Potensi Nefrotoksik Daripada Metabolit Putative 3,5-Dichloroaniline (3,5-DCA) Dan Biotransformasi 3,5-DCA dalam Sel Buah Pinggang Terpencil Daripada Tikus Fischer 344

Untuk mengetahui lebih lanjut, sila hubungi:tina.xiang@wecistanche.com

Abstrak:Kajian semasa telah direka bentuk untuk meneroka potensi nefrotoksik in vitro bagi empat 3,5-dichloroaniline(3,5-DCA)metabolit(3,5-dichloroacetanilide,3,5- DCAA;3,5-dichlorophenylhydroxylamine,3,5-DCPHA;2-amino-4,6-diklorofenol,2-A-4 ,6-DCP;3,5-dichloronitrobenzene,3,5-DCNB)dan untuk menentukan metabolisme buah pinggang 3,5-DCA in vitro. Dalam ujian sitotoksisiti,sel buah pinggang terpencil(IKC) daripada tikus Fischer 344 jantan(~4 juta/mL, 3mL) telah terdedah kepada metabolit (0-1.5 mM; sehingga 90 min) atau kenderaan. Daripada metabolit ini, 35-DCPHA ialah nefrotoksik yang paling kuat, dengan 35-perantaraan DCNB dalam potensi nefrotoksik.2-A-4,6-DCP dan 3,{ {12}}DCAA bukan sitotoksik. Dalam percubaan berasingan, 35-Sitotoksisiti DCNB telah dikurangkan dengan prarawatan IKC dengan antioksidan dan sitokrom P450, flavin monooxygenase dan perencat peroksidase, manakala 3,5-sitotoksisiti DCPHA telah dilemahkan oleh dua nukleofilikantioksidan(glutathione dan N-acetyl-L-cysteine). Pengeraman IKCdengan 3,5-DCA(0.5-1.0 mm,90 min) menghasilkan hanya 3,5-DCAA dan 3,{{12 }}DCNB sebagai metabolit yang boleh dikesan. Data ini mencadangkan bahawa 3,5-DCNB dan 3,5-DCPHA ialah metabolit nefrotoksik yang berpotensi dan boleh menyumbang kepada 3,5-nefrotoksisiti tercetus DCA in vivo. Selain itu, buah pinggang boleh bioaktif3,5-DCNB kepada metabolit toksik, dan 3,5-DCPHA nampaknya menjana metabolit reaktif untuk menyumbang kepada3,5-nefrotoksisiti DCA. In vitro, N-pengoksidaan 3,5-DCA nampaknya merupakan mekanisme utama bioaktivasi 3,5-DCA kepada metabolit nefrotoksik.

Kata kunci:nefrotoksisiti; dalam vitro; tikus;3,5-dichloroaniline;35-dichlorophenylhydroxylamine;3,5-dichloroacetanilide;2-amino-4,6-dichlorophenol;3,{{ 9}}dichloronitrobenzene

klik untuk mengetahui maklumat lanjut.

1. Pengenalan

Kloroanilin ialah bahan perantaraan kimia yang biasa digunakan dalam proses pembuatan untuk banyak pewarna, bahan kimia pertanian, ubat-ubatan, dan bahan kimia industri. Pendedahan kepada kloroanilin berlaku dalam tetapan pekerjaan, melalui pembebasan atau pembentukannya semasa metabolisme mamalia bagi banyak sebatian [1-3], atau oleh kemerosotan alam sekitar racun perosak[1,4-6]. Pengesanan kloroanilin dalam air kencing atau darah manusia telah digunakan sebagai penanda bio untuk pendedahan kepada racun perosak berasaskan kloroanilin [7-10]. Ketoksikan yang dikaitkan dengan pendedahan kepada kloroanilin termasuk hematotoksisiti (cth, anemia atau methemoglobinemia)[11-13], splenotoksisiti [11,14], hepatotoksisiti [14-17], gangguan endokrin [18] dan nefrotoksisiti [16,19]. ,20]. Chloroanilines juga dianggap sebagai pencemar keutamaan dalam kajian penilaian risiko alam sekitar kerana potensi kesan kesihatan yang buruk dan pembebasan berikutan degradasi racun perosak ke dalam alam sekitar di kawasan pertanian [21,22].

Antara tiga anilin monoklorin dan enam tak berklorin, 3,5-dichloroaniline (3,5-DCA) ialah nefrotoksik paling mujarab dalam vivo dandalam vitro[16,19,23]. Pendedahan in vivo kepada 3,5-DCA dalam Sprague-Dawley atau Fischer, 344 tikus menghasilkan kepekatan nitrogen urea darah (BUN) yang tinggi, penurunan pengangkutan ion organik dalam sel tubular proksimal, penurunan berat buah pinggang, proteinuria dan hematuria [23,24]. Perubahan morfologi yang paling teruk berlaku dalam sel tubular proksimal buah pinggang, tetapi sel tubular distal dan saluran pengumpul juga dipengaruhi oleh 3,5-pendedahan DCA [23]. Kajian lanjut menggunakansel buah pinggang terpencil(IKC) daripada tikus Fischer 344 jantan menunjukkan bahawa kepekatan 1.0 mm atau lebih 3,5-pendedahan DCA selama 90 minit membawa kepada peningkatan pelepasan laktat dehidrogenase(LDH), ukuran sitotoksisiti [25 ].

Ketoksikan sebatian anilin dalam vivo terutamanya disebabkan oleh pembentukan metabolit toksik. Berdasarkan kajian dengan anilin dan beberapa terbitan berklorinnya, laluan biotransformasi untuk sebatian anilin ini telah ditetapkan dengan jelas dan termasuk pengoksidaan N, asetilasi N dan pengoksidaan cincin fenil [13,26-28]. Walaupun metabolisme in vivo 35-DCA tidak dikaji secara terperinci, laluan biotransformasi ini boleh menghasilkan beberapa metabolit yang berpotensi toksik (Rajah 1), seperti yang berlaku dengan kloroanilin lain di mana kajian biotransformasi telah dijalankan [26, 29,30]. Kajian terkini oleh Racine et al. [25] telah menunjukkan bahawa 35-DCA dimetabolismekan kepada metabolit toksik melalui beberapa sistem enzim buah pinggang. Walau bagaimanapun, tidak jelas metabolit mana yang dihasilkanbuah pinggang.

Satu potensi 3,5-metabolit DCA,4-amino-2,6-diklorofenol (4-A-2,6-DCP) , telah dinilai untuk potensi nefrotoksik dan merupakan nefrotoksik kuat dalam vivo dan in vitro dalam tikus Fischer 344 jantan [31-33]. Kajian in vitro perbandingan potensi nefrotoksik selalunya mono-, di- dan trichloronitrobenzenes dalam hirisan kortikal buah pinggang mendapati 3,5-dichloronitrobenzene (35-DCNB)sebagai nefrotoksik paling kurang mujarab dalam kalangan dichloronitrobenzenes [34] . Sehingga kini, pada masa ini tiada kajian yang telah meneroka potensi nefrotoksik bagi metabolit 3,5-DCA yang lain.

Kajian semasa telah direka bentuk untuk menentukan potensi nefrotoksik tiga tambahan diduga 3,5-metabolit DCA yang timbul daripada N-asetilasi, (3,5-dichloroacetanilide;

3.5-DCAA), pengoksidaan N (3,5-dichlorophenylhydroxylamine; 35-DCPHA), atau pengoksidaan cincin fenil (2-amino-4,{{ 8}}diklorofenol;2-A-4,6-DCP)(Rajah 1) berikutan biotransformasi buah pinggang tambahan 35-DCA. Potensi nefrotoksik 3,5-DCNBdalam model IKC dan mekanisme potensi bioaktivasinya telah diterokai. Selain itu, potensi untuk radikal bebas/metabolit reaktif menyumbang kepada 3,5-sitotoksisiti DCPHA telah ditentukan. Akhir sekali, kajian biotransformasi telah dijalankan untuk memastikan sejauh mana 3,5-DCA dibiotransformasi dalam IKC daripada tikus Fischer 344 jantan dan untuk menentukan metabolit mana yang terbentuk.

2. Keputusan

2.1. Hubungan Sitotoksisiti Masa dan Kepekatan untuk 3,5-Metabolit DCA

Untuk menentukan potensi nefrotoksik bagi setiap 3,5-kajian metabolit diduga DCA, kepekatan dan kursus masa telah dijalankan di IKC. Pendedahan kepada 3,5-DCAA tidak meningkatkan pelepasan LDH dengan ketara, penanda sitotoksisiti, pada bila-bila masa (60 atau 90 min) atau kepekatan(0-1. 5 mM) diuji (Rajah 2A). Selain itu, pendedahan kepada 2-A-4,6-DCP tidak menghasilkan peningkatan ketara dalam pelepasan LDH pada sebarang kepekatan yang diuji (sehingga 1.5 mM) selepas pendedahan 60 atau 90 minit ( Rajah 2B). Pengeraman IKC dengan 3,5-DCNB atau 3,5-DCPHA menghasilkan peningkatan masa dan bergantung kepekatan dalam pelepasan LDH untuk kedua-dua sebatian, walaupun 3,5-DCPHA menyebabkan peningkatan terbesar dalam pelepasan LDH. Keluaran LDH yang ketara dilihat pada 3,5-kepekatan DCNB 1.0 atau 1.5.mM atau lebih besar selepas 90 minit tetapi hanya pada 1.5 mM selepas 60 minit (Rajah 2C). Sebaliknya,35-DCPHA menyebabkan peningkatan yang ketara dalam pelepasan LDH pada 0.25 mM atau lebih besar selepas 60 dan 90 min, dengan peningkatan dalam pelepasan LDH yang diperhatikan pada 90 minit meningkat dengan ketara berbanding dengan peningkatan 60 minit masing-masing dalam pelepasan LDH (Rajah 2D). Oleh itu, daripada metabolit yang diuji, 3,5-DCPHA ialah yang paling nefrotoksik.

2.2. Biotransformasi Renal dan 3,5-Sitotoksisiti DCNB

Oleh kerana anilin dan nitrobenzena boleh dimetabolismekan antara satu sama lain, kajian lanjut telah direka untuk meneroka perananbiotransformasi buah pinggangdan radikal bebas dalam sitotoksisiti berikutan pendedahan kepada 1.0 mM 3,5-DCNB selama 60 min. Untuk menentukan potensi peranan radikal bebas dalam 3,5-DCNBsitotoksisiti, IKC telah dirawat terlebih dahulu dengan antioksidan. Prarawatan dengan semua antioksidan ( -tokoferol, glutation, askorbat dan N-acetyl-L-cysteine; Rajah 3) melemahkan 3,5-sitotoksisiti akibat DCNB dengan ketara.

Untuk meneroka peranan biotransformasi buah pinggang dalam 3,5-Ketoksikan DCNB dalam IKC, prarawatan dengan perencat cytochromes P450(CYPs), monooxygenases (FMOs) yang mengandungi flavin dan peroksidase telah digunakan. Penggunaan CYPinhibitors (Rajah 4) menunjukkan bahawa dua perencat CYP am (piperonylbutoxide [PiBx]; metyrapone) melemahkan 3,5-sitotoksisiti DCNB dengan ketara. Prarawatan dengan perencat FMO(n-octylamine; methimazole), dan perencat peroksidase mercaptosuccinate, melemahkan 3,5-sitotoksisiti DCBN dengan ketara (Rajah 5). Indomethacin, yang menghalang aktiviti peroksidase siklooksigenase cenderung mengurangkan 3,5-pelepasan LDH akibat DCNB tetapi tidak mencapai perbezaan yang ketara (Rajah 5).

2.3. Antioksidan dan 3,5-DCPHA Sitotoksisiti

Untuk mula meneroka peranan radikal bebas dalam 3,5-sitotoksisiti yang disebabkan oleh DCPHA, IKC telah dirawat terlebih dahulu denganantioksidan(glutathione, ascorbate, atau N-acetyl-L-cysteine) sebelum pendedahan kepada 3,5-DCPHA(0.5 mM). Keputusan menunjukkan bahawa, berbeza dengan 3,5-DCNB, 3,{{10}}sitotoksisiti teraruh DCPHA telah dilemahkan sebahagiannya dengan N-acetyl-L-cysteine ​​dan dilindungi sepenuhnya oleh glutation (Rajah 6 ).Ascorbate(1.0 atau 2.0mM) tidak berkesan untuk mengurangkan 3,5-DCPHA sitotoksisiti.

2.4.3,5-Metabolisme DCA oleh IKC

Kajian sitotoksisiti perbandingan sebelumnya telah direka bentuk untuk meneroka potensi nefrotoksik bagi metabolit 3,5-DCA yang dihasilkan secara luaran. Kami juga mengkaji cara IKC memetabolismekan 3,5-DCA untuk melihat metabolit yang dihasilkan secara langsung oleh sel-sel buah pinggang. Dalam eksperimen ini, IKC diinkubasi sama ada dengan kepekatan tidak toksik 3,5-DCA (0.5 mM) atau kepekatan sitotoksik(1.0 mM) selama 90 minit dan sampel media dan sel dianalisis melalui HPLC untuk 3,5-DCA dan metabolitnya. Masa pengekalan untuk 3,5-DCA dan metabolitnya, had pengesanan dan pekali pengekstrakan ditunjukkan dalam Jadual1 untuk piawaian tulen 3,5-DCA dan setiap metabolit (4-A{{ 19}},6-DCP,2-A-4,6-DCP, 3,5-DCPHA, 3,5-DCAA dan 3 ,5-DCNB).

Pada kedua-dua kepekatan, sebatian utama dalam media dan sel pada penghujung tempoh inkubasi ialah sebatian induk 3,5-DCA. Kurang daripada 5 peratus daripada 3,5-DCA telah dimetabolismekan kepada 3,5-DCAA dan 3,5-DCNB(Jadual 2). Tiada bukti untuk pembentukan metabolit klorofenol amino tak terkonjugasi 2-A-46-DCP atau 4-A-2,6-DCP.35-DCPHA tidak dikesan, yang tidak menghairankan memandangkan sifat metabolit ini sangat reaktif, tetapi penemuan bahawa 3,5-DCNB hadir dalam media dan sel menyokong kesimpulan bahawa 3,5-DCPHA telah terbentuk dan kemudian dioksidakan lagi kepada 3,5-DCNB.

Kemungkinan wujud bahawa amino klorofenol telah terbentuk tetapi dimetabolismekan kepada konjugat sulfat atau glukuronida. Untuk menentukan sama ada konjugat telah terbentuk, 3,5-DCA (1.0 mM) telah diinkubasi dengan IKC selama 45 atau 90 minit. Walau bagaimanapun, rawatan media atau sel lisat dengan arilsulfatase atau -glucuronidase tidak mendedahkan sebarang 2-A-4,6-DCP atau 4-A-2 percuma,{ {12}}DCP(data tidak ditunjukkan). Keputusan ini menunjukkan bahawa kedua-dua metabolit ini tidak terbentuk pada tahap yang boleh dikesan atau terus teroksida kepada metabolit reaktif (Rajah 1). Walau bagaimanapun, memandangkan pada dasarnya pemulihan penuh 35-kesetaraan DCA berlaku, tidak mungkin sangat banyak, jika ada, metabolit ini dibentuk olehsel buah pinggang.

2.5. Kesan Asid Diethyldithiocarbamic (DEDTCA) pada 3,5-Metabolisme DCA

Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa prarawatan IKC dengan perencat CYP2C telah mengurangkan 3,5-sitotoksisiti DCA dengan ketara [25]. Salah satu perencat 35-ketoksikan DCA yang paling berkesan ialah perencat CYP2C DEDTCA. Untuk mengkaji cara DEDTCA mempengaruhi 3,5-metabolisme DCA, IKC telah dirawat terlebih dahulu dengan DEDTCA(0.1 mM) diikuti oleh {{10}}DCA (1.0mM) untuk 90 pengeraman min. Penentuan 35-DCA dan 3,5-paras metabolit DCA mendedahkan bahawa jumlah tahap 3,5-DCA dalam media dan sel hanya meningkat sedikit, manakala pembentukan 3,{{ 20}}DCAA dan 3,5-DCNB telah dikurangkan (Jadual3). Tiada 2-A-4.6-DCP 4-A-2,6-DCP atau 3,5-DCPHA dikesan, yang bersetuju dengan kajian terdahulu (Jadual 2).

3. Perbincangan

Aspek penting dalam kajian ini ialah menentukan potensi nefrotoksik metabolit terhasil luaran yang diduga sebanyak 3,5-DCA pada sel sasaran buah pinggang. Metabolit ini diramalkan akan terbentuk berdasarkan metabolisme anilin dan kloroanilin (Rajah 1)[13.26,28,29]. Kami sebelum ini telah mengira bahawa dos nefrotoksik sebanyak 3,5-DCA dalam tikus Fischer 344 akan menghasilkan paras darah maksimum~1.25 mM [25]. Oleh itu, kepekatan metabolit di bawah kepekatan ini mungkin berkaitan secara fisiologi. Keputusan kajian semasa menunjukkan bahawa metabolit yang terhasil daripada N-asetilasi 3,5-DCA, 3,5-DCAA, mempunyai potensi nefrotoksik yang sangat berkurangan berbanding 3,5-DCA. Keputusan ini tidak menghairankan dan bersetuju dengan kajian awal dengan monokloroanilin dan metabolitnya yang menunjukkan bahawa N-asetilasi menghasilkan metabolit kloroacetanilida dengan potensi nefrotoksik yang berkurangan berbanding dengan sebatian induk [35,36]. Oleh itu, N-asetilasi nampaknya merupakan laluan detoksifikasi untuk nefrotoksisiti yang disebabkan oleh kloroanilin, termasuk 3,5-DCA. Selain itu, IKC dapat memetabolismekan 3,5-DCA kepada 3,{{30} }DCAA (Jadual 2). Tetapi memandangkan potensi nefrotoksik yang lemah bagi 3,5-DCAA, tidak mungkin metabolit ini menyumbang kepada 3,5-nefrotoksisiti teraruh DCA secara in vitro.

Berbeza dengan 3,5-DCAA, sekurang-kurangnya satu metabolit terhasil daripada pengoksidaan cincin fenil 3,5-DCA mendorong nefrotoksisiti. Pengoksidaan 3,5-DCA pada kedudukan 4-menghasilkan 4-A-2,6-DCP (Rajah 1), yang merupakan nefrotoksik kuat dalam vivo dan in vitro [31-33]. In vivo, 4-A-2,6-DCP(0.38 mmol/kg,ip)mendorong nefrotoksisiti ketara dalam tikus Fischer 344 jantan yang dicirikan oleh proteinuria, glukosuria, meningkat kepekatan urea nitrogen (BUN) darah danbuah pinggangberat, dan nekrosis tubular proksimal dalam segmen S3 [3132]. Dalam vitro,4-A-2,6-DCP mengurangkan pengambilan p-amino hippurate (PAH) dan tetraethylammonium(TEA) dalam tikushirisan kortikal buah pinggangpada kepekatan 5 μM dan 50 uM, masing-masing 【31】dan meningkatkan pelepasan LDH pada 50 μM atau lebih tinggi selepas pendedahan 2 jam 【33】. Dalam IKC, kepekatan 250 μM atau lebih tinggi dan pendedahan 90 minit diperlukan untuk 4-A-2,6-DCP untuk meningkatkan pelepasan LDH. Kepekatan yang lebih tinggi yang diperlukan untuk mendorong sitotoksisiti dalam model ini kemungkinan besar disebabkan oleh kehadiran albumin dalam media inkubasi untuk IKC tetapi tidak dalam larutan Krebs-Ringer yang digunakan dalam kajian inkubasi hirisan kortikal buah pinggang. Dalam kajian ini,2-A-4,6-DCP, yang terhasil daripada pengoksidaan pada 2-kedudukan 35-DCA, tidak meningkatkan pelepasan LDH pada kepekatan sehingga 1.5 mM dan sehingga 90 pendedahan, menunjukkan bahawa 4-A-2,6-DCP adalah lebih kuat sebagai nefrotoksik daripada 2-A-4, 6-DCP. Dapatan ini bersetuju dengan perbandingan potensi nefrotoksik 4-amino-dan 2-aminofenol[37,38] lain. Oleh itu, 4-A-2.6-DCP kelihatan lebih berkemungkinan daripada 2-A-4,6-DCP menyumbang kepada 3,{{38 }}Nefrotoksisiti akibat DCA dalam vivo.

Dalam IKC3,5-kajian metabolisme DCA, bukan 2-A-4,6-DCA mahupun 4-A-2,6- DCA dikesan sebagai metabolit bebas atau sebagai konjugat glukuronida atau sulfat (Jadual 2), Walaupun ada kemungkinan sejumlah kecil amino dichlorophenols ini dihasilkan, pemulihan lengkap 3,5-DCA yang ditambahkan pada pengeraman IKC adalah dikesan sebagai sebatian induk serta metabolit lain (Jadual2). Keputusan ini mencadangkan bahawabuah pinggangtidak membentuk metabolit amino dichlorophenol yang mencukupi untuk menyumbang kepada 3,5-nefrotoksisiti DCA secara in vitro.

N-Pengoksidaan telah ditunjukkan sebagai laluan biotransformasi penting bagi metabolisme anilin dan kloroanilin yang boleh menyumbang kepada hepatotoksisiti, dan kemungkinan ketoksikan lain, yang disebabkan oleh sebatian ini [11,39-41]. N-Pengoksidaan anilin menghasilkan metabolit fenilhidroksilamin yang selanjutnya dioksidakan kepada metabolit nitrosobenzena [39](Rajah 1). Metabolit fenilhydroxylamine dan nitrosobenzene boleh mengitar redoks untuk menjana radikal bebas dan mengoksidakan besi ferus dalam hemoglobin, dan protein lain yang mengandungi besi ferus, kepada besi ferik. Kitaran ini menukarkan hemoglobin kepada methemoglobin dalam eritrosit tetapi juga boleh menjejaskan aktiviti biologi protein dan enzim lain yang memerlukan molekul besi ferus untuk aktiviti biologi. Metabolit nitrosobenzene juga reaktif dan boleh mengikat secara kovalen kepada nukleofil pada makromolekul dalam sel [42,43]. Kumpulan nitroso boleh dioksidakan lagi untuk membentuk metabolit nitrobenzena (Rajah 1). Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa 3,5-DCA boleh mendorong methemoglobinemia dalam vivo dan 3,5-DCPHA (Rajah 1) bertanggungjawab terutamanya untuk ketoksikan ini [40,44,45]. Penemuan ini mencadangkan bahawa 3,5-DCPHA sedang dihasilkan secara luaran, kemungkinan besar dalam hati, dan bergerak ke dalam darah untuk mendorong methemoglobinemia seperti yang berlaku dengan aniline [44,45]. Penemuan ini juga mencadangkan bahawa buah pinggang terdedah kepada 3,5-DCPHA yang dihasilkan di lokasi buah pinggang tambahan.

Pembentukan 3,5-DCNB oleh IKC (Jadual 2), menunjukkan bahawa buah pinggang boleh membentuk 3,5-DCPHA daripada 3,5-DCA. Oleh itu, buah pinggang boleh terdedah kepada 3,5-DCPHA daripada pembentukan intra dan ekstra-renal.3,5-DCPHA terbukti sebagai metabolit paling toksik yang diuji, dan berkemungkinan 3,{ {13}}DCPHA ialah penyumbang utama kepada 3,5-nefrotoksisiti DCA, secara langsung kepada sel buah pinggang dan/atau secara tidak langsung melalui hematotoksisiti. Juga berkemungkinan berbilang sistem enzim berupaya membentuk 35-DCPHA daripada 3,5-DCA, dan sistem enzim ini juga mungkin membentuk 3,5-metabolit nefrotoksik DCA yang lain [46, 47]. N-pengoksidaan sebatian aniline telah terbukti dimangkinkan oleh CYPs, flavin monooxygenases (FMOs),

peroksidase, dan prostaglandin sintetase [48-51]. Kajian terdahulu dari makmal kami telah menunjukkan bahawa 3,5-nefrotoksisiti DCA dalam IKC boleh dilemahkan oleh perencat pelbagai keluarga enzim ini kepada tahap yang berbeza-beza [25], menunjukkan bahawa perencatan satu keluarga enzim akan membolehkan 35- DCA akan terus dibioaktifkan oleh sistem enzim memetabolismekan yang lain. Untuk menentukan sama ada perencat yang digunakan oleh Racine et al. [25] telah mengubah N-pengoksidaan 3,5-DCA, keupayaan diethyldithiocarbamate (DEDTCA), perencat CYP2C, dan pada tahap yang lebih rendah CYP2E1, untuk mengurangkan pembentukan DCNB telah diperiksa. DEDTCA telah dipilih untuk kajian kerana ia telah mengurangkan 3,5-sitotoksisiti DCA dengan ketara dalam IKC [25]. Penemuan bahawa DEDTCA mengurangkan pembentukan 3,5-DCNB dalam IKC menyokong kesimpulan bahawa DEDTCA melemahkan 3,5-nefrotoksisiti DCA, sekurang-kurangnya sebahagiannya, dengan menghalang pengoksidaan N 3,{{21} }DCA. Memandangkan isoniazid perencat CYP2E1 tidak mempunyai kesan ke atas 3,5-sitotoksisiti DCA, nampaknya enzim CYP2C adalah bioaktivasi 3,5-DCA kepada metabolit toksik melalui 3,5-pembentukan DCPHA.

Sitotoksisiti boleh dihasilkan secara in vitro dalam IKC sebanyak 3,5-DCPHA melalui dua mekanisme yang berpotensi; kitaran redoks untuk menghasilkan radikal bebas (cth, radikal anion superoksida) dan tekanan oksidatif atau penghasilan metabolit pengalkilasi. Racine et al. [25] mendapati bahawa 3,5-sitotoksisiti akibat DCA dalam IKC bukan disebabkan oleh tekanan oksidatif. Paras glutation yang dikurangkan dan jumlah kedua-duanya dikurangkan sebanyak3,5-pendedahan DCA yang mencadangkan pembentukan metabolit reaktif. Dalam kajian semasa, 35-Sitotoksisiti DCPHA dikurangkan oleh antioksidan nukleofilik (glutathione dan N-asetil-L-cysteine), tetapi bukan oleh askorbat antioksidan bukan nukleofilik (Rajah 6). Keputusan ini menyokong satu atau lebih metabolit pengalkilasi reaktif sebanyak 3,5-DCPHA sebagai spesies sitotoksik.

Nitrobenzena berklorin adalah nefrotoksik dalam vivo dan in vitro [34,52,53]. Rickert dan Held [3] mendapati bahawa mikrosom hepatik daripada tikus Fischer 344 jantan memetabolismekan 3-chloronitrobenzene melalui pengurangan kumpulan nitro untuk membentuk 3-chloroaniline, menunjukkan bahawa metabolisme antara 3,5-DCA dan 3,5-DCNB boleh diterbalikkan. Oleh itu, pengurangan 3,5-DCNB akan menghasilkan 3,5-dichloronitrosobenzene dan 3,5-DCPHA sama seperti pengoksidaan 3,5-DCA menghasilkan kedua-dua metabolit ini. Walau bagaimanapun, potensi sumbangan 3,5-DCNB kepada 3,5-nefrotoksisiti DCA adalah tidak jelas. Jika 35-DCNB ialah metabolit nefrotoksik, ia juga tidak jelas sama ada biotransformasi diperlukan untuk menghasilkan spesies kimia toksik. Keputusan semasa menyokong 3,5-DCNB sebagai toksik3,5-metabolit DCA, yang berpotensi menyumbang kepada 3,5-nefrotoksisiti DCA berikutan biotransformasi.

Kajian semasa menunjukkan bahawa 3,5-DCNB ialah nefrotoksik yang lebih kuat daripada 3,5-DCA dalam IKC [25]. Selain itu, keupayaan antioksidan dan perencat biotransformasi oksidatif untuk melemahkan 3,5-sitotoksisiti DCNB mencerminkan kesan prarawatan ini dalam mengurangkan 3,5-sitotoksisiti DCA dalam IKC [25]. Keputusan ini menunjukkan bahawa mana-mana 3,5-DCNB yang terbentuk semasa 3,5-biotransformasi DCA berpotensi menyumbang kepada 3,5-nefrotoksisiti DCA melalui metabolisme 3,5- DCNB ditukar kembali kepada 3,5-dichloronitrsobenzene dan 3,5-DCPHA. Walau bagaimanapun, aktiviti lemah CYPinhibitors pada 3,5-sitotoksisiti DCNB menunjukkan bahawa sistem enzim lain (cth, nitroreductase bukan CYP) mungkin bertanggungjawab untuk, atau menyumbang kepada, pengurangan kumpulan nitro dalam sistem model ini . Selain itu, keupayaan antioksidan untuk melemahkan dengan ketara 3.5-Sitotoksisiti DCNB menyokong peranan radikal bebas terbitan kumpulan nitro dan/atau spesies oksigen/nitrogen reaktif dalam mekanisme nefrotoksik untuk sebatian ini. Memandangkan pengecilan ketara 3,5-nefrotoksisiti DCNB oleh beberapa perencat metabolisme oksidatif (cth, n-octylamine dan mercaptosuccinate), adalah tidak mungkin bahawa 35-DCNB adalah toksik secara langsung kepada sel buah pinggang tetapi menghasilkan sitotoksisitinya melalui metabolit. Selain itu, kajian metabolisme DCA in vitro 3,5-menunjukkan bahawa sel renal mungkin tidak menghasilkan 3,5-DCNB yang mencukupi untuk bertanggungjawab terhadap 3,5-sitotoksisiti DCA in vitro. Ada kemungkinan metabolisme ekstrarenal sebanyak 3,5-DCA menghasilkan 3,5-DCNB yang mencukupi untuk menyumbang kepada 3,5-nefrotoksisiti akibat DCA dalam vivo, tetapi sumbangan keseluruhan sebanyak 3,{{ 46}}DCNB hingga 3,5-nefrotoksisiti DCA akan memerlukan kajian lanjut.

Secara ringkasnya, keputusan kajian ini mencadangkan bahawa metabolit dan metabolit amin-odichlorophenol yang dijana secara luaran yang timbul daripada pengoksidaan N berpotensi menyumbang kepada 3.5-nefrotoksisiti DCA dalam vivo, manakala N-asetilasi {{5} }DCA ialah mekanisme detoksifikasi. In vitro, N-pengoksidaan 3,5-DCA ialah mekanisme utama bioaktivasi 3,5-DCA kepada metabolit sitotoksik, dan ketoksikan berkemungkinan besar diantarkan oleh 3,5-dichloronitrsobenzene dan /atau 3,5-DCPHA.Selain itu,3,5-nefrotoksisiti akibat DCNB adalah disebabkan oleh pembentukan metabolit, dan nefrotoksisiti 3,5-DCNB juga berkemungkinan besar dimediasi oleh 3,5-dichloronitrsobenzene dan/atau 35-DCPHA.

4. Bahan dan Kaedah

4.1.Haiwan

Tikus Fischer 344 jantan (200-250 g) diperoleh daripada Hilltop Lab Animals, Inc. (Scotts-dale, PA, USA). Haiwan telah menempatkan dua ekor tikus setiap sangkar dengan makanan dan air tersedia secara ad libitum, dengan suhu (21-23 darjah ), kelembapan (40-55 peratus ), dan cahaya (12 jam hidup/12 jam mati) dikawal. Sebelum digunakan, semua haiwan dibenarkan sekurang-kurangnya satu minggu untuk menyesuaikan diri dalam kemudahan haiwan bertauliah Persatuan Akreditasi Penjagaan Haiwan Makmal Amerika (AAALAC). Semua penggunaan haiwan telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi Universiti Marshall (Protokol 447 (5 Ogos 2010) dan531 (1 Februari 2013)), dan eksperimen penggunaan haiwan telah dijalankan mengikut Panduan Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Makmal. , diterima pakai oleh Institut Kesihatan Negara.

4.2. Bahan kimia

Semua bahan kimia telah dibeli pada ketulenan tertinggi yang tersedia daripada Fischer Scientific(Pittsburgh, PA, USA) atau Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA), kecuali 3,5-dichlorophenylhydroxylamine(3,{{3} }DCPHA), 35-dichloroacetanilide (3.5-DCAA), dan 2-amino-4,6-dichlorophenol(2-A{{11 }},6-DCP), yang telah disintesis dalam makmal kami. 3,5-DCPHA telah disintesis dengan pengurangan 3,5-DCNB menggunakan hidrazin-paladium pada karbon melalui kaedah Rondestvedt dan Johnson yang diterangkan sebelum ini dan ditulenkan seperti yang diterangkan oleh Valentovic et al. [55]. Sintesis dan penulenan 3,5-DCAA telah dicapai menggunakan kaedah Newell et al. [56]dengan bertindak balas dalam jumlah yang sama 3,5-dikloroanilin dan anhidrida asetik dengan kehadiran natrium asetat. Untuk menyediakan 2-A-4,6-DCP, 2,4-diklorofenol telah dinitrat menggunakan kaedah McMillan et al.[29,57] diikuti dengan pengurangan nitro kumpulan kepada kumpulan amino dengan natrium hidrosulfit dalam 10 peratus natrium hidroksida berair mengikut Newell et al. [56].

4.3. Penyediaan dan Rawatan Sel Buah Pinggang Terpencil

Sel buah pinggang terpencil(IKC) diperoleh daripada tikus Fischer 344 jantan yang tidak dirawat. Tikus Fischer 344 jantan telah dipilih sebagai model untuk mendapatkan sel buah pinggang terpencil kerana majoriti data ketoksikan kami sebelum ini dengan 3,5-DCA telah diperoleh dalam model ini. Tikus telah dibius dengan pentobarbital (75 mg/kg, ip), dan IKC telah disediakan melalui kaedah Jones et al.[58] menggunakan perfusi kolagenase seperti yang diterangkan oleh Racine et al. [25]. Sel buah pinggang yang diasingkan dengan teknik ini diperkaya dalam sel kortikal buah pinggang berdasarkan pencirian biokimia dan kerap digunakan dalam penilaian toksikologi buah pinggang [59-63]. Daya maju sel awal ditentukan menjadi~85-90 peratus oleh pelepasan laktat dehidrogenase (LDH) dan trypan blue (2 peratus tanpa) pengecualian. Sebelum pengeraman, IKC dikira dan digantung semula dalam penampan Krebs-Henseleit (pH 7.37; 25 mM Hepes; 2 peratus tanpa albumin serum lembu) pada kepekatan ~4.2 juta sel/mL. IKC(3 mL) telah dipraeram dalam 25 mL kelalang Erlenmeyer polikarbonat selama 5 minit pada 37 darjah di bawah atmosfera 95 peratus oksigen/5 peratus karbon dioksida. Selepas pra-pengeraman, sel telah terdedah kepada pelbagai kepekatan 3,5-DCNB (0.5-1.5 mM), 3.5-DCAA({{32} }.5-1.5 mM),3.5-dichlorophenylhydroxylamine (3,5-DCPHA;0.{{40}}.{{45 }} mM, 2-A-4,6-DCP （0.5-1.5 mM）, atau kenderaan （30 μL DMSO） sehingga 90 min. Pada akhir tempoh inkubasi yang diperuntukkan, sampel (0.5 mL) telah diambil untuk ujian pelepasan LDH, seperti yang diterangkan sebelum ini [20,25].

Untuk menentukan perananbiotransformasi buah pinggangdalam 3,5-Sitotoksisiti DCNB dan radikal bebas dalam35-nefrotoksisiti DCPHA, IKC telah dirawat terlebih dahulu dengan sama ada antioksidan atau perencat sistem enzim biotransformasi (Jadual 4) atau kenderaan (30uL DMSO) sebelum pendedahan kepada 1.0mM35-DCNB (60 min)atau 0.5 mM3,5-DCPHA(60 min). Semua kepekatan dan masa prarawatanantioksidandanperencat enzim buah pinggangberdasarkan kajian yang diterbitkan sebelum ini [20,25].

4.4.IKC Metabolisme 3,5-DCA

4.4.1.Inkubasi IKC dan Pengasingan Metabolit

IKC (~4.2 juta sel/mL;3 mL) telah diinkubasi dengan 3,5-DCA(0.5 atau 1.0mM) dalam penimbal Krebs-Henseleit (KH) ( pH 7.4) selama 90 min dalam tab mandi air goncang di bawah 95 peratus oksigen/5 peratus atmosfera karbon dioksida seperti yang diterangkan di atas. Kepekatan 0.5 mM 3,5-DCA ialah kepekatan bukan sitotoksik pada 90 min, manakala kepekatan 1.0 mM mendorong sitotoksisiti seperti yang dibuktikan oleh peningkatan pelepasan LDH. Pada penghujung tempoh inkubasi, 1.0 sampel mL telah dikumpul dan media serta sel dipisahkan dengan sentrifugasi. Sel-sel pellet telah dibasuh dengan penimbal KH (tiada albumin serum lembu), dan bilas telah ditambah ke media. Sel-sel telah dilisiskan melalui sonication dan protein telah dimendakkan oleh penambahan metanol (1.0 mL) kepada semua sampel. Sampel telah disentrifugasi (3000 g; 10 min 4 darjah ） dan supernatan ditapis melalui penapis picagari 0.45μ dan disimpan pada -20 darjah sehingga dianalisis oleh HPLC seperti yang diterangkan di bawah.

4.4.2. Penentuan Konjugasi Sulfat dan Glukuronida

Untuk menentukan sama ada konjugat sulfat atau glukuronida telah terbentuk, dalam beberapa eksperimen, pecahan media dan supernatan sel yang diperolehi seperti yang diterangkan di atas telah dirawat dengan ß-glucuronidase(6500 unit/mL, kepekatan akhir) atau arilsulfatase (200 unit/mL, kepekatan akhir) ditambah saccaharolactone (20 mM, kepekatan akhir) selama 18 jam (37 darjah ) dalam penimbal asetat 0.1 M (pH5.0) untuk menghidrolisis mana-mana konjugat glukuronida atau sulfat, yang telah terbentuk 26] . Hidrolisis dihentikan dengan penambahan metanol sejuk (2.4 mL). Pecahan kemudiannya ditapis dan disimpan sehingga dianalisis seperti yang diterangkan di atas.

4.4.3. Perencatan Metabolisme CYP2C oleh DEDCTA

Dalam percubaan berasingan, sel telah dirawat terlebih dahulu dengan asid diethyldithiocarbamate (DEDTCA, 0.1 mM, 30 min prarawatan), perencat CYP2C, sebelum 3,5-Tambahan DCA untuk menentukan metabolit yang dikurangkan dengan DEDTCA prarawatan. Selepas tempoh inkubasi 90 minit, sel dan media dirawat dan disimpan seperti yang diterangkan di atas untuk penentuan 3,5-kepekatan DCA dan kepekatan 3,5-metabolit DCA terbentuk.

4.4.4. Penentuan Metabolit HPLC

Sampel （75 μL） media dan IKC terlisis telah dianalisis pada sistem Waters Alliance e2695 HPLC (Waters Co., Milford, MA, USA), menggunakan pengesan UV/Vis pembolehubah Waters 2489 pada 254 nM. Kromatogram dikumpulkan dan disepadukan menggunakan perisian Empower 3(Waters Co., Milford, MA, USA). Lajur A Waters X Select HSS T3 C18 （3.5 μm; 4.6×150 mm²）dilengkapi dengan Waters XSelect HSS T3 Kartrij VanGuard (3.5 um;3.9×5mm2) telah digunakan untuk pengasingan sebatian. Fasa mudah alih terdiri daripada 50}:50 metanol; air dengan kadar aliran 0.75 mL/min. Lengkung standard , had pengesanan dan pekali pengekstrakan ditentukan untuk 3,5-DCA dan metabolit yang diduga. Pekali pengekstrakan ditentukan dengan membandingkan penyepaduan 1.0 mM3,5-DCA atau sampel metabolit yang telah menjalani sampel pemprosesan (iaitu, penambahan metanol dan sentrifugasi) kepada sampel 1.0 mM 35-DCA atau metabolit yang belum diproses.

4.5. Perangkaan

Data dibentangkan sebagai min ± SEM dengan N daripada {{0}} eksperimen haiwan yang berasingan, kecuali N=3 dalam eksperimen metabolisme DCA 0.5 mM 3,5-tidak toksik. Data antara rawatan dianalisis dengan analisis varians sehala (ANOVA) diikuti dengan Ujian Tukey. Kepentingan ditentukan pada p<0.05. a="" power="" analysis="" was="" performed="" with="" g*="" power="" software="" version="" 3.1.9.7="" for="" f="" tests,="" anova="" (repeated="" measures,="" within="" factors)="" with="" effect="" size="" f="0.85," α="" error="" probability="0.05," power(1-β="" error="" probability)="0.8" and="" actual="" power="0.832," which="" determined="" a="" sample="" size="" of="" n="4" was="" sufficient="" with="" a="" 95%="" confidence="">

Sumbangan Pengarang: CRR: kajian literatur, menjalankan kerja, analisis data, dan tafsiran, menyumbang kepada penulisan kertas kerja; MAV: reka bentuk eksperimen dan tafsiran data, DKA:membantu dalam menjalankan kerja dan penyediaan kertas kerja; GOR: kajian literatur, reka bentuk eksperimen, tafsiran data, menulis dan mengedit kertas. Semua pengarang telah membaca dan bersetuju dengan versi manuskrip yang diterbitkan.

Pembiayaan: Penyelidikan ini disokong sebahagiannya oleh Institut Sains Perubatan Am Negara Institut Kesihatan Nasional di bawah nombor anugerah P20GM103434 kepada GOR Kandungan adalah tanggungjawab pengarang semata-mata dan tidak semestinya mewakili pandangan rasmi Institut Kesihatan Nasional .

Penyata Lembaga Semakan Institusi: Semua penggunaan haiwan telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi Universiti Marshall (Protokol 447 (5 Ogos 2010) dan 531(1 Februari 2013)), dan eksperimen penggunaan haiwan telah dijalankan mengikut Panduan untuk Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Makmal, diterima pakai oleh Institut Kesihatan Kebangsaan.

Penyata Ketersediaan Data: Data yang dibentangkan dalam kajian ini tersedia atas permintaan daripada pengarang yang berkaitan.

Konflik Kepentingan: Pengarang mengisytiharkan tiada konflik kepentingan.

Rujukan

1. Aizawa, H. Peta Metabolik Racun Perosak; Academic Press, Inc.: London, UK, 1989; Jilid 2.

2. Ehlhardt, WJ Metabolisme dan pelupusan agen antikanser sulfur dalam tikus, tikus, monyet, dan manusia. Metab Dadah. Dispos. 1991, 19, 370–375. [PubMed]

3. Rickert, DD; Dipegang, SD Metabolisme chloronitrobenzenes oleh hepatosit tikus terpencil. Metab Dadah. Dispos. 1990, 18, 5–9. [PubMed]

4. Lee, JB; Sohn, HY; Shin, KS; Kim, JS; Jo, MS; Jeon, CP; Jang, JO; Kim, JE; Kwon, GS Biodegradasi mikrob dan ketoksikan vinclozolin dan metabolit toksiknya 3,5-dichloroaniline. J. Mikrobiol. Bioteknol. 2008, 18, 343–349. [PubMed]

5. Santos, TCR; Rocha, JC; Alonsa, RM; Martinez, E.; Ibanez, C.; Barcelo, D. Kemerosotan pesat propanil dalam tanaman ladang padi. alam sekitar. Sci. Technol. 1998, 32, 3479–3484. [CrossRef]

6. Marlett, VL; Martyniuk, CJ Tindak balas biologi terhadap racun herba fenilurea dalam ikan dan amfibia; arahan baharu untuk mencirikan mekanisme ketoksikan. Komp. Biokim. Fisiol. C Toksik. Pharmacol. 2017, 194, 9–21. [CrossRef]

7. Lindh, CH; Littorin, M.; Amilon, A.; Jonsson, BA Analisis 3,5-dichloroaniline sebagai biomarker vinclozolin dan iprodione dalam air kencing manusia menggunakan kromatografi cecair/spektrometri jisim triple quadrupole. Komuniti Cepat. Spektrom Jisim. 2007, 21, 536–542. [CrossRef]

8. Kutting, B.; Goen, T.; Schwegler, U.; Daripada saya, H.; Uter, W.; Angerer, J.; Drexler, H. Monoarylamines dalam populasi umum—Kajian berasaskan populasi keratan rentas termasuk 1004 subjek Bavaria. Int. J. Hyg. alam sekitar. Kesihatan 2009, 212, 298–309. [CrossRef]

9. Turci, R.; Barisano, A.; Balducci, C.; Colosio, C.; Minoia, C. Penentuan dichloroanilines dalam air kencing manusia melalui kromatografi gas/spektrometri jisim: Protokol pengesahan dan penubuhan Nilai Rujukan dalam kumpulan penduduk yang tinggal di Itali tengah. Komuniti Cepat. Spektrom Jisim. 2006, 20, 2621–2625. [CrossRef]

10. Vitelli, N.; Chiodini, A.; Colosio, C.; De Paschale, G.; Somaruga, C.; Turci, R.; Minoia, C.; Brambilla, G.; Colombi, A. Pendedahan pekerjaan dan alam sekitar kepada racun perosak anilida dan dicarboximide. G. Itali. Med. Lav. Ergon. 2007, 29 (Bekalan 3), 276–277.

11. Chhabra, RS; Thompson, M.; Elwell, MR; Gerken, DK Ketoksikan p-chloroaniline dalam tikus dan tikus. Kimia Makanan. Toksik. 1990, 28, 717–722. [CrossRef]

12. Guilhermino, L.; Soares, AM; Carvalho, AP; Lopes, MC Kesan akut 3,4-dichloroaniline pada darah tikus Wistar jantan. Chemosphere 1998, 37, 619–632. [CrossRef]

13. Pizon, AF; Schwartz, AR; Shum, LM; Rittenberger, JC; Rendah, DR; Giannoutsos, S.; Virji, MA; Krasowski, MD Analisis makmal Toksikologi dan pendedahan manusia kepada p-chloroaniline. Clin. Toksik. 2009, 47, 132–136. [CrossRef] [PubMed]

14. Koenig, CM; Beevers, C.; Pant, K.; Young, RR Penilaian potensi mutagen para-chloroaniline dan aniline dalam hati, limpa, dan sumsum tulang tikus Big Blue® dengan analisis mikronukleus dalam darah periferi. alam sekitar. Mol. Mutagen. 2018, 59, 785–797. [CrossRef] [PubMed]

15. Valentovic, MA; Bola, JG; Anestis, DK; Bir, KW; Madan, E.; Hubbard, JL; Rankin, GO Ketoksikan akut buah pinggang dan hepatik 2-haloanilin dalam tikus Fischer 344. Toksikologi 1992, 75, 121–131. [CrossRef]

16. Valentovic, MA; Bola, JG; Anestis, DK; Rankin, GO Perbandingan ketoksikan in vitro isomer struktur dichloroaniline. Toksik. In Vitro 1995, 9, 75–81. [CrossRef]

17. Valentovic, MA; Lo, HH; Brown, PI; Rankin, GO 3,5-Ketoksikan dichloroaniline dalam tikus Fischer 344 yang dirawat terlebih dahulu dengan perencat dan inducer cytochrome P450. Toksik. Lett. 1995, 78, 207–214. [CrossRef]

18. Bhuiyan, MNH; Kang, H.; Kim, JH; Kim, S.; Kho, Y.; Choi, K. Gangguan endokrin oleh beberapa derivatif aniline dan mekanisme yang berkaitan dalam talian sel H295R adrenal manusia dan ikan zebra jantan dewasa. Ecotoxicol. alam sekitar. Saf. 2019, 180, 326–332. [CrossRef]

19. Hong, SK; Anestis, DK; Henderson, TT; Rankin, GO Haloaniline-induced in vitro nephrotoxicity: Kesan 4-haloanilines dan 3,5-dihaloanilines. Toksik. Lett. 2000, 14, 125–133. [CrossRef]

20. Racine, C.; Ward, D.; Anestis, DK; Ferguson, T.; Preston, D.; Rankin, GO 3,4,5-Nefrotoksisiti trichloroaniline in vitro: Potensi peranan radikal bebas dan biotransformasi buah pinggang. Int. J. Mol. Sci. 2014, 15, 20900–20912. [CrossRef]

21. Boehncke, A.; Kielhorn, J.; Konnecker, G.; Pohlenz-Michel, C.; Mangelsdorfer, I. Dokumen Penilaian Kimia Antarabangsa Ringkas 48—4-Chloroaniline; Pertubuhan Kesihatan Sedunia: Geneva, Switzerland, 2003.

22. Vangnai, AS; Kataoka, N.; Soonglerdsongpha, S.; Kslsmbaheti, C.; Tajima, T.; Kato, J. Pembinaan dan penggunaan bioreporter Escherichia coli untuk pengesanan anilin dan kloroanilin. J. Ind. Mikrobiol. Bioteknol. 2012, 39, 1801–1810. [CrossRef]

23. Lo, HH; Brown, PI; Rankin, GO Nefrotoksisiti akut yang disebabkan oleh dichloroanilines isomerik dalam tikus Fischer 344. Toksikologi 1990, 63, 215–231. [CrossRef]

24. Rankin, GO; Yang, DJ; Teets, VJ; Lo, HH; Brown, PI 3,5-Nefrotoksisiti akibat dichloroaniline dalam tikus Sprague-Dawley. Toksik. Lett. 1986, 30, 173–179. [CrossRef]

25. Racine, CR; Ferguson, T.; Preston, D.; Ward, D.; Bola, J.; Anestis, D.; Valentovic, M.; Rankin, GO Peranan biotransformasi dan tegasan oksidatif dalam 3,5-dichloroaniline (3,5-DCA) menyebabkan nefrotoksisiti dalam sel kortikal renal terpencil daripada tikus Fischer 344 jantan. Toksikologi 2016, 341–343, 47–55. [CrossRef] [PubMed]

26. Hong, SK; Rankin, GO Biotransformasi 2-chloroaniline dalam tikus Fischer 344: Pengenalpastian metabolit kencing. Xenobiotica 1998, 28, 985–994. [CrossRef] [PubMed]

27. Rankin, GO; Racine, C.; Sweeney, A.; Kraynie, A.; Anestis, DK; Barnett, JB Nefrotoksisiti in vitro yang disebabkan oleh propanil. alam sekitar. Toksik. 2008, 23, 435–442. [CrossRef]