NGF Memodulasi Metabolisme Kolesterol Dan Merangsang Rembesan ApoE dalam Sel Glial Memberi Neuroprotection Terhadap Tekanan Oksidatif Bahagian 2

2.6. Rembesan ApoE dengan Pengantaraan NGF oleh U373 Melindungi Sel Neuronal daripada Penghinaan Oksidatif

Bukti terkumpul menyerlahkan bahawa ApoE meningkatkan daya tahan neuron terhadap penghinaan oksidatif, dengan itu menghalang apoptosis dan neurodegenerasi [17,18,37]. Dalam konteks ini, kami menilai sama ada rembesan ApoE yang disebabkan oleh NGF oleh sel U373 boleh melindungi neuron N1E-115 daripada tekanan oksidatif. N1E yang dibezakan sepenuhnya-115 telah diprarawat dengan rotenon, yang mendorong tekanan oksidatif dengan menghalang kompleks mitokondria I.

Apoptosis ialah proses pemusnahan diri, dan ia merupakan cara penting bagi sel untuk mengekalkan homeostasis badan melalui pemusnahan diri yang diprogramkan dalam keadaan tertentu. Apoptosis memainkan peranan yang berbeza dalam pelbagai peringkat kehidupan.

Kajian terbaru menunjukkan bahawa terdapat hubungan tertentu antara apoptosis dan ingatan. Kita sedia maklum bahawa ingatan adalah proses saraf yang kompleks di dalam otak, yang melibatkan sambungan dan penyelarasan antara pelbagai kawasan otak. Apoptosis mungkin memainkan peranan dalam proses saraf ini.

Di satu pihak, apoptosis boleh menstabilkan struktur rangkaian neuron dengan membersihkan neuron dan sinaps yang tidak diperlukan, menjadikan sambungan neuron lebih halus, dengan itu meningkatkan kualiti dan kecekapan ingatan. Sebaliknya, apoptosis yang berlebihan juga boleh menyebabkan pengurangan bilangan sel otak, yang boleh menjejaskan penyimpanan dan penangkapan kenangan secara negatif.

Oleh itu, sambil mengekalkan tahap apoptosis yang sesuai, kita boleh meningkatkan ingatan melalui satu siri tingkah laku dan kemahiran, seperti membaca, belajar, bersenam dan menyesuaikan minda kita. Tingkah laku dan kemahiran ini boleh menggalakkan pertumbuhan dan sambungan sel-sel otak dan meningkatkan kualiti dan kecekapan ingatan dengan merangsang hubungan dan koordinasi antara neuron otak.

Kesimpulannya, hubungan antara apoptosis dan ingatan adalah kompleks. Hanya sambil mengekalkan apoptosis yang betul kita boleh merangsang otak kita dan meningkatkan ingatan kita melalui pelbagai tingkah laku dan kemahiran. Dari sudut ini, kita perlu meningkatkan daya ingatan kita. Cistanche deserticola boleh membantu kita meningkatkan daya ingatan dengan ketara, kerana Cistanche deserticola juga boleh mengawal keseimbangan neurotransmitter, seperti meningkatkan tahap asetilkolin dan faktor pertumbuhan. Bahan-bahan ini penting untuk ingatan. Ia sangat penting untuk pembelajaran dan pembelajaran. Selain itu, daging daripada daging juga boleh meningkatkan kecairan darah dan menggalakkan pengangkutan oksigen, yang dapat memastikan otak menerima nutrien dan tenaga yang mencukupi, seterusnya meningkatkan daya hidup dan daya tahan otak.

Klik tahu suplemen untuk meningkatkan ingatan

Selepas 16 jam pendedahan rotenon, neuron N1E-115 dibiakkan dalam medium segar (Ctrl), medium terkondisi daripada sel U373 (U373-Ctrl), medium terkondisi daripada U373 pra-rawatan dengan NGF selama 48 jam (U373-NGF), atau medium terkondisi daripada ApoE-senyap U373 pra-rawatan dengan NGF selama 48 jam (U373-NGF ApoE siRNA). Pra-rawatan Rotenone telah mengurangkan bilangan N1E-115 yang dibiakkan dalam medium kawalan, menunjukkan bahawa pemberian racun perosak ini memberi kesan teruk kepada kemandirian N1E-115.

Sitotoksisiti rotenon juga menentukan penarikan balik neurit yang sengit, seperti yang diperhatikan oleh panjang neurit. Kerosakan neurit yang ditimbulkan oleh rawatan rotenon amat ketara apabila penilaian sel yang mengandungi neurit, kerana bilangan N1E-115 dengan neurit berkurangan kepada 50%. Keputusan yang sama diperoleh apabila sel N1E-115 dikultur dalam medium terkondisi U373-Ctrl, menunjukkan bahawa kehadiran supernatan yang diperoleh daripada astrosit yang tidak dirangsang tidak mencukupi untuk melindungi sel neuron daripada ketoksikan yang dimediasi rotenone. Pada asasnya, penggunaan medium terkondisi yang diperolehi daripada U373 yang dirawat NGF berkesan menghalang kematian neuron, serta pengurangan sel-sel yang mengandungi neurit dan panjang neurit yang disebabkan oleh pentadbiran rotenone (Rajah 5).

Lebih penting lagi, medium terkondisi yang terhasil daripada sel U373 yang disenyapkan ApoE kehilangan sepenuhnya kesan berfaedah yang diakibatkan oleh medium terkondisi U373-NGF, menunjukkan bahawa perlindungan saraf didorong oleh pelepasan ApoE yang disenyapkan NGF dalam medium kultur. Terutamanya, medium terkondisi daripada U373 yang dirawat NGF yang ditransfeksi dengan siRNA hancur sepenuhnya mengekalkan kesan perlindungan yang diberikan oleh medium terkondisi U373-NGF, menunjukkan bahawa kehilangan perlindungan saraf yang diperhatikan dalam medium terkondisi daripada sel yang disenyapkan ApoE adalah bergantung secara berkesan kepada ApoE. downregulation (Rajah S3C).

Rajah 5. Kesan medium terkondisi U373 terhadap tekanan oksidatif dalam neuron. Imej perwakilan dalam medan terang dan penilaian kuantitatif morfologi neuron N1E-115. Sel sebelum ini dirawat (+) atau tidak (-) dengan rotenone (0.1 µM) selama 16 jam, dan kemudian dikultur dalam DMEM (Ctrl) segar, dalam medium terkondisi yang diperoleh daripada kawalan U373 (U{{ 9}}Ctrl), U373 prarawat NGF (U373-NGF) dan U373 prarawat NGF disenyapkan untuk apoE (U373-NGF ApoE siRNA) selama 48 jam. n=5 percubaan yang berbeza. Data mewakili min ± SD. Analisis statistik dinilai dengan menggunakan ANOVA sehala, diikuti dengan ujian post hoc Tukey. ** p < 0.01, *** p < 0.001.

Untuk mengukuhkan keputusan yang diperoleh daripada medium terkondisi, kami melakukan kultur bersama U373/N1E115. Untuk memulakan, sel U373 telah dirawat terlebih dahulu atau tidak dengan NGF selama 48 jam. Tambahan pula, sel N1E-115 yang dibezakan telah dirawat terlebih dahulu atau tidak dengan rotenone selama 16 jam. Selepas itu, medium U373 telah digantikan dengan medium segar yang mengandungi 0.5% FBS, dan coverlips yang disemai dengan N1E-115 telah dipindahkan ke lapisan U373 untuk menyediakan kultur bersama (Rajah 6A).

Kerosakan oksidatif yang ditimbulkan oleh rawatan rotenon sangat menjejaskan sel galas viabilineurit sel dan panjang kawalan neurit N1E-115 dan N1E-115 yang dikultur bersama dengan U373-Ctrl astrocytes (Rajah 6B). Selaras dengan percubaan sederhana terkondisi, sel N1E-115 yang dikultur bersama dengan sel U373-NGF dilindungi daripada kerosakan oksidatif, manakala penyenyapan ApoE dalam U373 memansuhkan perlindungan saraf yang dikekalkan oleh NGF.

Rajah 6. Rembesan ApoE oleh sel U373 yang dirawat NGF memberikan perlindungan saraf daripada tekanan oksidatif. (A) Skim perwakilan kultur bersama astrocyte-neuron yang ditetapkan seperti yang diterangkan dalam Bahagian Bahan dan Kaedah. Sel-sel yang mengandungi neurit, panjang neurit, dan bilangan sel dinilai beberapa jam selepas penubuhan kultur bersama. (B) Imej perwakilan dalam medan terang dan penilaian kuantitatif morfologi neuron sel N1E-115, sebelum ini dirawat (+) atau tidak (-) dengan rotenone (0.1 µM) selama 16 jam.

N1E-115 kemudiannya disimpan dalam DMEM (Ctrl) baharu atau dikultur bersama dengan kawalan U373 (U373-Ctrl), U373 pra-rawat NGF (U373-NGF) dan U373 pra-rawatan NGF disenyapkan untuk ApoE (U373-NGF ApoE siRNA) selama 48 jam. n=5 percubaan yang berbeza. Data mewakili min ± SD. Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan ANOVA sehala, diikuti dengan ujian post hoc Tukey. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001.

3. Perbincangan

Ketidakseimbangan dalam laluan isyarat neurotropin, serta perubahan dalam metabolisme kolesterol otak, sangat dikaitkan dengan penyakit neurologi dan neurodegeneratif, seperti sindrom Rett, HD, penyakit Alzheimer (AD), dan penyakit Parkinson (PD) [2,38,39] . Dalam konteks ini, penyelidikan asas mengenai aktiviti biologi neurotropin adalah penting untuk membedah mekanisme molekul yang menghubungkan metabolisme kolesterol dan fisiopatologi otak. Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, satu kajian yang menarik melaporkan peranan untuk BDNF dalam pengawalan metabolisme kolesterol dalam astrocytes [38].

Walaupun tanggapan ini, tiada maklumat tersedia mengenai penglibatan NGF dalam pengawalan kolesterol astrocytic. Oleh itu, dalam kerja ini, kami memberi tumpuan kepada peranan prospektif yang dilakukan oleh NGF dalam pengawalan metabolisme kolesterol, dengan merujuk khusus kepada pengaruh rembesan ApoE pada pembezaan neuron dan kelangsungan hidup. U373, garisan sel astrocytoma yang digunakan sebagai model eksperimen astrosit manusia, mengekalkan potensi untuk bertindak balas sepenuhnya kepada NGF, kerana ia menyatakan tahap yang ketara bagi kedua-dua TrkA dan p75NTR.

Keputusan utama menunjukkan bahawa NGF mengimbangi tahap protein utama yang terlibat dalam biosintesis kolesterol (HMGCR), pemerdagangan intraselular (NPC1) dan rembesan (ABCA1). Peristiwa ini disertai dengan peningkatan serentak ApoE dan kolesterol lein ke dalam medium kultur, menunjukkan bahawa NGF meningkatkan biosintesis kolesterol dan penyemperitan daripada sel glial. Telah dilaporkan bahawa NGF mendorong ekspresi protein ApoE dengan meningkatkan transkripsinya [40]. Walau bagaimanapun, kami tidak melihat sebarang perubahan ketara dalam ekspresi ApoE intraselular. Ketidakkonsistenan yang jelas ini boleh dijelaskan kerana pembentukan ApoE tidak dapat dihargai kerana peningkatan pengeluarannya daripada UIn yang dirawat NGF
Dalam percubaan untuk membedah mekanisme molekul dengan lebih baik, kami merawat U373 dengan LM11A-31 dan mendapati bahawa modulator p75NTR hanya dapat meniru peningkatan dalam ekspresi HMGCR yang dimediasi oleh NGF. Penglibatan p75NTR dalam modulasi tahap HMGCR adalah konsisten dengan data sebelumnya yang diperoleh dalam jenis sel lain, menunjukkan bahawa reseptor ini mengawal transkripsi enzim kolesterol [41]. Walau bagaimanapun, LM11A-31 tidak menyebabkan sebarang perubahan sama ada dalam protein lain yang dianalisis dalam kajian ini, termasuk ABCA1, atau dalam tahap kolesterol dan ApoE ke dalam medium kultur, menunjukkan bahawa modulasi terpilih p75NTR tidak mencukupi untuk menggalakkan kolesterol. penyemperitan melalui zarah yang kaya dengan ApoE yang diperhatikan dalam sel yang dirawat NGF. Keputusan ini membawa kita untuk membuat hipotesis bahawa NGF mengawal metabolisme kolesterol dalam sel glial melalui penglibatan kedua-dua reseptor p75NTR dan TrkA.

Adalah diketahui bahawa neurotropin yang mengikat kepada reseptor Trk mengaktifkan ERK1 / 2, dengan itu mengawal beberapa laluan yang terlibat dalam pembezaan sel, percambahan, dan kelangsungan hidup [2,38]. Menariknya, telah diperhatikan bahawa pengaktifan ERK1/2 juga mengawal ekspresi ABCA1 dan ApoE dalam jenis sel yang berbeza [38,42,43]. Penemuan ini, bersama-sama dengan bukti bahawa paksi BDNF/TrkB/ERK menggalakkan penyemperitan ApoE dan ekspresi ABCA1 dalam sel glial [38], mencadangkan bahawa laluan transduksi isyarat yang melibatkan paksi TrkA/ERK boleh menerangkan sebahagian daripada kesan yang dikenakan oleh NGF dalam kajian kami.

Walaupun tiada perubahan diperhatikan dalam pertumbuhan neurit, penggunaan medium terkondisi U373- dan penubuhan eksperimen kultur bersama menunjukkan bahawa peningkatan rembesan ApoE daripada sel glial yang dimediasi oleh NGF adalah penentu untuk mengelakkan hasil yang memudaratkan yang disebabkan oleh oksidatif. tekanan dalam sel neuron. Untuk mendorong sitotoksisiti, kami menggunakan rotenone, racun perosak yang biasa digunakan dalam penyelidikan praklinikal untuk mendorong spesies oksigen reaktif (ROS) yang berasal dari mitokondria dan apoptosis berikutnya [44].

Keputusan kami menyerlahkan bahawa NGF merangsang rembesan ApoE oleh sel glial, yang diperlukan untuk menjamin kesan neuroprotektif terhadap pentadbiran rotenone dalam sel N1E-115 yang dibezakan. Peranan ApoE dalam pencegahan tekanan oksidatif didokumentasikan dengan baik. Sebagai contoh, pengurangan ApoE dalam model tetikus memburukkan lagi kecederaan oksidatif dalam tisu otak [45,46]. Sehubungan itu, pentadbiran ApoE eksogen melindungi daripada kerosakan oksidatif yang tidak dapat dipulihkan daripada rawatan hidrogen peroksida dengan mengatasi ketoksikan glutamat sekunder [18]. Di samping itu, lipoprotein yang mengandungi ApoE berkesan dalam melemahkan apoptosis yang disebabkan oleh penarikan sokongan trofik dalam neuron ganglion retina [47].

Dalam kajian kami, penggunaan rotenone menunjukkan bahawa neuroprotection yang dimediasi ApoE, yang dipromosikan oleh sel glial yang dirangsang NGF, mungkin relevan dalam konteks keadaan neurodegeneratif seperti PD. Terutamanya, rotenone menghasilkan semula degenerasi neuron dopaminergik yang serupa dengan yang diperhatikan dalam PD, kedua-duanya dalam model haiwan dan kultur sel, termasuk neuron terbitan N1E-115- [48–50]. Secara koheren, keputusan kami menyokong bukti terdahulu yang menunjukkan bahawa ApoE menimbulkan perlindungan saraf apabila pentadbiran 6-hidroksidopamin (6-OHDA), satu lagi neurotoksin yang mampu mendorong fenotip seperti PD [51]. Secara kolektif, kajian kami menunjukkan bahawa NGF adalah modulator penting metabolisme kolesterol dan penyemperitan ApoE daripada sel glial. Paling penting, peningkatan dalam rembesan ApoE yang dipromosikan oleh neurotropin ini diperlukan untuk memastikan perlindungan saraf terhadap sitotoksisiti rotenon.

BDNF adalah neurotropin yang paling banyak dalam otak dewasa. Walaupun bukti ini, ia telah menunjukkan bahawa NGF mungkin memainkan peranan penting bukan sahaja semasa pembangunan tetapi juga dalam sistem saraf pusat dewasa. Sebagai contoh, NGF mempengaruhi aktiviti hippocampal dan, sebagai akibatnya, memori spatial dan pembelajaran [52]. Penemuan lain menunjukkan bahawa NGF mempamerkan kesan neuroprotective pada neuron dopaminergik nigrostriatal dan aktiviti ini boleh menetapkan asas untuk pendekatan terapeutik berasaskan NGF baru untuk PD [53].

Menurut tanggapan ini, telah ditunjukkan bahawa pengeluaran NGF dikawal secara mendalam dalam astrosit semasa dewasa dan melakukan tindakan modulasi pada neuroinflammation, kecederaan otak, dan neurodegeneration [54-56]. Dalam konteks ini, adalah menarik untuk menilai, dalam kajian masa depan, sama ada kesan ini boleh dimediasi, sekurang-kurangnya sebahagiannya, oleh modulasi kolesterol glial yang dipromosikan oleh NGF. Kerja ini membentangkan beberapa batasan yang harus diatasi dalam penyiasatan eksperimen seterusnya; sebagai contoh, adalah penting untuk membedah mekanisme molekul yang menghubungkan rawatan NGF dan metabolisme kolesterol dalam sel glial dengan lebih baik.

Pemahaman yang luas berguna untuk mengenal pasti sasaran molekul tertentu yang sesuai dengan manipulasi farmakologi yang boleh digunakan dalam konteks neurodegeneratif. Tambahan pula, walaupun sel U373 dan N1E-115 digunakan secara meluas sebagai talian sel yang boleh diurus untuk masing-masing menghasilkan semula ciri astrocytic dan neuron [27-29,57], penemuan ini perlu disahkan lagi dalam kultur sel primer. Walaupun usaha selanjutnya perlu dilakukan untuk mengukuhkan penglibatan isyarat neurotropin dalam homeostasis kolesterol otak, kerja ini menunjukkan buat pertama kalinya bahawa NGF secara tidak langsung boleh menggunakan pelindung saraf dengan mempengaruhi metabolisme kolesterol glial.

4. Bahan dan Kaedah

4.1. Kultur sel

N1E-115 sel neuroblastoma dan sel U373 telah dikultur pada 5% CO2 dalam DMEM pada glukosa tinggi (Merck Life Science, Milan, Itali), dengan 10% (v/v) serum lembu janin (FBS) (Merck Life Science , Milan, Itali), dan ditambah dengan larutan penisilin/streptomisin.

Untuk mendorong pembezaan neuron, sel N1E-115 telah disemai pada 30% pertemuan dan telah ditukar kepada DMEM dengan 0.5% FBS selama 96 jam.

Untuk mendorong pembezaan neuron, sel N1E-115 telah disemai pada 30% pertemuan dan telah ditukar kepada DMEM dengan 0.5% FBS selama 96 jam.

Kultur bersama Astrocyte-neuron telah ditubuhkan mengikut protokol yang diterangkan oleh Ioannou dan rakan sekerja, dengan pengubahsuaian [59]. Pengatur jarak parafin ditekan pada slip penutup untuk memastikan pematuhan; kami menggunakan pengatur jarak pada slip penutup neuron untuk mengelakkan kerosakan mekanikal dengan cekap apabila sel diletakkan menghadap antara satu sama lain. Coverslip kemudiannya disterilkan dalam etanol dan disalut dengan poli-D-lisin (Merck Life Science, Milan, Itali). N1E-115 telah disemai pada coverlips bersalut pada ketumpatan yang diingini dan, setelah sedia untuk co-culture, forsep steril digunakan untuk mengangkat coverlips dengan neuron N1E-115 dan meletakkannya menghadap ke bawah ke dalam { {10}}telaga yang disemai dengan astrosit U373.

Pra-rawatan pada sel N1E-115 telah dijalankan dengan mentadbir 0.1 µM rotenone (Sigma-Aldrich, Milan, Itali, R8875) selama 16 jam. Sel kawalan menerima DMSO (pencairan 1:1000 dalam medium kultur sel) sebagai kenderaan. Sel U373 telah dirawat dengan NGF (Alomone Labs, Jerusalem, Israel, N-245) pada dos 100 ng/mL selama 48 jam dalam semua eksperimen.

4.2. Penyediaan Lysate dan Analisis Western Blot

Sel U373 telah disonikasi (kitaran tugas 20%, output 3) dalam penimbal sampel (0.1Tris-HClisHCl yang mengandungi 10% SDS, koktel perencat protease, pH 6.8) untuk toer mendapatkan jumlah lisat, seperti yang diterangkan sebelum ini [ 60,61]. Penampan Laemmli telah ditambah, dan sampel telah dinyahtutur pada 95 ◦C selama 5 minit. Ekstrak protein (dua puluh mikrogram protein) telah diselesaikan pada SDS-PAGE, dan pemindahan ke membran nitroselulosa dilakukan dengan menggunakan sistem pemindahan turbo trans-blot (Biorad Laboratories, Milan, Itali), seperti yang dilaporkan sebelum ini [62].

Selepas itu, membran diinkubasi pada suhu bilik selama 1 jam dengan 5% susu kering tanpa lemak dalam garam Tris-buffered (25 mM Tris-HCl, 138 mM NaCl, 27 mM KCl, 0.05% Tween{ {10}}, pH 6.8) dan disiasat semalaman pada suhu 4 ◦C dengan antibodi utama berikut: anti-p75NTR (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-271708, pencairan 1:500), anti- TrkA (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-118, pencairan 1:500), anti-SREBP-1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-8984 , pencairan 1:1000), anti-SREBP-2 (Abcam, Cambridge, UK, ab30682, pencairan 1:1000), anti-HMGCR (Abcam, Cambridge, UK, ab242315, pencairan 1:1000), anti-LDLr (Abcam, Cambridge, UK, ab30532, pencairan 1:500), anti-NPC1 (Novus Biologicals, Centennial, CO, USA, NB400-148, pencairan 1:3000 ), antiABCA1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-58219, pencairan 1:400), anti-ApoE (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-53570, pencairan 1 :400), anti-vinculin (SigmaAldrich, Milan, Itali, V9264, pencairan 1:10,000) dan anti- -aktin (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-47778, pencairan 1 :10,000).

Membran diinkubasi secara berturut-turut selama 1 jam pada suhu bilik dengan antibodi anti-tikus atau anti-arnab sekunder konjugasi HRP (Bio-Rad Laboratories, Milan, Itali). Antibodi terikat protein telah divisualisasikan dengan kejelasan ECL Western blotting (Bio-Rad Laboratories, Milan, Itali, #1705061), dan chemiluminescence telah didaftarkan melalui sistem MP ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Milan, Itali). Analisis densitometrik yang diperoleh daripada Western blots kemudiannya dijalankan dengan menggunakan perisian ImageJ versi 1.52t (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) untuk Windows. Vinculin atau -actin digunakan sebagai protein pengemasan, yang berfungsi sebagai kawalan dalaman untuk pemuatan protein. Pengiraan densitometrik diperolehi sebagai unit sewenang-wenangnya, diperoleh daripada nisbah antara keamatan jalur protein dan protein pengemasan masing-masing.

4.3. Minyak Merah O Pewarnaan

Sel U373 telah disemai pada slip penutup bersalut poli-L-lisin (Sigma-Aldrich, P6282-5MG) dalam 6-plat perigi, dan pewarnaan minyak O merah telah dilakukan seperti yang dilaporkan sebelum ini [60]. Secara ringkas, sel telah ditetapkan dalam paraformaldehid (larutan 4%) selama 10 minit dan perlahan-lahan dibilas tiga kali dengan PBS. Sel-sel tetap diinkubasi dengan 60% isopropanol selama 5 minit dan kemudian dibasuh dengan air suling. Selepas itu, sel telah disiasat dengan 1 mL larutan kerja Oil Red O (Sigma-Aldrich, O1391-250ML) selama 15 minit pada suhu bilik dengan meletakkan 6-plat telaga pada pemutar orbital shaker. Selepas pengeraman dengan larutan pewarna, telaga dicuci tiga kali dengan air suling untuk menghilangkan kotoran yang berlebihan.

Coverslips akhirnya dipasang dengan medium pelekap Fluoroshield (Sigma-Aldrich, F6182), dan Autofluoresensi O merah minyak telah divisualisasikan melalui mikroskop confocal (TCS SP8; Leica, Wetzlar, Jerman). Imej ditangkap menggunakan Leica TCS SP8 dilengkapi dengan pembesaran 63× dan Perisian Leica LAS X (Milan, Itali). Kuantifikasi pewarnaan minyak O merah dilakukan melalui perisian ImageJ untuk Windows dan dikira sebagai intensiti pendarfluor purata setiap kawasan sel.
4.4. Pewarna Filipina

Pewarnaan Filipina dilakukan menggunakan kompleks Filipin (Sigma-Aldrich, F9765). Penyelesaian stok Filipina (10 mg/mL dalam PBS) sentiasa disediakan sebaik sebelum digunakan. Sel telah ditetapkan dalam paraformaldehid (larutan 4%) selama 10 minit dan dibasuh dengan PBS. U373 kemudian diwarnakan dengan 1 mL larutan kerja Filipin (0.05 mg/mL dalam PBS) selama 1 jam dalam gelap, pada suhu bilik. Selepas itu, sel telah dibasuh tiga kali dengan PBS, dan penutup penutup dipasang dengan medium pelekap Fluoroshield dan segera dianalisis melalui mikroskop confocal menggunakan set penapis UV (pengujaan 340-380 nm). Imej diperoleh pada pembesaran 40X. Kuantifikasi Filipina dikira sebagai intensiti pendarfluor purata setiap kawasan sel dengan menggunakan perisian ImageJ untuk Windows.

4.5. Kuantiti Kolesterol

Kuantifikasi kolesterol dilakukan dengan menggunakan ujian kolorimetrik (Kit Kuantiti Kolesterol, MAK043, Sigma-Aldrich, Milan, Itali) mengikut arahan pengilang.

4.6. ELISA
Tahap ApoE dalam medium kultur dinilai dengan menggunakan Kit Apolipoprotein E ELISA Manusia (Abcam, Cambridge, UK, ab108813), mengikut arahan pengilang.

4.7. Imunofluoresensi

Imunofluoresensi sel U373 telah dilaksanakan seperti yang diterangkan sebelum ini [60]. U373 telah ditetapkan dalam paraformaldehid (4% dalam PBS) dan disiasat semalaman dengan antibodi utama: anti-p75NTR (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-271708, pencairan 1:100) dan anti-TrkA ( Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-118, pencairan 1:100). Selepas itu, sel-sel diinkubasi selama 1 jam dengan antibodi sekunder anti-tikus kambing Alexa Fluor 555 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA, A28180) dan dengan antibodi sekunder anti-arnab kambing Alexa Fluor 488 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA , A27034). Pewarnaan DAPI dilakukan untuk menggambarkan nukleus, dan penutup penutup akhirnya dipasang dengan medium pelekap Fluoroshield. Sampel dianalisis melalui mikroskop confocal, seperti yang diterangkan di atas.

4.8. ApoE Silencing

Penyenyapan mRNA ApoE telah dilakukan pada sel U373 menggunakan ApoE siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-29708) mengikut arahan pengilang. Pemindahan telah disediakan dalam 6-plat kultur tisu telaga di mana 100,000 sel setiap telaga telah disemai dalam medium pertumbuhan bebas antibiotik DMEM ditambah dengan 10% FBS selama 24 jam. Bagi setiap telaga, Medium Transfection siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, sc-36868) ​​telah ditambahkan pada larutan Transfection Reaction siRNA, disediakan menggunakan dupleks siRNA dan Reagen Transfection siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, Amerika Syarikat, sc29528). Sel-sel kemudiannya dibasuh sekali dengan Medium Transfection siRNA dan ditutup dengan campuran transfection yang dibuat sebelum ini. Selepas itu, plat kultur diinkubasi selama 7 jam pada suhu 37 ◦C dalam inkubator CO2 5%.

Medium pertumbuhan DMEM dengan 20% FBS dan antibiotik (2-lipat kepekatan normal) telah ditambahkan pada campuran pemindahan dalam setiap telaga dengan nisbah 1:1. Sel telah diinkubasi selama 18 jam, dan kemudian medium dilepaskan dan digantikan dengan medium pertumbuhan normal yang segar; 24 jam selepas langkah terakhir ini, sel sedia untuk digunakan untuk eksperimen selanjutnya. Kecekapan pembungkaman ApoE dinilai oleh RT-qPCR dalam sel U373 dan oleh ELISA dalam supernatan sel; ApoE siRNA cekap menghalang induksi ApoE oleh NGF jika dibandingkan dengan siRNA berebut (mRNA ApoE: penurunan 83%; ApoE ELISA: penurunan 78%). Terutama, ekspresi ApoE apabila pembungkaman siRNA adalah lebih rendah daripada tahap ekspresi basal yang diperhatikan dalam kawalan U373 (mRNA ApoE: penurunan 72%; ApoE ELISA: penurunan 58%) (Rajah S 3A, B).

4.9. Pengekstrakan RNA dan PCR Masa Nyata

Analisis mRNA dilakukan seperti yang dilaporkan sebelum ini [22,63]. Secara ringkas, jumlah RNA daripada sel U373 telah diekstrak dengan Reagen TRI (Merck Life Science, Milan, Itali) mengikut arahan pengilang. Rawatan DNAse (Ambion, Thermo Fisher Scientific, Milan, Itali) telah dilakukan, dan kemudian RNA disucikan menggunakan Kit pembersihan RNA (Zymo, Itali). RNA ditranskripsikan secara berbalik kepada cDNA melalui Kit Sel Transkripsi Balik cDNA Berkapasiti Tinggi (Sistem Bio Gunaan, Foster City, CA, Amerika Syarikat) dan digunakan untuk analisis qPCR.

Primer yang digunakan dalam qRT-PCR untuk apoE ialah: ke hadapan 5 0 -GGGTCGCTTTTGGGATTACCTG-30 dan belakang 50 -CAACTCCTTCATGGTCTCGTCC3 0 . Primer yang digunakan dalam qRT-PCR untuk gapdh (dipilih sebagai gen rujukan) ialah: ke hadapan 50 - GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-30 dan belakang 50 -ACCACCCTGTTGCTGTAGCCA-30. Pengeluaran amplikon yang betul dinilai dengan penilaian keluk lebur. Setiap sampel biologi dijalankan dalam tiga kali ganda dengan reagen IQ hijau SYBR (Bio-Rad Laboratories, Milan, Itali) dan menggunakan sistem pengesanan CFX Connect (Bio-Rad Laboratories, Milan, Itali).

4.10. Penilaian Kuantitatif Morfologi Neuron

Morfologi neuron dalam sel N1E-115 dianggarkan dengan menangkap imej dengan mikroskop terbalik. Analisis morfometrik telah dijalankan melalui perisian ImageJ untuk Windows, dan bilangan jumlah sel (dinyatakan sebagai variasi peratusan kawalan), purata panjang neurit (dinyatakan sebagai peratusan kawalan), dan sel-sel galas neurit dianggarkan. Untuk sel yang mengandungi neurit, peratusan dikira dengan membahagikan bilangan sel yang dibezakan dengan jumlah bilangan sel setiap medan. N1E-115 dibezakan apabila mereka mempunyai sekurang-kurangnya satu neurit a dengan panjang sama atau lebih besar daripada diameter soma. Penilaian morfologi dilakukan pada sekurang-kurangnya lima eksperimen bebas, di mana sekurang-kurangnya tiga imej dianalisis.

4.11. Analisis statistik

Semua keputusan yang dibentangkan dalam kajian ini dinyatakan sebagai min ± SD (sisihan piawai taburan normal data telah disemak dengan menggunakan ujian Shapiro-Wilk. Apabila dua kumpulan eksperimen dibandingkan, Ujian tidak berpasangan digunakan. Walau bagaimanapun, apabila tiga atau lebih kumpulan dibandingkan, analisis varians sehala (ANOVA) diikuti dengan ujian post hoc Tukey telah digunakan. Mengenai eksperimen dengan rotenone, di mana dua pembolehubah hadir, ANOVA dua hala diikuti dengan ujian pasca Bonferroni telah digunakan. p < 0.05 dianggap berbeza secara statistik. Analisis statistik telah dijalankan menggunakan GraphPad Prism 5 (GraphPad, La Jolla, CA, USA) untuk Windows.

Sumbangan Pengarang:

Pengkonsepan, MS; metodologi, MS dan MC; pengesahan, MS dan MC; analisis formal, MS, MC, DP dan MP; penyiasatan, MC, NM, LL, MP dan DP; sumber, MS dan VP; penyusunan data, MS dan MC; penulisan—penyediaan draf asal, MS dan MC; menulis—menyemak dan menyunting, MP, LL, DP, NM dan VP; visualisasi, MS, MC dan MP; penyeliaan, MS; pentadbiran projek, MS; pemerolehan pembiayaan, MS Semua pengarang telah membaca dan bersetuju dengan versi manuskrip yang diterbitkan.

Pembiayaan:

Penyelidikan ini dibiayai oleh Funds for Departmental Research 2021 (University of Molise) kepada MS, dan oleh Jerome Lejeune Foundation panggilan untuk Geran sesi 2021a, #2043 kepada MS

Penyata Lembaga Semakan Institusi:

Tidak berkaitan.

Kenyataan Persetujuan Termaklum:

Tidak berkaitan.

Penyata Ketersediaan Data:

Tidak berkaitan.

Penghargaan:

Kami berterima kasih kepada Claudia Tonini untuk bantuan dengan ujian kolesterol

Konflik Kepentingan:

Penulis mengisytiharkan tiada konflik kepentingan.

Rujukan

1. Björkhem, I.; Meaney, S.; Fogelman, AM Kolesterol Otak: Kehidupan Rahsia Panjang di Sebalik Halangan. Arterioskler. debaran. Vasc. biol. 2004, 24, 806–815. [CrossRef] [PubMed]

2. Colardo, M.; Martella, N.; Pensabene, D.; Siteni, S.; Di Bartolomeo, S.; Pallottini, V.; Segatto, M. Neurotrophins sebagai pengawal selia utama metabolisme sel: Implikasi untuk homeostasis kolesterol. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 5692. [CrossRef] [PubMed]

3. Goritz, C.; Mauch, DH; Pfrieger, FW Pelbagai mekanisme mengantara sinaptogenesis yang disebabkan oleh kolesterol dalam neuron CNS. Mol. sel. Neurosci. 2005, 29, 190–201. [CrossRef] [PubMed]

4. Pfenninger, KH Pengembangan membran plasma: Tugas Herculean neuron. Nat. Rev. Neurosci. 2009, 10, 251–261. [CrossRef]

5. Takamori, S.; Holt, M.; Stenius, K.; Lemke, EA; Grønborg, M.; Riedel, D.; Urlaub, H.; Schenck, S.; Brügger, B.; Ringler, P.; et al. Anatomi Molekul Organel Pemerdagangan. Sel 2006, 127, 831–846. [CrossRef] [PubMed]

6. Suzuki, S.; Kiyosue, K.; Hazama, S.; Ogura, A.; Kashihara, M.; Hara, T.; Koshimizu, H.; Kojima, M. Faktor neurotropik yang berasal dari otak mengawal metabolisme kolesterol untuk pembangunan sinaps. J. Neurosci. 2007, 27, 6417–6427. [CrossRef]

7. Segatto, M.; Leboffe, L.; Trapani, L.; Pallottini, V. Kegagalan Homeostasis Kolesterol dalam Otak: Implikasi untuk Disfungsi Sinaptik dan Penurunan Kognitif. Curr. Med. Kimia. 2014, 21, 2788–2802. [CrossRef] [PubMed]

8. Jeske, DJ; Dietschy, JM Peraturan kadar sintesis kolesterol dalam vivo dalam hati dan bangkai tikus diukur menggunakan air [3H]. J. Lipid Res. 1980, 21, 364–376. [CrossRef]

9. Pfrieger, FW; Ungerer, N. Metabolisme kolesterol dalam neuron dan astrosit. Prog. Lipid Res. 2011, 50, 357–371. [CrossRef]

10. Nieweg, K.; Schaller, H.; Pfrieger, FW Perbezaan ketara dalam sintesis kolesterol antara neuron dan sel glial daripada tikus selepas bersalin. J. Neurochem. 2009, 109, 125–134. [CrossRef]

11. Oram, JF; Heinecke, Pengangkut kaset pengikat ATP JW A1: Pengeksport kolesterol sel yang melindungi daripada penyakit kardiovaskular. Fisiol. Wahyu 2005, 85, 1343–1372. [CrossRef]

12. Pfrieger, FW Penyumberan Luar dalam otak: Adakah neuron bergantung kepada penghantaran kolesterol oleh astrocytes? BioEssays 2003, 25, 72–78. [CrossRef]

13. Christopherson, KS; Ullian, EM; Stokes, CCA; Mullowney, CE; Neraka, JW; Agah, A.; Lawler, J.; Mosher, DF; Bornstein, P.; Barres, BA Thrombospondins ialah protein yang dirembeskan oleh astrocyte yang menggalakkan sinaptogenesis CNS. Sel 2005, 120, 421–433. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com