Nc886, RNA Bukan Pengekodan, Merupakan Penanda Bio dan Pengantara Epigenetik Baharu Bagi Penuaan Selular dalam Fibroblas

Abstrak:

Kajian fungsional organisma dan model manusia telah mendedahkan bahawa perubahan epigenetik boleh memberi kesan ketara kepada proses penuaan. RNA bukan pengekodan (ncRNA), salah satu pengawal selia epigenetik, memainkan peranan penting dalam mengubah suai ekspresi mRNA dan proteinnya. Ia boleh menjadi pengantara fenotip sel. Telah dilaporkan bahawa nc886 (=vtRNA2-1 atau pra-miR-886), ncRNA panjang, boleh menyekat pembentukan tumor dan kerosakan foto keratinosit yang disebabkan oleh UVB. Kajian ini bertujuan untuk menentukan peranan nc886 dalam penuaan replikatif fibroblas dan menentukan sama ada bahan yang mampu mengawal ekspresi nc886 boleh mengawal penuaan selular.

Dalam fibroblas penuaan replikatif, ekspresi nc886 dikurangkan manakala nc886 metilasi meningkat. Terdapat perubahan dalam biomarker penuaan termasuk aktiviti SA- -gal dan ekspresi p16INK4A dan p21Waf1/Cip1 dalam sel senescent. Penemuan ini menunjukkan bahawa penurunan nc886 yang dikaitkan dengan penuaan adalah berkaitan dengan penuaan selular fibroblas dan peningkatan ekspresi nc886 berpotensi untuk menindas penuaan selular. AbsoluTea Concentrate 2.0 (ATC) meningkatkan ekspresi nc886 dan meningkatkan penuaan selular fibroblas dengan menghalang biomarker berkaitan usia. Keputusan ini menunjukkan bahawa nc886 berpotensi sebagai sasaran baharu untuk anti-penuaan dan ATC boleh menjadi bahan anti-penuaan epigenetik yang kuat.

Penuaan selular ialah istilah luas yang merangkumi fenomena seperti penurunan fungsi selular, penurunan kapasiti proliferatif dan kerosakan DNA yang disebabkan oleh banyak faktor. Penuaan selular bukanlah satu proses yang boleh diramal, tetapi kesan gabungan pelbagai faktor fisiologi, genetik dan persekitaran yang berbeza. Dalam penyelidikan, didapati bahawa Cistanche boleh menahan penuaan kerana prinsip anti-penuaan Cistanche terutamanya berkaitan dengan pelbagai bahan aktif yang terkandung di dalamnya. Cistanche kaya dengan pelbagai bahan aktif secara biologi, seperti polisakarida, flavonoid, acetophenone, dan lain-lain. Antaranya, polisakarida adalah salah satu bahan aktif utama Cistanche, yang mempunyai pelbagai fungsi kesihatan seperti meningkatkan imuniti, anti-pengoksidaan, mengawal selia metabolisme, dsb., dan boleh mengurangkan tahap penuaan badan.

Klik manfaat cistanche tubulosa

Kata kunci:

fibroblas; penuaan replikatif; peraturan epigenetik; nc886; ekstrak teh hijau.

1. Pengenalan

Penuaan selular dalam keadaan tidak dapat dipulihkan selepas penahanan percambahan sel telah muncul sebagai penyumbang yang berpotensi penting kepada disfungsi tisu dan penuaan organisma [1]. Senescence dicirikan oleh aktiviti tinggi beta-galactosidase yang berkaitan dengan senescence (SA- -}gal), meningkatkan ekspresi penanda biologi penuaan seperti p16INK4A dan p21Waf1/Cip1, dan penurunan ekspresi LaminB1 [2]. Terdapat dua jenis asas penuaan selular: penuaan replikatif dan penuaan pramatang yang disebabkan oleh tekanan. Penuaan replikatif ditakrifkan sebagai fenomena apabila sel normal berhenti membahagi selepas mencapai bilangan bahagian yang terhad. Ia berkaitan dengan penuaan kronologi. Pengumpulan kerosakan yang berterusan boleh menyebabkan penuaan replikatif fibroblas, yang membawa kepada kehilangan keupayaan untuk merombak dan menyusun matriks ekstraselular (ECM). Ciri-ciri utama dermis yang berumur adalah jumlah gentian kolagen yang berkurangan dan peningkatan pengeluaran matriks metalloproteinase (MMPs), yang menyumbang kepada struktur dermis yang nipis dan tidak teratur [3,4].

Mekanisme pengawalseliaan epigenetik adalah pengantara utama proses penuaan, menyesuaikan diri dengan tekanan dan perubahan berkaitan usia dalam persekitaran genomik dan molekul. Pengubahan epigenetik ini berlaku pada pelbagai peringkat, termasuk pengurangan histon teras besar-besaran, ubah bentuk histon oleh pengubahsuaian pasca translasi dan metilasi DNA, penggantian histon kanonik dengan varian histon, dan perubahan ekspresi RNA bukan pengekodan (ncRNA) semasa penuaan organisma dan replikatif [5]. ,6]. nc886 ialah ncRNA panjang 101 nukleotida yang boleh mengikat protein sasaran, dengan itu mengantara aktiviti protein dan mengawal ekspresi gen [7]. nc886 juga telah dicadangkan sebagai penindas tumor sebahagian besarnya disimpulkan oleh corak ekspresinya dan lokasi genomnya pada kromosom manusia 5q31, lokus gen penindas tumor. Satu ciri ekspresi nc886 ialah penyenyapan keganasan yang kerap oleh metilasi DNA CpG di rantau promoter [8]. Berdasarkan kajian terdahulu, kami mendapati bahawa pengurangan ekspresi nc886 yang disebabkan oleh penyinaran UVB dikaitkan dengan peningkatan COX-2 dan MMP-9 melalui laluan protein kinase RNA-activated (PKR) dalam keratinosit dan bahawa promosi ekspresi nc886 boleh menjadi strategi yang berguna untuk membangunkan bahan pelindung UVB [9,10].

Teh hijau telah dikaji sebagai rawatan untuk pelbagai keadaan dermatologi, seperti jerawat, rosacea, psoriasis, ketuat virus, dan juga kanser kulit. Sebatian fenolik termasuk asid gallik (GC) dan epigallocatechin gallate (EGCG) adalah sebatian aktif yang terkenal dalam teh hijau. (-)-Epigallocatechin-3-(3"-O-methyl) gallate (3" Me-EGCG) ialah bentuk unik O-methylated EGCG dan terkandung dalam teh oolong dan teh hijau. Khususnya, Jangwon No. 3 (varieti teh hijau Amorepacific) mengandungi lebih 3" Me-EGCG daripada jenis teh hijau yang lain [11]. 3" Me-EGCG telah dilaporkan mempamerkan kesan antioksidan dan fotoprotektif pada keratinosit [12] . Dalam kajian ini, kami menyiasat peranan nc886 dalam penuaan replikatif fibroblas dan menentukan sama ada penyediaan Me-EGCG 3" teh hijau pekat tinggi (AbsoluTea Concentrate 2.0) yang boleh meningkatkan ekspresi nc886 boleh meningkatkan penuaan selular.

2. Keputusan

2.1. Profil Kimia AbsoluTea Concentrate 2.0 (ATC)

Profil kimia AbsoluTea Concentrate 2.0 (ATC) ditunjukkan dalam Rajah 1B. Keputusan diperoleh menggunakan HPLC untuk ATC yang disediakan seperti yang diterangkan dalam bahagian Kaedah. ATC mengandungi 30 peratus atau lebih 3" Me-EGCG (Rajah 1B). Adalah diketahui bahawa ekstrak teh hijau tidak mengandungi 3" Me-EGCG atau menunjukkan kepekatan kurang daripada 6 peratus [13,14]. Kedua-dua fibroblas muda dan senescent yang dirawat dengan ATC menunjukkan lebih banyak peningkatan dalam ekspresi nc886 daripada yang dirawat dengan 70 peratus ekstrak etanol teh hijau (Tambahan Rajah S1A). Selain itu, paras ekspresi SA{15}}gal dalam fibroblas tua yang dirawat dengan ATC telah menurun lebih banyak berbanding tahap ekspresi gal yang dirawat dengan ekstrak teh hijau (Rajah Tambahan S1B).

2.2. nc886 Mengawal Penuaan Selular Fibroblas

Untuk melihat peranan nc886 dalam penuaan selular fibroblas, kami menggunakan model senescent replikatif melalui pertumbuhan dan subkultur. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah Tambahan S2, aktiviti SA- -gal dan tahap ekspresi penanda senescent p16INK4A dan p21Waf1/Cip1 telah meningkat dan ekspresi Lamin B1 telah menurun dalam fibroblas senescent berbanding dengan sel muda. Banyak kajian terdahulu telah melaporkan bahawa penuaan disebabkan oleh tekanan oksidatif. Untuk mengesahkan sama ada siri tekanan oksidatif ini terlibat dengan penuaan selular, tahap ROS dalam fibroblas muda (p3) dan senescent (p30) diukur. Keputusan menunjukkan bahawa tahap ROS meningkat dengan penuaan (Rajah Tambahan S2D).

Untuk melihat potensi kesan nc886 pada penuaan selular dalam fibroblas, tahap ekspresi gen nc886 dalam setiap bilangan petikan ditentukan. Tahap ungkapan nc886 telah menurun dengan peningkatan nombor laluan (Rajah 2A). Telah dilaporkan bahawa ungkapan nc886 berkurangan dengan metilasi pulau CpG. Untuk menentukan sama ada downregulation nc886 dalam fibroblas senescent telah dimediasi oleh metilasi nc886, PCR khusus metilasi telah dilakukan. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2A, metilasi nc886 telah meningkat dengan peningkatan nombor laluan (Rajah 2A). Keputusan ini menunjukkan bahawa ekspresi berkurangan nc886 dalam bilangan laluan fibroblas yang tinggi adalah disebabkan oleh peningkatan dalam metilasi DNA nc886. Untuk mengesahkan peranan nc886 dalam penuaan fibroblast, perubahan dalam penanda senescent dalam model overexpression dan knock-down nc886 telah ditentukan. Keputusan mendedahkan bahawa kumpulan fibroblas senescent dengan overexpression nc886 menunjukkan penurunan aktiviti SA-beta-gal, penurunan tahap ekspresi p16INK4A dan p21Waf1/Cip1, dan peningkatan tahap laminB1.

Di samping itu, peningkatan ROS dalam fibroblas senescent telah dikurangkan oleh overexpression nc886 (Rajah 2B). Sebaliknya, dalam kumpulan fibroblas muda dengan nc886 knock-down, penuaan selular telah dipercepatkan dan tahap ekspresi penanda tua selular seperti p16INK4A dan p21Waf1/Cip1 telah meningkat (Rajah 2C). Keputusan ini menunjukkan bahawa nc886 boleh mengawal selia senescence selular fibroblas dengan mengawal selia ekspresi penanda senescence (Rajah 2B, C).

2.3. ATC Mengurangkan Penuaan Selular dengan Mengawal Ungkapan nc886

Keputusan yang diperoleh di atas menunjukkan bahawa peningkatan ekspresi nc886 dapat meningkatkan penuaan selular dengan mengantarkan penanda tua. Untuk melihat kesan ATC pada ekspresi nc886, tahap ekspresi, dan metilasi nc886 dalam fibroblas senescent dinilai selepas rawatan dengan ATC pada kepekatan bukan sitotoksik (Rajah 3A). Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3B, dan C, ATC meningkatkan ekspresi nc886 dengan ketara dan menurunkan metilasi nc886 dalam cara yang bergantung kepada kepekatan. Keputusan ini menunjukkan bahawa peningkatan ekspresi nc886 oleh ATC telah dimediasi melalui perencatan metilasi nc886. Selain itu, kami mendapati bahawa ATC menghalang aktiviti SA{11}}gal dan menurunkan tahap ekspresi penanda senescent p16INK4A dan p21Waf1/Cip1 dalam fibroblas senescent (Rajah 3D, E). Walau bagaimanapun, ekspresi LaminB1 yang diketahui berkurangan dengan penuaan meningkat dalam fibroblas senescent yang dirawat dengan ATC (Rajah 3E). Keputusan ini menunjukkan bahawa ATC boleh mengurangkan penuaan selular dengan meningkatkan ekspresi nc886.

Rajah 2. nc886 mengawal penuaan selular fibroblas. (A) Ekspresi nc886 dan nc886 metilasi mengikut petikan telah disahkan oleh PCR masa nyata dan dinormalisasi dengan 18s rRNA. (B) Serpihan nc886 yang dikuatkan dan disucikan daripada DNA genom manusia telah dipindahkan ke dalam sel senescent dengan Lipofectamine 3000. Ekspresi berlebihan telah disahkan dengan memerhatikan ungkapan nc886 oleh ekspresi PCR dan SA{10}}masa nyata oleh mikroskop pendarfluor dan sitometri aliran. Ekspresi protein penanda senescence dan penjanaan ROS intraselular diperhatikan dalam model overexpression nc886. (C) Sel telah ditransfeksi dengan anti-oligos (si-ctrl dan si-nc886) pada kepekatan 250 ppm menggunakan reagen LipofectaminTM RNAiMAX. nc886 knock-down telah disahkan dengan memerhatikan ekspresi nc886 oleh PCR masa nyata dan ekspresi SA- -gal oleh mikroskop pendarfluor dan sitometri aliran. Ekspresi penanda penuaan telah disahkan dengan Western blot. Bar skala: 200 µm. Data dibentangkan sebagai min ± SD bagi tiga ujian bebas. *, p < 0.05; **, p < 0.01 berbanding kawalan.

2.4. ATC Mengawal Perubahan Berkaitan Umur ECM dan SASP

Ciri penuaan fibroblast ialah aktiviti MMP-1, komponen yang merendahkan kolagen, meningkat, manakala sintesis kolagen berkurangan [15,16]. Peningkatan MMP-1 dan penurunan kolagen telah disahkan dalam fibroblas tua dengan nombor laluan yang tinggi (Rajah 4A).

Walau bagaimanapun, ATC menyekat ekspresi MMP-1 dan meningkatkan sintesis kolagen dalam fibroblas tua. Keputusan ini menunjukkan bahawa ATC boleh meningkatkan perubahan ECM yang berkaitan dengan usia melalui pengawalan ekspresi MMP-1 dan sintesis kolagen dalam fibroblas senescent (Rajah 4B). Fenotip rembesan berkaitan penuaan (SASP) di mana sel-sel senescent merembeskan faktor pro-radang tertentu, faktor pertumbuhan, dan enzim proteolitik telah dilaporkan menyumbang kepada permulaan dan perkembangan penyakit berkaitan penuaan [17-19]. Kami memerhatikan kesan ATC pada SASP terutamanya sitokin pro-radang seperti IL-1 , IL_6 dan IL-8. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4C, ATC mengecilkan tahap ekspresi IL-1 , IL-6 dan IL{17}} yang disebabkan oleh penuaan. Ini menunjukkan bahawa ATC boleh memberikan kesan anti-penuaan melalui penindasan SASP.

3. Perbincangan

Sel sensen mengalami perubahan morfologi ciri yang melibatkan penyusunan semula nuklear dan kromatin yang diperbesar dan selalunya tidak teratur. Apabila penuaan disebabkan oleh kerosakan DNA, pengurangan replikasi, atau ekspresi onkogen, Lamin B1 terutamanya hilang. Pelbagai tekanan dalaman atau luaran boleh mencetuskan laluan tindak balas kerosakan DNA (DDR) untuk mengaktifkan laluan p53 dan/atau p16INK4A. p16INK4A boleh menyahaktifkan Cdk4/6, mengakibatkan pengumpulan pRb terfosforilasi, mengganggu peraturan faktor transkripsi E2F, dan mendorong penangkapan atau penuaan kitaran sel [20,21]. Peningkatan pengeluaran spesies oksigen reaktif (ROS) yang kebanyakannya dihasilkan oleh mitokondria yang tidak berfungsi boleh membawa kepada penuaan selular melalui kerosakan DNA dan transaktivasi laluan isyarat penuaan, termasuk p53, p16INK4A, dan p21Waf1/Cip1 [22].

Dalam kajian ini, kami mendapati bahawa ekspresi nc886 telah berkurangan dengan peningkatan nombor laluan dan penyelarasan ekspresi nc886 mengurangkan penuaan selular melalui pengantaraan LaminB1, p16INK4A, p21Waf1/Cip1, dan pengeluaran ROS. nc886 ditranskripsikan oleh RNA polimerase III (Pol III) dan disenyapkan oleh hipermetilasi DNA CpG dalam banyak keganasan [8]. Kami memerhatikan bahawa ungkapan nc886 telah menurun dengan metilasi pulau CpG dalam fibroblas senescent. Keputusan ini menunjukkan bahawa hipermetilasi pulau CpG menjejaskan fungsi nc886 sebagai penindas penuaan selular.

Laluan ekspresi gen tertentu yang terjejas oleh nc886 tidak jelas. Mereka mungkin termasuk yang dilaporkan sebelum ini untuk ncRNA lain. nc886 boleh memainkan peranan penting dalam penuaan selular melalui pengantaraan secara langsung atau tidak langsung laluan isyarat penuaan pada tahap struktur kromatin, aktiviti faktor transkripsi, peraturan gen selepas transkripsi, dan pasca translasi [23]. Sebagai contoh, nc886 boleh mengantara laluan senescent perkembangan kitaran sel.

Telah dilaporkan bahawa AK156230 sebagai ncRNA dikaitkan dengan induksi penuaan replikatif fibroblas melalui peranannya dalam autophagy dan perkembangan kitaran sel. Penurunan regulasi sel AK156230 yang diinduksi untuk menunjukkan tindak balas penuaan dengan mengaktifkan p53 dan p21 sambil mengurangkan kinase 1 (CDK1) yang bergantung kepada cyclin [24]. ncRNA1 yang berkaitan dengan senescence (SAL-RNA1), MALAT1 dan MIAT dikenali sebagai pengawal selia negatif penuaan selular. Mereka berkurangan dalam fibroblas tua. Menurun kawal selia gen ini boleh menyebabkan peningkatan dalam penanda penuaan seperti SA-gal, p16, p21, dan p53 [25]. Kesan MALAT1 pada penuaan selular dicapai melalui penurunan faktor transkripsi onkogenik b-Myb/Mybl2.

Walaupun ekspresi pelbagai ncRNA terjejas semasa penuaan, hanya beberapa yang terlibat secara fungsional dalam penuaan. Oleh kerana penyetempatan ncRNA adalah penting untuk memahami mekanisme yang terlibat dalam fungsi, ncRNA nuklear dan sitoplasma dibincangkan secara berasingan apabila menerangkan mekanisme molekul yang mempengaruhi penuaan [26]. ncRNA yang terletak di dalam sitoplasma boleh berfungsi sebagai pengawal selia terjemahan melalui pasangan asas dengan mRNA sasaran [27]. ncRNA boleh menjejaskan tahap ekspresi protein dengan meningkatkan atau mengurangkan kestabilan mRNA [28].

Sebagai contoh, semasa penuaan yang disebabkan oleh RAS, sitoplasma UCA1 menyumbang kepada penstabilan mRNA p16 dengan mengasingkan hnRNPA1 [29]. nc886 mengandungi tapak pengikat protein kinase RNA-activated (PKR). Pengikatan PKR–nc886 boleh menghalang aktiviti PKR. PKR, reseptor sitoplasma untuk RNA beruntai dua (dsRNA), dikawal oleh kinase protein serin/treonin yang diaktifkan oleh jangkitan, sitokin, tekanan oksidatif, dan penyinaran (termasuk UV), yang membawa kepada induksi keradangan dan apoptosis berikutnya [20]. ,21] [30,31]. nc886 mengikat PKR dengan pertalian yang setanding dengan dsRNA dan menghalang PKR daripada diaktifkan. nc886 knockdown menghasilkan pemfosforilasi subunit faktor 2 permulaan eukariotik (eIF2 ) melalui laluan PKR, yang menyebabkan kematian sel dan menghalang sintesis protein selular global. Telah dilaporkan bahawa pengeluaran COX-2, IL-8 dan MMP oleh TNF- dimediasi oleh laluan PKR dalam kondrosit manusia [32].

Dalam kajian terdahulu, kami juga telah menunjukkan bahawa keradangan yang disebabkan oleh UVB boleh dikawal melalui laluan nc886-PKR dalam keratinosit [10]. Selain itu, PKR berkaitan dengan kecederaan akibat tekanan oksidatif dalam miosit jantung neonatal. Perencatan PKR melindungi daripada kecederaan akibat H2O2-dengan melemahkan apoptosis dan keradangan [33]. Keradangan dan tekanan oksidatif adalah faktor utama yang mendorong proses penuaan. Oleh itu, laluan PKR boleh mengantara penuaan selular fibroblas yang disebabkan oleh pengurangan nc886. Untuk menjelaskan mekanisme pengawalseliaan terperinci yang terlibat dalam kesan nc886 pada penuaan selular fibroblas, kajian lanjut diperlukan.

Kesan antipenuaan ekstrak teh hijau telah dilaporkan secara meluas dalam kajian terdahulu. Aktiviti antioksidan dan anti-radang teh hijau adalah mekanisme terkenal yang menyumbang kepada kesan anti-penuaannya. Dalam ujian awal, kami mendapati bahawa ATC meningkatkan ekspresi nc886 dengan ketara sebanyak lebih daripada 70 peratus ekstrak etanol teh hijau (Tambahan Rajah S1A). Keputusan ini menunjukkan bahawa katekin pekat termasuk 3" Me-EGCG boleh dikaitkan dengan penyelarasan ekspresi nc886. Untuk menentukan sama ada agen perangsang nc886 boleh menghalang penuaan selular, kami melihat kesan ATC pada fibroblas tua. ATC meningkatkan ekspresi nc886 sebanyak menghalang tahap metilasi gen nc886 dalam fibroblas senescent (Rajah 3B, C). ATC juga melegakan penuaan selular dengan mengantarkan biomarker senescent seperti aktiviti SA- -gal, LaminB1, p16INK4A dan p21Waf1/Cip1 (Rajah 3). ). Selain itu, peningkatan MMP-1 dan pengurangan pengeluaran kolagen yang disebabkan oleh penuaan selular telah dipulihkan oleh ATC (Rajah 4B). Faktor SASP berbeza sedikit bergantung pada jenis sel dan jenis tekanan akibat penuaan, ia biasanya dikenali sebagai gen sasaran untuk NF-κB yang mengawal selia sitokin pro-radang seperti IL-6 dan IL-8.

Dalam kajian ini, kami mengesahkan bahawa peningkatan ekspresi IL-1 , IL_6 dan IL-8 dalam sel senescent telah ditindas oleh ATC (Rajah 4C). Kami tidak boleh mengecualikan kemungkinan bahawa kesan penambahbaikan teh hijau pada penuaan selular dicapai dengan pelbagai mekanisme, termasuk peraturan nc886, anti-pengoksidaan dan anti-keradangan. Walau bagaimanapun, keputusan kami menunjukkan bahawa peningkatan nc886 oleh ATC memainkan peranan penting dalam penindasan penuaan selular, seterusnya menjejaskan pengeluaran fibroblas ECM.

4. Bahan dan Kaedah

4.1. Penyediaan ATC

Daun teh hijau kering (Camellia sinensis var. sinensis cv. Jangwon No. 3) yang digunakan untuk kajian semasa diperoleh daripada pokok teh yang ditanam di taman teh Dolsongi (33◦16023.900 N 126◦28058.300 E), Jeju, Korea Selatan. Daun teh kering (170 g) diekstrak dengan 70 peratus EtOH (v/v) pada suhu bilik selama 16 jam. Ekstrak kemudiannya diserbukkan menggunakan lyophilizer (TF10D, TEFIC BIOTECH, Xian, China). Untuk menyediakan ATC, ekstrak EtOH ditumpukan sepuluh kali ganda dengan penyejat berputar dan dimuatkan pada lajur yang dibungkus dengan resin AB-8 (diameter dalam 5 cm, panjang 45 cm). Elusi pelarut lajur dilakukan dengan 4 kali isipadu katil (BV) sebanyak 20 peratus, 30 peratus, dan 100 peratus EtOH (v/v). Dalam kajian ini, sisa pelarut dalam lajur dikeluarkan dengan pemampat udara sebelum elusi. eluat EtOH 30 peratus telah ditumpukan dua puluh kali ganda dan digunakan pada lajur poliamida (diameter dalam 2.5 cm, panjang 40 cm). Lajur poliamida telah dielusi 5 kali BV sebanyak 10 peratus dan 100 peratus EtOH. Eluat EtOH 100 peratus dipekatkan dengan teliti dan diliofilkan.

4.2. Kultur Sel dan Rawatan Sel dengan ATC

Fibroblas kulit manusia (HDF) telah dibeli daripada ATCC (Manassas, VA, Amerika Syarikat). Kultur sel dijalankan di bawah keadaan terkawal pada 37 ◦C dengan 5 peratus CO2 menggunakan medium Eagle yang diubah suai Dulbecco (WELGENE, Daegu, Korea) ditambah dengan 10 peratus serum lembu janin (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) dan 1 peratus penisilin -streptomycin (WELGENE, Daegu, Korea). Sel telah disemai ke dalam 6-plat perigi pada ketumpatan 2 × 105 sel/plat. Selepas mencapai 60 peratus pertemuan, mereka dirawat dengan kepekatan ATC yang ditunjukkan selama 72 jam.

4.3. SA- -Analisis Pewarnaan Gal dan Sitometri Aliran

Sel telah diwarnakan menggunakan SPiDER- -Gal (Dojindo, Kumamoto, Jepun) mengikut arahan pengilang. Sel dianalisis dengan Sistem Pengimejan Sel FL EVOS® (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Amerika Syarikat) dan cytometer aliran BD FACS Calibur (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, Amerika Syarikat).

4.4. Pengukuran ROS Intraselular

Pengeluaran ROS intraselular dipantau menggunakan C20,70 -dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA; Molecular Probes), penunjuk ROS pendarfluor. Sel telah diinkubasi dengan H2DCFDA (5 µM) selama 30 minit pada suhu 37 ◦C. Pendarfluor berkaitan sel telah dikesan dengan cytometer aliran BD FACS Calibur (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, Amerika Syarikat).

4.5. PCR Masa Nyata dan PCR Khusus Metilasi

Jumlah RNA diekstrak menggunakan TRIzol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Pengukuran kuantitatif RNA dilakukan menggunakan spektrofotometer mikroplat Epoch (BioTek, Winooski, VT, USA). cDNA telah disintesis menggunakan am-fiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix (GenDEPOT, Barker, TX, USA). DNA Genomik diekstrak menggunakan Kit Pengekstrakan DNA Genomik AccuPrep® (BIONEER, Daejeon, Korea). Penukaran bisulfit telah dijalankan menggunakan kit metilasi DNA EZ (Zymo Research, CA, USA). Untuk melaksanakan qRT-PCR, Kit Sintesis cDNA AMPIGENE® (Enzo Life Sciences Inc., Farming-dale, NY, USA) dan sistem PCR masa nyata ABI7500 (Ambion Inc, Austin, TX, USA) telah digunakan. Urutan primer yang digunakan dalam kajian ini diterangkan dalam Jadual 1.

4.6. Ujian Dehidrogenase Laktat

Ujian LDH digunakan untuk menentukan sitotoksisiti dengan mengukur aktiviti laktat dehidrogenase (LDH) yang dikeluarkan daripada sel yang rosak. Ujian dilakukan menggunakan kit Ujian WST Sitotoksisiti LDH (sains hayat Enzo, Farmingdale, NY, Amerika Syarikat) mengikut arahan pengilang.

4.7. Transfection DNA untuk nc886 Overexpression dan Transfection siRNA untuk nc886 Knockdown

Untuk mendapatkan DNA bagi ekspresi berlebihan nc886 dalam sel, DNA telah dikuatkan dengan AccuPower® PCR PreMix (BIONEER, Daejeon, Korea) menggunakan DNA genomik HDF sebagai templat dan primer berikut yang diterangkan dalam Jadual 2.

DNA yang diperkuat telah disucikan menggunakan Kit Pemurnian PCR QIAquick (QIAGEN, Hilden, Jerman). DNA yang telah disucikan telah ditransfeksi dengan reagen LipofectamineTM 3000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Untuk knockdown nc886, sel telah ditransfeksi dengan anti-oligos (si-ctrl dan si-nc886) pada kepekatan 250pM menggunakan reagen Lipofectamine™ RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

4.8. Western Blotting

Lisat sel disediakan dengan Penyelesaian Pengekstrakan Protein PRO-PREP™ (Bioteknologi iNtRON, Gyeonggi do, Korea). Jumlah protein dipisahkan dengan sistem elektroforesis NuPAGE (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) dan dipindahkan ke membran polyvinylidene difluoride (PVDF). Immunoblotting dilakukan menggunakan antibodi primer terhadap p16INK4A, p21Waf1/Cip1 (Teknologi Isyarat Sel, Danvers, MA, Amerika Syarikat), MMP1, Col1A2, dan -actin (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA). Mengimbas nilai densitometrik jalur dianalisis menggunakan ImageJ, perisian versi 1.52a (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

4.9. Ujian Imunosorben Berkaitan Enzim

Selepas pengeraman yang dinyatakan, kolagen (Kit EIA C-Peptide Procollagen Type I, Takara, Shiga, Jepun) dan MMP-1 (Sistem R&D, Minneapolis, MN, Amerika Syarikat) dalam supernatan kultur diukur menggunakan ujian imunosorben berkaitan enzim. (ELISA) mengikut arahan pengilang.

4.10. Analisis statistik

Semua keputusan dibentangkan sebagai min ± sisihan piawai (SD). Perbezaan antara kedua-dua kumpulan telah dinilai oleh ujian-t atau analisis varians (ANOVA) menggunakan GraphPad Prism. Kepentingan statistik ditunjukkan sebagai sama ada p < 0.05 atau p < 0.01.

5. Kesimpulan

Kesimpulannya, mengawal selia ekspresi nc886 boleh menjadi sasaran potensi penuaan selular dalam fibroblas, dan ATC boleh menjadi bahan anti-penuaan epigenetik yang kuat.

Sumbangan Pengarang:

Pengkonsepan, YK, KH, dan EJ; metodologi YK, HJ, N.-HP, dan K.-SL; penyusunan data, YK, HJ dan EC; penyiasatan, YK, HJ, EC, K.-SL, N.-HP dan EJ; pentadbiran projek, WP, DP, dan EJ; sumber, WP dan DP; penyeliaan, DP, dan EJ; penulisan— draf asal, YK; penulisan—semakan & penyuntingan, N.-HP, KH, WP, DP, dan EJ Semua pengarang telah membaca dan bersetuju menerima versi manuskrip yang diterbitkan.

Pembiayaan:

Penyelidikan ini tidak menerima pembiayaan luar.

Penyata Lembaga Semakan Institusi:

Tidak berkaitan.

Kenyataan Persetujuan Termaklum:

Tidak berkaitan.

Penyata Ketersediaan Data:

Data akan disediakan atas permintaan.

Konflik Kepentingan:

Penulis mengisytiharkan tiada konflik kepentingan.

Rujukan

1. Campisi, J.; d'Adda di Fagagna, F. Senescence selular: Apabila perkara buruk berlaku kepada sel yang baik. Nat. Rev. Mol. Biol Sel. 2007, 8, 729–740. [CrossRef] [PubMed]

2. Kapoor, VK; Dureja, J. Aging: Pendekatan ke arah kawalannya. Discov dadah. Hari ini Ther. Strategi. 2010, 7, 43–44. [CrossRef]

3. Fisher, GJ; Kang, S.; Varani, J.; Bata-Csorgo, Z.; Wan, Y.; Datta, S.; Voorhees, JJ Mekanisme photoaging dan kronologi penuaan kulit. Gerbang. Derm. 2002, 138, 1462–1470. [CrossRef]

4. Tigges, J.; Krutmann, J.; Fritsche, E.; Haendeler, J.; Schaal, H.; Fischer, JW; Kalfalah, F.; Reinke, H.; Reifenberger, G.; Stuhler, K.; et al. Ciri-ciri penuaan fibroblast. Mech. Dev Penuaan. 2014, 138, 26–44. [CrossRef]

5. Brunet, A.; Berger, SL Epigenetik penuaan dan penyakit berkaitan penuaan. J. Gerontol. Sebuah Biol. Sci. Med. Sci. 2014, 69, S17–S20. [CrossRef] [PubMed]

6. Moskalev, AA; Aliper, AM; Smit-McBride, Z.; Buzdin, A.; Zhavoronkov, A. Genetik dan epigenetik penuaan dan umur panjang. Kitaran Sel 2014, 13, 1063–1077. [CrossRef]

7. Lee, K.; Kunkeaw, N.; Jeon, SH; Lee, I.; Johnson, BH; Kang, GY; Bang, JY; Park, HS; Leelayuwat, C.; Lee, YS Precursor miR-886, RNA bukan pengekodan novel yang ditindas dalam kanser, bersekutu dengan PKR dan memodulasi aktivitinya. RNA 2011, 17, 1076–1089. [CrossRef] [PubMed]

8. Park, JL; Lee, YS; Lagu, MJ; Hong, SH; Ahn, JH; Seo, EH; Shin, SP; Lee, SJ; Johnson, BH; Stampfer, MR; et al. Peraturan epigenetik transkripsi RNA polimerase III dalam tumorigenesis payudara awal. Onkogen 2017, 36, 6793–6804. [CrossRef] [PubMed]

9. Lee, KS; Shin, S.; Cho, E.; Saya, WK; Jeon, SH; Kim, Y.; Park, D.; Frechet, M.; Chajra, H.; Jung, E. nc886, RNA bukan pengekodan, menghalang ekspresi MMP-9 dan COX-2 akibat UVB melalui laluan PKR dalam keratinosit manusia. Biokim. Biophys. Res. Commun. 2019, 512, 647–652. [CrossRef] [PubMed]

10. Lee, KS; Cho, E.; Weon, JB; Park, D.; Frechet, M.; Chajra, H.; Jung, E. Perencatan Keradangan Akibat UVB oleh Ekstrak Laminaria japonica melalui Peraturan nc886-Laluan PKR. Nutrien 2020, 12, 1958. [CrossRef]

11. Ji, HG; Lee, YR; Lee, MS; Hwang, KH; Kim, EH; Park, JS; Hong, YS Pengenalpastian epigallocatechin-3-O-(3-Omethyl)-gallate (EGCG300Me) dan profil asid amino dalam pelbagai kultivar teh (Camellia sinensis L.). Ringkas Data. 2017, 14, 607–611. [CrossRef]

12. Kim, E.; Han, SY; Hwang, K.; Kim, D.; Kim, EM; Hossain, MA; Kim, JH; Cho, JY Antioksidan dan Kesan Sitoprotektif (-)-Epigallocatechin-3-(300-O-methyl) Gallate. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3993. [CrossRef]

13. Huang, LH; Liu, CY; Wang, LY; Huang, CJ; Hsu, CH Kesan ekstrak teh hijau pada wanita yang berlebihan berat badan dan obes dengan tahap tinggi kolesterol lipoprotein ketumpatan rendah (LDL-C): Percubaan klinikal terkawal plasebo secara rawak, dua buta dan silang. Pelengkap BMC. Altern. Med. 2018, 18, 294. [CrossRef] [PubMed]

14. Soares, S.; Soares, S.; Brandao, E.; Guerreiro, C.; Mateus, N.; de Freitas, V. Interaksi lisan antara ekstrak flavanol teh hijau dan ekstrak anthocyanin wain merah menggunakan model berasaskan sel baharu: Pandangan tentang kesan epithelia mulut yang berbeza. Sci. Rep. 2020, 10, 12638. [CrossRef] [PubMed]

15. Levi, N.; Papismadov, N.; Solomonov, I.; Sagi, I.; Krizhanovsky, V. Laluan ECM penuaan dalam penuaan: Komponen dan pengubah suai. FEBS J. 2020, 287, 2636–2646. [CrossRef] [PubMed]

16. Pitozzi, V.; Mocali, A.; Laurenzana, A.; Giannoni, E.; Cifola, I.; Battaglia, C.; Chiarugi, P.; Dolara, P.; Giovannelli, L. Rawatan Resveratrol Kronik Memperbaiki Lekatan Sel dan Mengurangkan Fenotip Radang dalam Fibroblas Manusia Senescent. J. Gerontol. Ser. 2013, 68, 371–381. [CrossRef] [PubMed]

17. Coppe, JP; Patil, CK; Rodier, F.; Matahari, Y.; Munoz, DP; Goldstein, J.; Nelson, PS; Desprez, PY; Campisi, J. Fenotip rembesan yang berkaitan dengan Senescence mendedahkan fungsi sel-nonautonomi RAS onkogenik dan penindas tumor p53. PLoS Biol. 2008, 6, 2853–2868. [CrossRef]

18. Tchkonia, T.; Zhu, Y.; van Deursen, J.; Campisi, J.; Kirkland, JL Senescence selular dan fenotip rembesan senescent: Peluang terapeutik. J. Clin. Menyiasat. 2013, 123, 966–972. [CrossRef] [PubMed]

19. Munoz-Espin, D.; Serrano, M. Senescence selular: Dari fisiologi kepada patologi. Nat. Rev. Mol. Biol Sel. 2014, 15, 482–496. [CrossRef]

20. Lagger, G.; O'Carroll, D.; Rembold, M.; Khier, H.; Tischler, J.; Weitzer, G.; Schuettengruber, B.; Hauser, C.; Brunmeir, R.; Jenuwein, T.; et al. Fungsi penting histon deacetylase 1 dalam kawalan proliferasi dan penindasan perencat CDK. EMBO J. 2002, 21, 2672–2681. [CrossRef] [PubMed]

21. Freitas-Rodriguez, S.; Folgueras, AR; Lopez-Otin, C. Peranan metalloproteinases matriks dalam penuaan: Pengubahsuaian tisu dan seterusnya. Biochim. Biophys. Acta Mol. Sel Re. 2017, 1864, 2015–2025. [CrossRef]

22. Victorelli, S.; Passos, Pengesanan Spesies Oksigen Reaktif JF dalam Sel Senescent. Kaedah Mol. Biol 2019, 1896, 21–29. [PubMed]

23. Puvvula, Rangkaian Kawal Selia PK LncRNAs dalam Senescence Selular. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 2615. [CrossRef] [PubMed]

24. Chen, YN; Cai, SAYA; Xu, S.; Meng, M.; Ren, X.; Yang, JW; Dong, YQ; Liu, X.; Yang, JM; Xiong, XD Pengenalpastian lncRNA, AK156230, sebagai pengawal selia novel penuaan selular dalam fibroblas embrio tetikus. Oncotarget 2016, 7, 52673–52684. [CrossRef] [PubMed]

25. Abdelmohsen, K.; Panda, A.; Kang, MJ; Xu, J.; Selimyan, R.; Yoon, JH; Martindale, JL; De, S.; Kayu, WH, ke-3; Becker, KG; et al. lncRNA berkaitan senescence: RNA bukan pengekodan lama yang berkaitan dengan senescence. Sel Penuaan 2013, 12, 890–900. [CrossRef]

26. Montes, M.; Lund, AH Peranan lncRNA yang muncul dalam penuaan. FEBS J. 2016, 283, 2414–2426. [CrossRef] [PubMed]

27. Carrieri, C.; Cimatti, L.; Biagioli, M.; Beugnet, A.; Zucchelli, S.; Fedele, S.; Pesce, E.; Ferrer, I.; Collavin, L.; Santoro, C.; et al. RNA antisense bukan pengekodan panjang mengawal terjemahan Uchl1 melalui ulangan SINEB2 yang dibenamkan. Alam 2012, 491, 454–457. [CrossRef]

28. Kretz, M.; Siprashvili, Z.; Chu, C.; Webster, DE; Zehnder, A.; Qu, K.; Lee, CS; Flockhart, RJ; Groff, AF; Chow, J.; et al. Kawalan pembezaan tisu somatik oleh TINCR RNA bukan pengekodan yang panjang. Alam 2013, 493, 231–235. [CrossRef] [PubMed]

29. Kumar, PP; Emechebe, U.; Smith, R.; Franklin, S.; Moore, B.; Yandell, M.; Lessnick, SL; Moon, AM Kawalan penuaan yang diselaraskan oleh lncRNA dan kompleks penindas bersama T-box3 novel. Elife 2014, 3, e02805. [CrossRef]

30. Freund, A.; Laberge, RM; Demaria, M.; Kehilangan Campisi, J. Lamin B1 ialah biomarker yang berkaitan dengan penuaan. Mol. biol. Sel 2012, 23, 2066–2075. [CrossRef]

31. Gal-Ben-Ari, S.; Barrera, I.; Ehrlich, M.; Rosenblum, K. PKR: Satu Kinase untuk Diingati. Depan. Mol. Neurosci. 2018, 11, 480. [CrossRef] [PubMed]

32. Ma, CH; Wu, CH; Jou, IM; Tu, YK; Hung, CH; Hsieh, PL; Tsai, Pengaktifan PKR KL menyebabkan keradangan dan rembesan MMP-13 dalam kondrosit artikular manusia yang merosot. Biol Redoks. 2018, 14, 72–81. [CrossRef] [PubMed]

33. Wang, Y.; Lelaki, M.; Xie, B.; Shan, J.; Wang, C.; Liu, J.; Zheng, H.; Yang, W.; Xue, S.; Guo, C. Perencatan PKR melindungi daripada kecederaan akibat H2O2 -pada miosit jantung neonatal dengan melemahkan apoptosis dan keradangan. Sci. Rep. 2016, 6, 38753–38763. [CrossRef] [PubMed]

Yuna Kim 1 , Hyanggi Ji 1 , Eunae Cho 1 , Nok-Hyun Park 2 , Kyeonghwan Hwang 2 , Wonseok Park 2 , Kwang-Soo Lee 1 , Deokhoon Park 1 dan Eunsun Jung 1,*.

1 Institut Sains Hayat Biospektrum, A-1805, U-TOWER, Yongin-si 16827, Korea; bioyn@biospectrum.com (YK); biocr@biospectrum.com (HJ); biozr@biospectrum.com (EC); bioyc@biospectrum.com (K.-SL); pdh@biospectrum.com (DP)

2 Bahagian Penyelidikan dan Inovasi Asas, Pusat R&D Amorepacific Corporation, Youngin-si 17074, Korea; aquareve@amorepacific.com (N.-HP); khhwang@amorepacific.com (KH); wspark@amorepacific.com (WP)

* Correspondence: bioso@biospectrum.com

For more information:1950477648@nn.com