Faedah Neuroprotektif Senaman Dan MitoQ Pada Fungsi Ingatan, Dinamik Mitokondria, Tekanan Oksidatif, dan Radang Neuro dalam Tikus Penuaan Akibat D-Galaktosa Bahagian 2

2.6. Penyediaan Tisu

Selepas melengkapkan 8 minggu ujian TE dan tingkah laku ingatan, semua tikus telah disingkirkan melalui penyedutan CO2, dan tisu otak telah dituai daripada 7 haiwan dalam setiap kumpulan rawatan.

Ujian tingkah laku ingatan ialah alat yang berkesan untuk menilai ingatan. Dengan tekanan sosial dan kerja yang semakin meningkat, ingatan orang ramai menjadi semakin penting. Oleh itu, mengambil ujian tingkah laku ingatan boleh membantu kita memahami tahap ingatan kita dan mengambil langkah berkesan untuk memperbaiki dan mengekalkan ingatan kita mengikut keputusan ujian.

Secara khusus, ujian tingkah laku ingatan boleh menilai keupayaan orang untuk menerima, memproses, menyimpan dan mendapatkan maklumat. Melalui ujian pelbagai jenis maklumat seperti bahasa, nombor, imej, dsb., ingatan manusia boleh diuji sepenuhnya. Keputusan ujian akan memberikan pelbagai markah untuk membantu kita memahami kelemahan dan kekuatan kita, dan bagaimana untuk menguatkan ingatan kita.

Dalam amalan, banyak ujian tingkah laku ingatan juga memberikan petua dan cadangan profesional. Contohnya, tidur yang baik, diet seimbang, senaman yang betul, dan senaman otak yang kerap semuanya bermanfaat untuk meningkatkan daya ingatan manusia. Melalui kaedah ini, kita boleh mempertingkatkan masa pengekalan ingatan, keupayaan pembiakan ingatan dan aspek lain, untuk menyesuaikan diri dengan kehidupan harian atau keperluan kerja dengan lebih baik.

Ringkasnya, ujian tingkah laku ingatan sangat berguna untuk memahami, menilai, dan meningkatkan daya ingatan seseorang. Kita juga harus menggunakan kaedah yang sesuai untuk menguatkan ingatan kita mengikut keadaan sebenar kita, untuk meletakkan asas yang kukuh untuk kehidupan yang lebih memuaskan dan kaya. Ia boleh dilihat bahawa kita perlu meningkatkan ingatan, dan Cistanche boleh meningkatkan ingatan dengan ketara kerana Cistanche adalah bahan perubatan tradisional Cina dengan banyak kesan unik, salah satunya adalah untuk meningkatkan daya ingatan. Kesan Cistanche berasal dari pelbagai bahan aktif yang terkandung di dalamnya, termasuk asid tannic, polisakarida, glikosida flavonoid, dll. Bahan-bahan ini boleh menggalakkan kesihatan otak dalam pelbagai cara.

Klik Tahu Memori Jangka Pendek cara menambah baik

Selepas memisahkan korteks serebrum dan hippocampus, tisu otak dibekukan kilat dalam nitrogen cecair dan disimpan pada -80 ◦C sehingga analisis. Baki 5 haiwan digunakan untuk analisis imunohistokimia (IHC).

Selepas membuka rongga toraks, 50 mM phosphate-buffered saline (PBS) telah disalurkan melalui ventrikel kiri selama 10 minit, dan kemudian haiwan itu diserap dengan 4% paraformaldehyde (PFA) dalam 100 mM PBS.

Selepas penetapan perfusi, otak dituai, diletakkan dalam 4% PFA, dan ditetapkan selama 4 jam pada suhu 4 ◦C. Tisu otak tetap direndam dalam larutan sukrosa 30% selama 2 hari dan kemudian dipotong menjadi kepingan setebal 40 µm menggunakan cryostat ( Leica Microsystems, Nussloch, Jerman).

2.7. Pengasingan Mitokondria

Untuk mengasingkan mitokondria, kami menggunakan Kit Pengekstrakan Mitokondria (IMGENEX Corporation, San Diego, CA, USA) mengikut arahan pengilang. Bagi setiap 100 mg tisu hippocampal, 1 mL penimbal homogenisasi telah ditambah.

Selepas homogenisasi, tisu telah disentrifugasi pada 900 × g selama 10 minit pada 4 ◦C, dan supernatan dikumpul dan disentrifugasi semula pada 15,000 × g selama 30 minit pada 4 ◦C.

Mengambil pecahan cytosolic sentrifuge, sitosol dipisahkan, dan pelet selebihnya dicampur dengan teliti dalam penimbal ampaian 1 mLof, sebelum mengempar pada 15,000 × g selama 10 minit pada 4 ◦C.

Supernatan telah dikeluarkan, dan 1 mL lagi penimbal ampaian telah ditambah sebelum dicampur dengan teliti dan mengempar semula pada 15,000 × g selama 10 minit pada 4 ◦C.

Supernatan dikeluarkan, dan pelet yang tinggal dibubarkan dalam 1 mL penimbal lisis mitokondria lengkap selama 30 minit pada 4 ◦C. Ekstrak mitokondria kemudiannya disentrifugasi pada 15,000 × g selama 5 minit pada 4◦C, dan supernatan (pecahan mitokondria) dikumpulkan.

2.8. Western Blotting
Jumlah protein yang diperolehi oleh pengasingan mitokondria dikira menggunakan kaedah Bradford. Jumlah protein mitokondria yang sama (30 µg setiap lorong) telah dimuatkan ke dalam elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-polyacrylamide (SDS-PAGE) (8% atau12%).

Selepas elektroforesis, protein dipindahkan ke membran Polyvinylidene fluoride (PVDF) (Millipore, Boston, MA, USA).

Penyekatan dilakukan selama 1 jam pada suhu bilik menggunakan 1×Tris-buffered saline yang mengandungi larutan Tween-20 (TBS-T) dengan 5% BSA, dan kemudian membran itu bertindak balas dengan antibodi primer semalaman pada suhu 4 ◦C.

Antibodi utama berikut telah digunakan: Mfn1, Mfn2, Opa1, Drp1, Fis1, p22 phox, p47 phox, gp91phox, SOD-2, catalase dan -actin (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, pencairan:1 :1000); dan TNF- (Abcam, Cambridge, UK, pencairan: 1:1000).

Membran itu kemudiannya dibasuh dengan penimbal pencuci (PBS dengan 0.1% Tween 20), selepas itu ia diinkubasi dengan lobak pedas peroksidase (HRP)-konjugasi antibodi sekunder anti-arnab kambing forp22 phox, gp91 phox dan TNF - (Invitrogen, Carlsbad, CA, Amerika Syarikat, pencairan: 1:5000).

Antibodi sekunder anti-tikus kambing konjugasi HRP digunakan untuk Mfn1, Mfn2, Opa1, Drp1, Fis1, p47 phox, SOD-2, catalase dan -actin (Santa Cruz Biotechnology, pencairan: 1:5000).

Tahap ekspresi protein dikesan menggunakan sistem pengesanan ECL Western blotting (Santa Cruz Biotechnology). Ketumpatan jalur protein yang dibangunkan dianalisis menggunakan sistem pengimejan gel ChemiDoc XRS (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, Amerika Syarikat).

2.9. Imunohistokimia (IHC)
Untuk analisis IHC, kaedah terapung bebas digunakan untuk tisu terpilih dalam setiap kumpulan rawatan. Selepas mencuci tisu 3× selama 10 min setiap satu dalam 0.01 M PBS, tisu telah diinkubasi pada 80 ◦C selama 60 minit dalam bikar yang mengandungi 0.01 M natrium sitrat, diikuti dengan menyekat dalam 10% serum keldai biasa (Millipore Sigma, Burlington, MA, Amerika Syarikat).

Sampel tisu kemudiannya bertindak balas dengan antibodi primer anti-p22 phox (Santa Cruz Biotechnology, pencairan: 1:500) dan anti-Glial fibrillary acidic protein (GFAP) (Abcam, pencairan:1:500) selama 12 h pada 4 ◦C. Keesokan harinya, tisu itu dibasuh 3x selama 5 minit setiap satu dalam 0.01 M PBS dan kemudian bertindak balas dengan antibodi sekunder anti-tikus kambing konjugasi HRP (Santa Cruz Biotechnology, pencairan: 1: 5000) pada suhu bilik selama 2 jam.

Akhirnya, tisu itu diinkubasi pada suhu bilik menggunakan kit Vectastain-Elite ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) dan hasilnya divisualisasikan menggunakan Kit Substrat DABPeroxidase (Vector Laboratories).

Setiap kepingan tisu dipasang pada slaid menggunakan medium pelekap (Vector Laboratories) dan diperiksa menggunakan mikroskop cahaya (Leica Microsystems).

2.10. Analisis Statistik

Data dianalisis menggunakan SPSS for Windows Versi 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL,USA). Semua nilai dinyatakan sebagai min ± SEM. Kepentingan statistik ditentukan menggunakan ANOVA sehala. Ujian pos hoc Bonferroni digunakan untuk berbilang perbandingan. Perbezaan dianggap signifikan secara statistik pada p < 0.05.

3. Keputusan

3.1. Kesan Latihan Treadmill dan MitoQ terhadap Ekspresi Protein Berkaitan Dinamik Mitokondria dalam Hippocampus Tikus Penuaan D-Gal

Kami mengesahkan bahawa TE dan MitoQ mempengaruhi faktor berkaitan gabungan mitokondria (Mfn1, Mfn2, Opa1) dan faktor berkaitan pembelahan (Drp1, Fis1) dalam hippocampus tikus penuaan (Rajah 1).

Tahap ekspresi faktor berkaitan gabungan mitokondria berbeza dengan ketara antara kumpulan rawatan (Mfn1, F4,34=134.750, p < 0.001; Mfn2, F4,34=80. 816, p < 0.001;Opa1, F4,34=51.456, p=0.001).

Tahap ekspresi faktor berkaitan pembelahan mitokondria juga berbeza dengan ketara antara kumpulan rawatan (Drp1, F4,34=53.448, p < 0.001; Fis1,F4,34=116 .313, p < 0.001). Keputusan ujian post hoc ditunjukkan dalam Rajah 1.

Berbanding dengan kumpulan Y-CON, ekspresi faktor berkaitan gabungan mitokondria menurun dalam kumpulan D-CON dan menunjukkan peningkatan trend dalam kumpulan D-TE, D-MI, dan D-COMBI.

Sebaliknya, ekspresi faktor berkaitan pembelahan mitokondria Drp1 meningkat dalam kumpulan D-CON berbanding dengan kumpulan Y-CON. Walaupun isyarat pembelahan mitokondria dikurangkan dengan rawatan gabungan dengan TE, rawatan MitoQ sahaja tidak menyebabkan perubahan ketara.

Faktor berkaitan pembelahan mitokondria yang lain, Fis1, menunjukkan trend penurunan yang sama seperti Drp1 tetapi juga dikurangkan oleh rawatan MitoQ sahaja.

Rajah 1. Kesan senaman treadmill dan mitoquinone (MitoQ) pada ekspresi protein berkaitan dinamik mitokondria dalam hippocampus tikus penuaan yang disebabkan oleh D-galaktosa (D-gal). (A) Perwakilan Western blots gabungan mitokondria dan protein berkaitan pembelahan. (B–F) Analisis densitometri jalur blot Barat dinormalkan kepada -Actin. Data yang ditunjukkan dalam Western blot adalah cara dari tujuh otak tikus.

-Actin telah disiasat sebagai kawalan dalaman. Ujian post hoc Bonferroni digunakan selepas ANOVA. Nilai ialah min ± SEM.

a Menandakan perbezaan statistik daripada kumpulan kumpulan kawalan muda (Y-CON). b Menyatakan perbezaan statistik daripada kumpulan D-galaktosa (D-CON). c Menyatakan perbezaan statistik daripada kumpulan D-galaktosa ditambah senaman treadmill (D-TE).

d Menandakan perbezaan statistik daripada kumpulan D-galaktosa tambah MitoQ (D-MI) (p < 0.05). D-COMBI; D-galaktosa ditambah TE dan kumpulan MitoQ.

3.2. Kesan Latihan Treadmill dan MitoQ terhadap Ekspresi Subunit NADPH Oksidase dalam Korteks Serebrum dan Hippocampus Tikus Penuaan D-Gal

Kami memerhatikan perbezaan ketara antara kumpulan rawatan dalam imunoreaktiviti p22 phox dalam korteks serebrum dan hippocampus tikus penuaan (Rajah 2) (CA3,F4,24=18.786, p < 0.{{11 }}01; korteks, F4,24=12.662, p < 0.001).

Dalam korteks, kumpulan D-CON menunjukkan peningkatan imunoreaktiviti p22 phox berbanding dengan kumpulan Y-CON, yang menurun dengan ketara dalam kumpulan D-TE, D-MI, dan D-COMBI.

Dalam CA3, peningkatan imunoreaktiviti p22 phox telah menurun dalam kumpulan D-TE dan D-COMBI berbanding D-CON. Tahap ekspresi protein subunit NOX p22 phox, gp91 phox dan p47phox berbeza dengan ketara antara kumpulan (p22 phox, F4,{{10}}.513, p < 0.{{24} }01; gp91 phox,F4,34=57.282, p < 0.001; p47 phox,34=69.249, p < 0.001).

Keputusan post hoctest menunjukkan peningkatan ketara dalam tahap subunit NOX dalam D-CON berbanding Y-CON. Walau bagaimanapun, tahap subunit NOX adalah lebih rendah dalam semua kumpulan intervensi berbanding kumpulan D-CON.

Khususnya, ekspresi p22 phox dan gq91 phox telah menurun dengan ketara dalam D-TE berbanding kumpulan D-MI. Penemuan ini membayangkan bahawa senaman dan MitoQ secara individu menghalang tekanan oksidatif akibat penuaan di dalam otak, tetapi gabungannya tidak menghasilkan kesan tambahan.

Rajah 2. Kesan senaman treadmill dan MitoQ pada ekspresi subunit NADPH oksidase dalam korteks serebrum dan hippocampus tikus penuaan akibat D-gal. (A1) Fotomikrograf yang menunjukkan imunoreaktiviti phox NAPDH p22 dalam korteks serebrum dan hippocampus tikus penuaan yang disebabkan oleh D-gal dalam setiap kumpulan. Segi empat tepat hitam dalam A1 menunjukkan bahagian imej seperti ditunjukkan dalam f–i dan p–t. (A2, A3) Kuantifikasi ketumpatan optik pewarnaan phox NADPH p22 dalam korteks serebrum dan hippocampus.

Ujian post hoc Bonferroni selepas ANOVA. Nilai dibentangkan sebagai min ± SEM.(n=5 haiwan). (a–e dan k–o) Bar skala=100 µm, (f–j dan p–t) Bar skala=50 µm. (B) RepresentativeWestern blot imej untuk subunit NADPH oksidase dalam hippocampus.

(C-E) Kuantiti subunit NADPH oksidase dalam hippocampus. Data yang ditunjukkan dalam Western blot adalah cara dari tujuh otak tikus. -Actin telah disiasat sebagai kawalan dalaman. Ujian pos hoc Bonferroni digunakan selepas ANOVA. Nilai ialah min ± SEM.

a Menandakan perbezaan statistik daripada kumpulan Y-CON. b Perbezaan denotesstatistik daripada kumpulan D-CON. c Menandakan perbezaan statistik daripada kumpulan D-TE.(p < 0.05).

3.3. Kesan Latihan Treadmill dan MitoQ pada Ekspresi GFAP dalam Korteks Serebrum dan Girus Gigi Hippocampal bagi Tikus Penuaan D-Gal

Kami memerhatikan perbezaan ketara antara kumpulan rawatan dalam imunoreaktiviti GFAP dalam korteks serebrum dan hippocampal dentate gyrus (DG) tikus penuaan (Rajah 3)(Cortex, F4,24=13.524, p < 0.001 ; DG, F4,24=30.364).

Keputusan ujian post hoc menunjukkan bahawa rawatan D-gal dengan ketara meningkatkan imunoreaktiviti GFAP dalam kedua-dua korteks dan DG.

Berbanding dengan kumpulan D-CON, tahap GFAP dalam korteks telah menurun dalam semua kumpulan intervensi, dan tahap GFAP dalam DG telah menurun dalam kumpulan D-TE dan D-COMBI, manakala kumpulan D-MI menunjukkan perbezaan dalam imunoreaktiviti GFAP sahaja. dalam kawasan korteks.

Oleh itu, walaupun rawatan TE atau MitoQ mengurangkan neuroinflammation yang disebabkan oleh D-gal dalam korteks, hanya campur tangan TE menghasilkan kesan positif dalam DG.

For more information:1950477648nn@gmail.com