Potensi Neuroprotektif Isothiocyanates dalam Model In Vitro Neuroinfammation

Hubungi:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Tiziana Latronico1 · Marilena Larocca2 · Serafna Milella1 · Anna Fasano1 · Rocco Rossano2 · Grazia Maria Liuzzi1

Diterima: 10 Julai 2020 / Diterima: 25 Oktober 2020 / Diterbitkan dalam talian: 16 November 2020

© Pengarang 2020

Fungsi serbuk herba cistanche: mempunyai yang sangat baikkesan neuroprotektif

Abstrak

Isothiocyanates (ITCs), hadir sebagai prekursor glukosinolat dalam sayur-sayuran silangan, telah menunjukkananti-radang, aktiviti antioksidan dan antikarsinogenik. Di sini, kami membandingkan kesan tiga ITC berbeza pada pengeluaran ROS dan pada ekspresi matriks metalloproteinase (MMP)-2 dan -9, yang mewakili faktor patogenetik penting pelbagai penyakit neurologi. Kultur utama astrosit tikus telah diaktifkan oleh LPS dan secara serentak dirawat dengan dos Allyl isothiocyanate (AITC), 2-Phenethyl isothiocyanate (PEITC) dan 2-Sulforaphane (SFN) yang berbeza. Keputusan menunjukkan bahawa SFN dan PEITC dapat mengatasi pengeluaran ROS yang disebabkan oleh H2O2. Analisis zymografi bagi supernatan kultur sel membuktikan bahawa PEITC dan SFN ialah perencat MMP-9 yang paling berkesan, manakala, hanya SFN menghalang aktiviti MMP-2 dengan ketara. Analisis PCR menunjukkan bahawa semua ITC yang digunakan menghalang ekspresi MMP-2 dan MMP-9 dengan ketara. Siasatan ke atas laluan isyarat protein kinase diaktifkan mitogen (MAPK) menunjukkan bahawa ITC memodulasi transkripsi MMP dengan menghalang aktiviti kinase protein terkawal ekstraselular (ERK). Keputusan kajian ini mencadangkan bahawa ITC boleh menjadi agen nutraseutikal yang menjanjikan untuk pencegahan dan rawatan pelengkap penyakit saraf yang berkaitan dengan penglibatan MMP.

Kata kunciAntioksidan · Anti-radang · Isothiocyanate · Metalloproteinases matriks · Penyakit neurodegeneratif

pengenalan

Neuroinflammation ialah tindak balas kompleks terhadap kecederaan otak yang melibatkan rangkaian peristiwa biokimia yang membawa kepada pengaktifan sel pemastautin sistem saraf pusat (CNS). Pengaktifan astrocytes yang menyimpang menjejaskan peranan neuroprotektif mereka yang membawa kepada pembebasan mediator keradangan, seperti spesies oksigen reaktif (ROS), nitrik oksida (NO), sitokin, kemokin, dan metalloproteinase matriks.

(MMPs).

MMP adalah keluarga besar endopeptidase yang bergantung kepada Zn2 dan Zn2 ​​yang mempunyai sasaran utama komponen matriks ekstraselular (ECM) seperti fibronektin, kolagen, elastin dan laminin (Latronico dan Liuzzi 2017).

Tiziana Latronico

tiziana.latronico@uniba.it

Jabatan Biosains, Bioteknologi dan Biofarmaseutik, Universiti Bari"Aldo Moro",

Bari, Itali

Jabatan Sains, Universiti Basilicata, Potenza,

Itali

Dalam CNS, MMP terlibat dalam pelbagai tindak balas fisiologi, seperti morfogenesis, pusing ganti, dan pembentukan semula ECM, embriogenesis, dan pembaikan luka; bagaimanapun, apabila MMP terlepas daripada mekanisme pengawalseliaan ia menjadi berbahaya (Rosenberg 2009; Agrawal et al. 2008).

Dalam hal ini, diketahui bahawa perubahan dalam ekspresi dan aktiviti MMP adalah peristiwa patogenetik utama dalam beberapa gangguan neurologi (Latronico dan Liuzzi 2017; Mastroianni dan Liuzzi 2007; Brkic et al. 2015). Bukti eksperimen telah mencadangkan bahawa dalam kalangan MMP, gelatinase A (MMP-2) dan B (MMP-9) terlibat terutamanya dalam keradangan saraf kerana pengawalseliaan mereka mungkin menjejaskan integriti penghalang darah-otak (BBB). Ini membawa kepada peningkatan pengambilan dan penyusupan sel darah periferal imun ke dalam parenkim otak yang mengekalkan proses keradangan yang menyebabkan kehilangan neuron progresif dan fungsi neuron terjejas (Rivest 2009). Beberapa kajian in vitro dan in vivo telah menunjukkan pengeluaran ROS adalah salah satu faktor yang terlibat dalam pengawalseliaan peningkatan ekspresi MMP-9 dalam sel otak melalui mekanisme yang bergantung kepada laluan isyarat mitogen-activated protein kinase (MAPK) (Hsieh dan Yang 2013).

Berdasarkan bukti ini, adalah jelas bahawa downregulation faktor neurotoksik, mengakibatkan pengurangan tindak balas neuroinflamasi, mungkin mewakili strategi terapeutik yang berkesan untuk mencegah permulaan atau mengurangkan perkembangan penyakit otak.

Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, minat bioperubatan dalam bidang neurologi semakin tertumpu pada penyelidikan sebatian semula jadi yang mampu memodulasi proses yang berkaitan dengan tindak balas neuroinflamasi. Dalam hal ini, beberapa kajian telah menunjukkan bahawa sebatian fitokimia, seperti polifenol, isothiocyanates (ITCs), dan lain-lain, mempunyai potensi neuroprotektif yang juga berasal dari keupayaan mereka untuk menghalang ekspresi MMP dan untuk mengatasi pengeluaran ROS (Dinkova-Kostova dan Kostov 2012; Liuzzi et al. 2007, 2011).

Isothiocyanates adalah metabolit yang dihasilkan oleh beberapa tumbuhan kepunyaan keluarga Brassicaceae sebagai sistem pertahanan terhadap serangan patogen (Bones dan Rossiter 2006). Mereka berasal daripada degradasi enzimatik glukosinolat (GSL) oleh enzim myrosinase. ITC terdapat dalam sayur-sayuran silang yang biasa dimakan seperti brokoli, pucuk Brussels, kubis, lobak, lobak pedas, kohlrabi, sawi, lobak, selada air dan kangkung. Jumlah mereka dalam makanan sangat berubah-ubah dan bergantung kepada pemprosesan dan penyediaan makanan.

Baru-baru ini ia telah menunjukkan bahawa ITC mempunyai pelbagai kesan terapeutik, termasuk tindakan antioksidan, antibakteria, anti-radang dan kemopencegahan (Dufour et al. 2015; Marzocco et al. 2015).

Aktiviti perlindungan ITC dijalankan melalui modulasi laluan isyarat berbeza yang terlibat dalam detoksifikasi, keradangan, apoptosis, dan peraturan kitaran sel. Beberapa bukti menunjukkan bahawa sifat anti-karsinogenik dan anti-radang ITC boleh dikaitkan terutamanya dengan keupayaannya untuk mengaktifkan laluan faktor 2 (Nrf2) faktor nuklear erythroid 2-berkaitan. Nrf2 ialah faktor transkrip sensitif redoks yang dengan kehadiran agen elektrofilik dan keadaan tegasan oksidatif translokasi ke dalam nukleus di mana ia mengikat unsur tindak balas antioksidan (ARE), mendorong ekspresi gen sitoprotektif yang terlibat dalam detoksifikasi dan dalam modulasi keadaan oksidatif dan proses keradangan (Heiss et al 2001). Dalam hal ini, telah dilaporkan bahawa ITC mampu meningkatkan kapasiti antioksidan sel manusia dengan mendorong ekspresi enzim detoksifikasi fasa II dan dengan pengawalan peningkatan pengeluaran GSH (Wagner et al 2010). Tambahan pula, telah dilaporkan kewujudan perbincangan silang antara Nrf2 dan laluan faktor nuklear (NF) -κB yang mengakibatkan modulasi keradangan (Sturm dan Wagner 2017; Lee dan Johnson 2004). Dalam hal ini, pelbagai model eksperimen in vitro dan in vivo neuroinflammation telah menunjukkan bahawa ITC mampu mengurangkan translokasi NF-κB dengan ketara dengan perencatan akibat sitokin proinflamasi dan MMP (Lee et al. 2015; Subedi et al. 2017).

Dalam kertas kerja ini, kami menyiasat kesan tiga ITC iaitu Allyl isothiocyanate (AITC), 2-Phenethyl isothiocyanate (PEITC) dan 2-Sulforaphane (SFN) ke atas pelepasan MMP-2 dan -9 serta pada pengeluaran ROS oleh astrosit yang diaktifkan LPS. Keputusan kami membuktikan bahawa PEITC, SFN dan AITC berupaya menghalang ekspresi in vitro MMP-9 dan MMP-2 dalam astrosit yang diaktifkan LPS dan untuk mengatasi pengeluaran ROS yang disebabkan oleh H2O2. Di samping itu, kami menunjukkan bahawa ITC memodulasi ekspresi berlebihan MMP dengan mekanisme yang berkaitan dengan perencatan aktiviti kinase protein terkawal ekstraselular (ERK). Keputusan ini menunjukkan bahawa diet yang kaya dengan sayur-sayuran Cruciferous mungkin mempunyai potensi manfaat untuk pencegahan dan rawatan pelengkap penyakit saraf.

Bahan dan kaedah

Bahan kimia dan reagen

Medium Eagle's modified Dulbecco (DMEM), serum lembu janin (FBS), penisilin, dan streptomycin disediakan oleh GIBCO (Paisley, Scotland). Gelatin, DNase 1, poli-L-lisin

(PLL), trypsin, lipopolysaccharide (LPS), Trypan Blue dan 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2.5-diphenyltetrazolium bromide (MTT ), Alyl isothiocyanate (AITC) [cod. 377,430, ketulenan 95 peratus (HPLC)], 2-Phenethyl isothiocyanate (PEITC) [cod. 253,731, ketulenan 99 peratus )], 2-Sulfraphane (SFN) [cod. S6317, ketulenan Lebih daripada atau sama dengan 95 peratus (HPLC)] disediakan daripada Sigma (St. Louis, MO, Amerika Syarikat). 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) telah dibeli daripada Calbiochem. Protein standard dan R-250 Coomassie Brilliant Blue adalah daripada Bio-Rad (Hercules, CA, USA). Antibodi anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) (RRID: AB_2294571) telah dibeli daripada Serotec (Oxford, UK). Antibodi terhadap kinase protein terkawal ekstraselular (ERK) 1/2, dan fosforilasi ERK 1/2 (p-ERK 1/2) adalah dari Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Membran PVDF Hybond-P, Sistem Analisis Pemadaman Barat (ECL) chemiluminescence yang dipertingkatkan dan antibodi sekunder anti-tikus-HRP adalah daripada GE

Sains Hayat Penjagaan Kesihatan (Little Chalfont, Buckinghamshire,

United Kingdom). Pasangan primer khusus untuk MMP-2, MMP-9 dan 18S rRNA adalah daripada Sigma Genosys (Cambs, UK). Kit mini RNeasy dan kit Transkripsi Terbalik QuantiTect telah dibeli dari Qiagen (Valencia, CA, Amerika Syarikat). Reagen Campuran Induk Econo- Taq PLUS HIJAU 2X untuk PCR telah dibeli daripada Lucigen Corporation (Middleton, WI, Amerika Syarikat).

Kenyataan etika

Eksperimen yang melibatkan haiwan telah dijalankan mengikut cadangan dalam Panduan NIH untuk Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Makmal dan dengan kelulusan Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi Universiti Bari, Itali (Nombor Permit: 23-98- A).

Penyediaan kultur astrocyte

Astrocytes disediakan daripada tisu neokortikal {{0}}tikus Wistar berumur sehari (RRID: RGD_737960, Harlan Laboratories srl, Udine, Itali). Untuk penyediaan astrocytes 6 litters of 12 pups, setiap kedua-dua jantina digunakan. Haiwan-haiwan itu telah dimatikan dengan pendedahan kepada karbon dioksida (CO2) dan dibunuh dengan memenggal kepala yang cepat. Tisu neokortikal telah dibedah dan digunakan untuk pemurnian kultur sel glial primer mengikut kaedah yang dilaporkan oleh Latronico et al. (2018). Secara ringkas, selepas pembedahan, otak tikus telah kehabisan meninges dan saluran darah, dicincang mekanikal dan dihadam dengan 0.25 peratus trypsin dengan kehadiran 0.01 peratus DNase. Selepas sentrifugasi dan penilaian daya maju sel, sel disalut dalam kelalang bersalut PLL (75 cm2) pada ketumpatan 1.5 × 107 sel/kelalang dalam DMEM, 10 peratus FBS, 100 IU mL −1 penisilin, 100 µg mL −1 streptomycin , dan dikekalkan pada 37 darjah dalam CO2 5 peratus. Selepas 7 hari, kelalang digoncang untuk mengeluarkan oligodendrosit dan mikroglia. Ketulenan astrosit, yang diperoleh melalui trypsinization (0.25 peratus trypsin / 0.02 peratus EDTA), dinilai dengan imunostaining untuk GFAP.

Rawatan astrosit yang diaktifkan LPS dengan Allyl isothiocyanate, Phenethyl isothiocyanate atau 2‑Sulfraphane

Astrosit konfluen, disemai dalam 96 plat telaga, telah dirangsang dengan 10 µg mL −1 LPS dan secara serentak dirawat dengan kepekatan Allyl isothiocyanate (AITC), 2-Phenethyl isothiocyanate (PEITC) atau 2-Sulforaphane yang berbeza. (SFN) dalam DMEM tanpa serum. Astrocytes dalam DMEM bebas serum dan astrocytes diaktifkan LPS mewakili kawalan negatif dan positif, masing-masing. Di samping itu, kerana penyelesaian stok AITC (100 µM), PEITC (67 µM), dan SFN (56.4 µM) dibuat dalam DMSO, lengkung tindak balas dos kepada DMSO, dicairkan dalam medium kultur pada kepekatan pelarut yang sama yang terdapat dalam sampel yang dianalisis, dijalankan untuk menganggarkan ketoksikan kompaun. Selepas 20 jam pengeraman pada 37 darjah, 5 peratus CO2 supernatan dikumpul dan disimpan pada -20 darjah sehingga digunakan manakala sel telah tertakluk kepada ujian MTT untuk menilai daya maju sel.

Ujian daya maju sel MTT

Sitotoksisiti AITC, PEITC dan SFN pada astrocytes telah dikesan menggunakan MTT [{{0}}(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,{{5 }}difenil tetrazolium bromida] ujian. Ujian ini adalah berdasarkan pengurangan MTT oleh mitokondria suksinat dehidrogenase dalam sel yang berdaya maju, kepada produk formazan biru yang tidak larut yang boleh diukur secara spektrofotometri. Secara ringkas, selepas rawatan selama 20 jam dengan AITC, PEITC atau SFN, medium kultur telah dikeluarkan dan sel-sel telah dimuatkan dengan 0.5 mg mL-1 MTT. Selepas pengeraman selama 2 jam pada 37 darjah, medium CO2 5 peratus telah dikeluarkan dan hablur formazan dalam sel telah dilarutkan dengan 90 peratus etanol. Selepas menggoncang plat selama 15 minit untuk mendapatkan pelarutan kristal yang lengkap, kuantiti produk formazan ditentukan oleh penyerapan optik pada 560 nm dengan panjang gelombang rujukan 690 nm. Daya maju sel dinyatakan sebagai peratusan kawalan (CTRL), diwakili oleh sel yang tidak dirawat, yang ditetapkan pada 100 peratus . Bagi setiap sebatian, lengkung tindak balas dos daya maju sel diperolehi.

Pengesanan spesies oksigen reaktif

Pengesanan spesies oksigen reaktif (ROS) dilakukan dengan memuatkan astrosit dengan 10 μM 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) dalam DMEM bebas merah fenol pada 37 darjah selama 30 minit. Kemudian DCFH-DA dikeluarkan dari telaga dan sel dirawat selama 1 jam dengan AITC (400 μM), PEITC (10 μM) atau SFN (25 μM) dalam DMEM bebas merah fenol dengan kehadiran H2O2 pada kepekatan akhir 100 μM . Sel yang dirawat hanya dengan DCFH-DA atau dengan H2O2 masing-masing mewakili kawalan negatif (CTRL) dan positif (H2O2). Selepas sel inkubasi dibilas dengan PBS dan dilisiskan dengan

Tris–HCl 10 mM/NaCl 150 mM/Triton X-100 0.5 peratus , pH 7.5,

kemudian disentrifugasi pada 10,000×g, 4 darjah selama 10 min. Supernatan dikumpulkan dan analisis spektrofluorimetrik mereka dilakukan pada 525 nm di bawah pengujaan pada 485 nm. Keputusan telah dinormalisasi kepada jumlah kandungan protein dan pengeluaran ROS dinyatakan sebagai peratusan relatif intensiti photoluminescence (PL) berbanding kawalan positif.

Pengesanan gelatinase

Aktiviti gelatinase dalam supernatan sel (SNs) dikesan oleh analisis zymografi seperti yang dilaporkan oleh Latronico et al. (2013). Secara ringkas, sejumlah SN, bersamaan dengan kira-kira 10 µg jumlah protein, telah dilarutkan dengan 30 µl penimbal sampel Laemmli tanpa -mercaptoethanol. Sampel dijalankan dalam gel poliakrilamida 7.5 peratus yang dikopolimerkan dengan gelatin 0.1 peratus (berat/v). Selepas larian elektroforesis, gel dibilas dua kali dengan 2.5 peratus Triton X-100/10 mM CaCl2 dalam 50 mM Tris–HCl, pH 7.4 dan diinkubasi selama 24 jam pada 37 darjah dalam 1 peratus Triton X-100 /50 mM Tris–HCl/10 mM CaCl2, pH 7.4. Gel telah diwarnakan dengan Coomassie biru cemerlang R-250 dan ditapis dalam metanol/asid asetik/H2O (4:1:5 v/v). Aktiviti gelatinase telah divisualisasikan sebagai jalur pencernaan yang jelas pada latar belakang biru gel dan dikira dengan analisis imej densitometrik berkomputer menggunakan Perisian Image LabTM (Bio-Rad Laboratories). Gelatinase

aktiviti dinyatakan sebagai ketumpatan optik (OD) × mm2, mewakili kawasan pengimbasan di bawah lengkung yang mengambil kira kedua-dua kecerahan dan lebar zon lisis substrat. Data dinyatakan menggunakan persamaan berikut: peratus perencatan=[100 − (sampel OD/kawalan positif OD) × 100].

Tindak balas rantai transkripsi‑polimerase terbalik (RT‑PCR)

Astrocytes, disemai dalam 6 plat telaga, diaktifkan dengan LPS (10 µg mL−1) dan secara serentak dirawat dengan ITC pada kepekatan bukan toksik maksimum. Selepas 20 jam pengeraman jumlah RNA diekstrak daripada astrosit menggunakan kit mini Qiagen RNeasy mengikut arahan pengilang. DNA pelengkap (cDNA) telah disintesis daripada 500 ng RNA dengan menggunakan kit Transkripsi Terbalik QuantiTect mengikut arahan pengilang. Sebanyak 25 ng produk transkripsi terbalik telah digunakan untuk menguatkan serpihan 591 bp menggunakan primer tertentu (rasa 5′-GTC ACT CCG CTG CGC TTT TCT CG-3′; antisense 5′-GAC ACA TGG GGC ACC TTC TGA-3′) untuk jujukan MMP{14}} tikus dan serpihan 541 bp menggunakan primer khusus (rasa 5′-CGG AGC ACG GGG ACG GGT ATC 3′; anti-deria 5′-AAG ACG AAG GGG AAG ACG CAC ATC 3′) untuk jujukan MMP{23}} tikus. Secara selari, penguatan serpihan 308 bp tikus 18S rRNA (rasa 5′-GCCTAGATA CCGCAGCTAGGA-3′; antisense 5′-TCATGGCCTCAG TTCCGAA-3′), gen rujukan dalaman yang agak invarian, telah dilakukan . Set primer, yang telah disahkan dalam kajian lain (Latronico et al. 2013; Liuzzi et al. 2004; Gramegna et al. 2011) secara khusus mengiktiraf hanya gen yang diminati seperti yang ditunjukkan oleh penguatan jalur tunggal saiz PCR yang dijangkakan. produk. Penguatan PCR telah dijalankan selama 25 kitaran setiap satu terdiri daripada denaturasi pada 94 darjah, penyepuhlindapan pada 59 darjah, dan lanjutan pada 72 darjah. Selepas amplifikasi, produk dianalisis dalam 1.5 peratus gel agarose. Selepas analisis densitometrik gel, penguatan gen sasaran telah dinormalisasi kepada ekspresi rRNA 18S, dan keputusan dinyatakan sebagai peratusan perencatan berbanding kawalan positif seperti yang dilaporkan untuk kuantifikasi gelatinase.

Pengesanan fosforilasi ERK 1/2 oleh analisis western blot

ERK 1/2 telah dikesan oleh analisis imunoblot seperti yang dilaporkan dalam Latronico et al. (2018). Secara ringkas, konfluen primer

astrosit disalut dalam {{0}}plat perigi, dibuat senyap dalam medium bebas serum selama 24 jam, telah dirawat selama 1 jam dengan AITC (400 μM), PEITC (10 μM), atau SFN (25 μM) dalam DMEM bebas merah fenol. Selepas rangsangan selama 2 jam dengan 10 ug mL−1 LPS, sel telah dilisiskan dengan 20 mM Tris–HCl, 150 mM NaCl, 2.5 mM Na-pirofosfat, 1 mM -gliserofosfat 1 peratus Triton X-100, 1 mM fenilmetilsulfonil fuorida, 20 ug/mL aprotinin, 1 mM EGTA, 1 mM Na-fuorida, 1 mM Na3VO4, pH 7.5. Enam puluh ug daripada jumlah protein setiap sampel telah diselesaikan oleh 10 peratus elektroforesis gel SDS-polyacrylamide dan protein kemudiannya diimunoblot ke membran polivinilidena difluorida. Selepas menyekat semalaman pada 4 darjah dengan 0.05 peratus Tween 20, 1 peratus susu, 1 peratus albumin serum lembu dalam 150 mM NaCl, 20 mM Tris–HCl (pH 7.5), membran telah disiasat semalaman pada 4 darjah dengan anti-p- monoklonal. ERK 1/2 antibodi (1:500). Kemudian membran dicuci tiga kali dengan 0.05 peratus Tween 20 dalam garam Tris-buffered, disiasat dengan antibodi sekunder peroksidase anti-tikus-lada kuda (1:20,000) selama 2-h pada 24 darjah dan dikesan dengan chemiluminescence yang dipertingkatkan. Untuk menilai jumlah ERK, membran dilucutkan dan diinkubasi dengan antibodi khusus untuk ERK 1/2 (1: 500) yang tidak berfosforilasi. Keamatan jalur dikira dengan pengimbasan densitometrik bintik dan tahap fosforilasi ERK 1/2 telah dinormalisasi kepada ERK 1/2 bukan fosforilasi dan dinyatakan sebagai peratusan berbanding dengan kawalan positif (astrosit dirawat dengan LPS), mengikut persamaan berikut:

peratus pERK 1/2=(ODsample/OD kawalan positif) × 100.

Analisis statistik

Analisis data dilakukan dengan menggunakan GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Data dinyatakan sebagai nilai min ± SD. Analisis statistik telah dijalankan menggunakan analisis varians sehala (ANOVA) diikuti dengan ujian post hoc Perbandingan Berbilang Dunnett.

Keputusan

Kesan sebatian isothiocyanate pada daya maju astrocyte

Eksperimen awal telah dilakukan untuk menilai sitotoksisiti AITC, PEITC, atau SFN. Untuk tujuan ini, astrosit yang telah disucikan dirawat selama 20 jam dengan sebatian ITC pada kepekatan antara 5 dan 400 µM atau dengan DMSO yang dicairkan dalam medium kultur seperti yang diterangkan dalam Bahagian Kaedah. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1, DMSO tidak toksik pada semua kepekatan yang digunakan yang sepadan dengan penyelesaian ITC yang diuji. Antara ITC yang disiasat, AITC

Rajah 1 Daya maju sel astrosit yang dirawat dengan sebatian isothiocyanate. Astrosit primer konfluen dirawat selama 20 jam dengan Allyl isothiocyanate (AITC), 2-Phenethyl isothiocyanate (PEITC), atau 2-Sulforaphane (SFN) pada kepekatan yang ditunjukkan kemudian tertakluk kepada ujian MTT. Di samping itu, kerana ia dalam larutan stok telah dilarutkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO), lengkung tindak balas dos kepada DMSO, dicairkan dalam medium kultur pada kepekatan pelarut yang sama ( peratus ) yang terdapat dalam sampel ITC dijalankan dalam setiap eksperimen untuk mendapatkan anggaran ketoksikan ITC yang boleh dipercayai. Kawalan (CTRL) adalah mewakili

wangi daripada astrocytes yang tidak dirawat dalam DMEM tanpa serum. Graf mewakili lengkung tindak balas dos daya maju sel, dinyatakan sebagai peratusan kelangsungan hidup sel berbanding dengan kawalan. Dos sebatian yang menentukan daya maju sel melebihi 60 peratus telah dipilih sebagai kepekatan bukan toksik maksimum. Nilai ialah min ± SD bagi n=3 percubaan yang dilakukan pada populasi sel yang berbeza. Mikrograf menunjukkan hasil perwakilan morfologi sel yang diperhatikan di bawah mikroskop fasa kontras (pembesaran 50X) selepas rawatan dengan sebatian berbeza

adalah kurang toksik untuk astrosit. Khususnya, AITC tidak toksik untuk sel sehingga 400 µM manakala PEITC dan SFN adalah toksik pada kepekatan melebihi 10 dan 25 µM, masing-masing. Pemerhatian mikroskopik mengesahkan keputusan ujian MTT yang menunjukkan bahawa pada kepekatan toksik PEITC dan SFN, bilangan astrosit berkurangan dan yang tinggal menunjukkan perubahan sitotoksik dalam sitoplasma mereka.

Kesan perlindungan sebatian ITC pada pengeluaran ROS dalam astrosit yang dirawat hidrogen peroksida

Untuk menilai kesan perlindungan ITC terhadap tekanan oksidatif, astrosit telah dirawat terlebih dahulu dengan PEITC, AITC, dan SFN pada kepekatan bukan toksik maksimum kemudian dirangsang dengan H2O2. Pengeluaran ROS intraselular, yang disebabkan oleh H2O2, telah diuji oleh DCFH-DA. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2, pendedahan kepada H2O2 meningkatkan isyarat pendarfluor masuk

Rajah 2 Pengeluaran spesies oksigen reaktif (ROS) dalam astrosit yang dirawat dengan ITC. Kehadiran ROS telah diuji dengan mengukur perubahan isyarat pendarfluor 2', 7'-dichlorofluorescein (DCFA) seperti yang dilaporkan dalam bahagian Bahan dan Kaedah. Astrocytes, disemai dalam 6 plat telaga, telah dirawat terlebih dahulu selama 30 min dengan DCFA kemudian dirawat selama 1 jam dengan 10 μM PEITC, 400 μM AITC, atau 25 μM SFN dengan kehadiran H2O2 pada kepekatan akhir 100 μM . Astrocytes yang dirawat dengan DCFA sahaja (CTRL) atau dengan 100 μM H2O2 mewakili kawalan negatif dan positif, masing-masing. Isyarat pendarfluor yang dikesan dalam lisat sel diukur oleh fluorometer pada 525 nm di bawah pengujaan pada 485 nm. Pengeluaran ROS dinyatakan sebagai peratusan ( peratus ) intensiti photoluminescence (PL) berbanding kawalan positif. Nilai ialah min ± SD daripada n=3 percubaan yang dilakukan pada populasi sel yang berbeza. Penurunan ketara secara statistik berbanding dengan H2O2 ditunjukkan oleh asterisk (ANOVA sehala diikuti oleh ujian post hoc Dunnet; *p <>

astrosit berbanding kawalan (CTRL). Seperti yang dibuktikan oleh penurunan intensiti pendarfluor DCF, pra-rawatan astrosit dengan sebatian ITC mengatasi penjanaan ROS yang disebabkan oleh H2O2. Antara ITC yang diuji, hanya PEITC dan SFN dapat mengurangkan pengeluaran ROS dengan ketara masing-masing kira-kira 20 dan 24 peratus, berbanding kawalan positif (H2O2).

Sebatian isothiocyanate menghalang tahap MMP‑2 dan MMP‑9 dalam astrosit yang diaktifkan LPS

Kesan sebatian ITC pada tahap MMP-2 dan MMP-9 telah dinilai pada astrosit yang diaktifkan dengan LPS, yang diketahui dapat mendorong ekspresi gelatinase (Gottschall dan Deb 1996), dan pada masa yang sama dirawat dengan AITC, PEITC, atau SFN dalam julat kepekatan yang tidak toksik untuk sel. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3a, dua jalur jelas pencernaan 72 dan 92 kDa hadir pada gel yang sepadan, masing-masing, dengan MMP-2 dan MMP-9. Pengaktifan astrosit dengan LPS meningkatkan tahap MMP-2 dan mendorong sintesis MMP-9. Rawatan dengan AITC (Rajah 3b), PEITC (Rajah 3c), atau SFN (Rajah 3d) menentukan dos yang bergantung kepada

pengurangan tahap MMP-9, yang berbeza-beza bergantung pada kompaun yang digunakan. Khususnya, antara ITC yang digunakan, SFN adalah yang paling berkesan dalam menghalang MMP-9 kerana ia menentukan perencatan 70 peratus pada dos 10 μM dan perencatan 100 peratus pada dos 25 μM. Di samping itu, hanya SFN pada kepekatan bukan toksik maksimum dapat menghalang MMP-2 dengan ketara (Rajah 2d).

Sebatian isothiocyanate menghalang ekspresi gen MMP‑2 dan MMP‑9 dalam astrosit yang diaktifkan LPS

Untuk menentukan sama ada sebatian ITC yang dikaji dapat menghalang ekspresi MMP-2 dan MMP-9, RT-PCR dilakukan pada astrosit diaktifkan LPS yang dirawat dengan kepekatan ITC bukan toksik maksimum. Seperti yang ditunjukkan dalam gel perwakilan dalam Rajah 4a, rawatan astrosit yang diaktifkan LPS dengan ITC individu dapat mengatasi peningkatan ekspresi MMP-2 dan MMP-9 mRNA. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4b, analisis kuantitatif keputusan, membuktikan bahawa, pada kepekatan maksimum bukan toksik, sebatian ITC, menentukan perencatan ketara secara statistik bagi ekspresi MMP-9 dan MMP-9 berbanding kepada kawalan positif (LPS). Khususnya, PEITC dan SFN menggunakan peratusan perencatan yang sama pada MMP-2 (85 peratus ) dan MMP-9 (100 peratus ) manakala AITC kurang berkesan berbanding PEITC dan SFN dalam menghalang MMP{{17} } (65 peratus ) dan MMP-9 (90 peratus ) ungkapan.

ERK 1/2 terlibat dalam perencatan ekspresi MMP oleh ITC

Memandangkan ERK 1/2 ialah laluan transduksi isyarat utama yang terlibat dalam pengawalseliaan ekspresi MMP-2 dan MMP-9 dalam astrosit yang diaktifkan LPS (Lee et al. 2003), kesan sebatian ITC pada pengaktifan kinase protein terkawal ekstraselular (ERK) 1/2 telah diuji.

Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 5 LPS mendorong peningkatan ketara secara statistik dalam tahap ERK 1/2 (p-ERK) terfosforilasi yang telah dilawan oleh pra-rawatan dengan sebatian ITC.

Perbincangan

Secara meluas dipercayai bahawa strategi pertahanan utama terhadap banyak penyakit terdiri terutamanya dalam mengelakkan faktor risiko dan mengamalkan gaya hidup yang betul. Terdapat banyak bukti saintifik yang menyokong hipotesis bahawa beberapa metabolit semula jadi, biasanya dihasilkan oleh pelbagai jenis buah-buahan dan sayur-sayuran mampu memodulasi fenomena patologi seperti kanser, penyakit saraf, dan penyakit multifaktorial lain. Dalam senario ini, isothiocyanates (ITCs) menimbulkan minat yang besar memandangkan antikulat, antibakteria,

Rajah 3 Kesan sebatian isothiocyanate pada tahap MMP-2 dan MMP-9 dalam astrosit diaktifkan LPS. Dalam a dilaporkan gel zymografik yang mewakili analisis supernatan kultur daripada astrosit yang diaktifkan dengan LPS (10 ug mL-1) dan secara serentak dirawat selama 20 jam dengan AITC, PEITC, atau SFN pada kepekatan yang ditunjukkan (μM). Kawalan negatif dan positif diperoleh daripada astrosit yang tidak dirangsang dan tidak dirawat dalam medium bebas serum (CTRL) dan LPS-

sel diaktifkan (LPS), masing-masing. Histogram b–d mewakili keputusan (min ± SD) bagi n {{0}} eksperimen yang dilakukan pada populasi sel yang berbeza, dinyatakan sebagai peratusan perencatan MMP berbanding dengan LPS, dikira selepas mengimbas densitometri dan analisis berkomputer bagi gel . Penurunan ketara secara statistik berbanding dengan LPS ditunjukkan oleh asterisk (ANOVA sehala diikuti oleh ujian post hoc Dunnet; *p < 0.05,="" **p=""><>

sifat biologi antikarsinogenik, antimutagenik, antioksidan dan anti-radang (Dufour et al. 2015; Marzocco et al. 2015; Vig et al., 2009; Talalay dan Fahey 2001). Isothiocyanates berasal daripada degradasi enzimatik glukosinolat (GSL) yang merupakan metabolit sekunder yang terdapat dalam 15 keluarga botani dari ordo Capparales dan sangat banyak dalam keluarga Brassicaceae (Fahey et al. 2001). GSL dihidrolisiskan oleh myrosinase ( -thioglucoside glucohydrolase e; EC 3.2.3.147) dalam pelbagai komponen seperti ITC, nitrit, tiosianat, epithionitriles, SFGate, glukosa, dan oksazolidin (Li dan Kushad 2005). Walaupun ITC telah dikaji secara meluas dalam bidang kemoterapeutik (Grundemann dan Huber 2018), beberapa penyiasatan telah dibuat tentang potensi terapeutik mereka dalam penyakit neurologi walaupun ia telah menunjukkan keupayaan SFN dan AITC untuk menyeberangi BBB dan terkumpul ke dalam parenkim otak. (Clarke et al. 2011; Jazwa et al. 2011; Zhang 2010). Dalam kertas ini, kami membandingkan kesan tiga ITC,

terdapat dalam beberapa sayur-sayuran salib yang biasa dimakan, pada pengeluaran spesies oksigen reaktif (ROS) dan ekspresi matriks metalloproteinase (MMP) dalam model in vitro neuroinflammation yang diwakili oleh astrosit yang diaktifkan dengan lipopolisakarida (LPS) atau dirawat dengan H2O2. Astrocytes, jenis sel glial yang paling banyak dalam CNS, memainkan peranan penting dalam penyelenggaraan homeostasis otak dan merupakan ciri penyakit neurologi yang berbeza (Cekanaviciute dan Buckwalter 2016; Colombo dan Farina 2016). Mereka dianggap sebagai pengawal selia penting bagi tindak balas imun semula jadi dan tindak balas mereka terhadap penghinaan berbahaya, seperti tekanan oksidatif, boleh memburukkan lagi tindak balas keradangan dan kerosakan tisu atau menggalakkan pembaikan tisu. Adalah diketahui umum bahawa astrosit yang diaktifkan menghasilkan faktor neurotoksik seperti MMP yang mempunyai peranan penting dalam menggalakkan keradangan saraf dan kehilangan neuron progresif dalam penyakit neurologi (Hsieh dan Yang 2013). Oleh itu, modulasi daripada

Rajah 4 Kesan sebatian ITC pada ekspresi MMP-2 dan MMP-9 dalam astrosit diaktifkan LPS. Astrocytes, disemai dalam 6 plat telaga, diaktifkan dengan LPS (10 µg mL-1) dan secara serentak dirawat selama 20 jam dengan AITC (400 μM), PEITC (10 μM) atau SFN (25 μM), kemudian tertakluk kepada RT-PCR. Gel agarose mewakili ekspresi MMP-2 dan MMP-9 dilaporkan dalam (a). Histogram dalam (b) mewakili keputusan (min ± SD) bagi n=3 percubaan yang dilakukan pada sel berbeza

peristiwa yang berlaku selepas pengaktifan astrocytes boleh mengurangkan tindak balas keradangan dan kerosakan neuron.

Keputusan kajian ini menunjukkan bahawa dalam kalangan ITC yang dikaji, AITC adalah kurang toksik kerana ia tidak menyebabkan sebarang pengurangan daya maju sel pada semua kepekatan yang digunakan. Sebaliknya, sama seperti apa yang telah diperhatikan oleh pengarang lain pada pelbagai garisan sel glial, PEITC dan SFN menunjukkan ketoksikan selular pada kepekatan lebih besar daripada 10 dan 25 µM, masing-masing (Lee et al. 2015; Eren et al. 2018; Su et al. . 2015).

Dalam kesusasteraan saintifik semasa, terdapat banyak data kontroversial mengenai mekanisme molekul yang mendasari kesan ITC terhadap daya maju sel. Dalam hal ini, kebanyakan kajian telah mencadangkan bahawa ITC menghalang apoptosis yang mendorong pertumbuhan selular, penahanan kitaran sel, penjanaan ROS dalam sel kanser tetapi tidak dalam sel normal (Fofaria et al. 2015; Qin et al. 2018; Sestili dan Fimognari 2015). Kami mendapati bahawa SFN dan PEITC, tetapi bukan AITC, mempunyai peranan perlindungan terhadap tekanan oksidatif dalam astrocytes, sememangnya pada kepekatan bukan toksik maksimum mereka dapat mengatasi pengeluaran ROS yang disebabkan oleh pendedahan kepada H2O2. CNS amat terdedah kepada tekanan oksidatif kerana penggunaan oksigennya yang tinggi, sistem antioksidan yang lemah, dan kandungan biomakromolekul yang tinggi yang mudah terdedah kepada pengoksidaan. Penjanaan ROS dan kerosakan oksidatif dipercayai terlibat dalam patogenesis gangguan neurologi seperti penyakit Alzheimer (AD), penyakit Parkinson (PD), Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), dan Multiple Sclerosis (MS) (Lee et al. 2015). Oleh itu, walaupun dalam eksperimen in vitro kami SFN dan PEITC mengatasi pengeluaran ROS ke tahap yang sederhana, kami mungkin mengandaikan bahawa dalam vivo pentadbiran ITC yang berpanjangan boleh membawa kepada pengurangan ROS yang lebih ketara yang, dari masa ke masa, boleh menghasilkan bermakna. untuk populasi yang dinyatakan sebagai peratusan perencatan MMP berbanding dengan kawalan positif (LPS), dikira selepas mengimbas densitometri dan analisis berkomputer bagi gel. Penurunan ketara secara statistik bagi ungkapan MMP-2 dan MMP-9 berbanding dengan LPS ditunjukkan oleh asterisk (ANOVA sehala diikuti dengan ujian post hoc Dunnet; *p <>

pencegahan dan modulasi penyakit otak. ROS bertindak sebagai molekul isyarat kritikal untuk mencetuskan lata tindak balas keradangan ke dalam CNS. Dalam hal ini, diketahui umum bahawa ROS mengawal ekspresi banyak gen yang terlibat dalam neuroinflammation melalui pengaktifan faktor transkripsi pro-radang seperti faktor nuklear-κB (NF-κB) (Lee et al. 2015; Chiurchiù et al. 2016; Martorana et al. 2019). Dalam senario ini, peranan penting dimainkan oleh MMP yang ekspresinya dikawal selia oleh ROS melalui pengaktifan NF-κB (Yan dan Boyd 2007).

Oleh kerana disregulasi MMP menyumbang kepada patogenesis pelbagai penyakit neuroinflamasi dan neurodegeneratif, perencatan mereka mewakili strategi terapeutik yang penting. Atas sebab ini, minat yang semakin meningkat telah tertumpu pada dekad yang lalu terhadap potensi ubat dan sebatian semula jadi untuk menghalang MMP. Banyak kajian in vitro telah membuktikan bahawa tindakan anti-radang dan antioksidan beberapa ubat dan sebatian bioaktif yang terdapat dalam sayur-sayuran dan organisma marin dikaitkan dengan kebolehan mereka untuk menghalang ekspresi MMP (Latronico et al. 2016, 2018; Di Bari et al . 2015). Dalam kajian ini, kami menunjukkan bahawa antara ITC yang diuji, SFN dan PEITC adalah yang paling berkesan dalam menghalang tahap dan ekspresi MMP-2 dan MMP-9 dalam astrosit yang diaktifkan LPS. Perencatan MMP oleh ITC telah dilaporkan dalam kajian in vivo dan in vitro yang lain. Khususnya, Li et al. (2013) menunjukkan bahawa SFN mampu mengurangkan kerosakan BBB dengan menghalang ekspresi MMP-9 dalam model in vivo encephalomyelitis autoimun eksperimen. Pengarang lain melaporkan bahawa SFN dapat melemahkan ekspresi MMP-9 berikutan kecederaan saraf tunjang pada tikus (Mao et al. 2010a). Di samping itu, kajian in vitro menunjukkan bahawa penindasan oleh ITC terhadap penghijrahan sel dan

Rajah 5 Kinase terkawal isyarat ekstraselular 1/2 (ERK 1/2) terlibat dalam perencatan ekspresi MMP oleh sebatian ITC. Filem autoradiografi perwakilan analisis blotting barat lisat daripada astrocytes pra-rawat selama 1 jam dengan AITC (400 μM), PEITC (10 μM) atau SFN (25 μM), dan kemudian diaktifkan selama 2 jam dengan LPS (10 ug mL{{ 13}}). Sel yang tidak dirawat dan tidak dirangsang mewakili kawalan negatif (CTRL). Histogram dalam (b) mewakili pencerobohan tahap pERK1/2 dalam sel glioma C6 dikaitkan dengan perencatan ekspresi MMP-9 yang dimediasi oleh NF-κB (Lee et al. 2015).

Mekanisme molekul yang mana ITC menghalang MMP tidak jelas, dan tidak ada kajian yang menyiasat sifat antioksidan dan anti-radang ITC pada kultur astrocyte primer. Beberapa kajian menyokong hipotesis bahawa kesan perencatan ITC adalah akibat daripada keupayaan mereka untuk menyekat NF-κB oleh laluan isyarat Nrf2. Dalam hal ini, bukti kajian in vivo bahawa tikus kalah mati Nrf2 lebih terdedah kepada tindak balas keradangan pengantara NF-κB saraf tunjang dan kepada peningkatan ekspresi gen yang bergantung kepada NFκB termasuk MMP-9 (Mao et al. 2010b ). Walaupun laluan NF-κB dan Nrf2 boleh saling mempengaruhi, kami menunjukkan bahawa peraturan NF-κB berlaku juga melalui modulasi mekanisme molekul yang bebas oleh Nrf2. Sesungguhnya, kami mendapati bahawa AITC, PEITC, dan SFN menghalang pengaktifan ERK1/2 yang memainkan peranan penting dalam rangkaian peristiwa transduksi isyarat yang akhirnya mengawal transkripsi gen MMP.

Walau bagaimanapun, bukti eksperimen bahawa SFN pada kepekatan bukan toksik maksimum menghalang sepenuhnya ekspresi dan tahap MMP-9 manakala AITC dan PEITC menghalang ekspresi MMP-9 lanjutan maksimum tetapi hanya menurunkan MMP{{3} } kepada sekitar 50 peratus , mungkin mencadangkan bahawa sebatian ini memodulasi transkripsi MMP-9 dengan mekanisme tindakan yang berbeza. Dalam hal ini, telah dilaporkan bahawa SFN, sebagai tambahan kepada perencatan pengaktifan yang disebabkan oleh LPS NF-κB, mengganggu pengikatan LPS kepada reseptor TLR4 (Koo et al 2013). Kesan perencatan SFN pada TLR4 boleh menghalang pengaktifan astrosit oleh LPS dan ini mungkin mengakibatkan perencatan huluan ekspresi MMP-9 dengan akibat kekurangan pengeluaran MMP-9 .

diperoleh selepas pengimbasan densitometrik filem autoradiografi dan normalisasi kepada ERK 1/2 yang tidak berfosforilasi. Data mewakili min ± SD daripada n=3 percubaan yang dilakukan pada populasi sel yang berbeza. Asterisk mewakili nilai yang berbeza secara statistik daripada kawalan positif (astrocytes diaktifkan LPS), yang ditetapkan pada 100 peratus (ANOVA sehala diikuti dengan ujian post hoc Perbandingan Berbilang Dunnett; *p <>

Kesimpulan

Ringkasnya, data kami menunjukkan bahawa rawatan astrosit dengan ITC mengurangkan pembentukan ROS dan menghalang pembebasan MMP-2 dan MMP-9 memberikan pandangan baharu tentang sifat anti-oksidan dan anti-radang ITC pada glial sel. Keputusan ini menunjukkan bahawa ITC boleh menjadi agen nutraseutikal yang menjanjikan untuk pembangunan intervensi neuro-nutrisi, berdasarkan penggunaan makanan yang sihat, untuk pencegahan dan rawatan pelengkap penyakit neurologi.

Pembiayaan Pembiayaan akses terbuka disediakan oleh Università Degli Studi di Bari Aldo Moro dalam Perjanjian CRUI-CARE.

Pematuhan dengan piawaian etika

Konflik kepentingan Pengarang mengisytiharkan tiada konflik kepentingan.

Akses Terbuka Artikel ini dilesenkan di bawah Atribusi Creative Commons 4.0 Lesen Antarabangsa, yang membenarkan penggunaan, perkongsian, penyesuaian, pengedaran dan pengeluaran semula dalam mana-mana medium atau format, selagi anda memberikan kredit yang sewajarnya kepada pengarang asal (s) dan sumber, berikan pautan ke lesen Creative Commons, dan nyatakan jika perubahan telah dibuat. Imej atau bahan pihak ketiga lain dalam artikel ini disertakan dalam lesen Creative Commons artikel itu melainkan dinyatakan sebaliknya dalam garis kredit kepada bahan tersebut. Jika bahan tidak disertakan dalam lesen Creative Commons artikel dan penggunaan anda yang dimaksudkan tidak dibenarkan oleh peraturan berkanun atau melebihi penggunaan yang dibenarkan, anda perlu mendapatkan kebenaran terus daripada pemegang hak cipta. Untuk melihat salinan lesen ini, lawati http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.