Natalenamides A–C, Tripeptida Kitaran Daripada Actinomadura Sp yang Berkaitan Anai-anai. RB99

Abstrak:

Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, penyiasatan terhadap biokimia bakteria berkaitan serangga telah meningkat. Apabila digabungkan dengan proses dereplikasi analitikal, kajian ini menyediakan strategi yang berkuasa untuk mengenal pasti sebatian baru secara struktur dan/atau biologi. Peptida kitaran yang tidak disintesis secara ribosom mempunyai spektrum bioaktiviti yang luas dengan potensi perubatan yang tinggi.

Di sini, kami melaporkan penemuan tiga tripeptida kitaran baharu: natalenamides A–C (sebatian 1–3). Sebatian ini dikenal pasti daripada sup kultur Actinomadura sp yang berkaitan dengan anai-anai tumbuh kulat. RB99 menggunakan kaedah nyahreplikasi berasaskan kromatografi cecair (LC)/ultraviolet (UV)/spektrometri jisim (MS). Struktur kimia sebatian baharu (1–3) telah ditubuhkan melalui analisis kaedah spektroskopi komprehensif, termasuk magnet nuklear satu dimensi (1H dan 13C) dan dua dimensi (1H-1H-COSY, HSQC, HMBC). spektroskopi resonans (NMR), bersama-sama dengan data spektrometri jisim pengionan elektrospray (HR-ESIMS) resolusi tinggi. Konfigurasi mutlak sebatian baru telah dijelaskan menggunakan analisis Marfey. Melalui beberapa ujian bioaktiviti untuk tripeptida, kami mendapati bahawa sebatian 3 mempamerkan kesan perencatan yang ketara pada pengeluaran melanin yang disebabkan oleh 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX). Kesan sebatian 3 adalah serupa dengan asid kojik, sebatian yang digunakan secara meluas sebagai bahan kosmetik dengan kesan pemutihan kulit.

Kulit cerah, licin dan halus sentiasa menjadi matlamat yang dikejar oleh wanita oriental. Penyelidikan dan pembangunan agen pemutih untuk produk penjagaan kulit terutamanya berdasarkan perencatan aktiviti tyrosinase.

Sebatian yang mengandungi cincin benzena atau struktur hidroksil fenolik mempunyai potensi kesan pemutihan, seperti arbutin agen pemutih yang biasa digunakan pada masa ini, yang boleh memberikan kesan pemutihan dengan menghalang aktiviti tyrosinase.

Dan kami mendapati bahawa Cistanche deserticola mempunyai kesan pemutihan. Bahan aktif utama Cistanche deserticola, glikosida phenylethanoid, adalah sejenis sebatian glikosida semula jadi. Kajian telah mendapati bahawa glikosida phenylethanoid boleh menghalang aktiviti tyrosinase dan pengeluaran melanin dalam melanosit epidermis manusia, dan mempunyai kesan pemutihan. keberkesanan ejen.

Klik serbuk ekstrak cistanche tubulosa

Kata kunci:

anai-anai tumbuh kulat; Actinomadura sp.; tripeptida; natalenamides A–C; kesan pemutihan kulit.

1. Pengenalan

Analisis kimia simbion bakteria pelindung serangga pertanian telah menarik banyak perhatian di kalangan ahli kimia produk semula jadi dalam beberapa tahun kebelakangan ini [1-5]. Menggunakan proses dereplikasi berasaskan resonans magnetik nuklear (NMR)/spektrometri jisim (MS) yang terkini dan bioassay berkaitan ekologi, sejumlah besar produk semula jadi yang menarik dari segi struktur, termasuk beberapa peptida kitaran bukan ribosom yang disintesis, telah ditemui daripada simbion mikrob [6]. Contoh yang paling menonjol termasuk dentigerumycin antikulat, depsipeptida kitaran yang diasingkan daripada Pseudonocardia sp yang berkaitan dengan semut yang tumbuh kulat. [7], dan gerumycins A-C, depsipeptida kitaran yang mengandungi asid piperazic yang dikenal pasti daripada Pseudonocardia sp. [8].

Peptida kitaran telah ditunjukkan untuk mempamerkan pelbagai aktiviti biologi, memupuk beberapa pendekatan sintetik ke arah struktur yang menjanjikan secara farmakologi ini [9-12]. Lebih 40 ubat peptida kitaran kini dipasarkan dan digunakan secara meluas dalam persekitaran klinikal, dan kira-kira satu ubat peptida kitaran baharu memasuki pasaran setiap tahun, secara purata [13].

Sebagai sebahagian daripada usaha berterusan kami untuk mengenal pasti metabolit sekunder novel dan/atau bioaktif secara struktur daripada mikrob berkaitan anai-anai [14-17], kami memberi tumpuan kepada Actinomadura sp yang berkaitan anai-anai. RB99, diasingkan daripada anai-anai yang tumbuh kulat, Macrotermes natalensis. Strategi dereplikasi berasaskan kromatografi cecair (LC)/ultraungu (UV)/spektrometri jisim (MS) kami menghasilkan produk semula jadi bioaktif baharu yang berpotensi. Dalam kajian ini, kami melaporkan pengasingan dan pengenalpastian kimia tiga tripeptida kitaran baharu, natalenamide A-C (sebatian 1-3, Rajah 1), menggunakan kaedah dereplikasi berasaskan LC/UV/MS serta penilaian biologi mereka untuk sitotoksik. , aktiviti anti-radang, dan pemutihan kulit.

2. Keputusan dan Perbincangan

2.1. Kromatografi cecair (LC)/Ultraungu (UV)/Spektrometri Jisim (MS) Berasaskan Pengasingan Sebatian 1–3

Actinomadura sp. RB99 diasingkan daripada permukaan pekerja anai-anai (M. natalensis). Analisis filogenetik bagi jujukan asid ribonukleik (rRNA) 16S ribosom yang hampir lengkap menunjukkan bahawa strain RB99 tergolong dalam genus Actinomadura, dengan jiran terdekat Actinomadura nitritigenes NBRC 15918T. Analisis berasaskan LC/UV/MS seterusnya bagi ekstrak kultur diperkaya mendedahkan satu set ciri penyerapan UV dengan puncak ion molekul unik yang mengandungi atom nitrogen.

Untuk mengenal pasti metabolit masing-masing dan menyiasat aktivitinya, penapaian berskala besar menggunakan keadaan pertumbuhan yang optimum (100 plat agar daripada 2 L ISP2 agar, pH 6, 10 hari pada suhu 30 ◦C) dan prosedur kerja dan prapemurnian yang ditetapkan telah digunakan [17]. Pecahan berpandukan LC-UV/MS dan kromatografi cecair berprestasi tinggi (HPLC) separa persediaan berulang yang berulang menghasilkan pengasingan tiga metabolit dengan corak NMR/MS yang unik. Kami melakukan kajian pertumbuhan dan media menggunakan garam yang berbeza (NaCl, KBr 1–3 peratus ) dan komposisi media (media ISP1-6) untuk meniru persekitaran semula jadi dan merangsang pengeluaran metabolit, yang turut membawa kepada kehadiran tiga metabolit (lihat Rajah Tambahan S19).

2.2. Penjelasan Struktur Sebatian

Natalenamide A (1) diperoleh sebagai serbuk amorf. Formula molekul 1 ditentukan sebagai C19H25N3O5 daripada ion molekul tambah natrium pada m/z 398.1691 [M tambah Na] tambah (dikira untuk C19H25N3O5Na, 398.1692) menggunakan mod ion positif-pengionan elektrospray resolusi tinggi (spektrometri jisim HR. data ESIMS). Spektrum inframerah (IR) menunjukkan jalur penyerapan yang kuat pada 1670 cm−1, mencadangkan kehadiran kumpulan amida dalam molekul. Analisis terperinci data 1H NMR 1 (Jadual 1) menunjukkan isyarat tipikal rangka peptida, memaparkan dua isyarat metil (δH 0.91 (3H, d, J=7.{{29 }} Hz, H-3) dan 0.92 (3H, d, J=7.0 Hz, H-4)), tiga isyarat metilena (δH 1.95 (1H, m, H-7a), 2.27 (1H, m, H-8a), 2.36 (1H, m, H-8b), 2.48 (1H , m, H{{50}}b), 2.97 (1H, dd, J=14.0, 8.0 Hz, H{{58} }a), dan 3.20 (1H, dd, J=14.0, 5.0 Hz, H-12b)), empat isyarat metin (δH 2.02 (1H , m, H-2), 4.16 (1H, d, J=7.5 Hz, H-1), 4.20 (1H, dd, J=8.5, 4.5 Hz, H-6), dan 4.63 (1H, dd, J=8.0, 5.0 Hz, H-11)) dan lima proton aromatik bertindih (δH 7.18 (1H, m, H-16), 7.23 (2H, m, H-14}/18) dan 7.24 (2H, m, H-15/17)).

Spektrum 13C NMR (Jadual 1), dengan bantuan spektrum HSQC dan HMBC, menunjukkan sejumlah 19 resonans karbon yang bertanggungjawab untuk dua isyarat metil (δC 18.9 dan 19.9), tiga isyarat metilena (δC 27.0, 30.6 dan 38.8), sembilan isyarat metin (δC 32.1, 55.6, 58.0, 60.4, 127.8, 129.5 (×2) dan 130.6 (×2)), termasuk lima karbon aromatik, satu karbon olefin isyarat (δC 138.8), dan empat isyarat karbon karbonil (δC 173.2, 173.3, 174.8, dan 181.3). Digabungkan dengan data spektroskopi di atas, pemeriksaan terperinci dua dimensi (2D) NMR (1H-1H COSY, HSQC dan eksperimen HMBC) mendedahkan kehadiran tiga asid amino dalam 1: glutamat (Glu), fenilalanin ( Phe), dan valine (Val) (Rajah 2). Kesambungan asid amino ini ditentukan oleh korelasi HMBC H-1/C-5 dan C-19, H-11/C-10 dan C{ {50}} dan H-6/C-5 dan C-10 (Rajah 2).

Untuk mengenal pasti konfigurasi mutlak 1, kaedah Marfey telah digunakan untuk menentukan stereokimia gandaan -H (C-1, C-6 dan C-11). Hidrolisis asid 1 dan asid amino piawai (L/D-Glu, Phe, dan Val) telah diterbitkan dengan 1-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amida (L-FDAA). Berturut-turut, campuran terbitan 1 dan asid amino standard dianalisis oleh LC/MS untuk memeriksa masa pengekalannya. Konfigurasi mutlak bahagian Glu, Phe, dan Val semuanya ditentukan sebagai bentuk-L, berdasarkan masa pengekalan terbitan L-FDAA bagi 1 berbanding dengan asid amino standard. Oleh itu, struktur 1 telah dijelaskan sebagai tripeptida kitaran yang ditunjukkan dalam Rajah 1.

Natalenamide B (2) telah diasingkan sebagai serbuk amorf. Formula molekulnya (C20H27N3O5) telah disimpulkan daripada puncak ion molekul tambah hidrogen dan natrium pada 390.2032 [M tambah H] tambah (dikira untuk C20H28N3O5, 390.2029) dan 412.1849 [M tambah Na] tambah masing-masing 412.1849 [M tambah Na] tambah (O1849 [M tambah Na] tambah (O1849) [M tambah Na]. Berbanding dengan formula molekul dan data spektrum NMR 1, sebatian 2 nampaknya mempunyai kumpulan CH2 tambahan dalam rangka peptida. Pemeriksaan menyeluruh terhadap spektrum satu dimensi (1D) (1H dan 13C NMR) dan 2D NMR (1H– 1H COSY, TOCSY, HSQC dan HMBC) spektrum 2 mendedahkan kewujudan tiga sisa asid amino: Glu, Phe, dan Leu (leusin). Jujukan asid amino ini telah dibina berdasarkan korelasi HMBC bagi H-1}/C-6 dan C-20, H-12/C-11 dan C -20 dan H-7/C-6 dan C-11 (Rajah 2). Untuk menentukan konfigurasi mutlak 2, derivatisasi sisa Glu, Phe, dan Leu dengan L-FDAA telah dilakukan dan kemudian dianalisis oleh LC/MS. Dalam data LC/MS, L-Glu, L-Phe, dan L-Leu telah dikesan dengan membandingkan masa pengekalan untuk terbitan L-FDAA 2 dengan asid amino standard. Oleh itu, struktur kimia 2 telah ditubuhkan sebagai tripeptida kitaran yang ditunjukkan dalam Rajah 1.

Data HR-ESIMS mod positif natalenamide C (3) memaparkan ion molekul hidrogen dan tambah natrium pada 424.1870 [M tambah H] tambah (dikira untuk C23H26N3O5, 424.1872) dan 446.1694 [M tambah Na] tambah (dikira untuk C23O5,N35. 424.1692). Ini mencadangkan bahawa formula molekulnya ialah C23H25N3O5. Analisis terperinci spektrum 1D dan 2D NMR 3 menunjukkan bahawa struktur kimianya adalah serupa dengan 2, kecuali Leu telah digantikan dengan Phe dalam 3. Keterkaitan tiga asid amino yang dikenal pasti dalam 3 telah disahkan menggunakan korelasi HMBC bagi H-1/C-9 dan C-23, H-15/C-14 dan C-23 dan H-10/ C-9 dan C-14 (Rajah 2). Dengan menggunakan kaedah Marfey untuk kompaun 3, konfigurasi mutlak gandaan -H (C-1, C-10 dan C-15) telah dijelaskan menjadi satu L-Glu dan dua L -Phe moieties. Sehubungan itu, struktur lengkap 3 telah ditentukan seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1.

Natalenamides A-C ialah peptida trisiklik, mungkin berasal dari bukan ribosom. Pada masa ini, beberapa tripeptida kitaran bioaktif telah dicirikan sebagai produk semula jadi: sitotoksik 17-tripeptida kitaran ahli (cth, OF4949 I–IV) diasingkan daripada Penicillium rugulose [18]; sklerotomi antikulat A−K, dikenal pasti daripada sup penapaian bakteria halotolerant [10]; dan antiproliferatif psychrophilic E, diasingkan daripada budaya campuran dua strain kulat alga marin daripada genus Aspergillus [19].

2.3. Aktiviti Biologi Sebatian 1-3

Oleh kerana peptida kitaran telah dilaporkan mempamerkan pelbagai aktiviti biologi kesan biologi tripeptida kitaran terpencil ({{0}}) telah dinilai menggunakan tiga bioaktiviti. Sitotoksisiti sebatian 1-3 telah disiasat terhadap empat garisan sel kanser (sel kanser payudara MCE7, sel kanser serviks HeLa, sel kanser paru-paru manusia A549 dan sel kanser hati HepG2) pada kepekatan berbeza (0, 6.25 , 12.5, 25, 50, dan 100 uM). Kompaun 1 tidak menjejaskan daya maju sel MCF-7, HeLa atau sel A549. Walau bagaimanapun, rawatan sel HepG2 dengan 100 M kompaun 1 mengurangkan daya maju sel kepada 78.5 ditambah 3.2 peratus (Rajah 3). Kompaun 2 mengurangkan daya maju sel sel HeLa dan A549 kepada 82.9  2.1 peratus dan 73.5=3.0 peratus , tetapi tidak menjejaskan daya maju MCF-7 atau Sel HepG2 (Rajah 3). Kompaun 3 tidak menjejaskan daya maju mana-mana garisan sel (Rajah 3).

Seterusnya, makrofaj RAW264.7 digunakan untuk menyiasat kesan anti-radang sebatian terpencil. Untuk menghapuskan ralat dalam pengeluaran NO yang disebabkan oleh perubahan kadar survival sel, kepekatan bukan toksik setiap sebatian telah diperiksa. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4, sebatian 1–3 mempunyai sedikit kesan sitotoksik dalam sel RAW264.7 (Rajah 4A–C) dan tidak memberikan kesan perencatan pada pengeluaran NO dalam sel RAW264.7 yang dirangsang lipopolysaccharide (LPS) (Rajah 4D–F) .

Kesan perencatan sebatian 1–3 pada kandungan melanin dalam sel B16F10 telah diperiksa sebagai bukti aktiviti pemutihan kulit mereka (Rajah 5). Oleh kerana perubahan dalam daya maju sel menyebabkan ralat dalam pengeluaran dan pengukuran melanin, kami mula-mula mengkaji kesan sebatian 1–3 pada kelangsungan hidup sel B16F10. Sebatian 1–3 tidak memberikan kesan sitotoksik dalam sel B16F10 pada mana-mana kepekatan yang digunakan (Rajah 5A–C). Kami kemudian menilai kesan perencatan sebatian pada pengeluaran melanin yang disebabkan oleh 3-isobutil-1-metilxanthine (IBMX) dalam sel B16F10 (Rajah 5D–F). IBMX, perangsang melanogenesis yang terkenal, mendorong peningkatan ketara dalam pengeluaran melanin berikutan satu rawatan dalam sel melanoma. Antara sebatian yang dinilai, sebatian 3 (pada 5-100 µM) mempamerkan kesan perencatan yang ketara pada sintesis melanin pengantara IBMX dalam cara yang bergantung kepada dos. Asid kojic, kawalan positif kami, telah digunakan secara meluas sebagai bahan kosmetik dengan kesan pemutihan kulit [20]. Kesan perencatan kompaun 3 pada pengeluaran melanin yang disebabkan oleh IBMX adalah serupa dengan asid kojik (Rajah 5F), menunjukkan bahawa kompaun 3 berfungsi sebagai perencat kuat pengeluaran melanin yang disebabkan oleh IBMX dalam sel melanoma B16F10.

Tambahan pula, sebatian 3 telah tercemar dengan sebilangan kecil kekotoran, yang ditentukan sebagai analog asid lemak dengan tafsiran data spektroskopi NMR dan analisis LC / MS (Bahan Tambahan, Rajah S11-S15 dan S23). Untuk mengenal pasti aktiviti kekotoran, eksperimen tambahan dengan analog asid lemak telah dijalankan untuk kesan perencatannya terhadap pengeluaran melanin yang disebabkan oleh IBMX dalam sel B16F10, yang mendedahkan bahawa sebatian yang diuji tidak mempunyai kesan pemutihan (Bahan Tambahan, Rajah S24). Oleh itu, walaupun kita tidak boleh mengecualikan bahawa kekotoran dalam sebatian 3 bertanggungjawab untuk kesan perencatan pada pengeluaran melanin yang disebabkan oleh IBMX, ini nampaknya tidak mungkin.

3. Bahan dan Kaedah

3.1. Prosedur Eksperimen Am

Spektrum inframerah diperoleh pada spektrometer Bruker IFS-66/S FT-IR (Bruker, Billerica, MA, USA). Pengionan elektrospray dan spektrum HR-ESIMS diukur pada spektrometer jisim Kromatografi cecair (LC) DecaXP SI-2/LCQ DecaXP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Spektrum NMR, termasuk eksperimen 1H–1H COSY, HSQC, dan HMBC, dilakukan menggunakan spektrometer Varian UNITY INOVA 800 NMR (Varian, Palo Alto, CA, USA) yang beroperasi pada 800 MHz (1H) dan 200 MHz (13C), dengan anjakan kimia diberikan dalam ppm (δ). HPLC persediaan menggunakan pam HPLC Perduaan Waters 1525 dengan Pengesan Tatasusunan Fotodiod Waters 996 (Waters Corporation, Milford, CT, Amerika Syarikat). Silika gel 60 (230–400 mesh, Merck, Kenilworth, NJ, USA) dan RP-C18 silika gel (230–400 mesh, Merck, digunakan untuk kromatografi lajur. HPLC separuh persediaan menggunakan Sistem HPLC Prominence Shimadzu dengan SPD{ {22}}Penonjolan Siri A/20AV HPLC Ultraviolet-Vis (UV–Vis) Pengesan (Shimadzu, Tokyo, Jepun). Analisis LC/MS telah dijalankan pada sistem HPLC Agilent 1200 Series (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) dilengkapi dengan pengesan tatasusunan diod dan spektrometer jisim ESI Siri 6130 dengan Kinetex analitikal (4.6 × 100 mm, 3.5 µm). Plat silika gel F254 prasalut Merck dan plat RP-18 F254s digunakan untuk nipis -kromatografi lapisan (TLC).Tompok dikesan pada TLC di bawah cahaya UV atau dengan pemanasan selepas disembur dengan larutan asid anisaldehid-sulfurik.

3.2. Bahan Mikrob

Actinomadura sp. RB99 telah diasingkan daripada permukaan pekerja anai-anai genus, M. natalensis, (koloni Mn103, GPS S25 43 45.9 E28 14 08.9) pada 2 Januari{ {13}}10. Bahan bio dimasukkan ke dalam beg plastik bersih dan diproses dalam masa satu hari selepas pengumpulan. Anai-anai dibasuh dalam air ternyahion steril, dan bakteria telah diasingkan dengan menyadurkan ampaian yang terhasil pada media nutrien rendah dengan kitin (setiap liter: 4 g kitin, 0.7 g K2HPO4, 0.3 g KH2PO4, 0.5 g MgSO4·5H2O, 0.01 g FeSO4·7H2O, 0.001 g ZnSO4, 0.001 g MnCl2, dan 20 g agar) [21]. Pengasingan dengan morfologi seperti Actinobacteria telah dipindahkan ke agar ISP2 (setiap liter: 10 g ekstrak malt, 4 g ekstrak yis, 4 g glukosa, dan 20 g agar), dan subkultur sehingga isolat tulen diperolehi.

3.3. Pengekstrakan DNA dan Penguatan Tindakbalas Rantaian Polimerase

Actinomadura sp. RB99 telah ditanam dalam media cecair yang kaya dengan nutrien ISP2 selama lima hingga tujuh hari pada suhu 30 ◦C. Sel telah dituai, dan DNA genom telah diekstrak menggunakan kit penulenan DNA genomik GenJet (#K0721, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) mengikut arahan pengilang dengan perubahan berikut: (a) rawatan lisozim dilanjutkan kepada 40 minit, dan ( b ) rawatan proteinase K dilanjutkan kepada 40 minit. DNA dikira secara fotometrik menggunakan spektrometer Nanodrop Lite (Thermo Scientific).

Untuk kajian filogenetik, gen rRNA 16S telah dikuatkan menggunakan set primer, 1492R/27F. Setiap tindak balas amplifikasi disediakan dalam 25 µL isipadu tindak balas akhir yang mengandungi 7.25 µL air suling, 5 µL penimbal HF, 5 µL setiap primer (2.5 µM), {{10}}.5 µL dNTPs (10 µM), 0.25 µL polimerase DNA Phusion High-Fidelity (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) dan 2 µL DNA yang diekstrak (templat). Tindak balas rantai polimerase (PCR) dilakukan di bawah keadaan berikut: 98 ◦C selama 38 saat; 32 kitaran 98 ◦ selama 30 s, 52 ◦C selama 45 s, 72 ◦C selama 1 min 20 s; dan lanjutan akhir 72 ◦C selama 8 min. Produk PCR telah divisualisasikan oleh elektroforesis gel agarose, dan tindak balas PCR telah disucikan menggunakan kit penulenan PCR (Thermo Scientific). Serpihan DNA telah disusun di GATC (Konstanz, Jerman).

3.4. Penjujukan dan Pengenalpastian Spesies

Urutan dinilai untuk ketulenan dan ketidakpadanan menggunakan BioEdit [22]. Urutan ke hadapan dan belakang yang diperolehi untuk setiap strain telah dipasang dengan BioEdit dan diuji untuk chimera menggunakan DECIPHER (//decipher.cee.wisc.edu/FindChimerasOutputs.html). Urutan yang terhasil telah didepositkan dalam GenBank (nombor penyertaan: KY558684). Analisis letupan dengan jujukan rRNA 16S hampir lengkap (1368 bp) dilakukan menggunakan pangkalan data Pusat Maklumat Bioteknologi Kebangsaan (NCBI) (jujukan RNA rujukan). Keputusan menunjukkan bahawa strain RB99 adalah ahli genus, Actinomadura. Urutan 10 hits pertama telah dimuat turun daripada pangkalan data NCBI dan diselaraskan dengan jujukan rRNA 16S Actinomadura sp. RB99 menggunakan perkhidmatan penjajaran jujukan Sina [23]. Dua pokok filogenetik berbeza telah dibina semula dengan algoritma penyatuan jiran atau kemungkinan maksimum menggunakan perisian MEGA versi 7.0.26 [24-26]. Model jarak evolusi Tamura dan Nei digunakan untuk menjana matriks jarak evolusi untuk algoritma kemungkinan maksimum dan gabungan jiran, dengan pemadaman jurang lengkap dan data yang hilang [27]. Untuk algoritma kemungkinan maksimum, taburan gamma diskret telah digunakan ( tambah G), dan model variasi kadar membenarkan sesetengah tapak menjadi tidak berubah secara evolusi ( tambah I). Untuk algoritma penggabungan jiran, variasi kadar antara tapak telah dimodelkan dengan taburan gamma ( tambah G). Nilai keyakinan nod telah dinilai oleh analisis bootstrap berdasarkan 1000 langkah pensampelan semula [28].

3.5. Pengekstrakan dan Pengasingan

Actinomadura sp. RB99 ditanam dalam 50 mL sup ISP2 selama tujuh hari pada suhu 30 ◦C (pra-kultur) dan digunakan untuk menyuntik 100 plat agar ISP2. Plat diinkubasi selama 10 hari pada suhu 30 ◦C, dipotong menjadi kepingan kecil, disatukan, dan direndam semalaman dalam MeOH. Fasa MeOH ditapis dan disejat di bawah tekanan yang dikurangkan. Ekstrak MeOH (20 g) telah dilarutkan dalam air suling (700 mL) dan kemudian dibahagikan pelarut dengan EtOAc (700 mL) tiga kali, menghasilkan 1.1 g residu. Pecahan larut EtOAc (1.1 g) daripada ekstrak MeOH telah dimuatkan pada lajur silika gel (230–400 mesh) untuk kromatografi dan dielusi dengan sistem pelarut kecerunan CH2Cl2-MeOH (100:1 hingga 1: 1, v/v). Ini menyediakan enam pecahan (A-F), yang tertakluk kepada analisis berasaskan LC-UV/MS. Analisis dereplikasi menggunakan perpustakaan spektrum UV dalaman mencadangkan kewujudan analog peptida kecil dalam pecahan E. Ini memaparkan corak UV mudah pada sekitar 220 nm dan puncak ion formula molekul unik yang mengandungi atom nitrogen. Pecahan kutub E (233 mg) telah dipecahkan oleh HPLC fasa terbalik persediaan (Phenomenex Luna C18, 250 × 21.2 mm id, 5 µm, Torrance, CA, USA) menggunakan CH3CN/H2O (1:9 hingga 9:1, v /v, sistem kecerunan, kadar alir: 5 mL/min) untuk menghasilkan lima pecahan kecil (E1–E5). Sub-pecahan E2 (27 mg) telah disucikan oleh HPLC fasa terbalik separa persediaan (Phenomenex Luna C18, 250 × 10.0 mm id, 5 µm) dengan 33 peratus MeOH/H2O (sistem isokratik, kadar aliran: 2 mL/min ) untuk menghasilkan kompaun 1 (5.8 mg, tR=57.0 min). Sebatian 2 (1.6 mg, tR=42.0 min) dan 3 (1.5 mg, tR=55.0 min) telah diasingkan daripada sub pecahan E3 (15 mg) dengan fasa terbalik separa persediaan HPLC mengelusi 43 peratus MeOH/H2O (sistem isokratik, kadar aliran: 2 mL/min).

3.5.1. Natalenamide A (1)

3.5.2. Natalenamide B (2)

3.5.3. Natalenamide C (3)

3.6. Hidrolisis Asid Sebatian 1–3

Jumlah keseluruhan 0.4 mg setiap sebatian (1–3) telah dihidrolisiskan dengan 6 N HCl (500 µL) selama 1 jam pada suhu 110 ◦C. Selepas menyejukkan ke suhu bilik, hidrolisat 1-3 disejat untuk menghilangkan kesan HCl. Air suling (500 µL) telah ditambah kepada campuran hidrolisat dan kemudian disejat untuk menghilangkan kesan HCl; proses ini dilakukan sebanyak tiga kali.

3.7. Penentuan Konfigurasi Mutlak Asid Amino dalam 1–3

Campuran hidrolisis (1–3), serta asid amino piawai (L/D-Leu, Glu, Phe, dan Val), telah dilarutkan dalam 1 N NaHCO3 (100 µL) dan kemudian dirawat dengan 50 µL L-FDAA (10 mg/mL dalam aseton). Berturut-turut, setiap hidrolisis dipanaskan selama 10 minit pada suhu 80 ◦C. Setiap campuran telah dipadamkan dengan 2 N HCl (50 µL) dan tertumpu dalam vakuo. Sisa itu dibubarkan dalam 300 µL MeOH. Setiap aliquot (5 µL) yang diperoleh daripada campuran hidrolisat disuntik terus ke LC/MS (Phenomenex Luna C18, 4.6 × 100 mm, 3.5 µm, kadar aliran 0.3 mL/min), dan imbasan penuh dalam positif dan negatif mod ion (julat imbasan dari m/z 100 hingga 1000) digunakan untuk mengenal pasti masa pengekalan asid amino terbitan L-FDAA.

Fasa bergerak, yang terdiri daripada asid formik dalam air suling ({{0}}.1 peratus v/v) (A) dan asetonitril (B), dibawa dengan sistem pelarut kecerunan seperti berikut: 20–40 peratus (B) selama 10 minit, 100 peratus (B) isokratik selama 5 minit, dan kemudian 20 peratus (B) isokratik selama 5 minit, untuk menjalankan prosedur pencucian selepas dijalankan untuk lajur. Masa pengekalan asid amino terbitan L-FDAA yang digunakan sebagai piawai ialah 16.7 min (L-Glu, m/z 400 [M tambah H] tambah ), 18.2 min (D-Glu, m/z 400 [M tambah H] tambah ), 22.1 min (L-Val, m/z 370 [M tambah H] tambah ), 25.1 min (D-Val, m/z 370 [M tambah H] tambah ), 25.6 min (L-Phe, m/ z 418 [M tambah H] tambah ), 27.0 min (D-Phe, m/z 418 [M tambah H] tambah ), 25.5 min (L-Leu, m/z 384 [M tambah H] tambah ), dan 28.2 min (D-Leu, m/z 384 [M tambah H] tambah ). Masa pengekalan hidrolisis terbitan 1–3 ialah L-Glu (16.9 min), L-Phe (25.7 min), dan L-Val (22.5 min) daripada 1; L-Glu (16.7 min), L-Phe (25.7 min), dan L-Leu (25.6 min) daripada 2; dan L-Glu (16.9 min) dan L-Phe (25.7 min) daripada 3.

3.8. Ujian Sitotoksik Menggunakan Sel Kanser

Sel MCF7, HeLa, dan A549 telah dibeli daripada Koleksi Budaya Jenis Amerika (Rockville, MD, Amerika Syarikat). Sel HepG2 telah dibeli daripada Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea). Sel MCF7 telah dikultur dalam medium Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 ditambah dengan 10 peratus serum lembu janin. Sel HeLa dan A549 telah dikultur dalam medium penting minimum Dulbecco (DMEM, Cellgro, Manassas, VA, USA) ditambah dengan 10 peratus serum lembu janin. Sel HepG2 telah dikultur dalam Medium Essential Minimum ditambah dengan 10 peratus serum lembu janin. Keadaan kultur dikekalkan pada 37 ◦C dalam suasana lembap yang mengandungi 5 peratus CO2. Sitotoksisiti telah diuji pada empat garisan sel manusia ini (MCF7, HeLa, A549, dan HepG2) menggunakan kit ujian daya maju sel EZ-CyTox (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Jepun). Secara ringkas, 5 × 103 sel /telaga telah disemai dalam 96-plat perigi. Selepas 24 jam, sel telah dirawat dengan sebatian pada kepekatan yang ditunjukkan. Selepas 72 jam pengeraman, kit ujian daya maju sel EZ-CyTox telah digunakan. Selepas 2 jam pengeraman, penyerapan diukur pada 450 nm dengan rujukan pada 620 nm. Daya maju sel dikira sebagai peratusan kawalan.

3.9. Aktiviti Anti-Radang

Barisan sel makrofaj tetikus RAW264.7 telah dibeli daripada Koleksi Budaya Jenis Amerika. Sel telah dibiakkan dalam DMEM ditambah dengan 10 peratus serum lembu janin (FBS), 100 unit/mL penisilin, dan 100 µg/mL streptomycin, dan diinkubasi pada suhu 37 ◦C dalam suasana lembap dengan 5 peratus CO2. Daya tahan sel diukur menggunakan kit pengesanan daya maju sel Ez-Cytox. Sel telah diinkubasi dalam 96-plat telaga pada kepekatan 2500 sel setiap telaga selama 24 jam dan dirawat dengan kepekatan sebatian yang ditunjukkan 1–3 selama 24 jam. Seterusnya, reagen Ez-Cytox ditambahkan pada setiap telaga. Ketumpatan optik pada 450 nm diukur selepas 1 jam menggunakan pembaca plat mikro (PowerWave XS; Instrumen Bio-Tek, Winooski, VT, Amerika Syarikat) untuk menganggarkan daya maju sel. Dalam percubaan berasingan, sel RAW264.7 diinkubasi dalam 96-plat perigi pada kepekatan 30,000 sel setiap telaga selama 24 jam. Selepas kebuluran serum selama 12 jam, sel telah dirawat terlebih dahulu dengan sebatian 1-3 selama 1 jam dan kemudian dirangsang dengan 1 µg/mL LPS selama 24 jam. Penyerapan media kultur dalam tindak balas Griess diukur pada 540 nm menggunakan pembaca plat mikro PowerWave XS untuk menganggarkan tahap NO.

3.10. Pengukuran Kandungan Melanin

Barisan sel melanoma tikus, B16F10, telah dibeli daripada Koleksi Budaya Jenis Amerika. Sel telah dibiakkan dalam DMEM ditambah dengan 10 peratus FBS, 100 unit/mL penisilin, dan 100 µg/mL streptomycin, dan diinkubasi pada 37 ◦C dalam suasana lembap dengan 5 peratus CO2. Sel B16F10 diinkubasi dalam hidangan kultur 6 cm pada 250,000 sel setiap telaga dalam DMEM ditambah dengan 10 peratus FBS, 100 µg/mL streptomycin dan 100 U/mL penisilin selama 24 jam. Sel-sel telah dibasuh dua kali dengan garam penampan fosfat (PBS) dan kemudian dirangsang oleh IBMX dan diinkubasi dengan kepekatan berbeza sebatian 1-3 atau asid kojic (kawalan positif) dalam medium RPMI bebas-merah fenol ditambah dengan 10 peratus FBS, 100 unit /mL penisilin, dan 100 µg/mL streptomycin selama 24 jam dan 48 jam. Penyerapan medium kultur diukur pada 405 nm menggunakan pembaca plat mikro PowerWave XS untuk menganggarkan kandungan melanin. Keputusan dinyatakan sebagai perubahan lipatan berbanding dengan kawalan (sel tidak dirangsang oleh IBMX).

3.11. Analisis statistik

Semua data termasuk daya maju sel, NO, dan pengeluaran melanin dibentangkan sebagai nilai purata dan sisihan piawai (SD). Semua ujian dilakukan dalam tiga kali ganda dan diulang sekurang-kurangnya tiga kali. Dalam kajian ini, hanya beberapa bilangan ulangan setiap eksperimen sel dimasukkan, oleh itu kaedah analisis bukan parametrik telah diterima pakai untuk analisis statistik. Ujian Kruskall-Wallis digunakan untuk analisis statistik setiap pembolehubah. Pakej statistik SPSS telah digunakan untuk semua analisis (Perbadanan Mesin Perniagaan Antarabangsa (IBM) perangkaan SPSS versi 21, Boston, MA, Amerika Syarikat). Kepentingan statistik telah dipertimbangkan pada nilai p yang lebih rendah daripada 0.05.

4. Kesimpulan

Laporan kami menyediakan analisis kimia pengasingan mikrob daripada anai-anai yang tumbuh kulat. Tiga tripeptida kitaran baharu, natalenamides A–C (1–3), telah diasingkan dan dicirikan secara struktur daripada sup kultur Actinomadura sp yang berkaitan dengan anai-anai tumbuh kulat. RB99 menggunakan kaedah dereplikasi berasaskan LC-UV/MS. Semua sebatian terpencil telah dinilai untuk aktiviti biologi menggunakan ujian berasaskan sel. Sebatian 1 dan 2 menunjukkan sitotoksisiti lemah terhadap sel HepG2 dan HeLa/A549, masing-masing. Tiada sebatian terpencil menunjukkan kesan perencatan yang ketara pada pengeluaran NO dalam sel RAW264.7 yang dirangsang LPS. Kompaun 3 mempamerkan kesan perencatan yang ketara pada sintesis melanin pengantara IBMX dalam cara yang bergantung kepada dos. Kesannya adalah serupa dengan asid kojic, yang digunakan sebagai bahan kosmetik dengan kesan pemutihan kulit.

Penghargaan:

Kami amat berterima kasih kepada Michael Thomas-Poulsen (Jabatan Biologi, Universiti Copenhagen, Denmark) kerana menyokong kerja lapangan kami.

Konflik Kepentingan:

Penulis mengisytiharkan tiada konflik kepentingan.

Rujukan

1. Newman, DJ; Cragg, GM Produk semula jadi sebagai sumber ubat baru dari 1981 hingga 2014. J. Nat. Prod. 2016, 79, 629–661. [CrossRef] [PubMed]

2. Mishra, BB; Tiwari, VK Produk semula jadi: Peranan yang berkembang dalam penemuan dadah masa hadapan. Eur. J. Med. Kimia. 2011, 46, 4769–4807. [CrossRef] [PubMed]

3. Beemelmanns, C.; Guo, H.; Rischer, M.; Poulsen, M. Produk semulajadi daripada mikrob yang dikaitkan dengan serangga. Beilstein J. Org. Kimia. 2016, 12, 314–327. [CrossRef] [PubMed]

4. Ramadhan, TR; Beemelmanns, C.; Currie, CR; Clardy, J. Simbion bakteria dalam sistem pertanian menyediakan sumber strategik untuk penemuan antibiotik. J. Antibiotik. 2014, 67, 53–58. [CrossRef] [PubMed]

5. Harvey, AL; Edrada-Ebel, R.; Quinn, RJ Kemunculan semula produk semula jadi untuk penemuan ubat dalam era genomik. Nat. Rev. Drug Discov. 2015, 14, 111–129. [CrossRef] [PubMed]

6. Sattely, ES; Fischbachb, MA; Walsh, CT Jumlah biosintesis: Penyusunan semula in vitro bagi laluan polyketide dan bukan ribosom peptida. Nat. Prod. Rep. 2008, 25, 757–793. [CrossRef] [PubMed]

7. Oh, D.; Scott, JJ; Currie, CR; Clardy, J. Mycangimycin, poliena peroksida daripada Streptomyces sp yang mutualis. Org. Lett. 2009, 11, 633–636. [CrossRef] [PubMed]

8. Duduk, CS; Ruzzini, AC; Van Arnam, EB; Ramadhan, TR; Currie, CR; Clardy, J. Seni bina genetik boleh ubah menghasilkan molekul yang hampir sama dalam simbion bakteria semut yang tumbuh kulat. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2015, 112, 13150–13154. [CrossRef] [PubMed]

9. Rendah, KE; Ler, S.; Chen, KJ; Campbell, RL; Hickey, JL; Tan, J.; Scully, CCG; Davies, RL; Yudin, AK; Zaretsky, S. Reka bentuk rasional perencat calpain berdasarkan peptidomimetik calpastatin. J. Med. Kimia. 2016, 59, 5403–5415. [CrossRef] [PubMed]

10. Zheng, J.; Xu, Z.; Wang, Y.; Hong, K.; Liu, P.; Zhu, W. Cyclic Tripeptides daripada kulat halotolerant Aspergillus sclerotiorum PT06-1. J. Nat. Prod. 2010, 73, 1133–1137. [CrossRef] [PubMed]

11. Weerakkody, D.; Moshnikova, A.; El-Sayed, NS; Adochite, RC; Slaybaugh, G.; Golijanin, J.; Tiwari, RK; Andreev, OA; Parang, K.; Reshetnyak, YK Novel peptida kitaran sensitif pH. Sci. Rep. 2016, 6, 31322. [CrossRef] [PubMed]

12. Zhao, M.; Lin, HC; Tang, Y. Biosintesis tripeptida kitaran yang mengandungi -nitro psikrofilik. J. Antibiotik. 2016, 69, 571–573. [CrossRef] [PubMed]

13. Zorzi, A.; Deyle, K.; Heinis, C. Terapeutik peptida kitaran: Masa lalu, sekarang dan masa depan. Curr. Pendapat. Kimia. biol. 2017, 38, 24–29. [CrossRef] [PubMed]

14. Kim, KH; Ramadhan, TR; Beemelmanns, C.; Cao, S.; Poulsen, M.; Currie, CR; Clardy, J. Natalamycin A, ansamycin daripada Streptomyces sp yang berkaitan anai-anai. Kimia. Sci. 2014, 5, 4333–4338. [CrossRef] [PubMed]

15. Kang, HR; Lee, D.; Benndorf, R.; Jung, WH; Beemelmanns, C.; Kang, KS; Kim, KH Termisoflavones A–C, glikosida isoflavonoid daripada Streptomyces sp yang berkaitan anai-anai. RB1. J. Nat. Prod. 2016, 79, 3072–3078. [CrossRef] [PubMed]

16. Beemelmanns, C.; Ramadhan, TR; Kim, KH; Klassen, JL; Cao, S.; Wyche, TP; Hou, Y.; Poulsen, M.; Bugni, TS; Currie, CR; et al. Macrotermycins A–D, makrolaktam terglikosilasi daripada Amycolatopsis sp yang berkaitan dengan anai-anai. M39. Org. Lett. 2017, 19, 1000–1003. [CrossRef] [PubMed]

17. Guo, H.; Benndorf, R.; Leichnitz, D.; Klassen, JL; Vollmers, J.; Görls, H.; Steinacker, M.; Weigel, C.; Dahse, HM; Kaster, AK; de Beer, ZW; et al. Pengasingan, biosintesis dan pengubahsuaian kimia rubterolones A–F: Alkaloid tropolone jarang daripada Actinomadura sp. 5–2. Kimia. Eur. J. 2017, 23, 9338–9345. [CrossRef] [PubMed]

18. Sano, S.; Ikai, K.; Katayama, K.; Takesako, K.; Nakamura, T.; Obayashi, A.; Ezure, Y.; Enomoto, H. OF4949, perencat baru aminopeptidase B. II. Penjelasan Struktur. J. Antibiotik. 1986, 39, 1685–1696. [CrossRef] [PubMed]

19. Ciasullo, L.; Casapullo, A.; Cutignano, A.; Bifulco, G.; Debitus, C.; Hooper, J.; Gomez-Paloma, L.; Riccio, R. Renieramide, tripeptida kitaran daripada span Vanuatu Reniera n. sp. J. Nat. Prod. 2002, 65, 407–410. [CrossRef] [PubMed]

20. Solano, F.; Briganti, S.; Picardo, M.; Ghanem, GH Ejen hipopigmentasi: Kajian terkini tentang aspek biologi, kimia dan klinikal. Pigm. Sel Melanoma Res. 2006, 19, 550–571. [CrossRef] [PubMed]

21. Visser, AA; Nobre, T.; Currie, CR; Aanen, DK; Poulsen, M. Meneroka potensi aktinobakteria sebagai simbion pertahanan dalam anai-anai yang tumbuh kulat. Mikrob. Ecol. 2012, 63, 975–985. [CrossRef] [PubMed]

22. Hall, TA BioEdit: Editor penjajaran jujukan biologi yang mesra pengguna dan program analisis untuk Windows 95/98/NT. Simptom Asid Nukleik. Ser. 1999, 41, 95–98.

23. Pruesse, E.; Peplies, J.; Glöckner, FO SINA: Penjajaran jujukan berbilang jujukan tinggi yang tepat bagi gen RNA ribosom. Bioinformatik 2012, 28, 1823–1829. [CrossRef] [PubMed].

24. Saitou, N.; Nei, M. Kaedah penyatuan jiran: Kaedah baru untuk membina semula pokok filogenetik. Mol. biol. Evol. 1987, 4, 406–425. [PubMed]

25. Felsenstein, J. Pokok evolusi dari urutan DNA: Pendekatan kemungkinan maksimum. J. Mol. Evol. 1981, 17, 368–376. [CrossRef] [PubMed]

26. Kumar, S.; Stecher, G.; Tamura, K. MEGA7: Analisis genetik evolusi molekul versi 7.0 untuk set data yang lebih besar. Mol. biol. Evol. 2016, 33, 1870–1874. [CrossRef] [PubMed]

27. Tamura, K.; Nei, M. Anggaran bilangan penggantian nukleotida dalam kawasan kawalan DNA mitokondria pada manusia dan cimpanzi. Mol. biol. Evol. 1993, 10, 512–526. [PubMed]

28. Felsenstein, J. Had keyakinan pada filogeni: Pendekatan menggunakan bootstrap. Evolusi 1985, 39, 783–791. [CrossRef] [PubMed]

Ketersediaan Sampel:

Sampel sebatian tidak tersedia daripada pengarang.

For more information:1950477648nn@gmail.com