Hubungi:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Sila klik di sini untuk Bahagian 2

I-Fang Wang,1,2 Yihan Wang,2 Yi-Hua Yang,1,3,4 Guo-Jen Huang,5,6 Kuen-Jer Tsai,3,4,* dan Che-Kun James Shen1,2,7 ,*

1Institut Siswazah Perubatan Regeneratif Neural, Kolej Sains Perubatan dan Teknologi, Universiti Perubatan Taipei, Taipei 11031, Taiwan

2Institut Biologi Molekul, Academia Sinica, Taipei 11529, Taiwan

3Institut Perubatan Klinikal, Kolej Perubatan, Universiti Cheng Kung Nasional, Tainan 70403, Taiwan

4Pusat Penyelidikan Perubatan Klinikal, Hospital Universiti Cheng Kung Nasional, Kolej Perubatan, Universiti Cheng Kung Kebangsaan, Tainan 70403, Taiwan

5Jabatan dan Institut Sains Bioperubatan Siswazah, Kolej Perubatan, Universiti Chang Gung, Taoyuan 33302, Taiwan

6Pusat Penyelidikan Neurosains, Hospital Memorial Chang Gung, Linkou 33302, Taiwan

7Pimpin kenalan

*Surat menyurat: kjtsai@mail.ncku.edu.tw (K.-JT), ckshen@tmu.edu.tw (C.-KJS)

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109477

Cistanche boleh meningkatkan daya ingatan

RINGKASAN

Variasi fenotip adalah prasyarat asas untuk evolusi sel dan organisma melalui pemilihan semula jadi. Walaupun peranan ekspresi gen stokastik dalam kepelbagaian fenotip sel yang serupa secara genetik dikaji dengan baik, tidak banyak yang diketahui mengenai hubungan antara ekspresi gen stokastik dan variasi tingkah laku individu dalam haiwan. Kami menunjukkan bahawa miRNA tertentu (miR-466f-3p) dikawal selia dalam hippocampus sebahagian tikus baka individu atas tugasan maze air Morris. Secara ketara, miR- 466f-3p secara positif mengawal morfologi neuron, fungsi dan pembelajaran spatial, daningatankeupayaan tikus. Secara mekanikal, miR-466f-3p menindas terjemahan MEF2A, pengawal selia negatif pembelajaran/ingatan. Akhir sekali, kami menunjukkan bahawa regulasi pelbagai miR-466f-3p hippocampal terhasil daripada fosforilasi rawak AMP kitaran hippocampal (cAMP)-pengikat unsur tindak balas (CREB) dalam individu. Penemuan modulasi pembelajaran spatial daningatanmelalui paksi isyarat hippocampal rawak pada rangsangan neuron mewakili demonstrasi bagaimana variasi dalam ekspresi gen tisu membawa kepada tingkah laku haiwan yang berbeza-beza.

PENGENALAN

Variasi fenotip di kalangan individu memberikan kelebihan evolusi kerana ia menyediakan kepelbagaian populasi yang bertindak pemilihan semula jadi (Pavlicev et al., 2011). Latar belakang genetik dan faktor persekitaran menyumbang kepada penjanaan variasi semula jadi tersebut (Bendesky dan Bargmann, 2011). Secara eksperimen, tikus inbred sering digunakan untuk mengkaji asas molekul dan selular bagi fenotip dan tingkah laku purata untuk meminimumkan kesan perbezaan genetik di kalangan individu yang diuji (Casellas, 2011). Walau bagaimanapun, variasi kelimpahan transkrip tisu telah ditunjukkan antara tikus isogenik individu. Gen yang mempamerkan tahap ekspresi yang sangat berubah-ubah sering dikaitkan dengan fungsi imun, tindak balas tekanan, dan peraturan hormon, iaitu, proses sensitif kepada isyarat persekitaran (Vedell et al., 2011). Beberapa kajian ini juga menunjukkan bahawa perbezaan dalam ekspresi gen atau isyarat selular, dengan atau tanpa pengaruh faktor persekitaran seperti jilat ibu, penyediaan nutrien dalam rahim, atau daya tahan yang disebabkan oleh tekanan berbanding kerentanan (Bale, 2015; Danchin et al. ., 2011; Lorsch

et al., 2019; Pedersen et al., 2011), boleh membawa kepada perbezaan dalam fenotip dan tingkah laku (Casellas, 2011; Locke et al., 2015; Loos et al., 2015; Oey et al., 2015).

Pembelajaran ruang daningatanpembentukan dikawal oleh otak boleh dipisahkan kepada dua sistem: (1) navigasi egosentrik menggunakan pergerakan diri dan isyarat dalaman dan (2) navigasi alosentrik terutamanya melibatkan hippocampus dan struktur otak berdekatan yang dirangsang oleh isyarat distal di luar organisma (Ekstrom). et al., 2014). Keupayaan pembelajaran spatial daningatanmembolehkan kebanyakan spesies haiwan menyesuaikan tingkah laku mereka secara progresif untuk menyesuaikan diri dalam persekitaran berubah-ubah secara spatial dan sementara, yang penting untuk kemandirian mereka. Ini boleh dinilai dalam haiwan makmal dengan menggunakan paradigma tingkah laku seperti Morris water maze (MWM) (Vorhees dan Williams, 2014). Terutama, tikus inbred yang serupa secara genetik telah ditunjukkan untuk mempamerkan variasi fenotip dalam pembelajaran spatial daningatan(Tsai et al., 2002), tetapi mekanisme asas variasi tingkah laku ini masih tidak diketahui.

Pembentukan ingatan baru adalah proses kompleks yang memerlukan transkripsi gen yang bergantung kepada aktiviti, sintesis protein baru, dan

Rajah 1. Korelasi antara variasi pembelajaran spatial daningatankeupayaan dan induksi miR-466f-3p

(A) Tugas MWM tikus C57BL/6J baka jenis liar. Panel kiri: Persembahan MWM tikus GLN (titik) dan tikus PLN (segi empat sama). Daripada sejumlah 289 tetikus yang diuji, 180 telah dikategorikan sebagaiGLNand109sebagai PLN.Panel kanan:probetestoftheMWMtask(n=47dan30insetiap kumpulan). Meandurationsspentineachofempatkuadran dan rantau platform dibandingkan dalam histogram. P, tempat platform yang hilang; T, zon sasaran tanpa P; R, zon kanan; O, zon bertentangan; L, zon kiri. ( B ) Analisis RT-qPCR ekspresi miRNA. Tahap ekspresi relatif enam miRNA yang terletak dalam kelompok miR-466-669 dan miR-132-3p, sebagai kawalan positif yang diperkaya otak, telah dianalisis dan dinormalisasi dengan kawalan dalaman U6 snRNA daripada GLN dan hippocampus tetikus PLN (n=9–18 setiap kumpulan). I, miR-466f- 3p; II, miR{18}}g; III, miR-466i-3p; IV, miR-467b-3p; V, miR-467f; VI, miR-669f; VII, miR-132-3hlm.

rangkaian neuron khusus yang ditala dengan baik sebagaiingatanengrams untuk membuat sambungan neuron baharu dan keplastikan yang berterusan (Asok et al., 2019). Hippocampal engrams, yang merupakan populasi neuron yang jarang dalam dentate gyrus (DG), mewakili ensembel neuron yang memaparkan peningkatan aktiviti selepasingatanpembentukan. Walaupun neuron engram DG mempamerkan corak ekspresi gen yang sangat berbeza (Rao-Ruiz et al., 2019), mekanisme molekul khusus engram yang mendasariingatanpenyatuan masih tidak diketahui. Pelbagai faktor dan laluan isyarat diketahui sama ada secara positif atau negatif mengawal pembelajaran daningatanproses telah dikenal pasti (Abraham et al., 2019; Humeau dan Choquet, 2019). Antaranya, bentuk protein pengikat unsur (CREB) kitaran kitaran (cAMP) yang diaktifkan merangsang transkripsi gen sebagai tindak balas kepada lipatan Ca2 intraselular yang bergantung kepada aktiviti dalam neuron (Kandel, 2012). Sebaliknya, aktiviti transkripsi kem/PKApathwayrepressesmyocyteenhancer factor 2 (MEF2) dengan menghalang eksport nuklear penindas bersamanya, HDAC5, dan import nuklear penggerak bersama NFAT (Belfield et al., 2006). Tambahan pula, tidak seperti CREB, kekangan aktiviti MEF2Aingatanpembentukan (Cole et al., 2012). Selain daripada faktor protein, mikroRNA (miRNA) juga terlibat dalam mengawal selia fungsi neuron, termasuk pembelajaran dan ingatan (McNeill dan Van Vactor, 2012). miRNA adalah kecil (22 nt) bukan pengekodanRNA yang terutamanya pengawal selia aktaspost-transkripsi ekspresi gen melalui pasangan asas khusus jujukan dengan tapak pengecamannya di 30 kawasan yang tidak diterjemahkan (30 UTR) mRNA tertentu (Daugaard dan Hansen, 2017). miRNA mengambil bahagian dalam pelbagai laluan isyarat dalam neuron pasca-mitotik, dan mereka mengantara proses selular yang bergantung kepada aktiviti, termasuk pertumbuhan dan percabangan dendritik, pembentukan sinaps dan kematangan. Dengan mengawal selia ekspresi gen, mereka juga memainkan peranan penting dalam bentuk keplastikan sinaptik tahan lama yang mendasariingatanpembentukan, perolehan semula, dan penyatuan (Chen dan Shen, 2013; Wang et al., 2012b).

Dalam perkara berikut, kami membentangkan bukti untuk hubungan penyebab antara ekspresi gen tisu stokastik dan variasi tingkah laku individu dalam haiwan. Khususnya, kami menunjukkan bahawa pengaktifan stokastik paksi CREB-pCREB / miR- 466f-3p-MEF2A hippocampal memodulasi variasi individu pembelajaran spatial daningatankeupayaan dalam tikus inbred.

KEPUTUSAN

Variasi individu pembelajaran spatial daningatankeupayaan dikaitkan dengan induksi miR-466f-3p daripada gugusan miRNA tertentu

Untuk mengenal pasti miRNA yang terlibat dalam peraturan pembelajaran daningatanpembentukan, kami menggunakan tugas MWM untuk membezakan tikus jenis liar inbred C57BL/6J dengan keupayaan pembelajaran dan ingatan yang baik atau lemah (Rajah 1A). Kami mentakrifkan tikus yang menyelesaikan tugasan dalam masa 30 saat dalam sesi terakhir (ke-6) sebagai ''pembelajar yang baik'' (GLN), manakala tikus yang tidak dapat menjumpai platform dalam masa 30 saat dalam sesi terakhir dianggap sebagai ''pelajar yang lemah' ' (PLN). Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1A (panel kiri), 62 peratus daripada tikus tergolong dalam kumpulan GLN (180 daripada 289 tikus), menunjukkan pengurangan ketara dalam kependaman melarikan diri daripada 98.1 s (sesi pertama) kepada 21.8 s (sesi ke-6). Sebaliknya, kependaman melarikan diri baki 38 peratus tikus, kumpulan PLN (109 daripada 289 tikus), hanya dikurangkan secara sederhana antara sesi pertama dan keenam (daripada 111.8 saat dalam sesi pertama kepada 82.1 saat dalam sesi ke-6) . Ujian siasatan, yang menunjukkan bahawa tikus sememangnya telah mempelajari tugas selama enam sesi, juga menunjukkan bahawa tikus GLN tinggal lebih lama di kawasan platform berbanding tikus PLN (Rajah 1A, sepasang bar kiri di panel kanan).

Seterusnya, kami menganalisis RNA daripada hippocampus tikus GLN dan PLN dengan hibridisasi mikroarray miRNA (n=4 setiap kumpulan). Secara umum, kami melihat perbezaan yang agak kecil dalam profil ekspresi miRNA hippocampal daripada tikus GLN dan PLN. Walau bagaimanapun, kami menyatakan bahawa 10 miRNA teratas yang tahap ekspresinya lebih tinggi dalam tikus GLN daripada tikus PLN (data tidak ditunjukkan) semuanya diperoleh daripada kelompok miRNA khusus tikus yang sama, miR-466-669, yang terletak dalam intron 10 daripada gen mSfmbt2 (lihat di bawah). Berdasarkan analisis tindak balas rantai polimerase kuantitatif transkripsi terbalik (RT-qPCR) tahap ekspresi miRNA terpilih dalam kelompok, kami memilih miR-466f-3p untuk siasatan lanjut (Rajah 1B). Purata ungkapan miRNA ini ialah 1.5-kali ganda lebih tinggi dalam hippocampus tikus GLN berbanding tikus PLN. Terutamanya, tahap purata hippocampal miR-466f-3p adalah serupa dalam kalangan kumpulan PLN, kumpulan kawalan sangkar rumah (HC) dan kumpulan kawalan renang (Rajah 1C), dengan itu tidak termasuk kesan berkaitan senaman semasa berenang dan seterusnya menyokong idea bahawa miR-466f-3p telah didorong semasa pembelajaran spatial daningatanpembentukan.

Dalam Rajah 1C, data mendedahkan bahawa tahap ekspresi miR-466f-3p hippocampal daripada lebih 42 peratus tikus GLN adalah sekurang-kurangnya 1.5-kali ganda lebih tinggi daripada tahap ekspresi purata bagi Tikus kawalan HC, manakala tahap dalam 15 peratus tikus PLN adalah separuh daripada tikus HC. Kira-kira 25 peratus tikus GLN dan 55 peratus tikus PLN mempunyai tahap miR-466f{{{10}}} yang serupa (0.8- hingga 1.2- kali ganda berbanding HC). Plot serakan korelasi Pearson yang menunjukkan korelasi positif antara tahap miR-466f-3p dan tempoh peratusan pada platform semasa ujian siasatan ditunjukkan dalam Rajah 1D. Kami juga melakukan miR-466f-3p dan U6 RNA nuklear kecil (snRNA) in situ hibridisasi (ISH) hirisan otak dalam kedua-dua tikus GLN dan PLN (Rajah 1E). Analisis statistik isyarat miR- 466f-3p melalui ISH mengesahkan bahawa aruhan miR-466f- 3p sememangnya lebih besar dalam DG tikus GLN berbanding dengan

Tikus PLN, sedangkan tiada perbezaan ditemui apabila isyarat snRNA U6 dibandingkan (histogram kanan, Rajah 1E). Walaupun isyarat miR-466-3p tidak sama di antara sel granul individu dalam DG, ia masih meningkat dengan ketara dan di mana-mana dalam hippocampus tikus GLN berbanding tikus PLN. Oleh itu, aruhan miR-466f-3p tidak berlaku hanya dalam sebahagian kecil sel, contohnya, neuron engram. Data ini menunjukkan bahawa penyelarasan miR-466f-3p semasa tugasan MWM berkait rapat dengan pembelajaran spatial daningatankeupayaan di kalangan sebahagian besar tikus GLN.

Kami juga menganalisis tahap ekspresi purata beberapa miRNA khusus otak oleh RT-qPCR. Antaranya, miR-132-3p telah dikawal selia dalam hippocampus tetikus selepas tugas MWM, tetapi kami tidak melihat perbezaan yang ketara antara kumpulan GLN dan PLN (pasangan bar VII, Rajah 1B). Tahap ungkapan miR-335-5p dan miR-22 adalah serupa antara kumpulan GLN, PLN dan HC (Rajah S1A). Oleh itu, tidak seperti miR-466f-3p, ekspresi hippocampal miRNA ini semasa latihan MWM tidak dikaitkan dengan pembelajaran spatial daningatankeupayaan tikus.

regulasi miR-466f-3p menggalakkan pertumbuhan neurit dan pembentukan tulang belakang dendritik

Untuk mengesahkan bahawa miR-466f-3p memang dinyatakan dalam neuron, kami melakukan miRNA ISH digabungkan dengan pewarnaan imunofluoresensi (IF) NeuN dan MAP2 dalam neuron hippocampal primer. Keputusan menunjukkan bahawa sama dengan miRNA lain (Cohen et al., 2011; Thomas et al., 2017), miR-466f-3p terutamanya dinyatakan dalam rantau soma neuron, dengan beberapa isyarat tambahan dalam dendrit (Rajah S2A). Untuk memahami asas molekul dan selular perkaitan miR-466f-3p terkawal dengan pembelajaran daningatanpembentukan, kami mula-mula mengekspresikan secara sementara miR-466f-3p bersama-sama polipeptida gabungan dsRed di bawah kawalan promoter ubiquitin daripada pFUGW- miR-466f-3p- Plasmid dsRed ke dalam neuron hippocampal primer DIV10 (Rajah S2B). Melalui miRNA ISH, kami mengesahkan bahawa isyarat miR-466f-3p lebih kuat dalam kumpulan ekspresi berlebihan miR-466f-3p berbanding kawalan vektor atau miR mutan{{ 12}}f-3p kumpulan (anak panah, Rajah S2B). Secara selari, kami juga menubuhkan platform untuk mengkaji kesan miR-466f-3p kehilangan fungsi melalui perencatan miR-466f-3p menggunakan miR-span yang terletak di 30 UTR mRNA EGFP dinyatakan daripada plasmid pFUGW-miR-sponge- EGFP (Rajah S2C). Wartawan EGFP dalam plasmid span berfungsi sebagai penunjuk kecekapan transfeksi dan penderia aktiviti miRNA selular (Kluiver et al., 2012). Dalam sebahagian besar sel HEK293T yang ditransfeksi, isyarat EGFP berkurangan apabila ekspresi bersama dengan miR-466f-3p jenis liar, tetapi tidak dengan miR{31}}f{{32} }}p, disebabkan oleh perencatan terjemahan mRNA EGFP dengan mengikat miR-466f-3p ke miR- span dalam 30 UTR (bandingkan empat imej kiri dan dua program his-, Rajah S2C) . Sebaliknya, kami tidak memerhatikan penurunan isyarat EGFP apabila ekspresi bersama pengekodan span kawalan lapan salinan jujukan yang dikacau daripada plasmid pFUGW-SCR-span-EGFP dengan sama ada miR-466f-3p atau mutannya (bandingkan empat imej kanan dan dua histogram).

Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2A, ekspresi ektopik miR-466f-3p semula menghasilkan perubahan morfologi neuron, terutamanya peningkatan pertumbuhan neurit berbanding neuron kawalan yang ditransfeksi dengan vektor pengekspres dsRed pFUGW- dsRed atau mutant miR-466f-3p-expressing plasmid pFUGW-mut-miR- 466f-3p-dsRed. Data pengiraan menunjukkan bahawa purata nombor cawangan dendritik bagi setiap neuron tidak berbeza dengan ketara antara miR-466f{15}}kumpulan p-overexpressing (bar II) dan kawalan vektor atau mutan (bar I dan III) (kanan histogram atas, Rajah 2A). Walau bagaimanapun, purata jumlah panjang dendrit dan purata panjang dendrit primer meningkat apabila miR-466f-3p lebih ekspresi (bandingkan bar II dengan bar I dan III, histogram kanan bawah Rajah 2A). Secara selari, kami menghalang miR-466f-3p endogen menggunakan miR-span. Seperti yang dilihat, tiada perbezaan yang ketara dalam nombor cawangan dendritik antara miR-466f-3p-perencatan dan kumpulan kawalan (bandingkan bar IV dengan bar I dan V, histogram atas kanan, Rajah 2A) , tetapi kumpulan perencatan miR-466f-3p menunjukkan pengurangan ketara dalam jumlah panjang dendrit serta min panjang dendrit primer dan sekunder berbanding kumpulan lain (bandingkan bar IV dengan bar I dan V, histogram bawah kanan Rajah 2A). Tambahan pula, pewarnaan IF menunjukkan bahawa ekspresi berlebihan miR- 466f-3p, tetapi bukan perencatan, juga meningkatkan ketumpatan duri dendritik (Rajah 2B, panel atas dan histogram kiri bawah). Kami juga melakukan pengecatan bersama untuk protein ketumpatan postsinaptik 95 (PSD-95) dan mengira ketumpatan duri dendritik kolokalisasi untuk mewujudkan bilangan tepat sinaps pengujaan (Rajah 2B, histogram kanan bawah), yang mendedahkan bahawa miR{{40 }}f-3p ekspresi berlebihan meningkatkan ketumpatan PSD-95-duri positif berbanding kumpulan kawalan lain. Walau bagaimanapun, perencatan miR-466f-3p tidak mengubah ketumpatan spina positif J-95-positif JPA dengan ketara terhadap kumpulan kawalan (Rajah 2B, histogram kanan bawah). Bersama-sama, data ini menunjukkan bahawa jika tiada rangsangan neuron, perencatan miR-466f-3p sahaja tidak menjejaskan ketumpatan sinaps pengujaan atau jumlah duri dendritik.