Bahagian 1: Penubuhan Model Eksperimen Serentak Osteoporosis Digabungkan Dengan Penyakit Alzheimer dalam Tikus Dan Kesan Dual Echinacoside Dan Acteoside Dari Cistanche Tubulosa
Mar 24, 2022
Hubungi:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Yi Chen, Ying-Qi Li, Jia-Yi Fang, Ping Li, Fei Li
ABSTRAK
Perkaitan etnopharmacological: Cistanche tubulosaadalah ubat tradisional Cina yang berharga yang telah digunakan secara meluas dalam rawatan osteoporosis danPenyakit Alzheimer.Echinacosidedan acteoside adalah juzuk aktif utama dalam tubulosa Cistanche yang mempunyai aktiviti farmakologi dengan nilai penyelidikan. Telah dilaporkan bahawa echinacoside danacteosideboleh meningkatkan keupayaan pembelajaran dan ingatan, menggalakkan percambahan dan pembezaan osteoblast. Matlamat kajian: Echinacoside dan acteoside dariCistanche tubulosatelah menunjukkan aktiviti penting anti-osteoporosis dan anti-Alzheimer penyakit, manakala kesan-kesan ini tidak dikaji secara serentak dalam model tikus. Tujuan kajian ini adalah untuk menubuhkan dan mengesahkan model osteoporosis yang digabungkan denganPenyakit Alzheimerpada tikus dan untuk menyiasat kesan bergandaechinacosidedan acteoside pada model serentak ini.
Bahan dan kaedah:Tiga kumpulan model ovariektomi (OVX), pembedahan sham dengan D-galactose dan AlCl3 (D), ovarieectomy dengan D-galactose dan AlCl3 (OVX+D) telah ditetapkan pada masa yang sama. Tikus dalam kumpulan rawatan dadah telah ovariektomized. Semasa menjalankan suntikan intraperitoneal D-galaktosa dan pentadbiran intragastrik AlCl3 dalam tikus kumpulan rawatan dadah, tikus diberikan secara lisanechinacoside(90 mg/kg/d),acteoside(90 mg/kg/d), dan ubat kawalan positif estradiol valerate (0.6 mg/kg/d), donepezil HCl (0.8 mg/kg/d), masing-masing. Selepas rawatan dadah 8 minggu, ujian Morris Water Maze (MWM) selama 6 hari pertama kali dilakukan. Kemudian, tikus - tikus itu dikorbankan untuk memanen darah, uteri, femora, tibiae, dan jaringan otak. Serum ini digunakan untuk ujian biokimia. Uteri digunakan untuk histomorphometry. femora kanan digunakan untuk Micro-CTdan histomorphometry, masing-masing. Tibiae yang betul digunakan untuk ujian biomekanik. Hippocampus yang dikumpulkan pada kotak ais digunakan untuk ujian biokimia. Otak 41 yang dikumpulkan oleh perfusi digunakan untuk histomorphometry.
Keputusan:Berbanding dengan kumpulan Sham, kumpulan OVX+D dapat mengurangkan keupayaan pembelajaran dan ingatan dengan ketara dengan menyebabkan kerosakan oksidatif, merosakkan neuron di hippocampus, dan mempengaruhi hidrolisis dan sintesis acetylcholine. Sementara itu, aktiviti BALP dan TRAP dalam kumpulan OVX+D meningkat dengan ketara (P<0.001) as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" in="" addition,="" compared="" with="" the="" sham="" group,="" the="" mean="" bone="" mineral="" density="" obviously="" decreased=""><0.05), the="" trabecular="" bone="" mass="" and="" microarchitecture="" were="" also="" destroyed="" significantly="" in="" the="" ovx+d="" group.="" furthermore,="" the="" maximum="" load="" and="" maximum="" stress="" significantly="" reduced=""><0.01) and="" the="" energy="" 50="" absorption="" also="" decreased="" greatly="" as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" after="" being="" administrated="" with="">echinacosideDanacteoside, ciri-ciri patologi tipikal osteoporosis danPenyakit Alzheimertelah ameliorated.
Kesimpulan:Model osteoporosis digabungkan denganPenyakit Alzheimerpada tikus boleh dilaksanakan dan berjaya ditubuhkan.Echinacosidedan acteoside juga menunjukkan beberapa kesan yang signifikan pada model serentak ini, dan mereka boleh menjadi calon berpotensi 56 dariCistanche tubulosadengan kesan berganda untuk kajian lanjut.
Kata kunci:osteoporosis; Penyakit Alzheimer; dwi-kesan; echinacoside; acteoside; Cistanche tubulosa
CIstanche kehilangan herba empayar ameliorates penyakit Alzheimer
1. Pengenalan
Osteoporosis adalah penyakit tulang degeneratif yang dicirikan oleh kehilangan progresif jisim tulang dan pemusnahan microarchitecture, yang boleh meningkatkan risiko patah kerapuhan (Rachner et al., 2011).Penyakit Alzheimer(AD) adalah penyakit neurodegeneratif biasa pada orang tua yang dicirikan oleh penurunan mental yang berterusan, gangguan kognitif, dan kehilangan keupayaan hidup bebas dalam klinikal (Reitz 76 et al., 2011). Pembentukan plak nyanyuk yang disebabkan oleh pemendapan β-amyloid, kusut neurofibrillary yang disebabkan oleh hiperfosforilasi tau, dan kemerosotan neuron di otak adalah ciri-ciri patologi khas AD (Serrano-Pozo et al., 2011). Secara dangkal, OP dan AD adalah penyakit yang benar-benar bebas dengan ciri patologi dan klinikal yang berbeza. Walau bagaimanapun, OP dan AD sering diperhatikan untuk berlaku bersama dalam amalan klinikal (Zhang et al., 2001; Lui et al., 2003; Luckhaus et al., 2009). Kelaziman kedua-dua penyakit meningkat dengan usia, terutamanya pada wanita selepas menopaus (Li et al., 2017; Stern, 2012). Semakin banyak bukti menunjukkan bahawa orang yang didiagnosis dengan AD mempunyai peningkatan risiko OP (Zhou et al., 2014).
Ia adalah perlu untuk mengkaji dan menjelaskan hubungan antara osteoporosis danPenyakit Alzheimerin vitro dan in vivo. Sebelum kajian dilakukan dalam vivo, adalah penting untuk memilih model haiwan osteoporosis atau penyakit Alzheimer yang berkenaan. Model osteoporosis boleh ditubuhkan dengan beberapa jenis kaedah seperti pentadbiran intragastrik asid retinoik, pembedahan ovariektomi, dan suntikan intramuskular glucocorticoids (Wei et al., 2007; Komori, 2015). Terutamanya, model osteoporosis postmenopausal yang disebabkan oleh ovariektomi pada tikus adalah klasik dantelah digunakan secara meluas dalam kebanyakan kajian (Miao et al., 2012; Liu et al., 2017).Penyakit Alzheimer Sporadic adalah jenis utama penyakit Alzheimer. Haiwan itumodel SporadicPenyakit Alzheimerboleh disebabkan oleh pelbagai kaedah sepertisuntikan D-galactose atauβ-amyloid, pentadbiran intragastrik AlCl3,dan sebagainya(Bagheri et al., 2011; Gao et al., 2015; Justin Thenmozhi et al., 2017). Di samping itu,model gabungan penyakit Alzheimer yang disebabkan oleh intraperitoneal jangka panjangsuntikan D-galactose digabungkan dengan ovariektomi juga telah banyak dikaji (Liuet al., 2010; Zhao et al., 2012). Untuk mendedahkan kaitan osteoporosis danPenyakit Alzheimer, adalah perlu untuk menubuhkan model osteoporosis digabungkandengan penyakit Alzheimer untuk mengkaji mekanisme biasa ubat-ubatan padaosteoporosis danAlzheimer's disease.
Cistanche tubulosa(Schenk) Wight adalah tumbuhan parasit, yang terutamanya diedarkan di padang pasir di Barat Laut China. Batang succulent keringCistanche tubulosa(CT) digunakan sebagai ubat tonik terkenal yang dipanggil Cistanches Herba dengan nama Cina Roucongrong dalam Pharmacopoeia Cina (2015). Ia telah dihormati sebagai "ginseng padang pasir" dan digunakan secara meluas untuk rawatan sakit pinggang dan lutut, kemandulan wanita, dan sembelit dalam perubatan tradisional Cina (Jiang dan Tu, 2009). Konstituen aktif utama CT adalah phenylethanoid glikosida (PhG), echinacoside (ECH) danacteoside(ACT) adalah sebatian wakil dalam PhG (Morikawa et al., 2014). Terutama, ECH dan ACT biasanya dipilih sebagai penanda untuk kawalan kualiti dalam CT kerana kandungannya yang tinggi dan pelbagai aktiviti farmakologi seperti kesan neuroprotection, perlindungan tulang,
antioksidan, anti-penuaan, dan meningkatkan keupayaan pembelajaran dan ingatan (Wang et al.,2012; Li et al., 2016). Walau bagaimanapun, kesan ECH dan ACT terhadap osteoporosisdigabungkan denganPenyakit Alzheimerbelum dipelajari bersama dalam model tikus.Oleh itu, tujuan kajian ini adalah untuk menubuhkan model tikus osteoporosis gabungandengan penyakit Alzheimer dan meneroka kesanechinacosidedan acteoside pada inimodel serentak, untuk menyediakan bukti eksperimen untuk kajian lanjut mengenaimekanisme molekul echinacoside atau acteoside dalam penyelidikan berikut.
cistanche farmasi khasBagiIKLAN
2. Bahan dan kaedah
2.1. Haiwan
Lapan puluh 8 minggu tikus Wistar betina (Nombor Sijil: SCXK 2018-0006), seberat 180 ~ 200 g, diperoleh dari Sino-British SIPPR / BK Lab. Animal Ltd (Shanghai, China) dan dibesarkan di Pusat Eksperimen Haiwan Farmaseutikal di Universiti Farmaseutikal China.
2.2. Bahan kimia dan reagen
Chloral hydrate, penisilin G natrium, D-galactose, aluminium klorida hexahydrate, estradiol valerate, donepezil HCl dibeli dari Aladdin Industrial Corporation (Shanghai, China).Echinacoside(HPLC 94%) diperolehi daripada Chengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, China).Acteoside(HPLC 98%) dibeli daripada Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, China). phosphatase alkali khusus tulang (BALP), phosphatase asid tahan tartrate (TRAP), superoksida dismutase (SOD), malonaldehid (MDA), acetylcholinesterase (AChE), dan choline acetyltransferase (ChAT) kit ujian imunsorbent berkaitan enzim (ELISA) telah dibeli daripada Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China). Fiksatif tisu sejagat diperolehi daripadaChengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, China).
echinacoside
2.3. Model dan rawatan haiwan
Semua eksperimen haiwan diberi kuasa dan diselia oleh Jawatankuasa Etika Haiwan Universiti Farmaseutikal China. Tikus dikekalkan dengan kitaran cahaya / gelap 12 jam di dalam bilik yang dikawal suhu (22±2 ° C) dan diberi makan dengan makanan ternakan dan air paip yang dipeluk standard.
Selepas penyesuaian satu minggu, model osteoporosis dicapai dengan menjalankan pembedahan ovariektomi (Perancis et al., 2008). Selepas operasi selesai, natrium penisilin G ditaburkan pada jahitan luka untuk satu masa untuk mengelakkan jangkitan. Tikus kemudian diberi makan secara normal selama tiga minggu. Menurut rujukan (Hua et al., 2007; Alawdi et al., 2017), modelPenyakit Alzheimerboleh disebabkan oleh suntikan intraperitoneal jangka panjang D-galactose digabungkan dengan ovariektomi atau pentadbiran intragastrik jangka panjang AlCl3. Untuk mengkaji kebolehlaksanaan model osteoporosis yang digabungkan dengan penyakit Alzheimer, tiga kumpulan model ovariektomi (kumpulan OVX), pembedahan sham dengan suntikan intraperitoneal 150 mg/kg/d D-galactose dan pentadbiran intragastrik 30 mg/kg/d AlCl3 (kumpulan D), ovariektomi dengan suntikan intraperitoneal 150 mg/kg/d D-galactose dan pentadbiran intragastrik 30 mg/kg/d AlCl3 (kumpulan OVX+D) telah ditetapkan dalam kajian ini.
Oleh itu, tikus secara rawak dibahagikan kepada lapan kumpulan (n = 9 untuk setiap kumpulan) selepas 3 minggu dan dirawat secara lisan dengan ubat-ubatan selama 8 minggu: Kumpulan Sham; Kumpulan OVX; Kumpulan D; Kumpulan OVX+D; kumpulan rawatan estradiol valerate (kumpulan EV, OVX+D+0.6 mg/kg/d estradiol valerate); kumpulan rawatan donepezil HCl (kumpulan DPZ, OVX+D+0.8 mg/kg/d donepezil HCl);echinacosidekumpulan rawatan (kumpulan ECH, OVX+D+90 mg/kg/d echinacoside);acteosidekumpulan rawatan (kumpulan ACT, OVX+D+90 mg/kg/d acteoside). Menurut Prinsip Penukaran Dos Setara Manusia-Rat dan dos dari rujukan yang berkaitan (Li et al., 2013; Gao et al., 2014), dos kumpulan rawatan ubat dalam kajian ini telah diterima pakai.
Berat badan setiap tikus diukur setiap minggu. Selepas keseluruhan rawatan dengan ubat-ubatan yang berlangsung selama 8 minggu, ujian Morris Water Maze (MWM) selama 6 hari pertama kali dilakukan. Selepas itu, 6 tikus dari setiap kumpulan telah dikorbankan untuk menuai bahan-bahan tersebut. Tikus telah dibius dengan suntikan intraperitoneal 3.0 mL / kg 10% hidrat kloral, dan darah dikumpulkan dari perut aorta. Darah diletakkan pada suhu bilik untuk membeku dan di sentrifuged pada 3500 r / min selama 10 minit. Serum itu dituai dalam tiub sentrifuge 1.5 mL (NEST Biotechnology) dan disimpan pada -80°C sehingga digunakan untuk ujian biokimia. Kemudian, uteri, femora, tibiae, dan jaringan otak dikumpulkan. Uteri digunakan untuk histomorphometry. femora kanan digunakan untuk Micro-CT dan histomorphometry, masing-masing. Tibiae yang betul digunakan untuk ujian biomekanik. Hippocampus yang dikumpulkan pada kotak ais digunakan untuk ujian biokimia. Selepas itu, tiga tikus lain dari setiap kumpulan telah meresap dari jantung dengan saline dan fiksatif tisu sejagat untuk menuai otak untuk histomorphometry.
2.4. Ujian Morris Water Maze (MWM)
Tikus tertakluk kepada pembelajaran rujukan spatial dan ujian ingatan dalam ujian MWM selepas 8 minggu campur tangan. Ujian MWM dilakukan mengikut kaedah yang dilaporkan sebelum ini (Morris, 1984; Gao et al., 2016). Secara ringkas, 5 hari berturut-turut dengan empat percubaan setiap hari, tikus dilatih untuk menggunakan pelbagai isyarat visual yang terletak di dinding kolam untuk mencari platform tenggelam tersembunyi (diameter 11 cm, ketinggian 29 cm) dalam kolam bulat (diameter 130 cm, ketinggian 50 cm) dipenuhi dengan air berwarna dakwat karbon bukan toksik. Kolam ini secara imaginasi dibahagikan kepada empat kuadran, dan empat kedudukan permulaan terletak di persimpangan kuadran. Platform ini terletak di tengah-tengah salah satu kuadran dan kedudukannya tetap semasa percubaan. Dalam setiap percubaan, tikus diletakkan secara rawak di lokasi terpilih, menghadap ke arah dinding kolam. Setiap percubaan ditamatkan apabila tikus mencapai platform atau selepas 60 s, dan masa berlalu direkodkan sebagai kependaman melarikan diri. Tikus yang gagal mencapai platform telah dipandu ke atasnya. Selepas setiap percubaan platform tersembunyi, tikus kekal di platform selama 10 s. Purata masa kependaman empat kajian setiap hari dikira sebagai keputusan latihan. Pada hari ke-6, semua tikus tertakluk kepada percubaan siasatan di mana mereka berenang selama 60 s di kolam renang tanpa platform. Masa persimpangan di lokasi platform dan masa perjalanan dalam kuadran sasaran telah direkodkan sebagai keputusan akhir. Tikus dipantau oleh kamera yang dipasang di siling tepat di atas kolam, dan semua percubaan telah direkodkan dan dianalisis menggunakan program MORRIS MAZE yang dibekalkan oleh pembangunan sains dan teknologi Zhongshidichuang Beijing Co., Ltd. (Beijing, China)
2.5. Ujian biokimia oleh ELISA
Menurut arahan pengeluar kit ELISA, aktiviti phosphatase alkali khusus tulang (BALP), aktiviti phosphatase asid tahan tartrate (TRAP), aktiviti dismutase superoksida (SOD), dan kandungan malondialdehid (MDA) dalam serum telah diuji oleh pembaca mikroplate pelbagai mod BioTek Synergy 2 (BioTek, Amerika Syarikat). Tisu hippocampus dari setiap kumpulan dibasuh dengan PBS (0.01 M, pH 7.4) untuk mengeluarkan darah atau kekotoran yang tinggal di permukaan tisu. Tisu hippocampus di satu sisi ditimbang dan kemudian dipotong sekecil mungkin. Tisu hippocampus homogenisasi mengikut nisbah 1: 9 (berat tisu: isipadu PBS). homogenat di sentrifuged pada 4 ° C, 3000 r / min selama 15 minit. Supernatant dikumpulkan dan dicairkan untuk mengukur kepekatan protein dengan kaedah BCA. Aktiviti acetylcholinesterase (AChE), aktiviti choline acetyltransferase (ChAT), aktiviti superoksida dismutase (SOD), dan kandungan malondialdehid (MDA) dalam tisu hippocampus kemudian diuji oleh kaedah ELISA.
2.6. Hippocampus histomorphometry
Tisu otak (n = 3 / kumpulan) telah diperbaiki dalam fiksatif tisu sejagat. Sampel tisu otak kemudiannya dibasuh, dehidrasi dengan etanol kecerunan, tertanam dengan lilin parafin, dan dihiris ke dalam bahagian koronal 5 μm. Bahagian-bahagian itu diwarnai dengan hematoxylin dan eosin (HE). Selepas itu, bahagian koronal tisu otak difoto oleh mikroskop pendarfluor terbalik (Nikon, Jepun). Perubahan morfologi CA1, CA2, CA3, dan KP di hippocampus terutamanya diperhatikan.
2.7. Histomorphometry rahim dan morfemetri
Uteri yang dipilih (n = 3 / kumpulan) telah ditetapkan dalam fiksatif tisu sejagat. Sampel tisu rahim kemudiannya dibasuh, dehidrasi dengan etanol kecerunan, tertanam dengan lilin parafin, dan dihiris ke bahagian melintang 5 μm. Bahagian-bahagian itu diwarnai dengan hematoxylin dan eosin (HE). Bahagian melintang uteri diperhatikan dan difoto. Lima bidang pandangan dipilih secara rawak, diameter bahagian melintang rahim dan ketebalan epitel mukosa mukosa rahim kemudian diukur menggunakan perisian Image-Pro Plus 6.0. Bilangan kelenjar rahim dalam propria lamina juga dikira.
2.8. Micro-CT
femora kanan yang dipilih (n = 3 / kumpulan) diimbas dalam kedudukan dengan jarak objek ke sumber 121 mm dan jarak kamera ke sumber 171 mm menggunakan tomografi berkomputer X-ray mikro SkyScan 1176 (Micro-CT) pengimbas (Bruker, Jerman). Plat pertumbuhan distal dipilih sebagai permukaan rujukan. Dengan jarak 1 mm di bawah permukaan rujukan, kawasan tebal 1.8 mm dipilih sebagai jumlah minat (VOI, 100 lapisan). Imej skala kelabu yang dihasilkan mempunyai saiz piksel 17.76 μm dari pembinaan semula tulang (65 kV, 385 μA). Kaedah kontur separa automatik digunakan untuk memilih trabeculae dari tulang kortikal. Kaedah pengukuran 3D langsung digunakan untuk menilai peratus isipadu tulang (BV / TV), ketumpatan permukaan tulang (BS / TV), pemisahan trabecular (Tb. Sp), nombor trabecular (Tb. N), ketebalan trabecular (Tb. Th), indeks model struktur (SMI), faktor corak trabecular (Tb. Pd) dan ketumpatan mineral tulang min (min BMD) untuk VOI yang sama menggunakanCTProgram penganalisis (Bruker, Jerman). Penggambaran 3D VOI menggunakan algoritma rendering adaptif dilakukan dengan perisian CTvol (Bruker, Jerman).
ekstrak tumbuhan cistanche
2.9. Histomorphometry tulang
femora kanan yang dipilih (n = 3 / kumpulan) telah diperbaiki dalam fiksatif tisu sejagat dan kemudian dinyahkalsifikasi dalam larutan 10% EDTA-2Na selama 3 minggu. Sampel yang dinyahkalsifikasi dibasuh, dehidrasi dengan etanol kecerunan, tertanam dengan lilin parafin, dan dihiris ke dalam bahagian membujur 5 μm. Bahagian-bahagian itu diwarnai dengan hematoxylin dan eosin (HE). Bahagian membujur femora telah diambil gambar. Struktur tisu tulang setiap kumpulan, terutamanya struktur tulang trabecular, diperhatikan.
2.10. Ujian biomekanik
Tibiae kanan (n = 4 / kumpulan) yang dipilih secara rawak dinilai untuk ujian lenturan tiga mata menggunakan mesin ujian sejagat (SHIMADZU, Jepun). Diameter sampel ini diukur oleh caliper vernier dalam julat 2.16-2.38 mm (d). Sampel kemudian diletakkan pada dua palang sokongan dengan jarak 25 mm (L) antara kedua-dua rel dan kelengkungan fisiologi spesimen adalah ke atas. Batang pemuatan beban terletak di tengah-tengah spesimen dan jatuh pada kadar malar 1.5 mm / min sehingga spesimen dipecahkan. Data daya (F) dan anjakan secara automatik direkodkan ke dalam komputer yang telah dimukapkan ke mesin ujian dan lengkung ubah bentuk beban telah diplotkan secara serentak. Nilai beban maksimum (N) dan penyerapan tenaga (mJ) direkodkan oleh perisian ujian bahan TRAPEZIUM X pada masa yang sama. Nilai tekanan maksimum (MPa) dikira mengikut formula berikut: Tekanan (σ) = momen lenturan (M) / Faktor bahagian (Z) = (8×L×F) / (π×d3 )
2.11. Analisis statistik
Hasil kumpulan model dibandingkan dengan kumpulan Sham, dan kumpulan yang dirawat ubat dibandingkan dengan kumpulan OVX+D. Data dianalisis menggunakan ANOVA sehala diikuti oleh ujian perbandingan berganda Bonferroni menggunakan perisian Graph Pad Prism 5.0. Data dinyatakan sebagai purata ± SD, dan nilai P kurang daripada 0.05 dianggap penting secara statistik.
myricetinDancistanche
