawa verbascoside dan bukan metabolitnya memberi kesan perlindungan kepada rawatan H2O2.
3.2. Verbascoside Memodulasi Homeostasis Redoks dan Memberi Kesan Anti-Radang dalam -Sel
Kami mula-mula mengesahkan dalam sel tc3 kesan anti-radang dan anti-oksida verbascoside yang diperhatikan dalam jenis sel lain [24,29,34]. Aktiviti pemusnahan ROS verbascoside telah dinilai dengan sel tc3 yang dilabelkan dengan probe telap selular DCFDA (2/,7/-dichlorofuorescein diacetate) khusus ROS. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2A, penurunan ketara kandungan ROS dikesan selepas pra-rawatan verbascoside, kedua-duanya di bawah keadaan tekanan basal dan oksidatif.
Analisis Western blot mendedahkan penurunan ketara penanda tegasan oksidatif akrolein dan 4-ekspresi hidroksinonenal (HNE) dalam sel yang dirawat verbascoside. Di samping itu, kami mendapati peningkatan ekspresi superoxide dismutase (SOD1), menunjukkan bahawa verbascoside menggunakan aktiviti antioksidannya mungkin dengan dua mekanisme yang berbeza, secara langsung sebagai pemulung ROS dan secara tidak langsung dengan mendorong ekspresi enzim antioksidan (Rajah 2B, C).
Kesan anti-radang verbascoside pada sel-sel telah dinilai dengan menilai pengaktifan laluan NFKB, laluan pro-radang yang paling penting dalam sel-sel ini [38]. Dengan analisis western blot, kami mendapati pengurangan ekspresi perencat faktor nuklear kappa B (IKB) dan faktor nuklear kappa-penambah rantai-cahaya (NFKB), dan penurunan ketara fosforilasi NFKB dalam sel pra-rawatan, menyokong hipotesis keberkesanan verbascoside untuk mengurangkan keradangan selular (Rajah 2D, E).
3.3. Verbascoside Memodulasi Tindak Balas Protein Terbuka bagi -Sel
Kami kemudian menganalisis secara mendalam mekanisme molekul yang verbascoside melaksanakan peranan antioksidan dan anti-radang, memfokuskan pada retikulum endoplasma yang muncul sebagai penderia utama isyarat metabolik dan tekanan dalam sel. Di bawah keadaan tekanan, organel memasang tindak balas homeostatik, yang dikenali sebagai tindak balas protein terungkap (UPR), bertujuan untuk memulihkan fungsi ER; bagaimanapun, pengaktifan berlebihan laluan ini mengakibatkan apoptosis [39,40].
Penanda tekanan ER yang meningkat ialah pengawalseliaan protein pendamping dan pengaktifan tindak balas UPR. Analisis Western blotting sel yang dirawat dengan verbascoside mendedahkan penurunan tahap dua protein kejutan haba chaperonin 70 (HSP70) dan protein imunoglobulin mengikat (BIP) (Rajah 3A, B). Tambahan pula, pengurangan ketara ekspresi protein kinase RNA-like ER kinase (PERK) dan penurunan fosforilasi efektor hilirannya, faktor permulaan terjemahan eukariotik 2 (eIF2), telah dikesan.
