Jangkitan Semulajadi Parvovirus dalam Kucing Memancing Liar (Prionailurus Viverrinus) Mendedahkan Penyetempatan Virus yang Masih Ada dalam Buah Pinggang
Feb 25, 2022
Abstrak
Protoparvovirus karnivor-1 (CPPV-1), spesies virus yang mengandungi virus panleukopenia kucing (FPV) dan varian canine parvovirus (CPV), tersebar secara meluas dalam kalangan karnivor domestik dan liar yang menyebabkan penyakit maut sistemik. Kucing memancing liar (Prionailurus viverrinus), spesies yang terdedah di peringkat global, telah ditemui mati. Pemeriksaan bedah siasat ke atas bangkai mendedahkan lesi pada usus, limpa danbuah pinggang. Pengecaman antigen CPPV-1 dalam tisu ini, menggunakan tindak balas rantai polimerase (PCR) dan imunohistokimia (IHC), menyokong jangkitan oleh virus. PCR- dan IHC-positif dalam tisu buah pinggangmendedahkan penyetempatan atipikal virus semasa hibridisasi in situ (ISH) dan mikroskop elektron penghantaran (TEM) dengan teknik pop-off mengesahkan perihalan pertama penyetempatan virus dalambuah pinggang. Pencirian genom yang lengkap dan analisis asid amino yang disimpulkan bagi CPPV-1 yang diperoleh daripada kucing pancing mendedahkan FPV sebagai agen penyebab. Urutan FPV yang dikesan menunjukkan mutasi asid amino pada I566M dan M569R dalam protein kapsid. Analisis filogenetik dan evolusi bagi jujukan genom pengekodan lengkap mendedahkan bahawa genom kucing pancing CPPV-1 dikelompokkan secara genetik kepada genom FPV yang diasingkan daripada kucing domestik di Thailand. Sejak tahun 1970-an, genom ini juga telah ditunjukkan untuk berkongsi evolusi genetik dengan strain FPV Cina. Kajian ini ialah bukti pertama jangkitan CPPV-1 dalam kucing memancing dan ia adalah yang pertama menunjukkan penyetempatannya dalambuah pinggang. Penemuan ini menyokong julat berbilang hos parvovirus ini dan mencadangkan jangkitan CPPV-1 maut boleh mengakibatkan karnivor liar lain yang terdedah.
Kata kunci: tisu buah pinggang; penyakit buah pinggang, buah pinggang, buah pinggang, tiub buah pinggang
pengenalan
Genus Prionailurus, keluarga Felidae, dikategorikan sebagai sekumpulan kucing liar berbintik-bintik, bersaiz kecil, yang berasal dari Asia [1]. Genus Prionailurus terdiri daripada empat spesies kucing liar yang diiktiraf secara rasmi termasuk kucing harimau bintang (P. bengalensis), kucing kepala rata (P. planiceps), kucing tompok berkarat (P. rubiginosus) dan kucing memancing (P. viverrinus) [2]. Kucing pancing itu tinggal terutamanya di kawasan paya dan bakau. Ia hidup secara eksklusif di Asia Selatan dan Tenggara dan lebih lazim di Thailand [3, 4]. Pada masa ini, populasi kucing nelayan terancam kerana tanah lembap tempat mereka tinggal telah musnah sejak sedekad yang lalu. Akibatnya, spesies ini pada masa ini dianggap terdedah dan berada dalam Senarai Merah Kesatuan Antarabangsa untuk Pemuliharaan Alam (IUNC) [3]. Disebabkan kehilangan habitatnya, koloni kucing nelayan telah berhijrah dan kadang-kadang tinggal di kawasan di mana haiwan peliharaan dan manusia hidup [5]. Fenomena persekitaran yang dikongsi ini boleh menyebabkan peningkatan limpahan patogen antara haiwan liar dan domestik yang terdedah dan sebaliknya. Laporan wabak maut sama ada dalam haiwan liar atau domestik yang mungkin terhasil daripada limpahan patogen telah didokumenkan sejak beberapa dekad yang lalu [6-9]. Oleh itu, dinamik penghantaran patogen daripada haiwan tersebut harus diperiksa dan memerlukan penyiasatan lanjut.
CISTANCHE AKAN MENINGKATKAN FUNGSI BUAH PINGGANG/BUAH PINGGANG
Protoparvovirus karnivor-1 (CPPV-1), spesies virus termasuk virus enteritis cerpelai (MEV), raccoon parvovirus (RPV), virus panleukopenia kucing (FPV) dan varian canine parvovirus (CPV), telah diiktiraf sebagai patogen penting yang dikaitkan dengan penyakit maut dalam kedua-dua keluarga Canidae dan Felidae liar dan domestik [10, 11]. FPV, patogen biasa spesies Felidae, telah dihipotesiskan sebagai nenek moyang biasa CPV [12-14]. CPV kerap menjangkiti haiwan dalam keluarga Canidae dan terdapat peningkatan bukti jangkitan dalam keluarga Felidae [9, 15, 16]. Sebelum ini, FPV dan CPV telah dihipotesiskan sebagai virus sekatan hos. Walau bagaimanapun, beberapa penemuan kemudiannya menunjukkan bahawa sesetengah haiwan dalam keluarga Canidae mungkin memainkan peranan sebagai takungan untuk FPV atau sebaliknya [11, 17, 18]. Selain itu, beberapa laporan telah menunjukkan bahawa varian FPV dan CPV (CPV-2a, -2b dan -2c) berkongsi hos yang terdedah. Perumah ini bukan sahaja haiwan domestik tetapi juga pelbagai spesies karnivor [15, 19, 20], mencadangkan julat berbilang perumah CPPV-1 [11].
Dari 1996 hingga 1997, varian CPV pertama kali dikesan dalam kucing harimau bintang dan pada mulanya ditetapkan sebagai parvovirus kucing harimau (LCPV), mencadangkan perihalan pertama CPPV-1 dalam genus Prionailurus [21, 22]. Sebahagian daripada strain LCPV ini telah didedahkan sebagai berbeza secara genetik daripada CPV-2a dan -2b yang diterangkan sebelum ini disebabkan oleh mutasi asid amino G300A dalam protein kapsid (VP). Ini mengakibatkan perubahan dalam sifat antigennya yang kini digunakan sebagai titik mutasi unik untuk membezakan CPV-2c daripada varian CPV lain [22]. Penemuan varian CPV baharu (kini dikenali sebagai CPV-2c) dalam kucing harimau bintang menyokong idea evolusi bersama CPPV-1 dalam kalangan spesies haiwan. Kemudian, jangkitan varian FPV dan CPV dilaporkan dalam kucing harimau bintang [9]. Ini mencadangkan bahawa spesies lain dalam genus yang sama seperti kucing harimau bintang (genus Prionailurus) mungkin terdedah kepada jangkitan CPPV{14}}. Sehingga kini, kerentanan kepada jangkitan CPPV{15}} dalam spesies lain dalam genus Prionailurus masih belum diketahui. Menghurai cara varian CPPV{16}} berkembang dan cara varian yang baru muncul boleh membantu menjelaskan cara mencegah kemungkinan wabak varian baharu itu. Walaupun virus baharu mendapat julat perumah yang lebih luas, wabak maut atau lesi atipikal yang berkaitan dengan jangkitan mungkin diperhatikan dalam perumah baharu yang mudah terdedah. Kajian ini menerangkan jangkitan CPPV{17}} maut dalam kucing memancing liar (Prionailurus viverrinus). Pencirian genetik CPPV{18}} yang diperolehi mendedahkan FPV sebagai agen penyebab. Penemuan ini memberikan bukti pertama jangkitan FPV dalam spesies ini, dan ia mendedahkan tropisme selular unik virus ini. Penjelasan lanjut mengenai jangkitan FPV dan variannya dalam spesies ini adalah perlu untuk akaunnya untuk jangkitan global dalam banyak spesies yang terdedah.
Bahan dan kaedah
Haiwan dan pemeriksaan postmortem rutinPada Jun 2019, dua kucing memancing liar (P. viverrinus), menetapkan no kes. 1 & 2 ditemui mati di kawasan pinggir bandar di Wilayah Nakhon Ratchasima, Thailand. Kemudian pada Ogos 2019, seekor lagi kucing pancing, kes yang ditetapkan no. 3, sedang diselamatkan dari kawasan di mana dua kucing pancing pertama ditemui. Disebabkan keterukan dehidrasi, kes no. 3 meninggal dunia semasa rujukan ke hospital haiwan. Ketiga-tiga kucing pancing ini telah diserahkan untuk siasatan bedah siasat sebagai proses rutin. Malangnya, sampel haiwan peliharaan bebas perayauan atau spesies liar yang disembunyikan di kawasan yang sama tidak tersedia; oleh itu, mereka tidak termasuk dalam kajian ini. Pemeriksaan bedah siasat rutin dilakukan ke atas semua kucing pancing. Organ penting terpilih termasuk paru-paru, hati, jantung, limpa, danbuah pinggangtelah diambil sampel daripada semua kucing pancing, manakala usus dan nodus limfa mesenterik juga dikumpul daripada kucing pancing no.3. Semua tisu terpilih telah diserahkan untuk pemeriksaan histologi dan sampel secara individu untuk ujian molekul selanjutnya. Untuk histologi, tisu telah direndam dalam 10 peratus (v/v) formalin penimbal neutral selama sekurang-kurangnya 24 jam dan diproses secara rutin. Kemudian mereka diwarnai dengan hematoxylin dan eosin
(H&E) menggunakan prosedur standard sebelum penyiasatan oleh ahli patologi veterinar (TK) yang diperakui oleh lembaga ACVP. Sampel tisu segar yang diperoleh daripada ketiga-tiga kucing pancing itu disimpan pada -80˚C untuk kajian molekul. Semua prosedur telah dilakukan mengikut garis panduan dan peraturan berikutan kelulusan Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Universiti Chulalongkorn (No. 1931036).
Ujian molekul virologi amSampel tisu segar termasuk jantung, paru-paru, hati, limpa, danbuah pinggangsemua kucing pancing ditambah tisu nodus limfa usus dan mesenterik tambahan kucing pancing no. 3, telah tertakluk kepada pengekstrakan asid nukleik virus dengan menghomogenkan secara individu dengan 1 peratus (v/v) garam penimbal fosfat (PBS). Selepas itu, jumlah asid nukleik virus telah diekstrak menggunakan kit pengekstrakan asid nukleik virus komersial II (Geneaid, Taipei, Taiwan) berikutan cadangan pengeluar. Asid nukleik yang diekstrak kemudiannya layak dan dikira mengikut nisbah penyerapan A260/A280 menggunakan kaedah spektrofotometri (NanoDrop, Thermo Scientific™, Waltham, MA, USA). Semua asid nukleik yang diekstrak selanjutnya tertakluk kepada penyiasatan molekul virus menggunakan analisis tindak balas rantai polimerase (PCR) dengan beberapa panel ujian PCR keluarga pan-virologi termasuk pengesanan herpesvirus [23], paramyxovirus [24], pneumovirus [25], calicivirus [26], virus influenza [27], bocavirus [26, 28], parvovirus [29] dan virus korona [30, 31]. Protokol PCR, reagen, keadaan berbasikal dan kawalan positif/negatif yang digunakan dalam tindak balas diterangkan dalam Fail S1. Pengesanan PCR khusus gen gliseraldehid{18}}fosfat dehidrogenase (GAPDH) kucing digunakan sebagai kawalan dalaman seperti yang diterangkan sebelum ini [32]. Selepas itu, amplikon PCR positif telah divisualisasikan menggunakan platform elektroforesis kapilari QIAxcel (Qiagen, Hilden, Jerman) seperti yang diterangkan sebelum ini [33]. Amplikon positif setiap ujian PCR telah disucikan dan tertakluk kepada penjujukan Sanger dua arah (Macrogen Inc, Seoul, Korea Selatan). Disebabkan oleh autolisis tisu yang sederhana, penyiasatan bakteriologi tidak dapat dilakukan ke atas kucing pancing ini.
Pengesanan CPPV in situ-1 menggunakan imunohistokimia (IHC), hibridisasi in situ (ISH) dan Transmission Electron Microscopy (TEM)
Pemeriksaan molekul virologik awal mendedahkan amplikon positif PCR pan-parvovirus dan hasil penjujukan juga menunjukkan jujukan DNA berpotensi CPPV-1. Penemuan ini mendorong kami untuk mengesahkan lagi kehadiran CPPV-1 dan menyetempatkan pengedaran CPPV-1 dalam tisu kucing memancing. Tisu tertanam parafin tetap formalin (FFPE) termasuk paru-paru, hati, jantung, limpa,buah pinggangdan usus telah tertakluk kepada pengesanan CPPV-1 IHC menggunakan antibodi parvovirus anti-canine monoklonal tetikus (ab59832, Abcam, Cambridge, UK) dengan sistem pengesanan horseradish peroxidase (HRP) (EnVision polymer, Dako, Glostrup, Denmark) . Secara ringkasnya, bahagian FFPE dipotong kepada ketebalan 4-μm dan selanjutnya dinyahparafin dan dihidrat semula. Slaid kemudiannya dirawat terlebih dahulu, peroksidase endogen disekat dan diproses seperti yang diterangkan sebelum ini [11]. Bahagian tisu usus kucing yang dijangkiti FPV dan anjing yang dijangkiti CPV digunakan sebagai kawalan positif, manakala bahagian yang sama diinkubasi dengan IgG tikus kambing dan arnab yang telah dimurnikan (reagen kawalan negatif universal IHC, kod ADI-950-231-0025, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA), digunakan sebagai kawalan negatif. Mengenaibuah pinggangnekrosis tiub terdapat di kawasan di mana isyarat positif CPPV-1 IHC diperhatikan,buah pinggangbahagian semua kucing pancing telah dikenakan pewarnaan khas Periodic AcidSchiff (PAS), untuk menunjukkan seni bina selularbuah pinggangtisu.
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI PENYAKIT BUAH PINGGANG/PINGGANG
Tambahan pula, FFPEbuah pinggangbahagian kucing memancing no. 1 & 3 telah tertakluk kepada analisis ISH dan TEM untuk menyokong hasil pewarnaan IHC CPPV-1 positif dan untuk menunjukkan zarah virus secara ultra struktur dalamtisu buah pinggang, masing-masing. Untuk ISH, probe DNA CPPV-1 yang meliputi 393 bp [34] gen kapsid CPPV-1 telah dibina menggunakan Kit Sintesis Probe PCR DIG (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland), menurut cadangan pengeluar. Tindak balas dan keadaan kitaran haba telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini [34] dengan pengecualian dengan menggunakan oligonukleotida berlabel digoxigenin (DIG). Probe hibridisasi yang dibina telah divisualisasikan dan disahkan oleh resolusi saiz pada 1.5 peratus (w/v) elektroforesis gel agarose. ISH dengan DNA kromogenik telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini [26] dengan pengubahsuaian kecil. Secara ringkas, selepas penyahparafinan, penghidratan semula dan pembilasan seterusnya dalam PBS, slaid FFPE setebal 4-μm telah tertakluk kepada pencernaan proteolitik, pasca penetapan dan pra-hibridisasi. Slaid kemudiannya dihibridkan dengan probe ISH 25 ng/μL pada 42˚C semalaman. Isyarat hibridisasi telah divisualisasikan dengan gandingan dengan 100 μL serpihan Fab anti-DIG-AP (Roche, Basel, Switzerland) (1:200 dalam penyelesaian Penyekatan 1X) dalam kombinasi dengan Liquid Permanent Red (LPR) (Dako, Glostrup, Denmark) . Slaid kemudiannya diwarnakan dengan hematoksilin. Mendakan merah dalam korelasi morfologi selular dianggap positif untuk ISH. Untuk kawalan negatif, probe virus tasik tilapia (TiLV) [35] digunakan, bukannya probe CPPV-1. Sampel TEM disediakan mengikut teknik pop-off dengan pengubahsuaian [36-38] dan diwarnai dengan logam berat seperti yang diterangkan sebelum ini [39, 40]. Ultrastruktur telah disiasat menggunakan TEM (HT7800; Hitachi, Tokyo, Jepun) beroperasi pada 80 kV
Pencirian genetik penuh CPPV kucing memancing-1Oleh kerana keputusan saringan PCR virologi dan IHC adalah bersetuju dan keputusan separa jujukan genom VP-2 yang diperoleh daripada PCR pan-parvoviral mencadangkan persamaan genetik antara no kes. 1 & 2, tetapi bukan untuk kes no.3, kami seterusnya mencirikan jujukan CPPV-1 penuh daripada kucing pancing ini (no. kes 1 & 3) dan mengelaskan asal CPPV-1 menggunakan set pasangan primer terdegenerasi khusus untuk FPV dan CPV yang diambil daripada penerbitan sebelumnya [26]. Secara ringkas, asid nukleik yang diekstrak diperoleh daripada limpa danbuah pinggangdaripada dua ekor kucing pancing ditambah tisu usus tambahan kucing pancing no. 3, telah dikuatkan secara individu menggunakan GoTaq1 Hot Start Green Master Mix (Promega, Madison, WI, USA) dan primer khusus (S1 File). Keadaan PCR telah diterangkan sebelum ini [26]. Amplikon sasaran telah divisualisasikan menggunakan elektroforesis gel agarose 2 peratus (w/v) dan selanjutnya disucikan menggunakan kit pengekstrakan Gel DNA Monarch (New England Biolab, Frankfurt, Jerman) sebelum penjujukan Sanger komersial. Jujukan genom lengkap pengasingan CPPV-1 yang diperoleh daripada dua kucing pancing telah didepositkan dalam GenBank (nombor penyertaan MW145540-MW145541).
Analisis filogenetik, penggabungan semula dan evolusi CPPV kucing pancing-1 Jujukan genom penuh bagi strain CPPV-1 kucing pancing telah diselaraskan dengan jujukan CPPV-1 lengkap yang diterbitkan yang diperoleh daripada pelbagai spesies hos , tersedia dalam GenBank menggunakan MAFFT V. 7 (http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/) dan perisian MEGA7 (http://www.megasoftware.net). Penjajaran jujukan kemudiannya tertakluk kepada pembinaan pokok filogenetik. Pokok filogenetik dicipta menggunakan kaedah kemungkinan maksimum (ML) dengan model Hasegawa-Kishino-Yano dengan taburan gamma (HKY plus G), yang dipilih menggunakan algoritma model cari-paling-paling dalam MEGA7 mengikut kriteria maklumat Bayesian . Pokok itu telah diikat dengan 1,000 replika. Jujukan kesamaan berpasangan antara genom CPPV{11}} telah dikira menggunakan model kemungkinan komposit maksimum dan jarak evolusinya dianalisis dalam MEGA7. Identiti nukleotida berpasangan keluaran telah dijana dan digambarkan dalam format Microsoft Excel (Fail S2). Urutan penjajaran output CPPV-1 kemudiannya digunakan sebagai templat untuk analisis penggabungan semula genetik menggunakan dua pakej perisian bebas statistik. Secara ringkas, penjajaran mengenal pasti strain penggabungan semula yang berpotensi menggunakan perisian Program Pengesanan Semula 4 (RDP4) Pakej V. Beta 4.94 bersepadu dan ini telah disemak silang dengan plot persamaan dan analisis imbasan but dalam pek perisian SimPlot umur V. 3.5.1. Tetapan program dan tafsiran keputusan telah dijalankan seperti yang diterangkan sebelum ini [26, 41].
FUntuk analisis evolusi CPPV kucing pancing{{0}}, set data 224 jujukan genom lengkap yang mengandungi 26 FPV-, 6 MEV- dan 192 jujukan CPV, semuanya berasal dari 18 negara antara 1979 dan 2019, telah diambil daripada pangkalan data GenBank. Analisis evolusi dilakukan dengan 2 jujukan CPPV{11}} berpotensi yang diperoleh daripada kucing pancing menggunakan model Bayesian Markov chain Monte Carlo (BMCMC) yang dilaksanakan dalam BEAST V. 2.4.8 [42]. jModelTest [43] telah dilakukan untuk mengenal pasti model penggantian nukleotida yang paling sesuai untuk jujukan penjajaran berbilang. Model penggantian paling sesuai di bawah model jam lognormal santai dan ketat pada saiz populasi malar seperti sebelum ini dilaksanakan untuk mengambil kira kadar evolusi yang berbeza-beza di kalangan keturunan. Pohon latar langit Bayesian bercantum sebelumnya dan frekuensi asas empirikal diperoleh di bawah model jam paling sesuai dan dijalankan untuk 100 juta rantai, persampelan setiap 10,000generasi ke-, dengan 10 peratus pertama dibuang sebagai burn-in. Konvergensi parameter telah disahkan dengan mengira saiz sampel berkesan menggunakan program TRACER V. 1.7.0 [44]. Pokok kredibiliti klad maksimum telah dianotasi menggunakan TreeAnnotator V. 1.8.3 [42]. Pokok filogenetik dengan anggaran divergens, garis masa berubah-ubah, kebarangkalian posterior dan 95 peratus ketumpatan posterior tertinggi (HPD) telah dijana dan dipaparkan menggunakan FigTree V. 1.4.3 [45].
Kajian retrospektif antigen CPPV-1 dalam karnivor hidupan liarUntuk meneroka peranan CPPV-1 yang dikaitkan dengan morbiditi dan kematian dengan punca yang tidak diketahui dalam karnivor liar pada masa lalu yang jauh dan baru-baru ini, 305 sampel segar terpilih telah disertakan untuk pengekstrakan genomik dan penyasaran pengenalpastian CPPV{{2} } gen kapsid seperti yang diterangkan di atas. Sampel ini telah diperolehi sejak 2013 sama ada sebagai sapuan najis atau kandungan usus. Ia diperoleh daripada 136 haiwan zoo daripada 27 spesies karnivor berbeza (Jadual S1). Keputusan Penemuan bedah siasat dan penyetempatan tisu CPPV kucing pancing-1 Semua kucing pancing yang nekropsi kurus sederhana dengan tahap dehidrasi yang berbeza-beza manakala 2 daripada 3 kucing pancing (nos. kes 1 & 2) menunjukkan autolisis sederhana. Secara ketara, limpa danbuah pinggangtelah sesak dalam semua kucing memancing. Kucing pancing no.3 mempunyai lesi makroskopik enteritis catarrhal yang mengandungi kandungan coklat-kuning berair dalam lumennya dan kesesakan nodus limfa mesenterik. Secara histologi, paru-paru kucing pancing no. 3 mendedahkan kesesakan teruk dengan penyusupan sel mononuklear dalam alveoli. Hati menunjukkan hepatitis periportal ringan, dicirikan oleh penyusupan sel mononuklear pada triad portal hati. Tahap kesesakan splenik yang sama dengan beberapa bilangan folikel limfoid splenik diperhatikan dalam semua kucing memancing. Folikel limfoid telah habis dan folikel limfoid yang tinggal di tengah-tengah seni bina splenik runtuh dengan peningkatan bilangan trabekula splenik yang menonjol (Rajah 1A). Terdapat serpihan karyorrhectic limfosit bertaburan dengan
Rajah 1. Jangkitan CPPV-1 dalam kucing memancing. Gambar H&E (A, C) dan CPPV-1 IHC (B, D) tunjuk cara daripada kucing pancing. (A) Kucing pancing no. 1. Limpa tersumbat meresap dengan bilangan folikel limfoid yang jarang. Pusat salah satu folikel limfoid yang tinggal mengandungi bahan fibrillar eosinofilik (fibrin) bercampur dengan serpihan karyorrhectic limfosit yang bertaburan (limfositolisis) (inset). Beberapa bilangan limfosit ini mengandungi badan kemasukan intranuklear basofilik 5-7 μm yang meminggirkan kromatin nuklear (anak panah). (B) Kucing pancing no. 3. Pemendekan vili dengan kript diluaskan sekali-sekala yang mengandungi bahan berprotein eosinofilik dan dilapisi oleh sel epitelium kript yang dilemahkan dengan ketara atau nekrotik (inset). Banyak sel epitelium crypt adalah sel pyknotic dan karyorrhectic dan jarang mengandungi badan kemasukan intranuklear basofilik yang serupa (anak panah). (C) Kucing pancing no. 1. Imunoreaktiviti CPPV-1 kerap diperhatikan dalam sitoplasma sel mononuklear di kawasan folikel limfoid splenik. (D) Kucing pancing no. 3. Isyarat CPPV-1 IHC telah dikesan secara meresap dan isyarat imunoreaktiviti telah disetempatkan dengan ketara dalam sitoplasma sel epitelium cryptal (inset). Bar menunjukkan 25 μm untuk (A) dan 120 μm untuk (B–D).
pengumpulan bahan fibrillar eosinofilik di tengah folikel tersebut. Beberapa bilangan limfosit ini mengandungi badan kemasukan intranuklear basofilik 5-7 μm yang meminggirkan kromatin nuklear. Pemendekan vili usus dengan keruntuhan seni bina mukosa hadir di bahagian usus kucing memancing no. 3 (Rajah 1B). Beberapa crypt telah diluaskan, dan ia mengandungi bahan protein eosinofilik dan dilapisi oleh sel epitelium crypt yang dilemahkan dengan ketara atau nekrotik. Banyak sel epitelium cryptal adalah pyknotic dan karyorrhectic dan sel jarang mengandungi badan kemasukan intranuklear basofilik yang serupa. CPPV-1 IHC digunakan untuk menunjukkan kehadiran virus dalam tisu dan untuk menerangkan peranan patologi CPPV-1 dalam lesi yang diperhatikan dalam pemeriksaan postmortem rutin. Sel-sel mononuklear yang tinggal dalam limpa mendedahkan imunoreaktiviti sengit positif CPPV-1 dalam semua kucing memancing (Rajah 1C). Imunoreaktiviti juga diperhatikan dalam kebanyakan sitoplasma sel epitelium cryptal dan serasi dengan lesi usus kucing memancing no. 3 (Rajah 1D). Terutama, pelbagai darjahtiub buah pinggangvakuolasi dan multifokalbuah pinggangpendarahan jelas dalam semua kucing memancing (Rajah 2A). Beberapabuah pinggangsel epitelium tiub adalah hipereosinofilik dengan pyknosis nuklear, manakala sel epitelium tiub vakuola yang jarang ditemui mendedahkan nukleus vesikulasi dengan kromatin nuklear terpinggir (Rajah 2B). Mengenaibuah pingganglesi, kami selanjutnya melakukan pewarnaan PAS untuk menunjukkan seni bina selulartisu buah pinggangdan untuk mengecualikan hipoksia sistemik sebagai kemungkinan penyebab lesi ini. Pencemaran PAS menunjukkantiub buah pinggangmembran bawah tanah adalah utuh (Rajah 2B, inset). Di antarabuah pinggangbahagian, pelabelan imun CPPV-1 adalah kuat dan kerap dilihat dalam sitoplasmatiub buah pinggangsel epitelium (Rajah 2C) dan sel urothelial padapelvis buah pinggangdalam semua kes. Tiada bukti tindak balas imunogenik diperhatikan dalam kawalan negatif (S1 Rajah). Penyetempatan CPPV{1}} atipikal dalamtisu buah pinggangyang didedahkan oleh IHC mencadangkan agar kami menjalankan siasatan tambahan untuk mengesahkan kehadiran dan penyetempatan CPPV-1 dalambuah pinggangmenggunakan ISH dan TEM dengan teknik pop-off. Imunoreaktiviti CPPV-1 ISH adalah positif dalam semua kucing pancing dan disetempatkan secara meresap dalam nukleusbuah pinggangsel epitelium tiub, di mana lesi tiub diperhatikan (Rajah 2D). Tiada tindak balas diperhatikan dalam kawalan negatif (S1 Rajah.) Selaras dengan keputusan isyarat imunologi positif ISH yang disetempat dalam nukleusbuah pinggangsel epitelium, banyak zarah virus padat elektron kecil, dianggarkan kira-kira 19-22 nm diameter, diperhatikan. Ini berkelompok dalam nukleus initiub buah pinggangdan sel urothelial (Rajah 3).
Pengesanan CPPV kucing pancing-1 dan analisis genomikTerutamanya, panel PCR pan-family khusus untuk pelbagai virus termasuk herpesvirus, paramyxovirus, pneumovirus, calicivirus, virus influenza, bocavirus, coronavirus dan parvovirus telah diuji pada sampel asid nukleik virus yang diekstrak. Ini mendedahkan keputusan positif hanya dengan PCR pan-parvovirus dalam usus, nodus limfa danbuah pinggangsampel tiga ekor kucing pancing. Sebaliknya, pan-PCR lain untuk pengesanan virus lain adalah negatif dalam semua sampel tisu yang diuji Daripada keputusan positif PCR pan-parvovirus yang diperoleh sebelum ini dalam semua kucing pancing, kami selanjutnya mencirikan urutan genom pengekodan dalam dua kucing pancing menggunakan beberapa pasangan primer dalam sampel asid nukleik yang diekstrak diperoleh daripada usus (kes no.1) danbuah pinggang(kes no.3). 4,462 dan 4,430 pasangan asas genom pengekodan lengkap dua strain CPPV-1 kucing pancing telah dikesan dan ditetapkan strain 19ZP004-TH/2019 (kes no.1, kesertaan no. MW145540) dan 19ZP{ {12}}TH/2019 (kes no.3, kesertaan no. MW145541), masing-masing. Selepas analisis genetik, genom pengekodan lengkap mendedahkan hasil yang serupa secara genetik antara strain CPPV-1 yang diperoleh daripada kucing pancing dengan menunjukkan bahawa CPPV kucing pancing ini-1 ialah FPV. Perbandingan asid amino yang disimpulkan antara varian CPPV-1 dan FPV kucing pancing diterangkan dalam Jadual 1. Sebagai perhatian, FPV kucing memancing mendedahkan mutasi asid amino unik I566M dan M569R dalam protein struktur (VP1 & 2) , yang tidak dikesan dalam varian CPPV-1 sebelumnya.
Rajah 2. Jangkitan CPPV-1 dalam kucing memancing. H&E Demonstratif (A), pewarnaan PAS (B), CPPV-1 IHC (C) dan penghibridan in situ (ISH) (D) fotomikrografbuah pinggangdaripada kucing memancing. (A, B) Kucing pancing no.3. (A) Multifokalbuah pinggangpendarahan dengantiub buah pinggangvakuolasi. Beberapa sel epitelium tiub adalah hipereosinofilik dengan nukleus pyknotic (inset, anak panah). (B)Tiub buah pinggangsel epitelium mempamerkan vakuol sitoplasma dan nukleus sel epitelium yang jarang ditemui adalah vesikulat dengan kromatin nuklear terpinggir. Pewarnaan PAS menyerlahkan membran bawah tanah yang utuh (inset). (C) Kucing pancing no. 2. CPPV-1 IHC-imunoreaktiviti (warna perang-gelap) diperhatikan secara meresap dalamtubul renaldan kerap dikesan dalam sitoplasmatiub buah pinggangepitelium (sisipan). (D) Kucing pancing no.1. CPPV-1 ISH-imunoreaktiviti (warna merah jambu kemerahan) banyak diperhatikan dalamtubul renal(asteris), dan ia disetempatkan dalam nukleustiub buah pinggangepitelium (sisipan, anak panah). Bar menunjukkan 50 μm untuk (A, C) dan 120 μm untuk (B, D).
Analisis filogenetik dan evolusiUntuk membandingkan hubungan genetik antara CPPV kucing pancing yang dikesan-1 dan genom CPPV-1 lain yang diterbitkan sebelum ini, analisis filogenetik berdasarkan jujukan genom pengekodan lengkap telah dijalankan. Pokok filogenetik ML menunjukkan bahawa kebanyakan FPV, MEV dan CPV membentuk klad yang sangat berbeza di kalangan kumpulan (Rajah 4). Dua genom CPPV-1 daripada kucing pancing yang dikaji (ditunjukkan oleh segi tiga merah) telah dikelompokkan bersama dengan keturunan yang sama bagi jujukan FPV yang diterbitkan sebelum ini yang diperoleh daripada pelbagai hos, mengesahkan bahawa
Rajah 3. Zarah virus CPPV-1 dalam nukleustiub buah pinggangsel epitelium. Mikroskopi elektron penghantaran (TEM) menggunakan teknik pop-off. Demonstrasi ultrastruktur pengelompokan zarah padat elektron (anak panah). Saiz zarah icosahedral ialah diameter 19–22 nm yang terletak di dalam nukleustiub buah pinggangsel epitelium (inset). Bar skala seperti yang ditunjukkan dalam rajah.
CPPV kucing pancing-1 ialah FPV. Genom yang dikesan dikelompokkan bersama dan paling berkait rapat dengan genom FPV yang dikesan dalam kucing domestik di Thailand (kesertaan no. MN127780). Untuk menjelaskan lagi proses evolusi CPPV kucing pancing yang dikesan-1, beberapa pengesanan penggabungan semula dan analisis evolusi pada set data 224 CPPV-1 jujukan genom lengkap telah dijalankan. Analisis penggabungan semula mendedahkan bahawa tiada peristiwa penggabungan semula ditemui dalam jujukan CPPV-1 kucing memancing. Pokok evolusi data ini menunjukkan dua klad berasingan yang berbeza (Rajah 5). Satu klad termasuk FPV dan MEV dan klad lain termasuk semua jujukan CPV. Kadar evolusi keseluruhan dianggarkan pada 1.08 × 10−4 penggantian/tapak/tahun (95 peratus HPD: 1.95– 2.87 × 10−4 ). Pokok evolusi menunjukkan bahawa jujukan FPV kucing memancing dikelompokkan dalam keturunan FPV yang sama seperti yang diasingkan dari Thailand. Mereka telah berkongsi evolusi genetik dengan genom FPV yang dikesan dalam kucing domestik di China dan mungkin mempunyai asal yang sama sejak sekitar 1970.
Perbincangan
Edaran varian CPPV-1 yang merangkumi CPV dan FPV telah dikenal pasti dalam kedua-dua karnivor domestik dan liar. Walaupun jangkitan maut CPPV-1 pada anjing dan kucing peliharaan adalah perkara biasa, jangkitan ini secara sporadis dilihat pada karnivor liar [46]. Beberapa kajian telah menunjukkan bahawa banyak karnivor liar terdedah kepada jangkitan CPPV-1 termasuk felid liar, cerpelai, memerang, skunk, raccoon, musang, serigala, coyote, musang dan martens [11, 19]. Khusus kepada genus Prionailurus, hanya kucing harimau bintang telah dilaporkan dijangkiti dengan varian CPPV-1 [9]. Dalam kajian ini, kami menerangkan jangkitan semula jadi FPV, ahli CPPV-1, dalam kucing memancing liar (Prionailurus viverrinus). Ini adalah laporan pertama dengan penerangan mengenai pengedaran virus dan tropisme yang berbeza dalamtisu buah pinggangseperti yang disahkan melalui pengesanan antigen menggunakan analisis PCR, IHC, ISH dan TEM bagi struktur ultra.
Penghantaran silang spesies varian CPPV-1 antara karnivor domestik dan liar telah diperhatikan, dan beberapa wabak CPPV-1 maut telah dispekulasi dikaitkan dengan limpahan patogen di kalangan habitat [9, 11]. Disebabkan kehilangan habitat hidupan liar semasa, koloni liar telah berhijrah dan berkongsi habitat dengan haiwan domestik, yang telah menyebabkan peningkatan limpahan patogen antara haiwan yang mudah terdedah. Dalam kajian ini, kami mendapati bahawa genom kucing pancing CPPV-1 telah berkongsi corak evolusi dengan strain FPV yang dikesan dalam
Rajah 4. Topologi filogenetik mendedahkan hubungan genetik bagi jujukan pengekodan panjang penuh antara CPPV kucing pancing-1 dan varian CPPV-1 lain. Pokok filogenetik menunjukkan bahawa jujukan CPPV-1 kucing pancing (ditunjukkan oleh segi tiga merah) dikelompokkan bersama genom FPV dengan genom yang paling berkaitan dengan genom FPV yang dikesan dalam kucing Thai (MN127780). Nombor akses GenBank bagi jujukan CPPV-1 yang diterangkan sebelum ini yang digunakan dalam analisis ini telah ditunjukkan.
kucing domestik di Thailand. Keputusan ini menunjukkan corak evolusi yang serupa dengan strain FPV daripada nenek moyang biasa yang diasingkan daripada kucing domestik di China sejak tahun 1970-an. Keputusan ini mungkin membayangkan sama ada bukti kemungkinan penularan silang spesies antara kucing domestik dan kucing pancing atau evolusi bersama varian CPPV-1. Walau bagaimanapun, disebabkan oleh pengehadan sampel yang diperoleh daripada haiwan perayauan bebas di habitat yang sama dan bilangan kecil kucing nelayan yang disiasat, takungan utama CPPV-1 dalam kajian ini tidak dapat dikenal pasti dan penyiasatan lanjut diperlukan . Walaupun beberapa kajian telah menunjukkan bahawa pelbagai sisa asid amino dalam gen kapsid dikaitkan dengan kedua-dua keupayaan untuk menjangkiti perumah baru dan antigenisiti CPPV-1 [18, 47], mutasi asid amino tunggal pada kedudukan 300 daripada protein kapsid (VP2) telah dilaporkan sebagai penentu utama untuk pelbagai julat hos [48]. Dalam kajian ini, varian CPPV-1 yang diperoleh daripada kucing pancing mendedahkan corak asid amino yang sama seperti yang terdapat dalam jujukan FPV, dengan kehadiran alanin (A) sebagai penentu asid amino utama pada kedudukan kapsid 300. Manakala protein capsid kucing memancing CPPV-1 mendedahkan asid amino asparagin (N) dan alanin (A) yang terletak pada kedudukan 564 dan 568, masing-masing (yang dianggap kritikal untuk replikasi FPV dalam perumah kucing), mereka mempunyai 2 mutasi asid amino unik pada kedudukan I566M dan M569R. Mutasi ini boleh membezakan virus ini daripada varian CPPV-1 yang diterangkan sebelum ini. Analisis terdahulu mengenai pembinaan semula nenek moyang mendapati bahawa FPV boleh menjangkiti karnivor yang berbeza dengan sedikit perubahan dalam gen VP2 [49]. Oleh itu, parvovirus seperti FPV dinamakan sementara sebagai virus baru yang berpotensi dikesan dalam kucing memancing dan ini mungkin menyokong pengecaman pertama virus ini dalam spesies ini. Walau bagaimanapun, sebilangan kecil kucing pancing yang disiasat berbanding sebilangan kecil jujukan lain mungkin tidak memberikan tafsiran yang pasti. Ini memerlukan kajian lanjut untuk membuat kesimpulan yang lebih pasti.
Penyetempatan CPPV-1 kucing memancing telah diperhatikan dalam pelbagai tisu termasuk sel epitelium usus dan sel limfoid, di mana penyetempatan tisu yang paling biasa bagi jangkitan CPPV-1 ditemui dalam spesies lain [20, 26, 50, 51 ]. Menariknya, sejak penyiasatan awal pengesanan genom virus menggunakan PCR dan penyetempatan virus menggunakan IHC mendedahkan penyetempatan virus yang berbeza dalamtisu buah pinggang, kami melakukan pewarnaan PAS untuk menunjukkan seni bina selulartisu buah pinggangdan untuk mengecualikan hipoksia sistemik sebagai punca kemungkinan nekrosis tiub. Pewarnaan PAS mendedahkan membran bawah tanah yang paling tiub adalah utuh, menunjukkan bahawa lesi ini mungkin tidak disebabkan oleh hipoksia sistemik [52]. Walau bagaimanapun, punca lain seperti nekrosis tiub yang disebabkan oleh toksin boleh menyebabkan lesi ini. Oleh itu, peranan jangkitan parvovirus seperti FPV dikaitkan denganbuah pingganglesi masih memerlukan siasatan lanjut. Selain itu, kami cuba untuk menjelaskan lebih lanjut penyetempatan virus yang masih ada dalamtisu buah pinggangmenggunakan ISH dan TEM dengan teknik pop-off [37] di kawasan di mana CPPV-1 IHC-imunoreaktiviti dikesan. Zarah padat elektron diperhatikan dalam nukleustiub buah pinggangsel epitelium dan sel urothelial, menyokong imunoreaktiviti in situ positif CPPV-1 dalamtisu buah pinggang. Kucing yang dijangkiti FPV menumpahkan virus terutamanya dalam najis, tetapi kehadiran virus aktif dalam air kencing telah diterangkan [53, 54]. Kajian terbaru menunjukkan bahawa jangkitan parvovirus mempunyai peranan dalamkegagalan buah pinggang[55]. Walau bagaimanapun, penyetempatan FPV dan rakan sejawatan CPV dalamtisu buah pinggangtidak pernah disiasat sebelum ini. Tambahan pula, seekor tikusbuah pinggangparvovirus (MKPV) telah terbukti sebagai virus nefrotropik dengan menunjukkan pertalian untuk menjangkiti dan menyetempat ditiub buah pinggangsel epitelium, mengakibatkanpenyakit buah pinggang [56, 57].
Berdasarkan pengetahuan kami, penyetempatan CPPV-1 dalambuah pinggangtidak diterangkan sebelum ini. Ini mencadangkan perihalan novel tentang penyetempatan virus unik dalam spesies ini atau walaupun ia boleh ditemui dalam kucing yang dijangkiti FPV. Dapatan ini mungkin menyokong kajian terdahulu yang mendapati FPV dalam air kencing. Penemuan patologi yang unik mungkin subjektif dan boleh diperhatikan sebagai jangkitan pada individu. Oleh itu, penyiasatan berskala besar terhadap CPPV kucing memancing-1 akan memudahkan tafsiran muktamad. Di samping itu, spesimen yang dihantar kebanyakannya daripada haiwan mati dan telah pun menjalani autolisis postmortem tidak sesuai untuk pengumpulan organ selanjutnya daripada haiwan ini. Oleh itu, kami tidak dapat menentukan penyetempatan virus dalam organ lain. Penjelasan penyetempatan virus atipikal CPPV kucing memancing-1 akan menjadi penyiasatan yang berguna.
CISTANCHE AKAN MEMPERBAIKI PENYAKIT BUAH PINGGANG/PINGGANG
CPPV-1 telah dikenal pasti dalam pelbagai karnivor liar dan ia dikaitkan dengan wabak maut. Bukti negatif pengesanan CPPV{1}} retrospektif dalam sampel zoo-liar dalam kajian ini mungkin disebabkan oleh sama ada tiada hubungan rapat antara haiwan yang mudah terdedah atau, sebaliknya, penyimpanan sampel berpanjangan yang menjejaskan kestabilan bahan genomik. Pengenalpastian baru CPPV-1 yang dikaitkan dengan jangkitan maut kucing pancing dalam kajian ini menimbulkan kebimbangan tentang novel, penyakit yang berpotensi ganas dalam haiwan yang terdedah ini. Oleh itu, kajian lanjut tentang penghantaran CPPV-1 dalam kucing memancing adalah penting untuk mengelakkan kehilangan spesies haiwan lain yang mudah terdedah. Sehubungan itu, strategi pencegahan harus dititikberatkan untuk mengurus jangkitan CPPV-1, bukan sahaja dalam spesies ini tetapi juga dalam haiwan domestik yang berkeliaran bebas yang mungkin berfungsi sebagai perumah berpotensi untuk virus ini.
