MTHFD2 Merupakan Pusat Pemeriksaan Metabolik Mengawal Kesan Dan Kawal Selia Nasib dan Fungsi Sel T
Mar 02, 2022
Abstrak grafik
Pengarang :
Ayaka Sugiura, Gabriela Andrejeva, Kelsey Voss, ..., Ashutosh K. Mangalam, Joshua D. Rabinowitz, Jeffrey C. Rathmell
Surat-menyurat:
jeff.rathmell@vumc.org
Secara ringkas :
Sintesis nukleotida diperlukan untuk menyokong percambahan sel T yang cepat. Sugiura et al. menunjukkan bahawa metabolisme de novo purine memberi isyarat kepada pembezaan dan fungsi sel T secara langsung dan mengenal pasti MTHFD2 sebagai pusat pemeriksaan metabolik dan sasaran terapeutik untuk penyakit radang.
Sorotan
MTHFD2 adalah penting untuk sel T CD4 yang diaktifkan untuk mengekalkan sintesis purin de novo
MTHFD2 yang tidak mencukupi menggalakkan fenotip dan metabolisme seperti sel Treg dalam sel Th17 d Perencatan MTHFD2 menyekat isyarat mTORC1 dan mengubah metilasi histon
MTHFD2 boleh disasarkan untuk melindungi daripada keradangan dan autoimun dalam vivo
MTHFD2 ialah pusat pemeriksaan metabolik yang mengawal effector dan kawal selia nasib dan fungsi sel T
Ayaka Sugiura,1Gabriela Andrejeva,1Kelsey Voss,1Darren R. Heintzman,1Xincheng Xu,5Matthew Z. Madden,1Xiang Ye,1Katherine L. Beier,1Nowrin U. Chowdhury,2Melissa M. Wolf,2Arissa C. Young,1Dalton L. Greenwood,1Allison E. Sewell,1Shailesh K. Shahi,3Samantha N. Freedman,3Alanna M. Cameron,4Patrik Foerch,4Tim Bourne,4Juan C. Garcia-Canaveras,5John Karizolich,1Fajar C. Newcomb,2Ashutosh K. Mangalam,3Joshua D. Rabinowitz,5dan Jeffrey C. Rathmell1,6,*
1Pusat Vanderbilt untuk Imunobiologi, Jabatan Patologi, Mikrobiologi dan Imunologi, Pusat Perubatan Universiti Vanderbilt, Nashville, TN 37232, Amerika Syarikat
2Jabatan Perubatan, Bahagian Hematologi dan Onkologi, Pusat Perubatan Universiti Vanderbilt, Nashville, TN 37232, Amerika Syarikat
3Jabatan Patologi, Universiti Iowa, Iowa City, IA 52242, Amerika Syarikat
4Sitryx Therapeutics Limited, Pusat Magdalen, Taman Sains Oxford, Oxford, UK
5Jabatan Kimia, Institut Penyelidikan Kanser Ludwig Cawangan Princeton, Institut Lewis-Sigler untuk Genomik Integratif, Universiti Princeton, Princeton, NJ 08544, Amerika Syarikat6Hubungan utama
*Surat menyurat: jeff.rathmell@vumc.org
https://doi.org/10.1016/j.immuni.2021.10.011
RINGKASAN
Rangsangan antigen menggalakkan pengaturcaraan semula metabolik sel T untuk memenuhi permintaan biosintetik, biotenaga dan isyarat yang meningkat. Kami menunjukkan bahawa enzim metabolisme satu karbon (1C) methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 2 (MTHFD2) mengawal sintesis purin de novo dan isyarat dalam sel T diaktifkan untuk menggalakkan percambahan dan pengeluaran sitokin radang. Dalam sel T helper-17 (Th17) patogenik, MTHFD2 menghalang regulasi yang menyimpang bagi faktor transkripsi FoxP3 bersama-sama dengan penambahan kapasiti penindasan yang tidak sesuai. Kekurangan MTHFD2 juga menggalakkan pembezaan sel T (Treg) pengawalseliaan. Secara mekanikal, perencatan MTHFD2 menyebabkan penyusutan kolam purin, pengumpulan perantaraan biosintetik purin, dan penurunan isyarat mTORC1 sensor nutrien. MTHFD2 juga penting untuk mengawal selia DNA dan metilasi histon dalam sel Th17. Yang penting, kekurangan MTHFD2 mengurangkan keterukan penyakit dalam pelbagai model penyakit radang in vivo. Oleh itu, MTHFD2 adalah pusat pemeriksaan metabolik untuk mengintegrasikan metabolisme purin dengan isyarat sel efektor patogen dan merupakan sasaran terapeutik yang berpotensi dalam laluan metabolisme 1C.
PENGENALAN
Mobilisasi berkesan tindak balas imun adaptif memerlukan pengaktifan teguh sel CD4 ditambah T untuk menjalani pertumbuhan dan percambahan sel yang cepat. Ini melibatkan pengaturcaraan semula metabolik, didorong oleh sensor nutrien mTORC1, daripada keadaan rehat katabolik kepada keadaan pertumbuhan anabolik dengan peningkatan permintaan biosintetik, biotenaga dan isyarat. Bergantung pada lingkungan sitokin, sel CD4 ditambah T dibezakan kepada effector serta subset pengawalseliaan yang mempunyai program metabolik yang berbeza yang memacu fungsi effector mereka (Bantug et al., 2018; Buck et al., 2015). Keseimbangan subset ini penting untuk imuniti normal sambil mencegah penyakit radang dan autoimun. Contohnya, multiple sclerosis (MS) dicirikan oleh peningkatan interleukin-17 (IL- 17)-menghasilkan sel T helper-17 (Th17) dan sel T (Treg) kawal selia penindasan yang berkurangan atau tidak berkesan (Dendrou et al., 2015). Menyasarkan program metabolik khusus subset sel T ini menawarkan pendekatan alternatif kepada imunoterapi.
Terapi berasaskan metabolisme sel bermula pada tahun 1948 apabila agen kemoterapi anti folat terbukti berkesan pada kanak-kanak dengan leukemia limfoblastik akut (Farber et al., 1948). Folat menyumbang kepada metabolisme satu karbon (1C) untuk biosintesis purin, penjanaan penderma metil, dan pengekalan keseimbangan redoks selular (Ducker dan Rabinowitz, 2017; Yang dan Vousden, 2016). Banyak ubat, termasuk methotrexate (MTX), fluorouracil (5-FU), dan mercaptopurine (6-MP), telah dibangunkan untuk menyasarkan laluan ini. Sel yang membiak dengan pantas, termasuk sel kanser dan sel T yang diaktifkan, berkongsi kebergantungan pada laluan ini untuk mensintesis DNA dan RNA. MTX kekal biasa digunakan untuk merawat penyakit autoimun seperti rheumatoid arthritis (RA) (Brown et al., 2016). Walau bagaimanapun, kerana ekspresi luas enzim yang disasarkan, agen terapeutik ini dikaitkan dengan kesan buruk yang biasa dan berpotensi teruk. Mengenal pasti sasaran enzim metabolik yang secara selektif penting dalam populasi sel yang diminati boleh membawa kepada pembangunan imunoterapi yang lebih selamat dan berkesan.
Metabolisme 1C termasuk kitaran folat dan metionin dengan pemindahan unit karbon tunggal. Serine berfungsi sebagai penderma 1C untuk mengaktifkan tetrahydrofolate (THF) kepada 5,10-methyleneTHF, dengan pengeluaran glisin bersamaan. 5,10-metilenaTHF kemudiannya boleh dioksidakan menggunakan NAD(P) untuk menjana prekursor purin 10- formylTHF. Sebagai alternatif, 10-formylTHF boleh disintesis daripada format dan THF dalam cara yang bergantung kepada ATP. Dalam laluan sitosol, 10-pengeluaran fomylTHF dimediasi oleh metilenaTHF dehidrogenase 1 (MTHFD1). Kehilangan sel MTHFD1 menyebabkan kebuluran 10-formylTHF sitosolik, kapasiti biosintetik purin yang mengecil dan mutasi dalam MTHFD1 menyebabkan kekurangan imun gabungan (SCID) yang teruk (Field et al., 2015). Laluan mitokondria bergantung pada mitokondria MTHFD2 dan MTHFD{17}}seperti (MTHFD1L).
Rajah 1. Metabolisme 1C dan MTHFD2 dikawal selia dalam CD4 yang diaktifkantambah lagisel T dan dalam konteks EAE
(A) Perubahan dalam spesies metabolisme nukleotida dalam CD4 yang dibezakan secara in-vitrotambah lagiSubset sel T berbanding dengan sel naif yang diukur dengan spektrometri jisim (n=3 replika biologi).
(B) Aliran kerja untuk pemeriksaan CRISPR yang disasarkan dalam model keradangan paru-paru in vivo.
(C) Perubahan dalam kelimpahan gRNA daripada 1C yang disasarkan dalam saringan CRISPR vivo dalam CD4 primertambah lagiSel T (analisis statistik yang dilakukan oleh MAGeCK, n=3 replika biologi).
(D) ekspresi mRNA gen yang dikenal pasti dalam (C) semasa pembangunan dan pengaktifan sel T (data daripada pelayar data ImmGen RNA-seq).
(E) Ekspresi protein gen yang dikenal pasti dalam (C) dalam CD4 naif dan diaktifkantambah lagiSel T (data daripada Sumber Proteome Imunologi [ImmPRes]).
(F) ekspresi mRNA gen yang dikenal pasti dalam (C) dalam darah keseluruhan individu dengan gangguan keradangan yang ditunjukkan berbanding individu kawalan yang sihat (Aune et al., 2017). RA-MTX, RA di bawah rawatan MTX; SLE, lupus erythematosus sistemik; MS-Tx naif, MS naif rawatan pada masa diagnosis; MS yang ditubuhkan, MS dalam rawatan dan dalam pengampunan penyakit; n=3–8 penderma.
(G) IHC menunjukkan pewarnaan CD3 dan MTHFD2 dalam segmen cauda equina saraf tunjang tikus dengan EAE bergejala pada tahun 2003 (atas; bar skala, 100 mm) dan 4003 (bawah; bar skala, 50 mm) pembesaran (data mewakili daripada dua eksperimen bebas).
(H dan I) Relatif (H) bermakna intensiti pendarfluor (MFI) dan (I) mRNA ekspresi MTHFD2 dalam CD4tambah lagiSel T dari limpa dan saraf tunjang tikus dengan EAE bergejala dan limpa tikus kawalan (min ± SD, ANOVA sehala, data mewakili dua eksperimen bebas dengan 6 jumlah replika biologi).
(J) Ekspresi mRNA MTHFD2 dalam CD4 yang tidak dibezakantambah lagiSel T 0, 5 dan 24 jam selepas pengaktifan dengan antibodi anti-CD3 dan anti-CD28 (min ± SD, ANOVA sehala, n=3 replika biologi).
(K) MFI MTHFD2 relatif selama 5 hari selepas pengaktifan dalam CD4 ditambah subset sel T, dinormalkan kepada sel rehat (min ± SD, n=3 replika biologi). Lihat juga Rajah S1. Keputusan yang ketara secara statistik dilabelkan (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0.001,="" ****="" p="" peratus="">
MTHFD2 adalah salah satu gen yang paling diinduksi dan terlalu tertekan dalam semua tumor (Nilsson et al., 2014). Walaupun dikawal secara meluas semasa embriogenesis, MTHFD2 mempunyai sedikit atau tiada ekspresi dalam kebanyakan tisu dewasa (Nilsson et al., 2014). Dalam terapi anti-kanser (Zhu dan Leung, 2020), perencatan MTHFD2 boleh menyebabkan peningkatan tekanan oksidatif (Ju et al., 2019; Wan et al., 2020), pergantungan glisin (Koufaris et al., 2016), dan tidak mencukupi sintesis purin (Ben-Sahra et al., 2016; Pikman et al., 2016). Kekurangan MTHFD2 juga boleh menyekat aktiviti mTORC1 melalui pelbagai mekanisme, termasuk melalui pengurangan guanin dan perencatan seterusnya mTORC1-mengaktifkan GTPase Rheb (Emmanuel et al., 2017). Kekurangan MTHFD2 juga menyebabkan pengumpulan perantaraan laluan sintesis purin, termasuk analog adenosin monofosfat (AMP) 5-aminoimidazole carboxamide ribonucleotide (AICAR) (Ducker et al., 2016), yang boleh mengaktifkan AMP-activated protein kinase (AMPK) untuk menghalang mTORC1 (Su et al., 2019).
Oleh kerana metabolisme 1C mengintegrasikan pelbagai input nutrien dan boleh dikendalikan secara terapeutik, kami mengkaji peranan 1Cmetabolisme dalam CD4tambah lagiT effector (Teff) dan subset sel Treg. Melalui saringan sasaran berasaskan in vivo CRISPR-Cas9-yang tidak berat sebelah dalam sel T murine primer, kami mengenal pasti MTHFD2 sebagai hit yang turut dikawal secara konsisten dalam individu yang mengalami gangguan keradangan. Terutama, kekurangan MTHFD2 menjejaskan percambahan dan fungsi sel Teff. Kekurangan MTHFD2 juga menggalakkan ekspresi FoxP3 yang menyimpang dan aktiviti menindas dalam selTh17 sambil menggalakkan pembezaan sel Treg. Kesan ini dikaitkan dengan pengumpulan AICAR, mengurangkan kepekatan purin, menurunkan regulasi isyarat mTORC1, meningkatkan metabolisme mitokondria, dan mengubah DNA dan metilasi histon. In vivo, menyasarkan MTHFD2 dilindungi daripada pelbagai model penyakit radang. Data ini menunjukkan bahawa MTHFD2 berfungsi sebagai pusat pemeriksaan metabolik dalam sel Th17 dan Treg dan menyerlahkan potensi enzim ini sebagai sasaran untuk imunoterapi anti-radang.
KEPUTUSAN
Metabolisme 1C dan sintesis purin secara berbeza aktif dalam CD4tambah lagiSubset sel T
Kami membuat hipotesis bahawa sintesis nukleotida mungkin berbeza di seluruh CD4tambah lagiSubset sel T. CD4tambah lagiSel T dibezakan secara in vitro ke dalam sel Th1, Th17, dan Treg dan dikumpulkan selepas 72 jam untuk spektrometri jisim. Jumlah spesies nukleotida secara amnya dinaikkan dalam semua subset berbanding dengan sel naif (Rajah 1A). Terutamanya, perantaraan sintesis purin adalah berbeza dengan banyaknya, dengan pengumpulan tertinggi glycinamide ribonucleotide (GAR), 1-(phosphoribosyl) imidazole carboxamide (SAICAR), dan AICAR dalam sel Th17 (Rajah S1A).
Untuk menguji kebergantungan CD4tambah lagiSel T pada enzim dalam metabolisme 1C, kami melakukan skrin berasaskan CRISPR-Cas dalam vivo9-dalam CD4 primertambah lagisel T (Rajah 1B). Perpustakaan RNA (gRNA) panduan tersuai telah dibina untuk menyasarkan enzim dalam metabolisme 1C, bersama-sama dengan kompleks sklerosis tuberous 2 (TSC2) sebagai kawalan positif dan kawalan negatif bukan sasaran (NTC). CD4tambah lagiSel T yang diasingkan daripada ovalbumin (OVA)-spesifik reseptor sel T (TCR) transgenik OT-II Cas9 tikus transgenik berganda telah ditransduksi dengan perpustakaan ini dan dipindahkan secara intravena ke dalam Rag1__ /__tuan rumah. Tikus kemudian diimunisasi dengan OVA intranasal untuk mendorong keradangan paru-paru. Sel T yang pulih dari paru-paru tikus ini telah disusun, dan pengayaan atau pengurangan gRNA telah ditubuhkan berbanding dengan frekuensi input. TSC2 gRNA diperkaya, menyokong peranan perencatan protein ini dalam sel T. Sebaliknya, gRNA PPAT, AHCY, MAT2A dan MTHFD1 telah berkurangan dengan ketara, dan GART, DHFR, DNMT1, MTRR, MTR, SHMT2, dan MTHFD2 gRNA telah dikurangkan ke tahap yang lebih rendah, menunjukkan bahawa gen ini menyumbang kepada percambahan sel T dan fungsi keradangan. dalam vivo (Rajah 1C dan S1B).
Kami seterusnya mengkaji profil ekspresi gen yang dikenal pasti dari skrin. Walaupun semuanya dikawal secara selaras dalam membangunkan thymocytes, mRNA dan protein MTHFD2 telah diinduksi paling kuat dalam sel T periferal yang dirangsang (Rajah 1D dan 1E). Selain itu, dalam set data penjujukan RNA (RNA-seq) yang diterbitkan secara berasingan daripada keseluruhan darah individu dengan pelbagai penyakit radang dan autoimun (Aune et al., 2017), MTHFD2 diekspresikan secara berlebihan secara konsisten dalam pelbagai keadaan, termasuk kolitis ulseratif, penyakit Crohn. , penyakit seliak, RA, systemic lupus erythematosus (SLE), psoriasis, psoriatic arthritis, sindrom Sjo¨ gren dan MS (Rajah 1F). Terutama, individu dengan MS yang didiagnosis baru-baru ini telah meningkatkan ekspresi MTHFD2 dengan ketara berbanding penderma yang sihat atau individu dengan MS yang menjalani terapi dengan remisi penyakit (Rajah S1C). Oleh itu, CD4tambah lagiProliferasi dan survival sel T bergantung kepada gen metabolisme 1C tertentu, dan ekspresi gen ini berbeza melalui peringkat perkembangan sel T, pengaktifan dan pembezaan serta dalam penetapan keradangan patologi.
Rajah 2. Kekurangan MTHFD2 menjejaskan CD4tambah lagiPembiakan dan fungsi sel T
(A–D) Proliferasi diukur dengan (A) pencairan CellTrace Violet (CTV), (B) daya maju, (C) ekspresi CD25 dan (D) ekspresi TF dalam CD4tambah lagiSubset sel T dirawat dengan MTHFD2i selama 72 jam selepas pengaktifan (min ± SD, ANOVA sehala, data mewakili tiga eksperimen bebas dengan 9 jumlah replika biologi).
MTHFD2 sangat dikawal dalam CD4 yang menyusup CNStambah lagiSel T dalam encephalomyelitis autoimun eksperimen (EAE) dan dalam CD4 diaktifkantambah lagiSel T secara in vitro
Peraturan MTHFD2 belum dijelaskan dengan baik dalam sel T CD4 ditambah. Untuk mengukur ekspresi MTHFD2 dalam lesi keradangan dalam vivo, CD4tambah lagiSel T daripada tikus 2D2 transgenik TCR khusus myelin telah diaktifkan dan dipindahkan secara angkat ke dalam Rag1__ /__tikus untuk mendorong EAE. Selepas tikus mula menunjukkan kelumpuhan hindleg, segmen cauda equina saraf tunjang dianalisis oleh imunohistokimia (IHC). Tikus yang menerima sel T 2D2 menunjukkan pengayaan MTHFD2 dan CD3tambah lagisel yang tiada dalam kawalan (Rajah 1G). Untuk menentukan secara langsung sama ada CD4tambah lagiSel T mengawal selia MTHFD2 dalam lesi yang meradang, sel T dari limpa dan saraf tunjang tikus yang tertakluk kepada myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) dan model EAE yang disebabkan oleh toksin pertussis (PTX) dikumpulkan untuk analisis. CD4 yang menyusup CNStambah lagiSel T melebihkan MTHFD2 berbanding CD4 splenik yang dipadankantambah lagiSel T dari kawalan dan tikus EAE, seperti yang diukur oleh sitometri aliran (Rajah 1H) dan qRT-PCR (Rajah 1I). Kinetik ungkapan MTHFD2 dalam CD4tambah lagiSel T secara in vitro diukur seterusnya. Regulasi teguh mRNA MTHFD2 dikesan selepas 5 jam rangsangan dan mula berkurangan sebanyak 24 jam (Rajah 1J), manakala CD4 dibezakantambah lagiSubset sel T mencapai ekspresi tertinggi protein MTHFD2 48 jam selepas pengaktifan (Rajah 1K). Data ini menunjukkan bahawa MTHFD2 dikawal selia dalam CD4tambah lagiSel T dengan pengaktifan in vitro dan di tapak keradangan in vivo.
CD4tambah lagiSubset sel T secara berbeza memerlukan MTHFD2 untuk pengaktifan, percambahan, kelangsungan hidup dan pengeluaran sitokin
Kami seterusnya menguji peranan MTHFD2 dalam CD4 ditambah pengaktifan subset sel T, pembezaan, percambahan dan fungsi. CD4tambah lagiSel T telah diaktifkan secara in vitro dengan kehadiran sitokin untuk pembezaan sel Th1, Th17, dan Treg yang optimum dan kenderaan atau perencat MTHFD2 (MTHFD2i; DS18561882) (Kawai et al., 2019). Selepas 72 jam, semua subset telah mengurangkan percambahan (Rajah 2A) dan bilangan sel berbasikal hidup (Rajah S2A dan S2B). Daya maju dikurangkan dalam sel Th1 dan Th17 (Rajah 2B), dan pengaktifan, seperti yang diukur oleh ungkapan CD25, dikurangkan dalam semua subset (Rajah 2C). Ekspresi faktor transkripsi pencirian keturunan (TF) dikurangkan dalam sel Th1 (T-bettambah lagi) tetapi tidak berubah dalam sel Th17 (ROR ttambah lagi) dan berubah secara minimum dalam sel Treg (FoxP3tambah lagi) (Rajah 1D). Untuk mengukur fungsi sel Teff, sel telah dirangsang semula dengan 12-myristate 13-acetate (PMA) dan ionomycin. Lebih sedikit sel Th1 yang menyatakan interferon-g (IFNg) dengan ketara dan lebih sedikit sel Th17 yang menyatakan IL-17 apabila dibezakan dengan kehadiran MTHFD2i (Rajah 2E). Ini bukan disebabkan oleh pengaktifan awal terjejas kerana fenotip ini dikekalkan apabila pendedahan dadah ditangguhkan sehingga 24 jam selepas pengaktifan, walaupun ekspresi TF penciri umur garis tidak diubah dalam tetapan ini (Rajah S2C-S2F). Oleh itu, MTHFD2 diperlukan untuk CD4 maksimumtambah lagiPengaktifan sel T, percambahan, kelangsungan hidup, dan pengeluaran sitokin.
Untuk mengesahkan kesan farmakologi ini secara genetik, kami menghasilkan Mthfd2fl/flketegangan tetikus dan menyeberanginya dengan tikus transgenik Cd4- cre untuk mencapai pemadaman genetik bersyarat. Seperti yang dijangkakan, CD4 diaktifkantambah lagiSel T daripada Mthfd2fl/flCd4-cre plus (CD4ΔMthfd2) tikus mempunyai ekspresi MTHFD2 yang lebih rendah berbanding dengan sel dari Mthfd2fl/flCd4-cretambah lagi(jenis liar [WT]) bersepah (Rajah 2F). Pada peringkat awal, tikus CD4DMthfd2 mempunyai sedikit CD4tambah lagiSel T dalam limpa berbanding dengan WT (Rajah 2G). Selepas pengaktifan dan pembezaan in vitro, nombor sel dan daya maju CD4ΔMthfd2Sel Th17 dan, pada tahap yang lebih rendah, sel Treg adalah lebih rendah dengan ketara (Rajah 2H). Di samping itu, ekspresi CD25 telah menurun dalam sel Th17 dan Treg dan lebih rendah dalam sel Th1 (Rajah 2I). Akhirnya, CD4ΔMthfd2Sel Th1 dan Th17 mempunyai ekspresi T-bet dan ROR t yang lebih rendah, masing-masing. FoxP3 dalam sel Treg, bagaimanapun, tidak berubah (Rajah 2J). Walaupun terdapat perubahan dalam ekspresi TF, sel Teff yang membezakan menghasilkan jumlah sitokin yang normal (Rajah 2K). Perbezaan dalam keputusan antara pendekatan farmakologi dan genetik mungkin dikaitkan dengan masa dan kesempurnaan kehilangan fungsi enzim semasa pembangunan dan mekanisme pampasan yang berpotensi.
MTHFD2i mendorong ekspresi FoxP3 dalam sel Th17 dan meningkatkan pembezaan sel Treg
Memandangkan pergantungan sel Teff pada MTHFD2, kami menguji peraturan MTHFD2i sel FoxP3 dan Treg. Terutama, pengawalseliaan menyimpang yang disebabkan oleh rawatan MTHFD2i FoxP3 dalam Th1 dan lebih menonjol dalam sel Th17 dalam cara yang bergantung kepada dos (Rajah 3A). Ini juga berlaku apabila rawatan ditangguhkan sehingga 24 jam selepas pengaktifan (Rajah 3B). Trend yang sama diperhatikan dalam sel CD4DMthfd2 Th17 (Rajah 3C). Penyelarasan FoxP3 ini berfungsi kerana sel Th17 yang dirawat MTHFD2i memperoleh kapasiti menindas apabila dikultur bersama dengan CD8tambah lagisel T (Rajah 3D). Oleh itu, MTHFD2i boleh mempromosikan fenotip seperti sel FoxP3 dan Treg dalam sel Th17. MTHFD2i juga meningkatkan pembezaan sel Treg yang diinduksi. Sel Treg dibezakan dengan julat kepekatan faktor pertumbuhan b (TGF-b) yang berubah dengan kehadiran MTHFD2i. Pada setiap kepekatan yang diuji kecuali yang tertinggi, ekspresi FoxP3 meningkat dengan rawatan MTHFD2i (Rajah 3E dan 3F). Fenotip ini juga dikekalkan dengan rawatan MTHFD2i yang tertunda (Rajah 3G).
Rajah 3. Kekurangan MTHFD2 mendorong ekspresi FoxP3 dan menggalakkan peralihan ke arah fosforilasi oksidatif
(A) Ekspresi FoxP3 dalam sel Th1 dan Th17 yang dirawat MTHFD2i 72 jam selepas pengaktifan (min ± SD, ANOVA sehala, data mewakili tiga eksperimen bebas dengan 9 jumlah replika biologi).
( B ) Ekspresi FoxP3 dalam sel Th1 dan Th17 diaktifkan selama 24 jam dan kemudian dirawat dengan kenderaan atau 500 nM MTHFD2i selama 48 jam (min ± SD, ujian t tidak berpasangan, data mewakili tiga eksperimen bebas dengan 9 jumlah replika biologi).
(C) Ekspresi FoxP3 dalam sel Th1 dan Th17 dari WT dan CD4DMthfd2 littermates 72 jam selepas pengaktifan (min ± SD, ujian t tidak berpasangan, data mewakili tiga eksperimen bebas dengan 9 jumlah replika biologi).
(D) Ujian penindasan mengukur kapasiti penindasan menyimpang bagi sel Th17 yang dirawat MTHFD2i. Sel Th17 pra-rawatan telah dikultur bersama dengan sel CD8 ditambah T yang diwarnai CTV untuk mengukur percambahan apabila pengaktifan dengan antibodi anti-CD3 dan anti-CD28 (min ± SD, ANOVA sehala, n=3 replika biologi) .
(E) Ekspresi FoxP3 dalam sel Treg dibezakan dengan julat kepekatan TGF-b dan dirawat dengan MTHFD2i (min ± SD, ujian t tidak berpasangan, data mewakili tiga eksperimen bebas dengan 9 jumlah replika biologi).
(F) Plot sitometri aliran untuk data yang dijadualkan dalam (E).
(G) Ekspresi FoxP3 dalam sel Treg diaktifkan dan dibezakan dengan kepekatan rendah TGF-b selama 24 jam dan kemudian dirawat dengan MTHFD2i selama 48j (min ± SD, ujian t tidak berpasangan, data mewakili tiga eksperimen bebas dengan 9 jumlah replika biologi ).
(H) Ujian tekanan Mito Sel XF Kuda Laut dilakukan pada sel Th17 dan Treg yang dirawat MTHFD2i (min ± SD, n=3 replika biologi).(I) ECAR basal, OCR basal, OCR maks dan OCR/ECAR basal nisbah diukur dalam (H) (min ± SD, ujian t tidak berpasangan, data mewakili dua eksperimen bebas dengan 6 jumlah replika biologi). Keputusan yang signifikan secara statistik dilabelkan (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p peratus 0.001).
Sel Treg mempunyai metabolisme mitokondria yang lebih besar daripada sel Th17 (Michalek et al., 2011). Untuk menentukan akibat metabolik rawatan MTHFD2i, sel Th17 dan Treg dinilai oleh analisis fluks ekstraselular. MTHFD2i meningkatkan kadar penggunaan oksigen basal dan maksimum (OCR) sel Th17 untuk menunjukkan peralihan ke arah pernafasan mitokondria (Rajah 3H). Sebaliknya, sel Th17 dan Treg mempunyai kadar pengasidan ekstraselular basal (ECAR) yang menurun dengan rawatan MTHFD2i, mencadangkan pengurangan glikolisis (Rajah 3I). Nisbah basal OCR kepada ECAR telah meningkat dengan ketara dalam sel Th17 dan Treg kerana MTHFD2i mengalihkan program metabolik daripada glikolisis ke arah fosforilasi oksidatif. Data ini menunjukkan bahawa MTHFD2i meningkatkan ekspresi FoxP3 dalam sel Th17 dan sel Treg dibezakan di bawah keadaan TGF-b yang rendah dan mengalihkan sel Th17 kepada metabolisme seperti sel Treg yang lebih.
Kekurangan MTHFD2 dalam CD4 manusia ditambah sel T mengurangkan proliferasi dan daya maju sel Th17 sambil meningkatkan ekspresi FOXP3 dan melembapkan aktiviti mTORC1
Untuk menguji kebolehterjemahan penemuan di atas kepada sel manusia, CD4tambah lagiSel T yang diasingkan daripada darah periferal penderma yang sihat telah dibezakan secara in vitro kepada sel Th1, Th17, dan Treg dan dirawat dengan kenderaan atau MTHFD2i dari masa pengaktifan. Proliferasi telah menurun dengan ketara dalam sel Th17 dan Treg yang dirawat MTHFD2i (Rajah 4A), dan sel Th17 juga menunjukkan peningkatan apoptosis (Rajah 4B). Penurunan proliferasi dalam sel Th17 telah direkapitulasi dengan pendekatan genetik menggunakan RNA mengganggu kecil (siRNA) (Rajah 4C dan S2G). Sama seperti sel murine, ekspresi FOXP3 lebih tinggi dalam sel Th17 manusia yang dirawat MTHFD2i dan lebih tinggi dalam sel Treg manusia yang dirawat MTHFD2i (Rajah 4D dan S2H). Memandangkan paksi mTORC1-AMPK adalah penting untuk pembezaan sel Th17 dan Treg, fosforilasi protein ribosom sasaran mTORC1 S6 (fosfo-S6) juga diukur. Ini menunjukkan penurunan aktiviti mTORC1 dalam sel Th17 dengan MTHFD2i atau siMTHFD2 (Rajah 4E). Oleh itu, kehilangan kapasiti proliferatif dan induksi ekspresi FOXP3 dalam sel Th17 dan Treg boleh direkapitulasi dalam CD4 manusia primertambah lagisel T.
Rajah 4. Kekurangan MTHFD2 menjejaskan percambahan dan mendorong ekspresi FOXP3 dalam sel Th17 manusia
(A) Percambahan diukur oleh pencairan CTV dalam CD4 manusia ditambah subset sel T yang dirawat dengan kenderaan atau 2 mM MTHFD2i selama 72 jam selepas pengaktifan dengan antibodi anti-CD3 dan anti-CD28 (ujian t berpasangan, data mewakili tiga eksperimen bebas dengan 5 –6 penderma yang sihat).
( B ) Apoptosis diukur oleh Annexin V dalam CD4 manusia ditambah sel T yang dirawat dengan MTHFD2i selama 72 jam (ujian t berpasangan, data mewakili tiga eksperimen bebas dengan 5-6 penderma yang sihat).
(C) Ekspresi Ki-67 dalam CD4 manusia ditambah sel T yang ditransduksi dengan NTC atau siMTHFD2 (ujian t berpasangan, data mewakili tiga eksperimen bebas dengan 4 penderma pesakit yang sihat).
( D ) Ekspresi FOXP3 dalam CD4 manusia ditambah sel T yang dirawat dengan MTHFD2i selama 72 jam (ujian t berpasangan, data mewakili tiga eksperimen bebas dengan 6-10 penderma yang sihat).
(E) Perubahan dalam ekspresi fosfo-S6 dalam CD4 manusia ditambah sel T yang dirawat dengan MTHFD2i selama 72 jam atau ditransduksi dengan siMTHFD2 (min ± SD, satu sampel ujian t, wakil data tiga eksperimen bebas dengan 4-6 penderma yang sihat). Keputusan yang signifikan secara statistik dilabelkan (* p < 0.{{10}}5,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0.001,="" ****="" p="" peratus="">
Sel T bergantung pada fungsi enzimatik MTHFD2, dan fenotip boleh diselamatkan oleh produk
MTHFD2 diperlukan untuk penyelenggaraan kolam format mitokondria untuk sintesis purin (Ma et al., 2017) tetapi mungkin juga memainkan peranan bukan enzim. Menyokong aktiviti enzimatik penting, rawatan MTHFD2i membawa kepada pengambilan pampasan format dari medium dalam CD4 ditambah subset sel T (Rajah 5A). Unit 1C yang digunakan untuk sintesis format disediakan dengan penukaran serine kepada glisin, dan serin intraselular terkumpul manakala glisin telah habis dengan rawatan MTHFD2i dalam semua subset (Rajah 5B). Kepekatan metionin juga meningkat sedikit, menunjukkan perencatan kitaran metionin. Seperti yang dijangkakan, memandangkan langkah penukaran serine-glisin adalah huluan MTHFD2, perubahan ini tidak diselamatkan oleh penyediaan format dalam medium.
Rajah 5. Kesan MTHFD2i pada subset sel T diselamatkan oleh format eksogen
(A) Pengambilan format diukur dengan 1 spektroskopi resonans magnetik (MRS) H dalam CD4 ditambah subset sel T yang dirawat dengan kenderaan atau 500 nM MTHFD2i selama 72 jam selepas pengaktifan (min ± SD, ujian t tidak berpasangan, data mewakili dua eksperimen bebas dengan 6 jumlah replika biologi).
(B) Perubahan kepekatan serin, glisin dan metionin dalam CD4 ditambah sel T yang dirawat dengan 500 nM MTHFD2i atau 500 nM MTHFD2i ditambah 1 mM format selama 4-6 jam berbanding dengan kenderaan, diukur dengan spektrometri jisim (min ± SD, n { {8}} replika biologi).
(C) Kiraan sel hidup, daya maju, dan ekspresi CD25 dalam CD4 ditambah sel T yang dirawat MTHFD2i yang diselamatkan dengan format 1 mM atau 60 mM larutan adenine dan guanin purin selama 72 jam selepas pengaktifan (min ± SD, ANOVA sehala, data adalah mewakili tiga eksperimen bebas dengan 9 jumlah replika biologi).
(D) Kiraan sel hidup, daya maju dan ekspresi CD25 dalam sel T CD4 ditambah daripada rakan sampah WT atau CD4DMthfd2 yang diselamatkan dengan format atau purin selama 72 jam selepas pengaktifan (min ± SD, ANOVA sehala, n=3 replika biologi ).
Kami seterusnya menguji sama ada penambahan format atau larutan adenine dan guanine purin boleh menyelamatkan fungsi enzim yang kurang dan membalikkan kesan hiliran kekurangan MTHFD2. Sesungguhnya, format 1 mM memulihkan percambahan, daya maju, dan pengaktifan dalam sel yang dirawat MTHFD2i (Rajah 5C). Suplemen purin menyelamatkan percambahan dalam semua subset dan pengaktifan dalam sel Th1 dan Th17 tetapi tidak berdaya maju dalam semua subset dan pengaktifan dalam sel Treg. Formate juga menyelamatkan percambahan, daya maju dan pengaktifan dalam CD4ΔMthfd2sel T (Rajah 5D). Pengeluaran sitokin terjejas dalam sel Th1 dan Th17 yang dirawat MTHFD2i telah diterbalikkan kepada jumlah kenderaan dengan penambahan format atau purin (Rajah 5E). Terutama, penyelarasan yang menyimpang FoxP3 dalam sel Th17 telah diselamatkan oleh penambahan purin tetapi tidak diformat, manakala penambahan format dan purin mengurangkan ekspresi FoxP3 ke garis dasar dalam sel Treg yang dibezakan dengan kepekatan rendah TGF-b (Rajah 5F). Fenotip MTHFD2i nampaknya bergantung kepada penyelenggaraan MTHFD2 bagi format mitokondria atau kolam purin.
MTHFD2 mengawal aktiviti mTORC1 dan metilasi DNA dan histon dalam CD4tambah lagisel T
Dalam sel-sel kanser yang diabadikan, kekurangan MTHFD2 boleh menyebabkan pengumpulan perantaraan sintesis purin GAR, SAICAR dan AICAR, yang merupakan huluan 10-langkah pembentukan pengantaraan formylTHF (Ducker et al., 2016). CD4tambah lagiSubset sel T telah dibiakkan selama 72 jam sebelum pendedahan kepada MTHFD2i selama 4-6 jam. Rangka masa yang singkat ini dipilih untuk mengelakkan sebarang kesan sekunder, termasuk perubahan pampasan. Rawatan MTHFD2i sementara mengakibatkan pengumpulan GAR, SAICAR, dan AICAR dalam semua subset (Rajah 6A). Kesan ini diselamatkan sepenuhnya dengan penambahan format 1 mM, menyokong peranan enzimatik MTHFD2. Nukleotida dan nukleobes, termasuk guanin, juga telah habis oleh MTHFD2i dan diselamatkan oleh format dalam sel Th17 dan Treg (Rajah 6B).
Rajah 6. MTHFD2i menghasilkan pengumpulan perantaraan sintesis purin melembapkan aktiviti mTORC1 dan mengubah DNA dan metilasi histon
(A) Perubahan dalam kepekatan GAR, SAICAR, dan AICAR dalam CD4 ditambah sel T yang dirawat dengan 500 nM MTHFD2i atau 500 nM MTHFD2i ditambah 1 mM format selama 4-6 jam berbanding kenderaan, diukur dengan spektrometri jisim (min ± SD, satu- cara ANOVA, n=3 replika biologi).
(B) Perubahan dalam spesies metabolisme nukleotida dalam sel Th17 dan Treg dirawat dengan MTHFD2i dengan atau tanpa format selama 4-6 jam berbanding kenderaan, diukur dengan spektrometri jisim (n=3 replika biologi).
(C) Imunoblot phospho-S6, S6, Rheb, phospho-ACC, ACC, HIF-1a dan b-actin dalam CD4 ditambah sel T yang dirawat dengan MTHFD2i dengan atau tanpa format selama 72 jam selepas pengaktifan (data mewakili tiga eksperimen bebas dengan n=3 replika biologi).
(D) Perubahan dalam metabolit kitaran TCA dalam sel Th17 yang dirawat dengan MTHFD2i dengan atau tanpa format selama 6 jam berbanding kenderaan, diukur dengan spektrometri jisim (min ± SD, ANOVA sehala, n=3 replika biologi).
(E) Peta haba nisbah kawalan H3K27me3 kepada IgG dalam kawasan ±10-kb di sekitar penganjur gen yang diketahui UCSC dalam sel Th17 dan Treg yang dirawat dengan MTHFD2i, diukur dengan CUT&RUN (data dikumpulkan daripada 3 replika biologi).
(F) Peta haba kekerapan metilasi DNA median lokus Foxp3 oleh tapak CpG dalam sel Th1 dan Th17 yang dirawat dengan kenderaan atau 500 nM MTHFD2i dan dalam sel nTreg daripada rakan sampah WT atau CD4DMthfd2 (ujian Mood, n=3 replika biologi).
(G) Penjadualan (F) oleh promoter proksimal, promoter distal dan TSDR (ujian t berpasangan). Lihat juga Rajah S3 dan S4. Keputusan yang signifikan secara statistik dilabelkan (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0.001,="" ****="" p="" peratus="">
AICAR dan nukleotida ialah pengawal selia bagi paksi AMPK1-mTORC (Emmanuel et al., 2017; Kim et al., 2016). Sesungguhnya, ekspresi fosfo-S6 telah menurun dengan rawatan MTHFD2i dalam semua subset dan dipulihkan sepenuhnya dengan penambahan format (Rajah 6C dan S3A). Protein pengikat GTP Rheb, pengaktif wajib mTORC1, boleh menjadi sensitif terhadap ketersediaan guanin intraselular (Emmanuel et al., 2017), dan ekspresi Rheb telah dilembapkan dengan rawatan MTHFD2i (Rajah 6C dan S3B). AICAR ialah analog adenosin dan pengaktif AMPK (Rae dan Mairs, 2019; Su et al., 2019). Walau bagaimanapun, 72 jam selepas pengaktifan, fosforilasi AMPK atau sasarannya, acetyl-coenzyme A(CoA) carboxylase (phospho-ACC) dan Unc-51-like autophagy activating kinase (phospho-ULK1), tidak berubah dengan rawatan MTHFD2i (Rajah 6C, S3C dan S3D). Aktiviti mTORC1 menggalakkan Th17 dan melemahkan pembezaan sel Treg sebahagiannya melalui induksi metabolisme glikolitik yang bergantung kepada HIF-1a (Shi et al., 2011). Selaras dengan ini, ungkapan HIF-1dikurangkan dalam sel Th17 yang dirawat MTHFD2i dan CD4DMthfd2 Th17 (Rajah 6C, S3E dan S3F). Perubahan dalam aktiviti mTORC1 ini tidak dikaitkan dengan sebarang defisit dalam isyarat TCR, seperti yang diukur oleh ekspresi Nur77 dengan dan tanpa rangsangan semula (Rajah S3G). Transduser isyarat dan pengaktif aktiviti transkripsi 3 (STAT3), yang penting untuk pembangunan sel Th17, tidak berubah atau meningkat secara sederhana dengan rawatan MTHFD2i (Rajah S3H). Pengurangan aktiviti mTORC1 dan peralihan daripada glikolisis ke arah fosforilasi oksidatif dengan rawatan MTHFD2i mencadangkan perubahan dalam banyaknya metabolit kitaran asid trikarboksilik (TCA). Kepekatan suksinat dan fumarat telah dikurangkan dengan ketara oleh MTHFD2i tetapi diselamatkan oleh format (Rajah 6D).
Metabolit TCA dikenali sebagai perencat DNA dan histon demetilase (Su et al., 2016), dan penyusutan kolam suksinat dan fumarat mungkin menyokong keadaan hipometilasi. Tri-metilasi H3K27 (H3K27me3) merentasi genom diukur dengan penjujukan CUT&RUN (pembelahan di bawah sasaran dan pelepasan menggunakan nuklease) (Skene dan Henikoff, 2017). Sesungguhnya, sel Th17 yang dirawat MTHFD2i telah mengurangkan H3K27me3 berbanding dengan kenderaan (Rajah 6E dan S4A). Metilasi DNA di lokus Foxp3 juga diukur dengan penjujukan bisulfat untuk menentukan sama ada metilasi pembezaan menyumbang kepada regulasi FoxP3 yang disebabkan oleh MTHFD2i. Walaupun beberapa lokus CpG berbeza dalam kekerapan metilasi antara kenderaan dan keadaan MTHFD2i, tidak ada corak yang dapat dilihat dalam kawasan demetilasi khusus sel Treg (TSDR). Terdapat juga tiada perbezaan antara sel nTreg (CD4 plus CD25 plus) yang diasingkan daripada tikus WT dan CD4DMthfd2 (Rajah 6F), walaupun ketulenan setiap populasi yang diperkaya adalah rendah (Rajah S4B). Walau bagaimanapun, terdapat penurunan ketara dalam kekerapan metilasi DNA ke atas kawasan promoter proksimal Foxp3 dalam sel Th17 yang dirawat MTHFD2i berbanding dengan kenderaan (Rajah 6G), menunjukkan kemungkinan peningkatan transkripsi dengan MTHFD2i.
Di samping mengekalkan kumpulan format intraselular, aktiviti MTHFD2 menyumbang kepada keseimbangan redoks selular melalui penukaran NADtambah lagikepada NADH dan NADPtambah lagikepada NADPH (Shin et al., 2017) dan sokongan laluan transsulfurasi dan sintesis glutation berikutnya. Sel Th17 yang dirawat MTHFD2i telah menurunkan kepekatan NADtambah lagi, NADH, NADPtambah lagi, dan NADPH, yang telah diselamatkan dengan format (Rajah S4C). Walau bagaimanapun, NADtambah lagi/NADH dan NADPtambah lagiNisbah /NADPH tidak berubah mengikut keadaan. Ini, digabungkan dengan kekurangan perubahan dalam spesies oksigen reaktif selular (ROS) dan superoksida mitokondria (Rajah S4D), mencadangkan bahawa perubahan dalam keadaan redoks tidak mungkin menjadi penyumbang utama kepada fenotip MTHFD2i.
Kekurangan MTHFD2 dalam vivo mengurangkan keterukan pelbagai penyakit keradangan
Keberkesanan MTHFD2 sebagai sasaran terapeutik seterusnya diuji dalam model hipersensitiviti jenis tertunda (DTH) yang bergantung kepada sel in vivo T. Tikus telah diimunisasi dan dicabar pada telinga dengan hemocyanin limpet lubang kunci (KLH) untuk menyebabkan keradangan tempatan dan dirawat dengan kenderaan oral atau MTHFD2i. Rawatan tidak menunjukkan ketoksikan yang nyata kerana haiwan mengekalkan berat badan mereka (Rajah S5A). Yang penting, ketebalan dan berat telinga meningkat dalam tikus DTH kawalan tetapi tidak pada haiwan yang dirawat dengan perencat, menunjukkan perlindungan daripada keradangan semasa rawatan MTHFD2i (Rajah 7A, 7B, dan S5B). Imunoglobulin G (IgG) khusus KLH juga dikurangkan pada dos perencat tertinggi, menunjukkan kesan berpotensi meluas ke fungsi sel B (Rajah 7C).
Rajah 7. Menyasarkan MTHFD2 dalam vivo mengurangkan keterukan penyakit dalam model DTH, EAE dan IBD
(A dan B) Telinga (A) ketebalan relatif dan (B) berat biopsi 10 hari selepas KLH dengan imunisasi CFA dan 3 hari selepas cabaran KLH untuk mendorong DTH (ANOVA sehala). Tikus dirawat dua kali sehari dengan oral 0, 100, atau 300 mg/kg MTHFD2i (min ± SEM, n=8 replika biologi).
(C) Kepekatan IgG khusus KLH pada hari ke-10 DTH akibat KLH (min ± SEM, ujian Kruskal-Wallis, n=8 replika biologi).
(D) Purata skor klinikal dari semasa ke semasa dalam WT dan CD4DMthfd2 littermates yang diimunisasi dengan MOG dengan CFA dan PTX untuk mendorong EAE (min ± SEM, pelbagai ujian Mann-Whitney, data mewakili dua eksperimen bebas, masing-masing dengan 5 replika biologi).
(E) Kiraan sel dan kekerapan sel CD4 ditambah T dalam saraf tunjang tikus EAE pada tahap keterukan penyakit puncak (min ± SEM, ujian t tidak berpasangan, data mewakili dua eksperimen bebas dengan 9 jumlah replika biologi).
(F) Ekspresi CD25 dan CD44 dalam CD4 ditambah sel T daripada saraf tunjang tikus EAE (min ± SEM, ujian t tidak berpasangan, n=4 replika biologi).
(G dan H) Kiraan sel bagi (G) T-bet tambah , RORgt tambah , FoxP3 tambah , FoxP3 tambah /T-pertaruhan tambah nisbah, FoxP3 tambah /RORgt tambah nisbah dan (H) IL-17 tambah , IFNg tambah , dan IL-17 tambah IFNg tambah CD4 tambah sel T daripada saraf tunjang tikus EAE (min ± SEM, ujian t tidak berpasangan, data mewakili dua eksperimen bebas dengan 9 jumlah replika biologi).
(I) Pewarnaan H&E, anti-CD3 IHC, dan Luxol Fast Blue (LFB) untuk myelin dalam saraf tunjang tikus WT tanpa imunisasi dan WT dan CD4DMthfd2 littermates dengan EAE pada penyakit puncak (pembesaran 2003, mewakili 5 replika biologi ).
(J) Perubahan berat badan mengikut masa Rag1__/__tikus menyuntik ip dengan sel CD4 tambah T naif WT atau CD4DMthfd2 untuk mendorong kolitis IBD (min ± SEM, ujian t berbilang, n=8 replika biologi).
(K dan L) Kiraan sel bagi (K) jumlah CD4 tambah sel T dan (L) T-bet tambah , RORgt tambah , dan FoxP3 tambah CD4 tambah sel T daripada MLN tikus IBD (min ± SEM, ujian t tidak berpasangan n { {4}} replika biologi). Lihat juga Rajah S5 dan S6. Keputusan yang signifikan secara statistik dilabelkan (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0.001,="" ****="" p="" peratus="">
Begitu juga, perencat dwi MTHFD1/2 LY345899 (Gustafsson et al., 2017) adalah berkhasiat dalam memulihkan penyakit dalam model EAE. EAE diinduksi dengan MOG dan PTX, dan tikus dirawat setiap hari dengan suntikan intraperitoneal (ip) DMSO atau LY345899. Rawatan perencat membawa kepada pengurangan keterukan penyakit dan skor klinikal kumulatif dengan ketara berbanding dengan kenderaan (Rajah S5C dan S5D). Tikus telah dikorbankan pada hari ke-26, dan sel-sel penyusupan saraf tunjang dikumpulkan untuk profil imun. Terutama, CD45 yang jauh lebih sedikittambah lagi, CD4tambah lagi, dan CD8tambah lagisel menyusup ke saraf tunjang tikus yang dirawat LY345899-(Rajah S5E–S5G). Tiada perubahan dalam kekerapan ROR ttambah lagiatau FoxP3tambah lagisel di antara CD4 yang menyusuptambah lagisel T (Rajah S5H). Walau bagaimanapun, terdapat penurunan dalam kekerapan sel IFNg tambah IL-17 tambah dan peningkatan dalam sel IL-17 tambah (Rajah S5I), mencadangkan kemungkinan penukaran kepada fenotip yang kurang patogenik.
Untuk menguji secara langsung pergantungan sel-intrinsik T pada MTHFD2 dalam vivo, WT dan CD4DMthfd2 littermates tertakluk kepada tiga model berbeza: EAE, penyakit radang usus (IBD), dan penyakit saluran pernafasan alahan. EAE sekali lagi diinduksi dengan MOG dan PTX, dan, sama dengan eksperimen perencat, tikus CD4DMthfd2 telah mengurangkan keterukan penyakit dengan ketara selama 26 hari (Rajah 7D). Kohort berasingan telah dimatikan pada penyakit puncak pada hari ke-15 selepas induksi untuk fenotaip sel T (Rajah S6A dan S6B). Walaupun CD4tambah lagiatau CD8tambah lagiKiraan sel T tidak berubah dalam limpa (Rajah S6C), penyusupan sel T CD4 ditambah ke dalam saraf tunjang telah menurun dengan ketara (Rajah 7E). CD4 ditambah sel T yang menyusup saraf tunjang dalam tikus CD4DMthfd2 mempunyai ekspresi CD25 yang sama seperti WT tetapi mengurangkan ekspresi CD44, menunjuk kepada pengaktifan terjejas sebahagiannya (Rajah 7F). Nombor T-bettambah lagi, sel ROR t plus dan FoxP3 plus (Rajah 7G), serta sel IL-17 plus dan IFNg plus (Rajah 7H), juga dikurangkan dalam saraf tunjang tikus CD4DMthfd2 berbanding dengan WT. Terutama, nisbah FoxP3 plus kepada T-bet plus dan RORgt plus sel telah dinaikkan dalam CD4DMthfd2 tikus berbanding dengan WT pada penyakit puncak, mencerminkan penemuan in vitro peningkatan ekspresi FoxP3 dengan kekurangan MTHFD2 (Rajah 7G). Walaupun kekerapan TF mengekspresikan sel di kalangan sel yang menyusup secara keseluruhan lebih tinggi, kekerapan ekspresi sitokin tidak berubah (Rajah S6D dan S6E). Histologi saraf tunjang tikus kawalan tanpa EAE dan WT dan CD4ΔMthfd2tikus dengan EAE menunjukkan peningkatan selular dan positif CD3 dalam saraf tunjang dalam tikus WT yang dikaitkan dengan demielinasi, seperti yang ditunjukkan oleh pewarnaan Luxol Fast Blue (Rajah 7I). Perubahan ini tidak terdapat dalam kawalan no-EAE dan CD4ΔMthfd2tikus.
Peranan MTHFD2 seterusnya diuji dalam IBD dan model penyakit saluran pernafasan alahan. WT dan CD4DMthfd2 naif CD4 ditambah sel T telah dipindahkan ke Rag1 / penerima untuk memulakan IBD. Walaupun tikus yang menerima sel WT mula menurunkan berat badan apabila IBD berkembang, penerima sel T CD4DMthfd2 terus bertambah berat (Rajah 7J). Bilangan dan kekerapan sel T CD4DMthfd2 yang lebih sedikit didapati dalam limpa (Rajah S6F) dan nodus limfa mesenterik (MLN) yang mengalirkan kolon (Rajah 7K dan S6G). Bilangan sel T-bet tambah , ROR t tambah dan FoxP3 tambah CD4DMthfd2 sel T juga berkurangan dalam MLN, tetapi kekerapan sel FoxP3 tambah telah meningkat (Rajah 7L dan S6H). Walau bagaimanapun, tiada perbezaan dalam nisbah kiraan sel FoxP3/T-bet dan FoxP3/RORgt dalam MLN pada titik masa peringkat akhir ini (Rajah S6I). Sama seperti penemuan MTHFD2 sebagai serangan sederhana dalam skrin CRISPR keradangan saluran udara in vivo (Rajah 1C), tikus CD4DMthfd2 yang mengalami penyakit saluran pernafasan alahan yang disebabkan oleh Alternaria mempunyai trend penurunan jumlah neutrofil dalam cecair lavage bronchioalveolar (BALF), walaupun tidak perubahan diperhatikan dalam bilangan limfosit BALF, eosinofil, dan makrofaj (Rajah S7A).
Akhirnya, kesan MTHFD2i telah diuji pada aktiviti imun umum. OT-II khusus OVA CD45.2tambah lagiCD4tambah lagiSel T telah diterima pakai ke dalam CD45.1tambah lagitikus, yang kemudiannya diimunkan secara subkutan dengan emulsi OVA dengan adjuvant Freund (CFA) lengkap dan dirawat setiap hari dengan kenderaan lisan atau MTHFD2i. Berat badan tidak berubah dalam semua keadaan (Rajah S7B). Pengembangan OT-II CD45.2 yang dipindahkantambah lagisel telah ditangguhkan sedikit dalam tikus yang dirawat MTHFD2i yang diimunisasi tetapi mencapai nombor kenderaan pada hari ke-7 (Rajah S7C-S7E). Walau bagaimanapun, kekerapan sel IFNg tambah telah dikurangkan dalam penyaliran LN (Rajah S7F). Data ini menunjukkan bahawa rawatan in vivo MTHFD2i membenarkan pengembangan sel T khusus antigen berikutan rangsangan akut, walaupun dengan pengeluaran sitokin keradangan yang lembap.
PERBINCANGAN
Pengaktifan, pembezaan dan fungsi sel T memerlukan pengaturcaraan semula metabolik yang sesuai untuk memenuhi permintaan sel yang meningkat untuk tenaga, blok binaan biosintetik dan molekul isyarat. Dalam kajian ini, kami menyiasat fungsi metabolisme 1C dalam sel T CD4 plus primer. Menggunakan gabungan data pemeriksaan berasaskan CRISPR dan data ekspresi gen sel T primer in vivo, MTHFD2 dikenal pasti sebagai sasaran berpotensi untuk terapi anti-radang. Perencatan atau kekurangan MTHFD2 secara amnya menyebabkan penurunan CD4 ditambah percambahan sel T. Terutama, ini dikaitkan dengan induksi ekspresi FoxP3 dan fungsi menindas dalam sel Th17 serta pembezaan sel Treg yang dipertingkatkan. Data ini mencadangkan bahawa MTHFD2 mungkin berfungsi sebagai pusat pemeriksaan metabolik dalam paksi sel Th{10}}Treg, dengan rawatan MTHFD2i menjahit keseimbangan daripada fenotip patogen kepada lebih anti-radang. Sesungguhnya, perencatan MTHFD2 atau kekurangan genetik memperbaiki keterukan penyakit dalam pelbagai model in vivo autoimun dan hipersensitiviti.
Metabolisme 1C terdiri daripada metabolisme serine-glisin, kitaran folat, dan kitaran metionin dan merupakan pusat kepada beberapa proses, termasuk sintesis purin de novo, penjanaan penderma metil, dan peraturan redoks (Yang dan Vousden, 2016). Metabolisme 1C terlibat dengan stimulasi TCR (Tan et al., 2017) dan diperlukan untuk menyokong pengembangan sel T (Ma et al., 2017). Kitaran folat dibahagikan kepada komponen sitosol dan mitokondria. Dalam sitosol, MTHFD1 menukar 5,10-methyleneTHF, 10-formylTHF dan formate. Dalam mitokondria, tindak balas yang sama dicapai oleh MTHFD2 dan MTHFD1L. Perantaraan yang terhasil ini digunakan untuk menyokong langkah pembentukan dalam sintesis purin de novo. MTHFD1 dan MTHFD2 juga boleh memodulasi keadaan redoks melalui penjanaan NAD(H) dan NADP(H) (Ducker dan Rabinowitz, 2017). Walaupun sesetengah jenis sel memaparkan fleksibiliti dalam beralih kepada sumber sitosolik di bawah tetapan disfungsi laluan mitokondria (Ducker et al., 2016), sel T telah dicadangkan sebelum ini untuk bergantung terutamanya pada laluan mitokondria untuk menyediakan unit 1C dan spesies reduktif (Ron- Harel et al., 2016). Sel T juga telah ditunjukkan bergantung pada pengambilan serin, dan tindak balas imun in vivo boleh dimodulasi oleh jumlah serin diet. Kesan kebuluran serin dimediasi dengan mengehadkan biosintesis purin walaupun dengan kehadiran laluan penyelamat yang utuh dan boleh dipintas dengan penyediaan glisin dan format (Ma et al., 2017). Data kami menambah penemuan ini dan menunjuk kepada MTHFD2 sebagai pengawal selia kritikal yang mempengaruhi CD4tambah lagiPembiakan dan pembezaan sel T.
Echanicoside
Walaupun metabolisme 1C memainkan peranan yang luas dalam metabolisme sel, kami mendapati bahawa beberapa fungsi adalah berbeza untuk memilih subset sel T. Semua sel T manusia dan tetikus membiak ke tahap yang lebih rendah dengan kekurangan MTHFD2, menunjukkan fungsi bersama untuk MTHFD2 untuk menyokong pertumbuhan dan pembahagian sel T. Kesan kekurangan MTHFD2 pada pembezaan sel T dan fungsi effector, bagaimanapun, berbeza dalam setiap subset yang diuji. Sel Th1 menunjukkan pembezaan terjejas dengan pengurangan induksi T-bet dan penurunan pengeluaran sitokin. Sel Th17 juga telah mengubah pembezaan dan mengurangkan pengeluaran sitokin. Walaupun ROR t tidak diubah, sel Th17 yang kekurangan MTHFD2-menimbangi sel Treg TF FoxP3 dan memperoleh keupayaan untuk menyekat pembiakan sel T CD8 ditambah T yang diaktifkan. Sel Treg mempamerkan pembezaan yang dipertingkatkan di bawah keadaan TGF-b yang rendah. Kini diketahui dengan jelas bahawa setiap subset ini boleh mempunyai keperluan metabolik yang berbeza (Batug et al., 2018; Buck et al., 2015). Data kami menunjukkan bahawa MTHFD2 juga diperlukan secara selektif untuk sel Teff sambil mempromosikan nasib dan fungsi sel Treg. Adalah ketara bahawa hasil ini berbeza daripada kekurangan GLUT1, GLS, atau ASCT2 yang menjejaskan atau mengubah pembezaan sel Teff sambil mempunyai kesan sederhana untuk mempromosikan secara langsung pembezaan sel Treg atau transdifferentiasi Th17 kepada sel Treg (Johnson et al., 2018; Macintyre et al. ., 2014; Nakaya et al., 2014).
Nasib sel T yang berbeza ini nampaknya bergantung kepada aktiviti enzimatik MTHFD2 kerana kesan kekurangan MTHFD2 telah diselamatkan dengan format atau nukleobes purin. Walaupun kami mendapati tiada kesan ketara keseimbangan redoks yang diubah dengan kekurangan MTHFD2, sintesis purin de novo yang diubah nampaknya kritikal. Rawatan MTHFD2i membawa kepada penurunan kepekatan purin, terutamanya guanin sambil mendorong pengumpulan perantaraan sintesis purin GAR, SAICAR, dan AICAR. Perantaraan ini memerlukan pembentukan untuk biosintesis selanjutnya, dan kesannya telah diselamatkan apabila format metabolit terbitan MTHFD{4}} ditambahkan pada medium, menyokong mekanisme biokimia pada sasaran untuk MTHFD2i. Sintesis nukleotida de novo untuk menyokong sintesis DNA dan RNA adalah penting untuk percambahan sel T (Que' me' neur et al., 2003, 2004). Oleh itu, komponen mekanisme yang mana MTHFD2i menjejaskan pengembangan sel T nampaknya adalah penjanaan nukleotida yang tidak mencukupi.
Flavonoid
Kegagalan untuk mensintesis nukleotida yang mencukupi boleh menyekat sel T effector melalui pelbagai mekanisme. AMPK dan mTORC1 adalah pemacu utama pengaturcaraan semula metabolik dengan peranan yang secara amnya bertentangan dalam sel Teff dan Treg (Bantug et al., 2018; Buck et al., 2015). Kami menunjukkan bahawa rawatan MTHFD2i dalam sel T membawa kepada pengumpulan akut AICAR, metabolit yang terkenal sebagai analog adenosin dan pengaktif AMPK (Rae dan Mairs, 2019; Su et al., 2019). Walau bagaimanapun, tiada bukti peningkatan aktiviti AMPK pada titik masa yang dipilih. Ini mungkin mencerminkan peraturan tambahan AMPK, tetapi AICAR juga boleh mempunyai kesan bebas AMPK (Dembitz et al., 2019). mTORC1 juga sensitif terhadap kepekatan purin kerana ketersediaan guanin yang berkurangan menyekat aktiviti pengaktif mTORC1 Rheb (Emmanuel et al., 2017; Hoxhaj et al., 2017). Pengumpulan dan pengurangan AICAR dalam aktiviti mTORC1 mungkin menyumbang kepada penjanaan terjejas sel Th1 dan Th17 yang dirawat MTHFD2i dan penjanaan sel Treg yang dipertingkatkan. Penindasan isyarat mTORC1 juga boleh menyumbang kepada peralihan dalam program metabolik daripada glikolisis kepada respirasi mitokondria dan kelimpahan metabolit TCA yang diubah dalam sel Th17 yang dirawat MTHFD2i. Laluan mTORC1 memainkan peranan penting dalam menggalakkan metabolisme anabolik dan boleh memacu pengumpulan TF ATF4, yang seterusnya, boleh mendorong ekspresi MTHFD2 (Ben-Sahra et al., 2016).
Fluks metabolik terikat kepada peraturan epigenetik kerana metabolit menyumbang kepada banyak pengubahsuaian epigenetik (Sharma dan Rando, 2017), termasuk metabolisme 1C untuk menjana penderma metil universal S-adenosyl methionine (SAM) untuk protein dan metilasi DNA. Eksperimen pengesanan karbon dalam sel T yang diaktifkan, bagaimanapun, mencadangkan bahawa unit 1C yang diperoleh daripada serin yang berasal dari glukosa dan eksogen tidak menyumbang secara bermakna kepada kitaran metionin dan metilasi (Ma et al., 2017). Fluks metabolik juga boleh menjejaskan corak metilasi melalui perubahan dalam banyaknya metabolit TCA, termasuk alfa-ketoglutarat, fumarat, dan suksinat. Secara khusus, fumarat dan suksinat menghalang DNA dan histon demetilase (Su et al., 2016). Selaras dengan kekurangan metabolit ini dalam sel Th17 yang dirawat MTHFD2i, H3K27me3 dikurangkan secara meluas merentasi genom, dan metilasi DNA dikurangkan secara khusus pada promoter proksimal Foxp3, yang mungkin menyumbang kepada fenotip transdifferentiation. Fenotip transdifferentiation sel Th17 tidak diselamatkan oleh suplemen format, menunjukkan bahawa laluan tambahan mungkin menyumbang kepada peraturan FoxP3, seperti melalui aktiviti mekanisme penderiaan kepekatan nukleotida lain.
Acteoside(Verbascoside)
MTHFD2 juga telah dilaporkan memainkan peranan bukan enzim yang mungkin menyumbang kepada tindakan pro-radang enzim ini. Dalam sel kanser, MTHFD2 boleh mempunyai fungsi nuklear, penyetempatan bersama dengan tapak replikasi DNA untuk menggalakkan perkembangan kitaran sel (Gustafsson Sheppard et al., 2015). Dalam sel stem murine, MTHFD2 telah ditunjukkan untuk memodulasi pembaikan DNA untuk mengekalkan kestabilan genomik (Yue et al., 2020). Dalam karsinoma sel renal, MTHFD2 didapati penting untuk pemrograman semula metabolik melalui metilasi mRNA (Green et al., 2019). Walaupun peranan MTHFD2 ini tidak saling eksklusif dengan penemuan kami, keupayaan format untuk menyelamatkan banyak fenotip kekurangan MTHFD2 dalam sel T menunjukkan bahawa aktiviti enzimatik MTHFD2 adalah pemacu utama percambahan dan nasib sel T.
MTHFD2 sebahagian besarnya telah dianggap sebagai sasaran dadah dalam tetapan anti-kanser. Ia juga boleh menjadi sasaran anti-radang yang menjanjikan dan menawarkan kesan buruk yang lebih sedikit berbanding dengan anti-folat yang tersedia pada masa ini, memandangkan ekspresi rendah dalam kebanyakan tisu dewasa. Sebagai contoh, satu sasaran MTX, DHFR, dinyatakan secara meluas dalam tisu dewasa (Nilsson et al., 2014). Oleh itu, MTX boleh dikaitkan dengan pelbagai kesan buruk, termasuk ketoksikan gastrousus. Selain itu, mekanisme tindakan MTX masih kurang difahami walaupun sejarahnya yang luas (Cronstein dan Aune, 2020). Ekspresi MTHFD2 yang sangat terkawal dan potensi redundansi dengan laluan MTHFD1 sitosol boleh mengakibatkan pergantungan terpilih populasi sel tertentu pada MTHFD2. Penemuan kami mengenal pasti MTHFD2 sebagai pusat pemeriksaan metabolik kritikal dalam CD4tambah lagisel T. Walaupun terdapat pertindihan yang luas antara biologi sel kanser dan biologi sel T yang berkembang pesat, kami mendapati bahawa CD4 ditambah subset sel T memaparkan sensitiviti tambahan melalui modulasi pembezaan dan fungsi sel. Berkemungkinan menyasarkan MTHFD2 dalam terapi kanser boleh menghalang imuniti anti-tumor. Walau bagaimanapun, tetapan seperti karsinoma kolorektal, di mana keradangan pengantaraan sel Th17 menyumbang kepada penyakit, mungkin sesuai untuk MTHFD2is. Kepekaan sel T kepada MTHFD2is mungkin merupakan bentuk imunoterapi yang berkesan dalam tetapan CD4tambah lagiKeradangan yang didorong oleh sel T melangkaui kanser dan membawa kepada kesan buruk yang lebih sedikit daripada agen terapeutik yang tersedia pada masa ini.
Batasan pengajian
MTHFD2i yang digunakan dalam kajian ini mempunyai nilai IC50 0.0063 mM untuk MTHFD2 dan 0.57 mM untuk MTHFD1; oleh itu, kesan luar sasaran kecil dari perencatan dwi MTHFD2 dan MTHFD1 tidak boleh dikecualikan. Memandangkan regulasi FoxP3 yang menyimpang dalam sel Th17 tidak diselamatkan dengan penyediaan format tetapi aktiviti mTORC1 adalah, mekanisme yang mendasari fenotip ini memerlukan penyiasatan lanjut. Selain itu, semua model in vivo dilakukan dengan rawatan MTHFD2i atau ablasi genetik dari masa induksi penyakit, dan fenotip sel T dilakukan pada satu titik masa. Untuk mencirikan kesan kekurangan MTHFD2 dengan lebih baik terhadap patogenesis penyakit, kajian lanjut perlu memasukkan eksperimen kursus masa dengan pencirian bersiri populasi sel T untuk menentukan dengan lebih pasti sama ada subset sel CD4 ditambah T dipengaruhi secara berbeza dalam vivo. Akhir sekali, untuk menambah baik kaitan kajian ini dengan aplikasi klinikal, keberkesanan rawatan MTHFD2i yang dimulakan selepas permulaan penyakit harus diuji.
STAR★KAEDAH
Kaedah terperinci disediakan dalam versi dalam talian kertas ini dan termasuk yang berikut:
JADUAL SUMBER UTAMA
KESEDIAAN SUMBER
B Hubungan utama
B ketersediaan bahan
B Ketersediaan data dan kod
MODEL EKSPERIMEN DAN BUTIRAN SUBJEK
B Tikus B Sel T manusia
Garisan Sel B
BUTIRAN KAEDAH
B tetikus in vitro CD4tambah lagiPengaktifan dan pembezaan sel T
Ujian penindasan sel B Th17
B CD4 manusia in vitrotambah lagiKeadaan kultur sel T
B Pemeriksaan CRISPR B Metabolomik spektrometri jisim
B Spektroskopi resonans magnetik nuklear Proton (1H-MRS)
B Immunoblotting
B CUT&RUN B EpigenDx Sasaran NextGen Bisulfifite Sequencing
B Model EAE in vivo untuk IHC dan sitometri aliran
B Rawatan in vivo LY345899 dalam model EAE
B Rawatan in vivo DS18561882 dalam model DTH B Model IBD in vivo dengan WT dan CD4ΔMthfd2bersepah
B Model penyakit saluran pernafasan alahan in vivo dengan WT dan CD4ΔMthfd2bersepah
B Rawatan in vivo DS18561882 dalam model imunisasi OVA
KUANTIFIKASI DAN ANALISIS STATISTIK
MAKLUMAT TAMBAHAN
Maklumat tambahan boleh didapati dalam talian di https://doi.org/10.1016/j. imun.2021.10.011.
PENGHARGAAN
Kami mengucapkan terima kasih kepada ahli makmal Rathmell kerana menyumbang kepada projek ini. Kami berterima kasih kepada Thomas Aune kerana menyediakan data RNA-seq dan J. Cools (VIB) kerana menyediakan binaan pMx-U6-gRNA-GFP. Kami berterima kasih kepada Max R. Van Belkum kerana mereka bentuk primer qPCR MTHFD2. Kami berterima kasih kepada Nello Mainolfifi, Vipin Suri, Adam Friedman dan Mark Manfredi daripada Raze Therapeutics, Inc. (Boston, MA) kerana menyediakan kompaun Raze 1459, yang digunakan untuk menyokong penemuan (data tidak ditunjukkan). Gambar rajah dicipta dengan BioRender. Kami mengiktiraf Sumber Dikongsi Patologi Terjemahan, disokong oleh geran sokongan Pusat Kanser NCI/NIH 5P30 CA68485-19 dan geran instrumentasi dikongsi S10 OD023475-01A1, untuk Leica Bond RX. Kerja ini disokong oleh William E. Paul Distinguished Innovator Award untuk Lupus Research Alliance (kepada JCR), R01s DK105550 (kepada JCR), HL136664 (kepada JCR dan DCN), CA217987 (kepada JCR), AI153167 (kepada JCR), AI137075 (kepada AKM), T32 DK101003 (KV), dan T32 GM007347 (kepada AS).
SUMBANGAN PENULIS
AS, GA dan JCR mereka bentuk penyelidikan. AS, GA, KV, DRH, XX, MZM, XY, KLB, NC, MMW, ACY, DLG, AES, SKS, SNF, AMC, PF, TB dan JCG-C. melakukan penyelidikan. AS, GA, XY, JK, DCN, AKM, JDR dan JCR menganalisis data. AS dan JCR menulis kertas itu dengan sumbangan daripada pengarang lain.
PENGISYTIHARAN KEPENTINGAN
JCR ialah pengasas, ahli lembaga penasihat saintifik, dan pemegang saham Sitryx Therapeutics; ahli lembaga penasihat saintifik dan pemegang saham Caribou Biosciences; ahli lembaga penasihat saintifik NirogyTherapeutics; telah berunding untuk Merck, Pfizer dan Mitobridge dalam tempoh 3 tahun yang lalu; dan telah menerima sokongan penyelidikan daripada Incyte Corp., CalitheraBiosciences, dan Tempest Therapeutics. JDR ialah pengasas bersama dan pemegang saham dalam Raze Therapeutics, Toran, Serien Therapeutics, dan Farber Partners serta penasihat dan pemegang saham dalam Agios Pharmaceuticals, Kadmon Pharmaceuticals, Bantam Pharmaceuticals, Colorado Research Partners, RafaelHoldings, Barer Institute dan LEAF Pharmaceuticals; beliau telah menerima yuran perundingan dan pembiayaan penyelidikan daripada Pfizer dan Rafael dan merupakan pencipta paten yang dipegang oleh Universiti Princeton. AMC, PF, dan TB ialah pekerja Sitryx Therapeutics.
KEMASUKAN DAN KEPELBAGAIAN
Kami berusaha untuk memastikan keseimbangan seks dalam pemilihan subjek bukan manusia. Seorang atau lebih daripada pengarang kertas ini mengenal pasti sendiri sebagai etnik minoriti yang kurang diwakili dalam sains. Sambil memetik rujukan yang relevan secara saintifik untuk kerja ini, kami juga berusaha secara aktif untuk mempromosikan keseimbangan jantina dalam senarai rujukan kami. Senarai pengarang kertas ini termasuk penyumbang dari lokasi di mana penyelidikan dijalankan yang mengambil bahagian dalam pengumpulan data, reka bentuk, analisis, dan/atau tafsiran kerja.
RUJUKAN
Anderson, GR, Musim Sejuk, PS, Lin, KH, Nussbaum, DP, Cakir, M., Stein, EM, Soderquist, RS, Crawford, L., Leeds, JC, Newcomb, R., et al. (2017). Landskap Kerjasama Terapeutik dalam Kanser Mutant KRAS Mendedahkan Prinsip untuk Mengawal Evolusi Tumor. Sel Rep. 20, 999–1015.
Aune, TM, Crooke, PS, ke-3, Patrick, AE, Tossberg, JT, Olsen, NJ dan Spurlock, CF, ke-3 (2017). Ungkapan RNA bukan pengekodan yang panjang dalam autoimun dan kaitan dengan fungsi penambah dan varian genetik risiko penyakit autoimun. J. Autoimun. 81, 99–109.
Bantug, GR, Galluzzi, L., Kroemer, G., and Hess, C. (2018). Spektrum metabolisme sel T dalam kesihatan dan penyakit. Nat. Rev. Immunol. 18, 19–34. Ben-Sahra, I., Hoxhaj, G., Ricoult, SJH, Asara, JM, dan Manning, BD (2016). mTORC1 mendorong sintesis purin melalui kawalan kitaran tetrahydrofolate mitokondria. Sains 351, 728–733.
Brown, PM, Pratt, AG dan Isaacs, JD (2016). Mekanisme tindakan methotrexate dalam arthritis rheumatoid, dan pencarian biomarker. Nat. Rev. Rheumatol. 12, 731–742.
Buck, MD, O'Sullivan, D., dan Pearce, EL (2015). Metabolisme sel T memacu imuniti. J. Exp. Med. 212, 1345–1360.
Cantor, JR, Abu-Remaileh, M., Kanarek, N., Freinkman, E., Gao, X., Louissaint, A., Jr., Lewis, CA dan Sabatini, DM (2017). Fisiologik Medium Mendawai Semula Metabolisme Sel dan Mendedahkan Asid Urik sebagai Perencat Endogen UMP Synthase. Sel 169, 258–272.e17.
Cronstein, BN, dan Aune, TM (2020). Methotrexate dan mekanisme tindakannya dalam arthritis radang. Nat. Rev. Rheumatol. 16, 145–154.
Dembitz, V., Tomic, B., Kodvanj, I., Simon, JA, Bedalov, A., dan Visnjic, D. (2019). AICAr ribonucleoside mendorong pembezaan leukemia myeloid dengan mengaktifkan ATR/Chk1 melalui penipisan pirimidin. J. Biol. Kimia. 294, 15257–15270.
Dendrou, CA, Fugger, L., dan Friese, MA (2015). Imunopatologi pelbagai sklerosis. Nat. Rev. Immunol. 15, 545–558.
Ducker, GS dan Rabinowitz, JD (2017). Metabolisme Satu Karbon dalam Kesihatan dan Penyakit. Metab Sel. 25, 27–42.
Ducker, GS, Chen, L., Morscher, RJ, Ghergurovich, JM, Esposito, M., Teng, X., Kang, Y., dan Rabinowitz, JD (2016). Pembalikan Cytosolic One Carbon Flux Mengimbangi Kehilangan Laluan Folat Mitokondria. Metab Sel. 23, 1140–1153.
Emmanuel, N., Ragunathan, S., Shan, Q., Wang, F., Giannakou, A., Huser, N., Jin, G., Myers, J., Abraham, RT, dan Unsal-Kacmaz, K (2017). Ketersediaan Nukleotida Purine Mengawal Aktiviti mTORC1 melalui Rheb GTPase. Sel Rep. 19, 2665–2680.
Farber, S., Diamond, LK, Mercer, RD, Sylvester, RF, dan Wolff, JA (1948). Pengampunan sementara dalam leukemia akut pada kanak-kanak yang dihasilkan oleh antagonis asid folik, 4-asid aminopteroyl-glutamic. N. Inggeris. J. Med. 238, 787–793.
Field, MS, Kamynina, E., Watkins, D., Rosenblatt, DS, dan Stover, PJ (2015). Pandangan baharu tentang penentu metabolik dan pemakanan bagi kekurangan imun gabungan yang teruk. Rare Dis. 3, e1112479.
Fuseini, H., Yung, JA, Cephus, JY, Zhang, J., Goleniewska, K., Polosukhin, VV, Peebles, RS, Jr., dan Newcomb, DC (2018). Testosteron Mengurangkan Keradangan Salur Udara Disebabkan Habuk Rumah Jenis 2 dan IL-17A. J. Immunol. 201, 1843–1854.
Govindaraju, V., Young, K., dan Maudsley, AA (2000). Peralihan kimia Proton NMR dan pemalar gandingan untuk metabolit otak. NMR Biomed. 13, 129–153.
Hijau, NH, Galvan, DL, Badal, SS, Chang, BH, LeBleu, VS, Long, J., Jonasch, E., dan Danesh, FR (2019). MTHFD2 menghubungkan metilasi RNA kepada pemrograman semula metabolik dalam karsinoma sel renal. Onkogen 38, 6211–6225.
Gustafsson, R., Jemth, A.-S., Gustafsson, NMS, F€ arnega˚rdh, K., Loseva, O., Wiita, E., Bonagas, N., Dahllund, L., Llona-Minguez, S., H€ aggblad, M., et al. (2017). Struktur Kristal Sasaran Kanser Muncul MTHFD2 dalam Kompleks dengan Perencat Berasaskan Substrat. Kanser Re. 77, 937–948.
Gustafsson Sheppard, N., Jarl, L., Mahadessian, D., Strittmatter, L., Schmidt, A., Madhusudan, N., Tegne´r, J., Lundberg, EK, Asplund, A., Jain, M ., dan Nilsson, R. (2015). Enzim bergandingan folat MTHFD2 ialah protein nuklear dan menggalakkan percambahan sel. Sci. Rep. 5, 15029.
Hoxhaj, G., Hughes-Hallett, J., Timson, RC, Ilagan, E., Yuan, M., Asara, JM, Ben-Sahra, I., dan Manning, BD (2017). Rangkaian Isyarat mTORC1 Mengesan Perubahan dalam Tahap Nukleotida Purin Selular. Sel Rep. 21, 1331–1346.
Johnson, MO, Wolf, MM, Madden, MZ, Andrejeva, G., Sugiura, A., Contreras, DC, Maseda, D., Liberti, MV, Paz, K., Kishton, RJ, et al. (2018). Peraturan Berbeza Pembezaan Sel Th17 dan Th1 oleh Metabolisme Bergantung kepada Glutaminase. Sel 175, 1780–1795.e19.
Ju, H.-Q., Lu, Y.-X., Chen, D.-L., Zuo, Z.-X., Liu, Z.-X., Wu, Q.-N., Mo, H.-Y., Wang, Z.-X., Wang, D.-S., Pu, H.-Y., et al. (2019). Modulasi Homeostasis Redoks dengan Perencatan MTHFD2 dalam Kanser Kolorektal: Mekanisme dan Implikasi Terapeutik. J. Natl. Kanser Inst. 111, 584–596.
Kawai, J., Toki, T., Ota, M., Inoue, H., Takata, Y., Asahi, T., Suzuki, M., Shimada, T., Ono, K., Suzuki, K., et al. (2019). Penemuan Perencat MTHFD2 yang Mujarab, Selektif dan Tersedia Secara Lisan (DS18561882) dengan Aktiviti Antitumor Vivo. J. Med. Kimia. 62, 10204–10220.
Kim, J., Yang, G., Kim, Y., Kim, J., dan Ha, J. (2016). Pengaktif AMPK: mekanisme tindakan dan aktiviti fisiologi. Exp. Mol. Med. 48, e224.
Koufaris, C., Gallage, S., Yang, T., Lau, C.-H., Valbuena, GN, dan Keun, HC (2016). Penindasan MTHFD2 dalam MCF-7 Sel Kanser Payudara Meningkatkan Glikolisis, Kebergantungan pada Glisin Eksogen dan Sensitiviti kepada Penghabisan Folat. J. Proteome Res. 15, 2618–2625.
Li, W., Xu, H., Xiao, T., Cong, L., Love, MI, Zhang, F., Irizarry, RA, Liu, JS, Brown, M., dan Liu, XS (2014). MAGeCK membolehkan pengecaman teguh gen penting daripada skrin kalah mati CRISPR/Cas9 skala genom. Biol Genom. 15, 554.
Ma, EH, Bantug, G., Griss, T., Condotta, S., Johnson, RM, Samborska, B., Mainolfifi, N., Suri, V., Guak, H., Balmer, ML, et al. (2017). Serine Merupakan Metabolit Penting untuk Pengembangan Sel T Effector. Metab Sel. 25, 345–357.
Macintyre, AN, Gerriets, VA, Nichols, AG, Michalek, RD, Rudolph, MC, Deoliveira, D., Anderson, SM, Abel, DE, Chen, BJ, Hale, LP, et al. (2014). Pengangkut Glukosa Glut1 Adalah Penting Secara Selektif untuk Pengaktifan dan Fungsi Pengesan Sel T CD4. Metab Sel. 20, 61–72.
Michalek, RD, Gerriets, VA, Jacobs, SR, Macintyre, AN, MacIver, NJ, Mason, EF, Sullivan, SA, Nichols, AG dan Rathmell, JC (2011). Kemajuan: program metabolisme glikolitik dan oksidatif lipid yang berbeza adalah penting untuk subset sel T CD4 dan pengawalseliaan efektor. J. Immunol. 186, 3299–3303.
Nakaya, M., Xiao, Y., Zhou, X., Chang, J.-H., Chang, M., Cheng, X., Blonska, M., Lin, X., dan Sun, S.-C . (2014). Tindak balas sel T yang meradang bergantung pada pengangkut asid amino ASCT2 pemudahan pengambilan glutamin dan pengaktifan kinase mTORC1. Kekebalan 40, 692–705.
Nilsson, R., Jain, M., Madhusudhan, N., Sheppard, NG, Strittmatter, L., Kampf, C., Huang, J., Asplund, A., dan Mootha, VK (2014). Ekspresi enzim metabolik menyerlahkan peranan utama untuk MTHFD2 dan laluan folat mitokondria dalam kanser. Nat. Commun. 5, 3128.
Palmer, LD, Maloney, KN, Boyd, KL, Goleniewska, AK, Toki, S., Maxwell, CN, Chazin, WJ, Peebles, RS, Jr., Newcomb, DC dan Skaar, EP (2019). Innate Immune Protein S100A9 Melindungi daripada Jenis Sel T-Helper 2-mediated Allergic Airway Inflammation. Am. J. Respirator. Sel Mol. biol. 61, 459–468.
Pikman, Y., Puissant, A., Alexe, G., Furman, A., Chen, LM, Frumm, SM, Ross, L., Fenouille, N., Bassil, CF, Lewis, CA, et al. (2016). Menyasarkan MTHFD2 dalam leukemia myeloid akut. J. Exp. Med. 213, 1285–1306.
Que´ me´ neur, L., Gerland, L.-M., Flacher, M., Ffrench, M., Revillard, J.-P., dan Genestier, L. (2003). Kawalan pembezaan kitaran sel, percambahan, dan kemandirian limfosit T primer oleh nukleotida purin dan pirimidin. J. Immunol. 170, 4986–4995.
Que´ me´ neur, L., Beloeil, L., Michallet, M.-C., Angelov, G., Tomkowiak, M., Revillard, J.-P., dan Marvel, J. (2004). Sekatan biosintesis nukleotida de novo mengganggu pengembangan dan pembezaan klon kepada sel T CD8 T effector dan memori. J. Immunol. 173, 4945–4952.
Rae, C., dan Mairs, RJ (2019). Pengaktifan AMPK oleh AICAR menyedarkan sel-sel kanser prostat kepada radioterapi. Onkotarget 10, 749–759.
Ron-Harel, N., Santos, D., Ghergurovich, JM, Sage, PT, Reddy, A., Lovitch, SB, Dephoure, N., Satterstrom, FK, Sheffer, M., Spinelli, JB, et al. (2016). Biogenesis Mitokondria dan Pengubahsuaian Proteome Menggalakkan Metabolisme Satu Karbon untuk Pengaktifan Sel T. Metab Sel. 24, 104–117.
Shahi, SK, Freedman, SN, Murra, AC, Zarei, K., Sompallae, R., Gibson Corley, KN, Karandikar, NJ, Murray, JA, dan Mangalam, AK (2019). Prevotella histicola, Komensal Usus Manusia, Sekuat COPAXONE dalam Model Haiwan Sklerosis Berbilang. Depan. Immunol. 10, 462.
Shalem, O., Sanjana, NE, Hartenian, E., Shi, X., Scott, DA, Mikkelson, T., Heckl, D., Ebert, BL, Root, DE, Doench, JG, dan Zhang, F. (2014). Pemeriksaan kalah mati CRISPR-Cas9 skala genom dalam sel manusia. Sains 343, 84–87.
Sharma, U., dan Rando, OJ (2017). Input Metabolik ke dalam Epigenome. Metab Sel. 25, 544–558.
Shi, LZ, Wang, R., Huang, G., Vogel, P., Neale, G., Green, DR, dan Chi, H. (2011). Laluan glikolitik yang bergantung kepada HIF1alpha mengatur pusat pemeriksaan metabolik untuk pembezaan sel T H17 dan Treg. J. Exp. Med. 208, 1367–1376.
Shin, M., Momb, J., dan Appling, DR (2017). Mitokondria manusia MTHFD2 ialah dwi redoks kofaktor khusus metilenetetrahidrofolat dehidrogenase/ methyltetrahydrofolate cyclohydrolase. Metab Kanser. 5, 11.
Skene, PJ, dan Henikoff, S. (2017). Strategi nuklease disasarkan yang cekap untuk pemetaan resolusi tinggi tapak pengikat DNA. eLife 6, e21856.
Su, C.-C., Hsieh, K.-L., Liu, P.-L., Yeh, H.-C., Huang, S.-P., Fang, S.-H., Cheng, W.-C., Huang, K.-H., Chiu, F.-Y., Lin, I.-L., et al. (2019). AICAR Mendorong Apoptosis dan Menghalang Migrasi dan Pencerobohan dalam Sel Kanser Prostat Melalui Laluan Bergantung AMPK/mTOR. Int. J. Mol. Sci. 20, 1647.
Su, X., Wellen, KE, dan Rabinowitz, JD (2016). Kawalan metabolik metilasi dan asetilasi. Curr. Pendapat. Kimia. biol. 30, 52–60.
Tan, H., Yang, K., Li, Y., Shaw, TI, Wang, Y., Blanco, DB, Wang, X., Cho, J.-H., Wang, H., Rankin, S. , et al. (2017). Proteomik Integratif dan Phosphoproteomics Profiiling Mendedahkan Rangkaian Isyarat Dinamik dan Laluan Bioenergetik yang Mendasari Pengaktifan Sel T. Kekebalan 46, 488–503.
Toffalini, F., Kallin, A., Vandenberghe, P., Pierre, P., Michaux, L., Cools, J., dan Demoulin, J.-B. (2009). Protein gabungan TEL-PDGFR dan FIP1L1-PDGFR terlepas dari ubiquitination dan degradasi. Haematologica 94, 1085-1093.
Wan, X., Wang, C., Huang, Z., Zhou, D., Xiang, S., Qi, Q., Chen, X., Arbely, E., Liu, C.-Y., Du, P., dan Yu, W. (2020). Cisplatin menghalang SIRT3-deasetilasi MTHFD2 untuk mengganggu keseimbangan redoks selular dalam sel kanser kolorektal. Kematian Sel Dis. 11, 649.
Wang, L., Xing, X., Chen, L., Yang, L., Su, X., Rabitz, H., Lu, W., dan Rabinowitz, JD (2019). Enjin Anotasi dan Pengesahan Puncak untuk Metabolomik LC-MS Tidak Sasar. dubur. Kimia. 91, 1838–1846.
Yang, M., dan Vousden, KH (2016). Metabolisme serin dan satu karbon dalam kanser. Nat. Rev. Kanser 16, 650–662.
Yue, L., Pei, Y., Zhong, L., Yang, H., Wang, Y., Zhang, W., Chen, N., Zhu, Q., Gao, J., Zhi, M., et al. (2020). Mthfd2 Memodulasi Fungsi Mitokondria dan Pembaikan DNA untuk Mengekalkan Pluripotensi Sel Stem Tetikus. Laporan Sel Stem 15, 529–545.
Zhu, Z., dan Leung, GKK (2020). Lebih Daripada Enzim Metabolik: MTHFD2 sebagai Sasaran Novel untuk Terapi Antikanser? Depan. Oncol. 10, 658.
STAR★KAEDAH
JADUAL SUMBER UTAMA
KESEDIAAN SUMBER
Hubungan utama
Maklumat lanjut dan permintaan untuk sumber dan reagen hendaklah diarahkan kepada dan akan dipenuhi setelah MTA yang sesuai telah selesai oleh Lead Contact, Dr. Jeffrey Rathmell (jeff.rathmell@vumc.org).
Ketersediaan bahan
Plasmid dan garisan tetikus yang dijana dalam kajian ini akan disediakan setelah selesai MTA yang sesuai atas permintaan.
Ketersediaan data dan kod
Data penjujukan CUT&RUN telah disimpan di GEO dan tersedia secara umum pada tarikh penerbitan (GSE180356). Data mikroskop dan imej western blot asal yang dilaporkan dalam kertas ini akan dikongsi oleh kenalan utama atas permintaan. Sebarang maklumat tambahan yang diperlukan untuk menganalisis semula data yang dilaporkan dalam kertas ini tersedia daripada hubungan utama atas permintaan.
