Glukosa Memberi Kesan Anti-Melanogenik Dengan Penyahaktifan Tidak Langsung Tirosinase dalam Melanosit Dan Setara Kulit Manusia
Mar 22, 2023
Abstrak:
Gula ada di mana-mana dalam organisma dan merupakan bahan kosmetik yang terkenal untuk melembapkan kulit dengan kesan sampingan yang minimum. Glukosa, gula ringkas yang digunakan sebagai sumber tenaga oleh sel hidup, sering digunakan dalam produk penjagaan kulit. Beberapa laporan telah menunjukkan bahawa gula dan sebatian berkaitan gula mempunyai kesan anti-melanogenik pada melanosit. Walau bagaimanapun, mekanisme molekul asas yang mana glukosa menghalang sintesis melanin tidak diketahui, walaupun glukosa digunakan sebagai pemutihan serta bahan pelembab dalam kosmetik. Di sini, kami mendapati bahawa glukosa telah mengurangkan kandungan melanin sel B16 yang dirangsang -melanocyte-stimulating hormone (MSH) dan melanosit manusia normal yang berpigmen gelap tanpa tanda-tanda sitotoksisiti.
Tambahan pula, rawatan topikal glukosa menunjukkan keberkesanan pemutihannya melalui fotografi, pewarnaan Fontana-Masson (F&M), dan mikroskop berbilang foton dalam model kulit manusia 3D berpigmen, MelanoDerm. Walau bagaimanapun, glukosa tidak mengubah ekspresi gen atau tahap protein protein melanogenik utama dalam melanosit. Walaupun glukosa berpotensi menurunkan aktiviti tyrosinase intraselular dalam melanosit, ia tidak mengurangkan aktiviti tyrosinase cendawan dalam sistem eksperimen bebas sel. Walau bagaimanapun, glukosa telah dimetabolismekan menjadi asid laktik, yang boleh menyekat aktiviti tyrosinase dengan kuat. Oleh itu, kami membuat kesimpulan bahawa glukosa secara tidak langsung menghalang aktiviti tyrosinase melalui penukaran kepada asid laktik, menjelaskan kesan anti-melanogeniknya dalam melanosit.
Tirosinase ialah enzim yang boleh menguraikan tirosin dalam protein dan menukarkannya kepada produk pengoksidaan tirosin, seperti fenol tirosin dan bahan lain. Enzim ini wujud secara meluas dalam tubuh manusia, terutamanya dalam saluran usus, di mana ia terlibat dalam penghadaman dan penyerapan makanan. Pada masa yang sama, didapati dalam penyelidikan bahawa cistanche boleh mengurangkan aktiviti tyrosinase dan dengan itu memutihkan kulit.
Kata kunci:
melanogenesis; gula; glukosa; tyrosinase; setaraf kulit manusia
1. Pengenalan
Melanogenesis ialah proses penghasilan melanin dan penting untuk perlindungan kulit. Melanin menyerap cahaya ultraviolet (UV) dan melindungi kulit daripada kesan merosakkan cahaya UV dan radikal bebas [1]. Walau bagaimanapun, kerana pengeluaran melanin yang berlebihan menyebabkan hiperpigmentasi seperti jeragat dan lentigo, yang mungkin dianggap tidak estetik, banyak penyelidikan telah didedikasikan untuk mencari bahan de-pigmen yang berkesan untuk kosmetik atau ubat-ubatan [2-4].
Gula adalah humektan yang kuat untuk pelembab kulit dan digunakan sebagai bahan kosmetik untuk melembapkan kulit dengan kesan sampingan yang minimum. Di samping itu, gula dan agen berkaitan gula mempengaruhi melanogenesis [5,6]. Glikosilasi tyrosinase, enzim utama yang terlibat dalam sintesis melanin, boleh diubah, menghalang aktiviti pemangkinnya dan mempercepatkan degradasinya [7]. Peranan gula dalam melanogenesis telah diserlahkan oleh kajian yang menyiasat kesan glikosilasi pada fenotip pigmentasi melanosit dan peranan sisa gula pada aktiviti pemangkin tyrosinase [5-7]. Beberapa kajian telah melaporkan bahawa derivatif gula boleh menghalang kematangan tyrosinase, menjejaskan glikosilasinya. Sebagai contoh, N-acetylglucosamine (NAG), heksosa amino yang dihasilkan secara fisiologi dengan penambahan kumpulan amino kepada glukosa, mengganggu glikosilasi tyrosinase, mengakibatkan kesan depigmentasi pada kulit babi guinea dan kulit manusia [8].
Selain itu, kajian baru-baru ini telah menunjukkan bahawa sebatian berkaitan gula menghalang ekspresi atau pengaktifan tyrosinase serta mengubah glikosilasinya. Sebagai contoh, kami menilai keberkesanan pemutihan asid galakturonik (GA), asid gula yang merupakan bentuk teroksida galaktosa dan komponen utama pektin. Asid galakturonik memberikan kesan pemutihan melalui pengawalan aktiviti dan ekspresi tyrosinase dalam sel melanoma murine B16 dan setara dengan kulit manusia [9]. Dalam laporan lain, sejenis oligosakarida kitaran baharu, yang dikenali sebagai nitrosil nigerose kitaran (CNN), menunjukkan kesan perencatan langsung yang lemah tetapi ketara pada aktiviti enzimatik tyrosinase, mencadangkan satu kemungkinan mekanisme hipopigmentasi [10]. Sama seperti pematangan tyrosinase oleh glikosilasi yang betul, ekspresi atau aktiviti CNN boleh menjadi sasaran agen anti-melanogenik [11]. Walau bagaimanapun, banyak agen anti-melanogenik mempunyai kesan sampingan yang teruk, seperti vitiligo [12,13]. Oleh itu, terdapat minat yang besar terhadap sebatian de-pigmen yang lebih selamat.
Di sini, kami menyiasat kesan anti-melanogenik glukosa pada sel melanoma murine B16 dan melanosit manusia biasa. Di samping itu, kami memeriksa warna tisu dan status epidermis menggunakan pewarnaan bahagian tisu yang setara dengan kulit manusia. Berdasarkan penemuan kami, kami mencadangkan bahawa kesan pemutihan glukosa adalah bergantung kepada pengeluaran asid laktik, mengakibatkan ketidakaktifan tyrosinase.
2. Keputusan
2.1. Keberkesanan Anti-Melanogenik Glukosa dalam B16 dan NHM
Untuk menyiasat kesan anti-melanogenik glukosa, kami menggunakan dua jenis melanosit, sel melanoma B16 (barisan sel melanoma murine) dan melanosit manusia normal (NHMs). Pertama, kami menentukan sama ada glukosa adalah toksik kepada sel B16. Glukosa tidak menunjukkan sebarang sitotoksisiti pada kepekatan sehingga 100 mM dalam sel B16, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1A. Berdasarkan data sitotoksisiti, sel B16 telah dirawat dengan pelbagai kepekatan glukosa selama 72 jam dengan kehadiran -melanocyte-stimulating hormone (MSH), inducer melanogenesis. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1B, glukosa dengan jelas dan ketara mengawal kandungan melanin intraselular dalam cara yang bergantung kepada dos. Asid Kojic (KA) digunakan sebagai sebatian rujukan untuk anti-melanogenesis kerana ia sering digunakan sebagai bahan kosmetik pencerah kulit [1,3,4]. Warna lisat dalam sel yang dirawat glukosa adalah lebih ringan daripada warna sel kawalan (Rajah 1C).
Di samping itu, kami mengesahkan bahawa jumlah melanin yang dirembeskan ke dalam media kultur berkurangan dan warna media menjadi cerah (Rajah 1D). Seterusnya, kami menyiasat kesan anti-melanogenik glukosa pada NHM berpigmen gelap. Glukosa pada kepekatan sehingga 100 mM tidak sitotoksik sehingga empat 4 hari (Rajah 1E). Apabila kandungan melanin ditentukan selepas rawatan glukosa NHM selama 4 hari, kami mendapati bahawa kandungan melanin menurun dalam cara yang bergantung kepada dos (Rajah 1F). Diambil bersama, keputusan ini menunjukkan bahawa glukosa menyekat sintesis melanin dalam melanosit.
2.2. Kesan Pemutihan Glukosa pada Setara Kulit Manusia 3D
Untuk mentakrifkan lagi keupayaan glukosa anti-melanogenik, kami menggunakan model kulit manusia 3D berpigmen, MelanoDerm. Seperti yang diterangkan dalam bahagian Bahan dan Kaedah, glukosa digunakan secara topikal pada MelanoDerm selama 18 hari dan daya maju sel ditentukan oleh ujian CCK-8. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2A, tiada sitotoksisiti tisu diperhatikan selepas rawatan glukosa selama 18 hari. Perubahan warna tisu dinilai oleh fotografi. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2B, tisu yang dirawat glukosa adalah berwarna lebih cerah daripada tisu yang dirawat dengan garam penampan fosfat (PBS). Di samping itu, pewarnaan hematoxylin dan eosin (H&E) mendedahkan bahawa glukosa tidak menyebabkan keruntuhan tisu, manakala pewarnaan fontana-masson (F&M) menunjukkan bahawa glukosa mengurangkan bilangan melanosit hiperpigmen (seperti yang ditunjukkan oleh anak panah) dalam lapisan basal (Rajah 2C) .
Untuk menyiasat lebih lanjut perubahan dalam kandungan melanin, kami membandingkan isyarat auto-pendarfluor melanin dalam lapisan melanosit PBS- dan tisu yang dirawat glukosa menggunakan mikroskopi pendarfluor pengujaan dua foton (TPEF), seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2D. Analisis imej-imej ini menunjukkan bahawa jumlah melanin telah menurun sebanyak kira-kira 36 peratus dan keamatan isyarat TPEF untuk melanin di kawasan yang kaya dengan melanosit telah menurun sebanyak kira-kira 38 peratus dalam tisu yang dirawat glukosa berbanding dengan tisu yang dirawat PBS.
Rajah 2. Kesan glukosa pada kulit manusia yang setara, MelanoDerm. (A) Daya maju setara kulit manusia yang dirawat dengan glukosa. (B) Setara kulit manusia (MelanoDerm; n=3) dirawat secara topikal dengan glukosa selama 18 hari, dan kemudian difoto. Nilai ∆L menunjukkan tahap kecerahan berbanding dengan tisu yang dirawat PBS. (C) Pewarnaan H&E dan F&M pada bahagian tisu. Slaid telah dibetulkan dalam larutan formaldehid dan dibenamkan dalam lilin parafin untuk pewarnaan (bar skala, 5{{10}} µm). Anak panah hitam menunjukkan melanosit berpigmen. (D) Pengimejan melanin (200 × 200 × 60 µm3 ) setara kulit manusia dilakukan menggunakan mikroskop TPEF. Isyarat pseudocolored (merah) menunjukkan melanin (bar skala, 50 µm). Graf menunjukkan kuantifikasi isipadu melanin dan isyarat TPEF. Data dinyatakan sebagai min ± SD sekurang-kurangnya tiga ukuran bebas (*p < 0.05, ***p < 0.001).
2.3. Kesan Glukosa terhadap Ekspresi Protein Melanogenik dalam Melanosit
Seterusnya, untuk menjelaskan mekanisme depigmentasi glukosa dalam melanosit, kami menilai kesannya terhadap ekspresi enzim melanogenik seperti tyrosinase dan Tyrp-1 dalam sel B16 dan NHM. Sel B16 dirawat dengan glukosa untuk masa yang dinyatakan dengan kehadiran -MSH. Kemudian, tahap protein tyrosinase dan Tyrp-1 ditentukan oleh ujian Western blot (Rajah 3A). Tahap ekspresi tyrosinase dan Tyrp-1 tidak dikurangkan oleh glukosa pada bila-bila masa. Tambahan pula, tahap transkrip tyrosinase tidak terjejas oleh glukosa dalam sel B16 yang dirangsang -MSH (Rajah 3B). Sama seperti sel B16, tahap protein tyrosinase, Tyrp-1 dan MITF tidak dihalang oleh glukosa (Rajah 3C) dalam sel NHM yang dirawat dengan glukosa dan tahap mRNA tyrosinase dan Tyrp-1 juga tidak menurun, tetapi meningkat sedikit oleh glukosa (Rajah 3D).
Rajah 3. Kesan glukosa pada ekspresi protein melanogenik dalam sel B16 dan NHM. (A, B) Sel B16 telah dirawat dengan -MSH untuk masa yang dinyatakan dengan kehadiran atau ketiadaan glukosa 20 mM. Kemudian, ujian Western blot (A) dan qRT-PCR (B) dilakukan. ( C ) NHM telah dirawat dengan kepekatan glukosa yang ditunjukkan selama 48 jam. Kemudian, ujian Western blot dilakukan. (D) NHM dirawat dengan masa yang ditunjukkan dengan kehadiran glukosa 50 mM. Kemudian, ujian qRT-PCR dilakukan. Data dinyatakan sebagai min ± SD sekurang-kurangnya tiga ukuran bebas.
2.4. Kesan Glukosa terhadap Aktiviti Tirosinase
Untuk mentakrifkan lagi mekanisme tindakan glukosa, kami menguji jika ia mempunyai kesan perencatan pada aktiviti tyrosinase cendawan. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4A, kami mendapati bahawa glukosa tidak mempunyai kesan perencatan pada aktiviti tyrosinase cendawan, menunjukkan bahawa glukosa tidak secara langsung menjejaskan aktiviti tyrosinase. Kami seterusnya melakukan ujian aktiviti tyrosinase intraselular keseluruhan menggunakan lisat sel yang dirawat glukosa dari kedua-dua sel B16 dan NHM. Menariknya, aktiviti tyrosinase intraselular telah dihalang dengan cara yang bergantung kepada dos dalam sel B16 yang dirawat glukosa dengan kehadiran -MSH (Rajah 4B). Dalam NHM, glukosa juga menghalang aktiviti tyrosinase intraselular (Rajah 4C). Data ini menyokong kemungkinan bahawa glukosa secara tidak langsung menyahaktifkan tyrosinase dalam melanosit.
Rajah 4. Kesan glukosa ke atas aktiviti tyrosinase. (A) Kesan glukosa ke atas aktiviti tyrosinase cendawan dalam sistem bebas sel. (B, C) Ujian aktiviti tyrosinase selular. (B) Sel B16 telah dirawat dengan kepekatan glukosa yang ditunjukkan selama 24 jam. Kemudian, ujian aktiviti tyrosinase selular dilakukan, seperti yang diterangkan dalam bahagian kaedah. (C) NHM dirawat dengan glukosa 50 mM untuk masa yang dinyatakan. Kemudian, ujian aktiviti tyrosinase selular dilakukan, seperti yang diterangkan dalam bahagian kaedah. Aktiviti tyrosinase selular telah dinormalkan oleh jumlah kandungan protein. Data dinyatakan sebagai min ± SD bagi sekurang-kurangnya tiga ukuran bebas (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).
2.5. Penyahaktifan Tyrosinase oleh Penghasilan Asid Laktik dalam Melanosit yang Dirawat Glukosa
Glukosa ditukar kepada laktat metabolit selular, yang merupakan asid laktik dalam larutan dan yang telah dilaporkan berkesan dalam merawat lesi pigmen [14,15]. Oleh itu, kami membuat hipotesis bahawa glukosa ditukar menjadi asid laktik dalam melanosit dan peningkatan tahap asid laktik menghalang melanogenesis melalui ketidakaktifan tyrosinase. Untuk menilai hipotesis ini, kami mula-mula menilai pengeluaran asid laktik dalam media daripada melanosit yang dirawat glukosa. Seperti yang dijangkakan, glukosa secara signifikan meningkatkan kandungan asid laktik dalam media kultur sel B16 (Rajah 5A). Di samping itu, kerana asid laktik diketahui secara langsung menghalang aktiviti tyrosinase [15], kami menilai jika asid laktik menindas aktiviti tyrosinase cendawan. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 5B, asid laktik secara mendadak menghalang aktiviti tyrosinase cendawan, tidak seperti glukosa. Keputusan ini menunjukkan bahawa penukaran glukosa kepada asid laktik mempunyai kesan anti-melanogenik melalui ketidakaktifan tyrosinase oleh asid laktik.
Rajah 5. Penghasilan laktat oleh glukosa dan kesan asid laktik ke atas aktiviti tyrosinase. (A) Pengeluaran laktat dalam sel B16 yang dirawat glukosa. (A) Sel B16 telah dirawat dengan kepekatan glukosa yang ditunjukkan selama 3 hari. Kemudian, ujian laktat dilakukan menggunakan media kultur, seperti yang diterangkan dalam bahagian kaedah. (B) Kesan asid laktik ke atas aktiviti tyrosinase cendawan dalam sistem bebas sel. Data dinyatakan sebagai min ± SD bagi sekurang-kurangnya tiga ukuran bebas (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001) .
3. Perbincangan
Gula atau bahan terhasil gula sering digunakan sebagai bahan kosmetik untuk perlindungan kulit dan kawalan fisiologi. Sebagai contoh, raffinose meningkatkan autophagy bebas mTOR dan mengurangkan kematian sel dalam keratinosit yang disinari UVB, menunjukkan bahawa agen semula jadi raffinose mempunyai nilai berpotensi dalam mengehadkan kerosakan foto [16]. Trehalose dan sukrosa adalah pengaktif baru autophagy dalam keratinosit manusia melalui laluan bebas mTOR [17]. Penemuan ini memberikan pandangan baru tentang peraturan autophagy yang dimediasi gula dalam keratinosit. Dalam kes glukosa, glukosa topikal ditunjukkan untuk mendorong ekspresi claudin-1 dan filaggrin dalam model tetikus dermatitis atopik dan kultur keratinosit, menunjukkan bahawa ia mempunyai kesan anti-radang dengan membaiki fungsi penghalang kulit [18]. Di samping itu, glukosa menghalang percambahan dan meningkatkan pembezaan keratinosit kulit [19]. Oleh itu, glukosa mengawal pelbagai aspek fisiologi epidermis, seperti fungsi penghalang kulit dan tahap penghidratan keratinosit.
Gula boleh bertindak sebagai agen depigmen melalui beberapa mekanisme berbeza yang melibatkan tyrosinase. Sebagai contoh, sesetengah agen menghalang kematangan tyrosinase, manakala agen lain mendorong perencatan ekspresi atau aktiviti gen tyrosinase [5,8-10]. Walau bagaimanapun, beberapa kajian telah menyiasat mekanisme yang mendasari kesan depigmentasi glukosa.
Untuk menentukan kesan glukosa pada melanogenesis, kami sebelum ini memberi tumpuan kepada reseptor X hati (LXRs), yang merupakan reseptor nuklear yang diaktifkan ligan yang memainkan peranan penting dalam metabolisme lipid dan homeostasis kolesterol [20]. Kami mendapati bahawa pengaktifan reseptor X hati menghalang melanogenesis melalui pecutan kemerosotan faktor transkripsi berkaitan mikroftalmia (MITF) yang dikawal oleh isyarat ekstraselular (ERK) [21]. Tambahan pula, glukosa adalah ligan LXR endogen [22]. Oleh itu, kami membuat hipotesis bahawa glukosa mempunyai kesan anti-melanogenik disebabkan oleh pengaktifan laluan yang bergantung kepada LXR. Walau bagaimanapun, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3C, glukosa tidak mengubah tahap ekspresi tyrosinase atau MITF, walaupun pengaktifan LXR mengurangkan tahap ekspresi protein ini dalam melanosit.
Oleh itu, kami membuat kesimpulan bahawa glukosa mempunyai kesan depigmentasi pada melanosit bebas daripada pengaktifan LXR.
Glukosa ialah substrat utama untuk penghasilan tenaga, dan ia dihidrolisiskan melalui tindak balas bersiri beberapa enzim, yang dikenali sebagai glikolisis. Banyak kajian telah menunjukkan bahawa glikolisis hanya mempunyai satu produk akhir, asid laktik, sama ada dalam keadaan aerobik atau anaerobik. Di bawah keadaan aerobik (O2), laktat digunakan sebagai substrat mitokondria laktat dehidrogenase (MLD). LDH menukarkannya kepada piruvat yang memasuki kitaran asid trikarboksilik (TCA). Di bawah keadaan anaerobik (N2), laktat terkumpul dalam sitosol. Oleh itu, laluan glikolisis bermula dengan glukosa sebagai substratnya dan berakhir dengan pengeluaran laktat sebagai produk akhir utamanya [23]. Di samping itu, David et al. mengukur pecahan glukosa yang ditukar kepada asid laktik atau piruvat dalam melanosit manusia biasa [24]. Kebanyakan metabolit glukosa adalah asid laktik dan bukannya piruvat.
Asid laktik ialah asid alfa hidroksi (AHA); asid ini digunakan secara meluas dalam formulasi kosmetik sebagai agen pengelupasan cetek [25]. Di samping itu, asid laktik menyekat pembentukan melanin dengan secara langsung menghalang aktiviti tyrosinase, kesan bebas daripada sifat berasidnya, yang bermaksud bahawa kesan asid laktik pada lesi pigmen bukan sahaja disebabkan oleh pecutan pusing ganti sel epidermis tetapi juga perencatan langsung pembentukan melanin dalam melanosit [15]. Oleh itu, kami beralasan bahawa glukosa boleh memberikan kesan anti-melanogenik melalui pengeluaran asid laktik kerana glukosa boleh ditukar kepada asid laktik. Seperti yang dijangkakan, kami mendapati bahawa rawatan glukosa menghasilkan pengeluaran asid laktik dalam melanosit (Rajah 5A).
Di samping itu, kami mengesahkan bahawa asid laktik secara kuat dan secara langsung menghalang aktiviti tyrosinase (Rajah 5B). Usuki et al. juga mendapati bahawa asid laktik menurunkan aktiviti tyrosinase intraselular dalam sel B16 dan sel HM3KO manusia [15]. Dalam laporan itu, mRNA dan tahap protein tyrosinase dan Tyrp-1 tidak terjejas oleh asid laktik. Bersama-sama, data ini menunjukkan bahawa glukosa meningkatkan pengeluaran asid laktik dan bahawa asid laktik ini secara langsung menghalang aktiviti tyrosinase tanpa menjejaskan tahap ekspresi gen, menunjukkan bahawa glukosa mempunyai kesan anti-melanogenik dalam melanosit melalui ketidakaktifan tyrosinase tidak langsung bergantung kepada pengeluaran asid laktik. Walau bagaimanapun, eksperimen lanjut diperlukan untuk mengesahkan peranan asid laktik dan glukosa dalam depigmentasi.
Data kolektif daripada kajian ini menyediakan bukti awal yang menyokong kegunaan glukosa topikal sebagai pemutihan yang berkesan serta reagen pelembap yang boleh digunakan dengan selamat dalam formulasi kosmetik dan perubatan.
4. Bahan dan Kaedah
4.1. Bahan
D-glukosa, -MSH, asid kojik (KA), L-tirosin, L-DOPA, dan asid laktik dibeli daripada Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Amerika Syarikat). Antibodi terhadap tyrosinase dan actin telah dibeli dari Abcam (Cambridge, UK). Antibodi terhadap Tyrp-1 telah dibeli daripada Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). Antibodi terhadap MITF telah dibeli daripada Proteintech (bandar, IL, Amerika Syarikat).
4.2. Kultur Sel dan Ujian Viability
Kami membeli sel melanoma murine B16, medium Eagle's modified Dulbecco (DMEM), dan serum bovine fetal (FBS) daripada American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Sel B16 telah dikultur dalam DMEM yang mengandungi 4500 mg/L glukosa tinggi (ATCC 30-2002) seperti yang disyorkan oleh pengilang (ATCC) ditambah dengan 5 peratus FBS, dan diinkubasi pada 37 ◦C dalam suasana lembap yang mengandungi 95 peratus udara dan 10 peratus CO2. NHM primer berpigmen gelap telah dibeli daripada Thermo Fisher Scientific (#C2025C; Waltham, MA, USA). Sel telah dibiakkan dalam Sederhana 254 (#M254500) ditambah dengan Tambahan Pertumbuhan Melanosit Manusia (#S0025) dan diinkubasi pada 37 ◦C di bawah atmosfera CO2 5 peratus. Untuk eksperimen, NHM primer antara petikan 4 dan 7 digunakan. Daya maju sel kultur dinilai menggunakan Kit Pengiraan Sel-8 (CCK-8) seperti yang diterangkan oleh pengilang (DOJINDO, Tokyo, Jepun).
4.3. Pengukuran Kandungan Melanin
Kandungan melanin ditentukan seperti yang diterangkan dalam laporan sebelumnya [2-4]. Secara ringkas, sel B16 telah dirawat dengan kepekatan glukosa yang ditunjukkan dengan kehadiran -MSH (200 nM) selama 72 jam. NHM dirawat dengan kepekatan glukosa yang ditunjukkan selama 4 hari. Selepas itu, semua sel dibasuh dengan garam penampan fosfat (PBS) dan dibubarkan dalam 1 N NaOH pada suhu 60 ◦C selama 1 jam. Lisat sel telah dipindahkan ke 96-plat perigi, dan penyerapan diukur pada 405 nm. Nilai telah dinormalisasi berdasarkan kepekatan protein dalam setiap telaga sampel.
4.4. Ujian Aktiviti Tirosinase Cendawan
Kami menyiasat kesan langsung kepekatan glukosa yang ditunjukkan pada aktiviti tyrosinase cendawan. Secara ringkas, 100 µL penimbal fosfat yang mengandungi glukosa dicampur dengan cendawan tyrosinase (10 unit/telaga) dan digabungkan dengan 50 µL 0.03 peratus L-tirosin atau L-DOPA dalam air suling. Kemudian, campuran diinkubasi bersama pada 37 ◦C selama 10 minit, dan penyerapan diukur pada 405 nm. Asid Kojic (KA), agen anti-tirosinase yang terkenal, digunakan sebagai sebatian rujukan.
4.5. Ujian Aktiviti Tirosinase Intraselular
Secara ringkas, sel B16 atau NHM telah dirawat dengan kepekatan glukosa yang ditunjukkan untuk masa yang dinyatakan. Kemudian, sel telah dibasuh dengan PBS dan dilisiskan melalui pengeraman dalam penimbal fosfat 50 mM (pH 6.8) yang mengandungi 1 peratus Triton X-100 dan 0.1 mM fenilmetil-sulfonil fluorida. Lisat selular kemudiannya diempar pada 12,000 rpm pada 4 ◦C selama 20 minit. Supernatan yang mengandungi tyrosinase selular dikumpulkan dan kandungan protein ditentukan untuk normalisasi. Ekstrak selular diinkubasi dengan L-DOPA dalam penimbal fosfat dan pembentukan dopachrome dipantau dengan mengukur penyerapan pada 405 nm dalam masa 30 minit.
4.6. Pengasingan RNA dan Tindak Balas Rantaian Transkripsi Balik-Polymerase Kuantitatif Masa Nyata (qRT-PCR)
Untuk menentukan ekspresi mRNA relatif gen terpilih, jumlah RNA telah diasingkan dengan TRIzol (Invitrogen, CA, Amerika Syarikat), mengikut arahan pengilang, dan 4 µg RNA telah ditranskripsikan secara terbalik ke dalam cDNA menggunakan RT-premix (Bioneer, Seoul, South Korea). PCR Kuantitatif telah dilakukan menggunakan Sistem PCR Masa Nyata ABI 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Set primer qRT-PCR untuk tyrosinase dan Tyrp-1 telah dibeli daripada Applied Biosystems dan kit TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems) telah digunakan untuk amplifikasi. Ekspresi gen sasaran telah dinormalisasikan kepada gen pengemasan yang mengekod protein ribosom subunit tangkai sisi P0 (RPLP0). Pengkuantitian relatif dilakukan menggunakan kaedah perbandingan ∆∆Ct mengikut arahan pengeluar.
4.7. Western Blotting
Sel telah dibasuh dua kali dengan PBS sejuk dan kemudian dilisiskan dalam penimbal RIPA diubah suai ais (Teknologi Isyarat Sel, MA, Amerika Syarikat) yang mengandungi perencat protease (Calbiochem, La Jolla, CA, Amerika Syarikat). Jumlah kepekatan protein telah ditentukan, dan protein telah diselesaikan oleh SDS-PAGE pada 4-12 peratus kecerunan gel Bis-Tris (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), dipindahkan ke membran nitroselulosa (Thermo Fisher Scientific). Selepas pemindahan, membran disekat dalam larutan penyekat 5 peratus. Membran diinkubasi dengan antibodi primer pada suhu 4 ◦C selama 24 jam, dibasuh dengan garam penimbal Tris yang mengandungi 0.1 peratus Tween-20 (TBST), dan terdedah kepada antibodi sekunder terkonjugasi peroksidase selama 1 jam pada suhu bilik. Membran dibilas tiga kali dengan TBST. Isyarat chemiluminescent telah dibangunkan menggunakan reagen Western blotting ECL (GE Healthcare, Hatfield, UK).
4.8. Tiga Dimensi (3D) Setara Kulit Manusia
Kami menggunakan MelanoDerm (MEL-300-B; MatTek Corp., Ashland, MA, USA) sebagai model tisu kulit manusia. Setara kulit manusia 3D yang berdaya maju, dibentuk semula, ini diperoleh daripada penderma hitam dan mengandungi melanosit dan keratinosit normal. MelanoDerm telah ditanam pada antara muka cecair udara dalam medium EPI-100-NMM-113 (MatTek Corp, Ashland, MA, USA). Sebelum rawatan glukosa, tisu dibasuh dengan 1 mL PBS untuk membuang sisa sebatian. Glukosa telah dibubarkan dalam PBS. Kepekatan akhir glukosa ialah 2 peratus. Sampel kawalan dirawat hanya dengan PBS. Glukosa telah digunakan untuk MelanoDerm pada hari 1, 4, 6, 8, 11, 13, dan 15. Selepas 18 hari, tisu MelanoDerm telah ditetapkan dalam 4 peratus formaldehid penampan, tertanam dalam parafin, dipotong kepada ketebalan 3 µm, dan tertakluk kepada pewarnaan H&E dan F&M. Daya maju sampel tisu telah dinilai menggunakan Kit Pengiraan Sel-8 (CCK-8) seperti yang diterangkan oleh pengilang (DOJINDO, Tokyo, Jepun). Pigmentasi MelanoDerm dinilai dengan membandingkan perubahan dalam nilai L*.
4.9. Pengimejan Pendarfluor Pengujaan Dua Foton (TPEF).
Untuk menggambarkan pengedaran melanin dalam setara kulit manusia 3D, kami melakukan pengimejan TPEF, seperti yang diterangkan dalam laporan kami sebelum ini [3,4]. Secara ringkas, setiap penyediaan MelanoDerm telah ditetapkan dalam 4 peratus formalin selama 24 jam pada suhu 4 ◦C dan kemudian dibasuh dengan PBS/0.1 peratus BSA (albumin serum lembu, Merck, Branchburg, NJ, Amerika Syarikat). Imej TPEF diperoleh daripada lapisan basal untuk mengukur melanin intraselular dalam lapisan melanosit. Keamatan isyarat TPEF relatif untuk melanin dalam volum pengukuran dikira menggunakan perisian Image-Pro Premier 3D (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA).
4.10. Ujian L-laktat
Sel B16 telah disemai pada 1.0 × 105 sel setiap telaga dalam 12-plat perigi. Selepas rawatan dengan glukosa selama 3 hari, tahap laktat ekstraselular dikira menggunakan kit ujian kolorimetrik L-laktat (Abcam, ab65331, Cambridge, UK) mengikut protokol pengeluar.
4.11. Analisis statistik
Data dinyatakan sebagai min ± SDs (sisihan piawai), dan kepentingan statistik ditentukan oleh ujian-t Pelajar. Nilai p < 0.05 dianggap signifikan secara statistik.
Sumbangan Pengarang:
Pengkonsepan, H.-JK, JL, dan CSL; Kurasi data, SHL; Siasatan, SHL; Metodologi, SHL, I.-HB, dan E.-SL; Penyeliaan, JL, dan CSL; Penulisan—draf asal, SHL dan CSL; Menulis—menyemak dan menyunting, JL Semua pengarang telah membaca dan bersetuju dengan versi manuskrip yang diterbitkan.
Pembiayaan:
Penyelidikan ini dibiayai oleh Program Penyelidikan Sains Asas melalui Yayasan Penyelidikan Kebangsaan Korea (NRF) yang dibiayai oleh Kementerian Pendidikan (Nombor Geran: 2018R1D1A1B07049402).
Konflik Kepentingan:
Penulis mengisytiharkan tiada konflik kepentingan.
Singkatan
-MSH -hormon perangsang melanosit
Tyrp{0}} protein berkaitan tyrosinase 1
Faktor transkripsi yang berkaitan dengan mikroftalmia MITF
NHMs melanosit manusia biasa
Pendarfluor pengujaan dua foton TPEF
Reseptor X hati LXR
Asid alfa hidroksi AHA
H&E hematoxylin dan eosin
F&M Fontana-Masson
Rujukan
1. Swalwell, H.; Latimer, J.; Haywood, RM; Birch-Machin, MA Menyiasat peranan melanin dalam UVA/UVB dan pengeluaran ROS selular dan mitokondria yang disebabkan oleh hidrogen peroksida dan kerosakan DNA mitokondria dalam sel melanoma manusia. Radic Percuma. biol. Med. 2012, 52, 626–634. [CrossRef]
2. Lee, CS; Jang, WH; Park, M.; Jung, K.; Baek, HS; Joo, YH; Park, YH; Lim, KM Sebuah novel terbitan adamantyl benzylbenzamide, AP736, menyekat melanogenesis melalui perencatan faktor transkripsi dan ekspresi tyrosinase cAMP-PKA-CREB-Activated microphthalmia-Associated transcription. Exp. Dermatol. 2013, 22, 762–764. [CrossRef] [PubMed]
3. Lee, JH; Lee, ES; Bae, IH; Hwang, JA; Kim, SH; Kim, DY; Taman, NH; Rho, HS; Kim, YJ; Oh, SG; et al. Keberkesanan Antimelanogenik Melasolv (3,4,5-Trimethoxycinnamate Thymol Ester) dalam Melanocytes dan Setara Kulit Manusia Tiga Dimensi. Farmakol Kulit. Fisiol. 2017, 30, 190–196. [CrossRef] [PubMed]
4. Bae, IH; Lee, ES; Yoo, JW; Lee, SH; Ko, JY; Kim, YJ; Lee, TR; Kim, DY; Lee, CS Mannosylerythritol lipid menghalang melanogenesis melalui menekan isyarat ERK-CREB-MITF-Tyrosinase dalam melanosit manusia normal dan setara kulit manusia tiga dimensi. Exp. Dermatol. 2019, 28, 738–741. [CrossRef] [PubMed]
5. Tong sampah, BH; Kim, ST; Bhin, J.; Lee, TR; Cho, EG Pembangunan agen anti-Melanogenik Berasaskan gula. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 583. [CrossRef]
6. Kumari, S.; Tien Guan Thng, S.; Kumar Verma, N.; Gautam, HK Melanogenesis Inhibitor. Acta. Derm. Venereol. 2018, 98, 924–931. [CrossRef]
7. Ando, H.; Kondoh, H.; Ichihashi, M.; Pendengaran, VJ Mendekati untuk mengenal pasti perencat biosintesis melanin melalui kawalan kualiti tyrosinase. J. Invest Dermatol. 2007, 127, 751–761. [CrossRef]
8. Hwang, JS; Lee, HY; Lim, TY; Kim, SAYA; Yoon, TJ Gangguan glikosilasi tyrosinase oleh N-acetylglucosamine dan kesan depigmentasinya dalam kulit babi guinea dan kulit manusia. J. Dermatol. Sci. 2011, 63, 199–201. [CrossRef]
9. Lee, CS; Baek, HS; Bae, IH; Choi, SJ; Kim, YJ; Lee, JH; Kim, JW Keberkesanan depigmentasi asid galakturonik melalui peraturan tyrosinase dalam sel melanoma murine B16 dan setara kulit manusia tiga dimensi. Clin. Exp. Dermatol. 2018, 43, 708–712. [CrossRef]
10. Nakamura, S.; Kunikata, T.; Matsumoto, Y.; Hanaya, T.; Harashima, A.; Nishimoto, T.; Ushio, S. Kesan karbohidrat kitaran bukan Cyclodextrin pada sel melanoma tikus: Pencirian jenis gula hipopigmentasi baharu. PLoS ONE 2017, 12, e0186640. [CrossRef]
11. Khan, MT Novel tyrosinase inhibitors daripada sumber semula jadi–Kajian pengiraan mereka. Curr. Med. Kimia. 2012, 19, 2262–2272. [CrossRef] [PubMed]
12. Solano, F.; Briganti, S.; Picardo, M.; Ghanem, G. Hypopigmentingagents: Kajian terkini tentang aspek biologi, kimia dan klinikal. Pigmen. sel. Res. 2006, 19, 550–571. [CrossRef] [PubMed]
13. Lee, CS; Joo, YH; Baek, HS; Park, M.; Kim, JH; Shin, HJ; Taman, NH; Lee, JH; Park, YH; Shin, SS; et al. Kesan berbeza daripada lima sebatian de-pigmen, rhododendron, raspberry ketone, monobenzone, rucinol, dan AP736 pada melanogenesis dan daya maju melanosit epidermis manusia. Exp. Dermatol. 2016, 25, 44–49. [CrossRef] [PubMed]
14. Mulukutla, BC; Khan, S.; Lange, A.; Hu, WS Metabolisme glukosa dalam budaya sel mamalia: Cerapan baharu untuk mengubah suai laluan vintaj. Trend. Bioteknol. 2010, 28, 476–484. [CrossRef]
15. Usuki, A.; Ohashi, A.; Sato, H.; Ochiai, Y.; Ichihashi, M.; Funasaka, Y. Kesan perencatan asid glikolik dan asid laktik pada sintesis melanin dalam sel melanoma. Exp. Dermatol. 2003, 12, 43–50. [CrossRef]
16. Lin, S.; Li, L.; Li, M.; Gu, H.; Chen, X. Raffinose meningkatkan autophagy dan mengurangkan kematian sel dalam keratinosit yang disinari UVB. J. Photochem. Photobiol. B 2019, 201, 111653. [CrossRef]
17. Chen, X.; Li, M.; Li, L.; Xu, S.; Huang, D.; Ju, M.; Huang, J.; Chen, K.; Gu, H. Trehalose, sukrosa dan rafinosa ialah pengaktif baru autophagy dalam keratinosit manusia melalui laluan bebas mTOR. Sci. Rep. 2016, 6, 28423. [CrossRef]
18. Yamada, K.; Matsushita, K.; Wang, J.; Kanekura, T. Glukosa Topikal Menggerakkan Ekspresi Claudin-1 dan Filaggrin dalam Model Tikus Dermatitis Atopik dan dalam Budaya Keratinosit, Mengeluarkan Kesan Anti-Radang dengan Membaiki Fungsi Penghalang Kulit. Acta. Derm. Venereol. 2018, 98, 19–25. [CrossRef]
19. Spravchikov, N.; Sizyakov, G.; Gartsbein, M.; Accili, D.; Tennenbaum, T.; Wertheimer, E. Kesan glukosa pada keratinosit kulit: Implikasi untuk komplikasi kulit diabetes. Diabetes 2001, 50, 1627–1635. [CrossRef]
20. Castrillo, A.; Tontonoz, P. Reseptor nuklear dalam biologi makrofaj: Di persimpangan metabolisme lipid dan keradangan. Annu. Sel Rev. Dev. biol. 2004, 20, 455–480. [CrossRef]
21. Lee, CS; Park, M.; Han, J.; Lee, JH; Bae, IH; Choi, H.; Anak lelaki, ED; Park, YH; Lim, pengaktifan reseptor KM Liver X menghalang melanogenesis melalui pecutan kemerosotan MITF ERK-Mediated. J. Melabur. Dermatol. 2013, 133, 1063–1071. [CrossRef] [PubMed]
22. Mitro, N.; Mak, PA; Vargas, L.; Godio, C.; Hampton, E.; Molteni, V.; Kreusch, A.; Saez, E. Reseptor nuklear LXR ialah sensor glukosa. Alam 2007, 445, 219–223. [CrossRef] [PubMed]
23. Schurr, A. Karbohidrat; IntechOpen: London, UK, 2017; ms 21–35.
24. Scott, D.; Richardson, A.; Filipp, F.; Knutzen, C.; Chiang, G.; Ronai, Z.; Osterman, A.; Smith, J. Pemprofilan Fluks metabolik perbandingan garisan sel melanoma: Di luar kesan Warburg. J. Biol. Kimia. 2011, 286, 42626–42634. [CrossRef] [PubMed]
25. Tang, SC; Yang, JH Dwi Kesan Asid Alpha-Hydroxy pada Kulit. Molekul 2018, 23, 863. [CrossRef]
For more information:1950477648nn@gmail.com
