Pemprofilan Metabolomik Berasaskan NMR Untuk Penghapusan Radikal Dan Sifat Anti-Penuaan Bahagian 2

Sila hubungioscar.xiao@wecistanche.comuntuk maklumat lanjut

2.5. Klasifikasi Ekstrak Herba Mengikut Analisis Komponen Utama

Variasi metabolit antara daun herba yang diuji selanjutnya dianalisis menggunakan analisis data multivariate (MVDA). Analisis komponen utama (PCA), kaedah pengecaman corak, ialah MVDA tanpa seliaan yang memberikan pemahaman utama tentang perkaitan antara sampel. Plot skor PCA menunjukkan pemisahan herba kepada kelompok, manakala plot pemuatan menyerlahkan metabolit yang menyediakan pengasingan [85,86]. Model PCA mempamerkan kecergasan yang baik (R2X=0.997)dan kebolehramalan yang tinggi (Q2=0.993)di mana variasi antara R2X(rangkap) dan Q2(rangkap) adalah kurang daripada 0 .3, dengan itu menunjukkan bahawa setiap ekstrak herba secara sama rata dan sama rata menyumbang kepada pemisahan kumpulan yang diperhatikan. Pemerhatian ini adalah sejajar dengan Wheelock et al. [87].

Sila klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

Plot skor analisis komponen utama menunjukkan bahawa herba terpilih dipisahkan kepada dua kelompok tanpa sebarang penyimpangan yang luar biasa seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4A. Komponen utama (PC)1 mempamerkan variasi sampel yang paling besar, kemudian diikuti oleh PC2. PC1 dan PC2 menyumbang kepada peratusan varians masing-masing pada 29.7 peratus dan 24.9 peratus. Oleh itu, jumlah varians kira-kira 54.6 peratus telah diterangkan oleh PC ini. Keputusan daripada plot lajur pemuatan mendedahkan metabolit yang bertanggungjawab untuk pemisahan herba ke bahagian positif PC1(V.negundo dan C.longa) dan bahagian negatif PC1 (P. tolak, P. indica, O.javanica dan C. caudatus)(Rajah 4B).

Data daripada plot lajur pemuatan PC1 mendapati bahawa sebatian fenolik, terutamanya kumpulan flavonoid dan asid fenolik, bertanggungjawab untuk pengasingan herba terpilih. Quercetin (1), quercetin-3-O-rhamnoside (2), quercetin-3-O-glucoside (3), quercetin-3-O-glucuronide (4), quercetin-3- O-arabinofuranoside (5), rutin (6), derivatif mvricetin (7), katekin (8), epicatechin (9), isorhamnetin (10), astragalin (11), asid klorogenik (12), asid gallic (13), kandungan asid kuumarik (14), asid askorbik (15), asid formik (21), asid fumarik (22), 3-metilxanthine (26) dan apigenin (28) kebanyakannya lebih tinggi dalam P. tolak, P. indica , C. caudatus dan O.javanica kerana ia terletak di bahagian negatif plot. Sebaliknya, V.negundo dan C.longa dibezakan daripada herba lain dengan kehadiran serotonin (27) dan D-limonene (29) dalam ekstrak mereka.

2.6. Korelasi antara Bioaktioiti dan Metabolit Menggunakan Analisis Kuasa Dua Separa (PLS)

Untuk memahami perkaitan antara bioaktiviti yang diukur dan metabolit yang terdapat dalam herba yang diuji, PLS, sebagai metodologi MVDA yang diselia, telah dilaksanakan untuk mengaitkan data pembolehubah bebas (anjakan kimia NMR metabolit) dengan data pembolehubah bersandar, yang adalah perencatan ujian DPPH, ABTS dan ORAC, serta aktiviti anti-elastase dan anti-kolagenase. Metodologi ini digunakan kerana PLS mempunyai pencapaian yang hebat untuk menghubungkan bioaktiviti yang diuji dengan metabolit, dengan itu boleh menyediakan model untuk ramalan [88]. Melalui analisis PLS, hubungan antara bioaktiviti seperti aktiviti penghapusan radikal dan sifat anti-penuaan dengan metabolit dalam sampel boleh diwujudkan. Oleh itu, metabolit yang bertanggungjawab sebagai penanda bioaktif kemudiannya boleh dicadangkan.

Biplot adalah campuran skor dan plot pemuatan hasil daripada analisis PLS, seperti yang dilaporkan oleh Mediani et al. [80]. Biplot separa kuasa dua terkecil untuk aktiviti penghapusan radikal (Rajah5A) dan sifat anti-penuaan (Rajah 5B) menunjukkan bahawa semua sampel telah diasingkan dengan baik dan berkelompok tanpa outlier yang ketara. PC1 memisahkan daun P. minus, C.caudatus, dan P. indica daripada V. negundo, O.jaoanica, dan C.longa. Berdasarkan aktiviti penghapusan radikal dan sifat anti-penuaan biplot, model tersebut mempersembahkan nilai kecergasan (R'Y) yang baik bagi {{10}}.988 dan 0.966, masing-masing. Sementara itu, kebolehramalan (Q4) untuk aktiviti penghapusan radikal dan sifat anti-penuaan masing-masing pada 0.984 dan 0.951.

Seperti yang ditunjukkan daripada biplot PLS aktiviti pemusnahan radikal (Rajah 5A), bioaktiviti (DPPH, ABTS, dan ORACassay) diarahkan ke sisi positif biplot, yang merupakan kawasan paling aktif dan paling hampir dengan P.minus, P. indica dan C.caudatus. Sebaliknya, V. negundo, O.javanica, dan C. longa diarahkan ke sisi negatif biplot, yang dianggap sebagai kawasan paling kurang aktif dan jauh dari ujian DPPH, ABTS, dan ORAC, dan menunjukkan korelasi negatif dengan bioaktiviti. Dalam keadaan ini, P. mimus, P. indica, dan C.caudatus telah berkumpul selain daripada herba yang paling kurang aktif, menunjukkan bahawa herba ini mempamerkan kesan pemusnahan radikal yang lebih kuat, dengan itu menunjukkan bahawa ekstrak herba ini mungkin mengandungi tahap fenolik yang lebih tinggi. sebatian. Antara tiga herba yang paling aktif, P. minus didapati lebih kuat berkorelasi dengan ujian DPPH dan ABTS, diikuti dengan ujian ORAC.

Penemuan ini adalah bersetuju dengan hasil in vitro aktiviti pemusnahan radikal yang telah dilakukan. Keputusan menunjukkan bahawa P. minus mempamerkan kesan penghapusan radikal bebas yang kuat berbanding dengan herba lain. Hasilnya menunjukkan bahawa P. minus adalah herba yang paling aktif untuk pembasmi spesies oksigen reaktif. Metabolit sekunder penting yang menyumbang kepada aktiviti penghapusan radikal P. minus dikenal pasti sebagai kuersetin, kuersetin-3-O-rhamnoside, katekin, isorhamnetin, astragalin dan apigenin.oteflavonoidKesemua metabolit ini terletak lebih dekat dengan P. tolak dan juga kepada ujian penghapusan radikal DPPH dan ABTS. Kajian terdahulu oleh Mediani et al.[80] juga mendapati bahawa sampel tumbuhan yang dikeringkan beku menunjukkan jumlah -glukosa, -glukosa, katekin dan asid klorogenik yang lebih tinggi, yang mungkin telah menyumbang kepada kapasiti pemusnahan radikal DPPH yang kuat bagi herba tersebut. Walau bagaimanapun, kesan pemusnahan radikal P.minus yang tinggi juga boleh disumbangkan oleh metabolit yang tidak dikenal pasti dalam ekstrak.

Penemuan yang sama juga didapati untuk sifat anti-penuaan. Rajah 5B membentangkan biplot yang diperoleh daripada PLS sifat anti-penuaan. Bioaktiviti (aktiviti anti-elastase dan anti-kolagenase) diunjurkan pada sisi positif biplot, yang merupakan kawasan paling aktif dan lebih dekat dengan P.minus, P. indica, dan C.caudatus. Sebaliknya, V.negundo, O.javanica, dan C.longa diarahkan ke bahagian negatif biplot, yang dianggap sebagai kawasan paling kurang aktif dan lebih jauh daripada aktiviti anti-elastase dan anti-kolagenase. Ini menunjukkan korelasi negatif atau lebih lemah kepada bioaktiviti. Dalam keadaan ini, P.mimus, P.indica, dan C. caudatus dikelompokkan selain daripada herba yang paling kurang aktif, menunjukkan bahawa ekstrak herba ini mempamerkan perencatan elastase dan kolagenase yang lebih besar. Antara tiga herba yang paling aktif, P. minus sekali lagi didapati mempunyai korelasi yang kuat dengan sifat anti-penuaan ini berbanding dengan herba lain.

Penemuan ini adalah bersetuju dengan hasil in vitro sifat anti-penuaan yang telah dilakukan sebelum ini. Keputusan menunjukkan bahawa P.minus adalah herba yang paling aktif untuk menghalang enzim elastase dan kolagenase. Metabolit sekunder penting yang menyumbang kepada sifat antipenuaan P. minus dikenal pasti sebagai quercetin, quercetin-3-O-rhamnoside, derivatif miricetin, catechin, isorhamnetin, astragalin dan apigenin. Metabolit lain seperti -glukosa, -glukosa, asid fumarik, dan asid lemak mungkin juga bertanggungjawab untuk bioaktiviti. Semua metabolit ini terletak lebih dekat dengan P. minus dan kepada aktiviti anti-elastase dan anti-kolagenase.

Cistanche boleh anti-penuaan

Diskriminasi herba terpilih ini adalah selaras dengan sampel aktiviti penghapusan radikal yang tinggi terutamanya. tolak, P.India dan C.caudatus, yang dijangka akan didiskriminasikan daripada yang lain kerana kepekatan metabolit sekunder yang tinggi, terutamanya flavonoid, Kehadiran sebatian fenolik ini juga dipercayai menyumbang kepada aktiviti perencatan elastase dan kolagenase yang lebih besar. herba ini [67-79,89-92].

Sumbangan sebatian bioaktif ekstrak tumbuhan terhadap keupayaan penghapusan radikal bebas dan aktiviti anti-penuaan telah didokumenkan oleh pelbagai kajian [66,72,75,79,92-101]. Selain itu, metabolit seperti flavonoid (quercetin, kaempferol, myricetin, epicatechin, dan catechin) dan fenol lain seperti resveratrol dan procyanidin B2, telah terbukti menghalang elastase dan kolagenase dengan ketara [69-71,79].

Dalam kajian ini, isyarat metabolit untuk kepentingan berubah-ubah dalam nilai unjuran (VIP) telah dikenal pasti dan disemak untuk mendapatkan metabolit paling ketara yang dikaitkan dengan bioaktiviti yang diuji. Ini dilakukan untuk meningkatkan integriti keputusan yang dibentangkan di sini, yang mengkaji potensi diskriminasi metabolit yang dikenal pasti.puritans vitamin cGenerally, the metabolites signal with VIP>{{0}}.5 telah diambil kira sebagai penting untuk diskriminasi [102]. Dalam kajian ini, semua metabolit yang menyumbang kepada aktiviti penghapusan radikal dan ciri-ciri anti-penuaan boleh diklasifikasikan sebagai metabolit diskriminasi yang ketara kerana nilai VIPnya melebihi 1.0 (Jadual 2). Kedua-dua model PLSbiplots telah disahkan menggunakan 100 pilih atur rawak, untuk mengesahkan kebolehan kesahan (R2) dan ramalan (Q2) model asal dengan beberapa model, berbanding dengan kebaikan kesesuaian. R2 menggambarkan bahawa kecergasan model adalah signifikan dan menjelaskan gred pembolehubah Y dalam model, manakala Q2 menawarkan kualiti ramalan model yang serupa dengan yang dilaporkan oleh Eriksson et al. [103].

Generally, when the values of R2 and Q² are nearing 1, it reflects an improved presentation of the model in relation to goodness of fit and predictive quality [80]. In this study, R2 and Q2 values for both of the PLS models fell in the range of 0.951-0.988, which indicated outstanding goodness of fit(R2Y(cum)>0.8)and superior predictive ability (Q2(cum)>0.8). Keputusan mendedahkan bahawa semua pintasan paksi-Y R< and="" q-="" for="" the="" assays="" in="" radical="" scavenging="" activities="" and="" anti-aging="" properties="" were="" within="" the="" limits="" of=""><0.3 and=""><0.05.>sistancheNilai pintasan R2 dan Q2 berada dalam julat 0.0367-0.0872 dan-0.444 hingga-0.492, menunjukkan bahawa kedua-dua model PLS adalah sah dan tidak menunjukkan terlalu fit. Oleh itu, kedua-dua model PLS ini boleh dikategorikan sebagai model prestasi yang baik dan penemuan ini meningkatkan kebolehpercayaan model.

2.7. Kuantifikasi Relatif Metabolit Sekunder

Kuantifikasi relatif beberapa metabolit sekunder yang telah dikenal pasti daripada herba terpilih ditunjukkan dalam Rajah 6. Metabolit ini didapati kebanyakannya lebih tinggi dalam herba yang paling aktif seperti P. minus, terletak pada bahagian positif biplot, dan lebih dekat dengan hampir semua bioaktiviti yang diuji.apa itu cistancheKeputusan ini mendedahkan bahawa metabolit sekunder terutamanya daripada kumpulan flavonoid sebatian yang terdapat dalam jumlah yang tinggi dalam P. tolak mungkin telah menyumbang kepada pembasmi radikal bebas dan sifat anti-penuaan herba ini?

Apabila dibandingkan dengan struktur flavonoid yang berbeza yang boleh menyumbang kepada keberkesanannya, diperhatikan bahawa corak hidroksilasi dalam cincin B mungkin merupakan salah satu faktor penting untuk kesan perencatan metabolit pada aktiviti enzim penuaan[80] . Sim et al.[104] juga mendedahkan bahawa pada kedua-dua tahap protein dan mRNA, kesan perencatan flavonoid ini menjadi kuat dengan bilangan kumpulan yang semakin meningkat dalam cincin-B, dan mereka meneliti persatuan struktur-aktiviti beberapa flavonoid dalam MMP-1 ekspresi gen dalam fibroblas kulit manusia yang disinari UV.

3. Bahan dan Kaedah

3.1. Bahan Kimia dan Reagen

Metanol-d4 (CH3OH-d4), KH2PO4 yang tidak dideuterasi, natrium deuterium oksida (NaOD), garam natrium asid-d4 asid trimetil propionik (TSP), etanol dan metanol dibekalkan oleh Merck Millipore International (Darmstadt, Jerman). Quercetin, penimbal fosfat, 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH),2,2-azinobis(3-etil-benzotiazolin-6-asid sulfonik)[ABTS ],Trolox,potassium persulfate,2,2'-azobis(2-amidinopropane)[AAPH, epigallocatechin gallate (EGCG),penampan HEPES, enzim elastase,N-methoxy succinyl-Ala-Ala-Pro-Chloro,N -Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide dan deuterium oxide (D2O) dibekalkan oleh Sigma (Aldrich, Jerman).

3.2. Bahan Tumbuhan dan Persampelan

Daun segar O.jacanica, P. minus, dan C.longa dikumpul dari Felda Sungai Koyan Satu, Raub, dan Pahang. Daun V.negundo diperoleh daripada Institut Biosains, Universiti Putra Malaysia. Daun segar P. indica telah dituai di Taman Pertanian Universiti, Universiti Putra Malaysia, dan daun segar C. caudatus dikumpul di Institut Pertanian, Serdang, Selangor. Satu spesimen baucar herba ini telah diletakkan di herbarium, Institut Biosains, Universiti Putra Malaysia, dan setiap spesimen telah disahkan oleh ahli botani.Cistanche anti penuaanSemua daun dituai secara konsisten pada waktu pagi, pada hari yang cerah untuk memastikan kebolehpercayaan kandungan metabolit. Plot di padang terbuka untuk setiap herba dipisahkan kepada enam bahagian dan setiap sampel dikumpul daripada setiap segmen sebagai enam ulangan.

3.3.Penyediaan Contoh

Setelah dituai, daun segar dibasuh di bawah air paip yang mengalir untuk membuang semua sisa, dikeringkan dengan kertas tisu makmal, dan serta-merta dibekukan dengan nitrogen cecair untuk menghentikan semua tindak balas enzim dan mengekalkan metabolit sebelum liofilisasi. Sampel kemudian dikeringkan dalam pengering beku LABCONCO (Kansas City, MO, USA) sehingga berat dan kandungan lembapan yang konsisten mencapai di bawah 10 peratus . Semua sampel kering dikisar menggunakan pengisar makmal hingga menjadi serbuk halus dan diayak menggunakan ayak ujian makmal(ENDECOTTS LTD.London, England) bersaiz 300 um untuk mendapatkan saiz seragam. Sampel serbuk telah dibungkus dengan vakum dalam pembungkusan aluminium untuk melindunginya daripada pendedahan cahaya dan kelembapan serta disimpan pada -80 darjah sebelum analisis.

3.4. Pengekstrakan

Prosedur pengekstrakan yang diterangkan oleh Mediani et al. [105] diikuti dengan beberapa pengubahsuaian. Secara ringkas, 10 g setiap sampel serbuk direndam dalam 100 mL 60 peratus etanol dalam kelalang kon ambar dan disonikasi selama 1 jam menggunakan sonikator mandi ultrasonik (WiseClean, model WUC-D10H, Seoul, Korea) di bawah suhu terkawal (di bawah 40 darjah). . Sampel telah ditapis melalui kertas turas Whatman no.1 dan mayatnya diekstrak semula dua kali dan ditapis selepas pengekstrakan pertama selesai. Ekstrak kemudiannya dikumpulkan dan ditumpukan menggunakan penyejat berputar di bawah vakum pada 40 darjah. Bahan likat yang diperoleh kemudiannya dikeringkan secara beku menggunakan pengering beku LABCONCO untuk memastikan penyingkiran air yang menyeluruh dan disimpan pada-80 darjah sehingga digunakan selanjutnya. Akhir sekali, ekstrak kasar kering telah dicairkan kepada kepekatan yang diperlukan untuk semua penyiasatan yang dijalankan.

3.5. Aktiviti Pemusnahan Radikal DPPH

Aktiviti scavenging radikal sampel ditentukan dengan mengikuti teknik yang dibangunkan oleh Kong et al.[106], yang dibangunkan daripada kaedah yang diubah suai oleh Brand-Williams et al. [107]dengan sedikit pengubahsuaian. Secara ringkas, 50uL sampel ekstrak dalam metanol pada kepekatan yang berbeza (0 hingga 500 ug/mL) telah ditambah dengan 195uL yang disediakan baru 0.2mMmethanolic2,2-difenil-1-pelarut picrylhydrazyl (DPPH) dan disimpan. Semua sampel ujian telah disediakan dalam plat telaga 96. Proses decolourizing telah direkodkan pada 515 nm menggunakan spektrofotometer (pembaca plat mikro Biotek EL 800, Bio-Tek, Winooski, VT, Amerika Syarikat) selepas 60 minit pengeraman dalam kegelapan dan dibandingkan dengan kawalan positif dan sampel kosong. Peratusan aktiviti penghapusan radikal diukur mengikut persamaan berikut:

di mana Kawalan ialah penyerapan kawalan tanpa ekstrak tumbuhan dan Mudah ialah penyerapan ekstrak tumbuhan.

Ekstrak tumbuhan atau kepekatan kawalan positif yang menghilangkan 50 peratus DPPH radikal bebas yang stabil telah dikira sebagai IC menggunakan graf linear peratusan aktiviti penghapusan radikal terhadap

ekstrak tumbuhan/kepekatan kawalan positif. ICso yang lebih rendah menunjukkan aktiviti antioksidan yang lebih tinggi. Semua eksperimen dijalankan dalam enam replika dengan Trolox dan quercetin sebagai kawalan positif.

3.6.ABTS Radical Scavenging Assay

Untuk ujian penghapusan radikal ABTS, analisis telah dijalankan mengikut prosedur yang diterangkan oleh Arnao et al.[108] dengan beberapa pindaan. Larutan stok yang disediakan ialah larutan 7 mM ABTS tambah dan larutan kalium persulfat 2.45 mM. Untuk menyediakan penyelesaian kerja, kedua-dua larutan stok dicampur dalam kuantiti yang sama dan dibiarkan bertindak balas dalam gelap selama 16 jam pada suhu bilik. Kemudian, larutan yang berfungsi dicairkan dengan air suling untuk memperoleh penyerapan sebanyak 0.700±0.005 unit pada 734 nm menggunakan spektrofotometer (UV-1650spektrofotometer PC, Shimadzu, Kyoto, Jepun)dan dikenali sebagai penyelesaian ABTS tambah. Penyelesaian tambah ABTS baru disediakan untuk setiap ujian. Larutan ABTS tambah ini （900 μL） dibenarkan bertindak balas dengan 100 μL ekstrak herba selama 2 minit. Penyerapan kemudiannya dibaca pada 734 nm menggunakan spektrofotometer. Keluk piawai yang terdiri daripada 3.1 ug/mL hingga dan 50 ug/mL Trolox telah dibangunkan, dan hasilnya dinyatakan sebagai mg Trolox Equivalent Antioxidant Capacity/g sampel (mg TEAC/g sampel).

3.7. ORAC Radical Scavenging Assay

Ujian ORAC untuk mengukur keberkesanan penghapusan radikal peroksil telah dilaksanakan seperti yang dinyatakan oleh Huang et al. [109] menggunakan Pembaca pendarfluor plat mikro FLUOstar OPTIMA (BMG LABTECH, Ortenberg, Jerman). Setiap ekstrak herba dan Trolox(standard) disediakan dalam larutan penimbal fosfat 75 mM（PBS） pH 7.4. Dalam 96-plat mikro hitam telaga, sejumlah 150 μL fluorescein （10 nM terlarut dalam PBS） telah ditambah diikuti dengan 25 μL Trolox, ekstrak tumbuhan atau PBS sebagai kosong. Larutan ini dipipet dalam telaga tiga kali ganda. Plat mikro diinkubasi selama 15 minit pada 37 darjah dan ditutup dengan penutup. Pendarfluor diukur dengan panjang gelombang pengujaan pada 458 nm dan panjang gelombang pancaran pada 520 nm. Isyarat latar belakang ditentukan dengan mengambil ukuran setiap 90 saat.

Selepas itu, 25 uL 2,2'-azobis(2-amidinopropane)(AAPH,240 mM yang baru disediakan dalam PBS) yang baru disediakan telah diperkenalkan oleh penyuntik on-board. Pereputan pendarfluor kemudiannya diambil sehingga 90 minit menggunakan pengujaan dan panjang gelombang pelepasan yang sama. Penilaian telah dilakukan untuk kawasan di bawah lengkung untuk sampel (pendarfluor berbanding masa) tolak kawasan di bawah lengkung untuk kosong dan dibandingkan dengan lengkung piawai （25-400 μM Trolox）. Nilai ORAC yang berkaitan dengan Trolox dikira menggunakan persamaan seperti berikut:

3.8.Ujian Perencatan Elastase

Aktiviti perencatan elastase ditentukan mengikut teknik yang diterangkan oleh Krause et al.[110], dengan pengubahsuaian kecil oleh Ndlovu et al. [75]. Telaga sampel mengandungi 25 μL 0.1 M penampan HEPES （pH7.5）, 25 μL ekstrak herba （100 ug/mL）, dan 25 μL enzim elastase （1 ug/mL）. Telaga kosong hanya mengandungi 75 μL penimbal HEPES dan telaga kawalan negatif mengandungi 50 μL penimbal HEPES dan 25 μL enzim elastase. Telaga kawalan positif mengandungi 25 μL penimbal HEPES, 25 μL N-methoxy succinyl-Ala-Ala-Pro-Chloro（10 ug/mL）, dan 25μL enzim elastase. Telaga kawalan pelarut mengandungi 25 μL penimbal HEPES, 25 μL metanol 10 peratus, dan 25 μL enzim elastase. Kawalan kosong untuk ekstrak herba（untuk kawalan warna setiap ekstrak yang diuji） mengandungi 150 μL penimbal HEPES dan 25 uL ekstrak herba. Plat telaga mikro kemudiannya diinkubasi selama 20 minit pada suhu bilik. Selepas ini, substrat 100μL （N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide,1 mM) telah ditambah. Kemudian plat diinkubasi selama 40 minit tambahan pada 25 darjah. Selepas pengeraman, penyerapan dibaca menggunakan spektrofotometer (pembaca plat mikro Biotek EL800) pada 405 nm. Peratusan perencatan ekstrak herba dikira menggunakan persamaan seperti berikut:

di mana A kawalan ialah penyerapan penimbal dengan elastase dan pelarut dan Atest ialah penyerapan penimbal, elastase, dan ekstrak herba atau N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Chloro.

3.9. Ujian Perencatan Kolagenase

Aktiviti perencatan kolagenase telah dijalankan mengikut kaedah Van-Wart dan Steinbrink [111] (1981) dengan pengubahsuaian oleh Madrone et al. [92]. Ujian telah dilaksanakan dalam penimbal TES 50 mM (pH7.4 dengan 0.36 mM CaCl2). Enzim kolagenase daripada Clostridium histolyticum (ChC-EC.3.4.23.3) telah disediakan pada kepekatan 0.8 unit/mL (larut dalam larutan stok penimbal TES). Substrat sintetik N-[3-(2-furyl) acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala (FALGPA) telah disediakan pada kepekatan 2 mM dalam larutan stok penimbal TES. Jumlah isipadu 150 μL untuk campuran tindak balas akhir mengandungi 46.3 μL TESbuffer, 60 μL FALGPA （0.8 mM kepekatan akhir FALGPA）, 18.7 μL enzim kolagenase （0.1 unit/mL kepekatan akhir） dan ekstrak herb 25μL 100 ug/mL）. Ekstrak herba dan enzim dalam penimbal TES diinkubasi pada suhu bilik selama 15 minit sebelum menambah substrat untuk memulakan tindak balas kimia. Kawalan negatif telah dijalankan dengan penimbal TES. Selepas menambah substrat, penyerapan segera dibaca pada 340 nm menggunakan spektrofotometer (Benchmark Plus Microplate, Bio-Rad 170-6930, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) dalam 96 plat mikrotiter telaga dan diukur secara berterusan untuk yang lain. 20 min. Kawalan positif dilakukan menggunakan epigallocatechin gallate(EGCG) pada 12.5ug/mL. Peratusan perencatan sampel dikira menggunakan persamaan seperti berikut:

di mana A kawalan ialah penyerapan penimbal TES dan Atest ialah penyerapan penimbal TES, enzim kolagenase, dan ekstrak tumbuhan atau FALGPA.

3.10.Pemprofilan Metabolit Menggunakan 'H-NMR Measurement

Pemprofilan metabolit menggunakan H-NMR herba terpilih dilakukan berdasarkan protokol yang diterangkan oleh Kim et al. [47] dengan sedikit pengubahsuaian. Ekstrak herba mentah (25mg) dipindahkan ke dalam tiub microcentrifuge mL. Campuran penimbal metanol-d4 dan KHPO4 dalam Dao (pH 6.0)mengandungi 0.1 peratus garam natrium asid silypropionic trimetil (TSP) telah ditambah kepada sampel herba dengan jumlah isipadu { {10}}.7mL pada (1:1)nisbah. Tiub microcentrifuge yang mengandungi ekstrak herba kemudiannya divirteks selama 1 minit pada suhu bilik diikuti dengan ultrasonik selama 15 minit. Kemudian, campuran itu diempar selama 10 min pada 5678g untuk mengasingkan supernatan daripada sebarang bahan tidak boleh larut. Seterusnya, supernatan jernih 0.6mL telah dimasukkan ke dalam tiub NMR dan tertakluk kepada 'analisis H-NMR. Analisis 'H-NMR telah dicapai melalui spektrometer Varian INOVA NMR 500 MHz (Varian Inc., Palo Alto, CA, USA) yang beroperasi pada frekuensi 499.887 MHz dan spektrum direkodkan pada 26 darjah . Setiap spektrum tunggal terdiri daripada 64 imbasan dengan 3.53 minit masa pemerolehan dan lebar 20 ppm. Data dianalisis menggunakan perisian Chenomx(v.6.2)(Clhenomx Inc, Edmonton, AB, Kanada) untuk menjalankan pembetulan fasa dan garis dasar dengan tetapan yang konsisten. Analisis data multivariate telah dijalankan menggunakan perisian SIMCA (versi 13.0, Umetrics, Umea, Sweden). 3.11. Timba 'H-NMR Spectra

Bucketing spektrum H-NMR telah dilaksanakan dengan menggunakan perisian Chenomx(v.6.2, Edmonton, AB, Kanada). Semua spektrum telah dibind dari0.5-10.0 rantau pprn dengan parameter yang sama. Parameter termasuk lebar spektrum §0.04 yang memperoleh sejumlah 245 kawasan bersepadu untuk setiap spektrum NMR. Peralihan kimia untuk air dan sisa metanol-d pada δ4.70-4.90 dan δ3.27-3.35 masing-masing telah dihapuskan. Data binned seragam kemudiannya tertakluk kepada analisis data multivariate (MVDA).

3.12. Kuantifikasi Relatif Metabolit

Metabolit yang dikenal pasti telah diperiksa untuk kuantifikasi relatifnya yang dikira berdasarkan purata kawasan puncak isyarat selepas binning spektrum LH-NMR.

3.13. Analisis statistik

Semua hasil daripada enam ulangan dinyatakan sebagai min ± sisihan piawai. Untuk pengukuran aktiviti pemusnahan radikal, perencatan aktiviti elastase dan kolagenase, dan kuantifikasi relatif metabolit, analisis statistik telah dijalankan menggunakan Minitab 16 (Versi 16, Minitab Inc., State College, PA, Amerika Syarikat). Analisis varians (ANOVA) telah digunakan untuk mengkaji perbezaan ketara antara min dengan p<0.05 considered="" as="" significantly="" different.="" principal="" component="" analysis="" (pca)="" and="" partial="" least="" square="" (pls)="" from="" the="" multivariate="" data="" analysis="" （mvda）,="" were="" implemented="" using="" simca-p="" software（v.="" 13.0,="" umetrics,="" umeå,="" sweden）using="" the="" pareto="" scaling="" method="" after="" the="" binning="" of="" nmr="" spectra="" was="" completed.="" the="" correlation="" between="" metabolites="" components="" and="" ics0="" values="" for="" dpph="" radical="" scavenging="" activity="" was="" converted="" to="" 1/ic5so="" in="" order="" to="" acquire="" the="" same="" trend="" as="" the="" functional="" properties="">

4. Kesimpulan

Penggunaan analisis H-NMR ditambah dengan MVDA berjaya menyiasat variasi dalam metabolit herba terpilih. Plot skor PCA menunjukkan pemisahan herba yang berbeza mengikut kelompok mereka. Kajian ini mendedahkan bahawa P. minus mempunyai kesan penghapusan radikal tertinggi melalui ujian DPPH dan ABTS dan mempamerkan aktiviti anti-penuaan tertinggi. Kedua-dua biplot analisis PLS selanjutnya mengesahkan keputusan ini, kerana perkaitan yang kukuh ditemui antara metabolit yang dikenal pasti dalam P. minus dan bioaktiviti yang diuji. Metabolit aktif yang dipercayai menyumbang kepada aktiviti penghapusan radikal dan sifat anti-penuaan P.minus termasuk quercetin, quercetin-3-O-rhamnoside, derivatif miricetin, catechin, isorhamnetin, astragalin dan apigenin. Oleh itu, boleh diandaikan bahawa metabolit ini bertanggungjawab untuk kesan pemusnahan radikal yang kuat dan sifat anti-penuaan yang tinggi P. minus. Metabolit ini kebanyakannya daripada kumpulan flavonoid, khususnya flavonol. Oleh itu, boleh dicadangkan bahawa metabolit daripada P. minus boleh menjadi penghapus radikal bebas yang menjanjikan dan perencat enzim penuaan yang boleh digunakan untuk melambatkan gejala penuaan dan untuk rawatan penyakit kronik yang berkaitan dengan penuaan. Penemuan ini akan membantu untuk mewujudkan potensi P. minus sebagai sumber semula jadi yang berpotensi agen anti-penuaan dan sebagai pembasmi radikal bebas semula jadi.

Artikel ini diekstrak daripada Molecules 2019, 24, 3208; doi:10.3390/molecules24173208 www.mdpi.com/journal/molecules