Penstabilan Membran Mitokondria Oleh Angelica Sinensis Polisakarida dalam Anemia Aplastik Murine

Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com

Abstrak

Untuk menyiasat mekanisme penstabilan membran mitokondria oleh Angelica Sinensis polysaccharide (ASP) dalam tikus anemia aplastik murine (AA) ICR secara rawak dibahagikan kepada kawalan. Kumpulan yang dirawat AA dan ASP Tikus kumpulan AA telah dirawat dengan 60Co Y dan suntikan intraperitoneal cyclophosphamide dan chloramphenicol. Haiwan kawalan telah dirawat dengan penyinaran pelindung plumbum dan suntikan garam. Tikus AA yang dirawat diberi makan dengan ASP selama 2 minggu. Ultrastruktur mitokondria sumsum tulang diperhatikan oleh mikroskop elektron penghantaran, dan potensi transmembran sel nukleus sumsum tulang (BMNC) telah diperiksa oleh spektrofotometri pendarfluor. Kandungan Cox dan MDH dalam medium juga dikaji dalam tiga kumpulan, Nombor mitokondria dan potensi transmembran BMNC dalam sumsum tulang menurun dalam kumpulan AA berbanding dengan kumpulan kawalan tetapi bertambah baik dalam kumpulan yang dirawat ASP berbanding dengan kumpulan AA. Pembelahan mitokondria lengkap dalam kumpulan yang dirawat ASP telah ditangguhkan dengan ketara (P< 0.05)="" as="" compared="" to="" the="" aa="" group.="" we="" conclude="" that="" asp="" might="" improve="" mitochondrial="" membrane="" stabilization,="" and="" suppress="" the="" downregulation="" of="" transmembrane="" potential="" and="" apoptosis="" of="" bmnc="" in="">

Kata kunci: anemia aplastik, polisakarida Angelica Sinensis, mitokondria, potensi membran, tikus ICR

ekstrak cistanche: meningkatkan pembentukan tulang dan meningkatkan ketumpatan tulang

Latar belakang

Anemia aplastik(AA) ialah gangguan darah di mana sumsum tulang dan sel stem darah yang berkaitan rosak menyebabkan kekurangan sel darah merah, sel darah putih dan platelet. Kekurangan ini secara individu dikenali sebagai anemia, leukopenia, dan trombositopenia, masing-masing, dan secara kolektif dikenali sebagai pancytopenia. Pendedahan kepada bahan kimia, dadah, sinaran, bahan radioaktif, peranti penghasil sinaran, jangkitan. penyakit imun, keturunan (dalam 50 peratus kes) dan etiologi yang tidak diketahui juga boleh membawa kepada perkembangan AA.

Mitokondria dianggap sebagai "pusat kuasa sel" kerana ia menghasilkan adenosin trifosfat (ATP) dengan mengekstrak tenaga secara sistematik daripada molekul nutrien (substrat)[1]. Selain itu, mtDNA direplikasi dengan kadar mutasi yang tinggi kerana ia tidak mempunyai histon pelindung dan sistem pembaikan DNA yang berkesan. Mutasi dalam mtDNA dikaitkan dengan penyakit hematologi seperti anemia sideroblastik yang diperolehi, sindrom myelodysplastic dan AA yang diperolehi [2-4]. Kajian terdahulu kami 5] menunjukkan bahawa kerosakan fungsi rantai pernafasan mitokondria yang disebabkan oleh mutasi mungkin terlibat dalam kegagalan hematopoietik dalam pesakit AA. Tanpa mengira ciri morfologi kematian sel peringkat akhir (apoptosis, nekrotik, autofagik, atau mitosis), permeabilisasi membran mitokondria (MMP) selalunya merupakan peristiwa penentu antara kelangsungan hidup dan kematian [6]

Menurut perubatan tradisional Cina, Angelica Sinensis membantu dalam menyatukan darah dan menggalakkan peredarannya [7]. Kajian terbaru menunjukkan bahawa ekstrak Angelica Sinensis mempunyai kesan anti-oksidatif dan neuroprotektif [8,9]. Walau bagaimanapun, fungsi anti-oksidatif ASP masih tidak jelas. Kajian ini mengkaji kerosakan sel awal menggunakan lengkung masa lisis mitokondria dan kesan penstabilan membran mitokondria ASP dalam AA.

suplemen cistanche meningkatkan ketumpatan tulang dan meningkatkan pembentukan tulang

Bahan dan Kaedah

Pengelompokan haiwan

Tikus jantan ICR yang sihat, seberat 18-22 g, berumur 6-8 minggu, disediakan oleh Pusat Haiwan Eksperimen Universiti Shandong(China). Haiwan ditempatkan dalam persekitaran yang hangat dan tenang dengan akses percuma kepada makanan dan air. dan disesuaikan selama satu minggu sebelum memulakan eksperimen.

Tikus dibahagikan secara rawak kepada tiga kumpulan: kumpulan normal, kumpulan AA, dan kumpulan yang dirawat, masing-masing. Model anemia aplastik telah dihasilkan seperti yang diterangkan sebelum ini [10].

Secara ringkas, tikus telah disinari dengan 2.0Gy 60Coy dan kemudian dirawat dengan suntikan intraperitoneal harian 40 mg/kg/hari siklofosfamid dan 50 mg/kg/hari kloramfenikol untuk tiga hari berikutnya. Kumpulan yang dirawat diberi secara intragastrik dengan ASP(200 mg/kg/hari, menurut Kamus Perubatan Cina). Kumpulan kawalan dan tikus kumpulan AA diberi makan secara intragastrik dengan diet tambahan garam fisiologi (10 ml/kg/d). Tambahan pula, semua tikus menerima diet standard semasa kajian. Selepas rawatan dengan ASP atau garam fisiologi selama 2 minggu, tikus telah dikorbankan oleh kehelan serviks.

Pemeriksaan hematologi

Sampel darah ekor daripada ketiga-tiga kumpulan dikumpulkan pada hari pertama dan keempat belas, masing-masing. WBC dan platelet dikira dalam sampel darah periferal, dan tahap Hb ditentukan. Setelah selesai eksperimen, tikus telah dikorbankan dan smear femur disediakan untuk pengiraan pembezaan sel nukleus sumsum tulang (BMNCs) (Rajah 1).

Mikroskopi elektron penghantaran

Sumsum femoral disapu dan dihiris menjadi bahagian ultranipis. Mitokondria sel hematopoietik dalam sumsum femoral dianalisis dan dikira dengan mikroskop elektron penghantaran (JEM-2000EX, Jepun) di bawah 50 bidang penglihatan.

Lengkung masa lisis mitokondria

Mitokondria diekstrak daripada BMNC murine mengikut protokol pengeluar kit pengasingan mitokondria (Pierce Biotechnology Inc., USA). Kepekatan monoamine oxidase(MAO) menunjukkan kepekatan mitokondria dan ditentukan menggunakan suspensi mitokondria 200U/ml daripada 20 kultur serum, dalam masa 12 jam pada titik masa yang berbeza (selang 30 minit). Kandungan cytochrome oxidase (Cox) dan malate dehydrogenase (MDH) dalam medium juga ditentukan. Analisis masa puncak membran mitokondria dan lengkung masa kepekatan enzim khusus matriks menunjukkan tahap lisis membran mitokondria.

Potensi membran mitokondria

Selepas pra-inkubasi dengan MAO atau ASP, mitokondria terpencil daripada tiga kumpulan telah digantung semula dalam 0.5 ml garam penimbal fosfat(Wuhan Boster Biotechnology, Ltd., China） dan 10 ul rhodamine 123 larutan kerja( Sigma-Aldrich, USA) telah ditambah dan diinkubasi pada 37 darjah C dalam 5 peratus CO2 selama 15 minit. Potensi membran mitokondria dianalisis oleh sitometri aliran menggunakan panjang gelombang pengujaan 490 nm dan panjang gelombang pancaran 520 nm.

Analisis statistik

Analisis statistik telah dilakukan menggunakan perisian SPSS 19.0. Data dinyatakan sebagai min dan sisihan piawai. Ujian-t pelajar digunakan untuk membandingkan kumpulan yang berbeza. P < 0.05="" dianggap="" penting="" secara="">

herba cistanche: untuk kualiti tulang yang lebih baik

Keputusan

Kiraan darah periferi dan BMC

Dengan menggunakan penganalisis sel darah automatik sepenuhnya, bilangan sel darah periferal dan BMC dalam tikus AA didapati berkurangan dengan ketara (P<0.05), indicating="" that="" the="" aa="" mouse="" model="" was="" successfully="" established="" (table="">

Ultrastruktur mitokondria dalam tikus anemia aplastik

Mikroskopi elektron penghantaran sumsum tulang tikus AA menunjukkan bahawa ultrastruktur mitokondria bertambah baik dengan ASP dalam kumpulan yang dirawat (Jadual 2 dan Rajah 1), menunjukkan bahawa ASP menstabilkan mitokondria dalam tikus AA. Saiz dan bentuk mitokondria kumpulan kawalan adalah normal. Berbeza. mitokondria kumpulan AA telah membesarkan struktur globular, bersama-sama dengan gangguan atau kehilangan cristae (Rajah 1A-C).

Potensi membran mitokondria (MMP) dalam tikus anemia aplastik

Oleh kerana mikroskop elektron penghantaran mendedahkan kerosakan mitokondria, kami menentukan kesan ASP pada MMP dalam tikus AA dengan mengukur perbezaan relatif dalam pendarfluor Rh 123 di antara tiga kumpulan menggunakan spektrofotometer pendarfluor.

Keputusan menunjukkan bahawa pendarfluor Rh 123 sel sumsum tulang dalam kumpulan AA (19.6±3.03) adalah lebih rendah daripada kumpulan kawalan (31.7±2.59, P<0.0). however,="" the="" rh="" 123="" fluorescence="" of="" the="" asp-treated="" aa="" group="" was="" higher="" than="" that="" in="" the="" aa="" group=""><0.0i)(table 2="" and="" figure="" 2),="" indicating="" that="" asp="" facilitated="" the="" recovery="" of="" the="" mmp="" in="" aa="">

Lengkung masa lisis mitokondria sel awal

Dalam kumpulan kawalan, kandungan kultur in vitro mitokondria Cox dan MDH mengambil masa 3.5 jam untuk mencapai puncak. Kandungan MAO dalam budaya tidak berubah dengan ketara dari semasa ke semasa, tetapi kandungan COX dan MDH secara beransur-ansur meningkat dengan masa, mencapai puncak, dan kemudian secara beransur-ansur menurun. Oleh itu, kandungan mitokondria lengkap yang dikeluarkan oleh sel mengambil masa kira-kira 3.5 jam untuk mencapai puncak belahan.

Puncak COX dan MDH dalam kumpulan AA masing-masing muncul pada 1.5 jam, 1.375U/, 36.732U/l. Puncak COX dan MDH dalam kumpulan yang dirawat masing-masing muncul pada 5.5 jam, 6.5 jam, 1.341U/l, 33.994U/. Dua set data pada setiap titik masa digunakan untuk analisis statistik. Pada 1.5 jam, tahap COX dan MDH dalam kumpulan AA adalah lebih tinggi dengan ketara berbanding kumpulan yang dirawat (P < 0.05).="" oleh="" itu,="" pembelahan="" mitokondria="" lengkap="" dalam="" serum="" telah="" ditangguhkan="" dengan="" ketara="" selepas="" penambahan="" asp="" (p=""><0.05), dengan="" sedikit="" penurunan="" pada="" puncak="" (rajah="">

Perbincangan

Anemia aplastik (AA) adalah sindrom kegagalan sumsum tulang yang dicirikan oleh pansitopenia periferi dan hipoplasia sumsum. Mutasi dan ketidakstabilan mtDNA telah ditunjukkan dalam beberapa penyakit. Disfungsi mitokondria dan pengurangan bilangan mitokondria boleh mengakibatkan pengurangan mtDNA, Penghapusan mtDNA yang diperoleh dalam petak hematopoietik didapati berlaku dalam pancytopenia dan reticulocytopenia yang teruk [11]. Berdasarkan penyelidikan terdahulu kami [5], kami mengkaji sama ada ASP boleh menstabilkan membran mitokondria tikus AA.

Angelica Sinensis polysaccharide-iron complex(APIC) bukan sahaja mempunyai kesan terapeutik yang unggul pada IDA tetapi juga untuk menambah darah dan menggalakkan peredaran darah [12]. ASP mungkin berguna untuk rawatan penyakit yang disebabkan oleh ekspresi berlebihan hepcidin dengan menghalang Janus-kinase (JAK), anak kepada ibu terhadap laluan dekapentaplegik ekstraselular (SMAD) dan 1 kinase dikawal isyarat (ERK) untuk mengecilkan ekspresi hepcidin dalam tikus IDA [13]. ]. Qin J mendapati bahawa ASP boleh meningkatkan sintesis proteoglycan (PG) kondrosit dalam model OA tikus in vivo dan IL-1B-stimulated chondrocytes in vitro dengan menggalakkan ekspresi aggrecan dan GT yang terlibat dalam sintesis PG [14].

Dalam kajian kami, model tetikus AA telah diinduksi oleh gabungan asetil fenilhidrazin, sinar-X, dan siklofosfamid. Tikus AA menunjukkan pengurangan ketara secara statistik dalam leukosit darah periferal, Hb, dan platelet (Jadual 1), dan pengurangan teruk dalam sel sumsum humerus dan sel progenitor yang komited sumsum, yang merupakan ciri klinikal AA. Tikus AA yang dirawat dengan ASP menunjukkan peningkatan progresif dalam sel BM berbanding kumpulan AA. Di samping itu, bilangan mitokondria dalam sel hematopoietik juga terjejas. ASP menghasilkan bilangan mitokondria yang jauh lebih tinggi dalam kumpulan yang dirawat berbanding kumpulan AA (Rajah 1). Keputusan ini menunjukkan bahawa ASP boleh menggalakkan percambahan sel bernukleus sumsum, meningkatkan bilangan mitokondria, dan menstabilkan membran mitokondria dalam tikus AA.

Kecederaan mitokondria dicerminkan oleh kerosakan mtDNA dan penurunan tahap transkrip mtRNA, sintesis protein, dan fungsi mitokondria, yang mungkin mengakibatkan penurunan tenaga selular, gangguan isyarat sel, dan gangguan dengan pembezaan dan apoptosis selular. Tambahan pula, kekurangan pengeluaran ATP mitokondria mungkin menggalakkan ketidakstabilan kromosom[15]. Memandangkan mtDNA mengekod komponen empat daripada lima kompleks pernafasan mitokondria, perubahan dalam mtDNA mengakibatkan penyakit mitokondria [16-18]. Selain daripada penyakit mitokondria, mutasi dalam mtDNA dikaitkan dengan kanser, diabetes. penyakit jantung. gangguan neurodegeneratif, penyakit hematologi seperti leukemia serta proses penuaan normal [19]. Yang penting, mutasi mtDNA, serta pengurangan nombor salinan mtDNA, boleh menjadi patogen [20, 21]. Memahami mekanisme selular untuk penyelenggaraan integriti mtDNA dan nombor salinan adalah amat penting kerana ia boleh menyediakan sasaran untuk campur tangan klinikal yang bertujuan untuk pencegahan dan rawatan penyakit hematologi seperti AA. Faktor-faktor ini juga mungkin mengakibatkan penurunan metabolisme tenaga, yang akan menjejaskan pembaharuan diri dan pembezaan sel stem hematopoietik.

Penemuan kajian ini menunjukkan bahawa ASP boleh meningkatkan ultrastruktur mitokondria, dan menyekat regulasi potensi transmembran dan apoptosis unsur mieloid untuk menyembuhkan kegagalan sumsum tulang.

Ekstrak cistanche & cistanche: sesuai untuk tulang

Rujukan

1 Chinnery PF, Schon EA. Mitokondria. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2003, 74: 1188-1199.

2. Gattermann N. Mutasi DNA mitokondria dalam sistem hematopoietik. Leukemia 2004,18:18-22.

3. Gattermann N, Retzlaff S, Wang YL, et al. Mutasi titik heteroplasma DNA mitokondria yang menjejaskan subunit I cytochrome c oxidase dalam dua pesakit dengan anemia sideroblastik idiopatik yang diperolehi.Blood 1997,90:4961-4972.

Kim HR, Shin MG, Kim MJ, et al. Mitokondria

4 . Penyimpangan DNA sel sumsum tulang daripada pesakit dengan anemia aplastik. Korean Med Sci 2008, 23:1062-1067. X Cui, JO Wang, ZG Cai, et al. Urutan lengkap

5. analisis DNA mitokondria dan panjang telomer dalam anemia aplastik.Int J Mol Med 2014.34:1309-1314.

6. Chiu TL, Su CC. Tanshinone IA mendorong apoptosis dalam sel A549 kanser paru-paru manusia melalui induksi spesies oksigen reaktif dan mengurangkan potensi membran mitokondria. Int J Mol Med 2010,25:231-236.

7. Liu PJ. Hsieh WT. Huang SH, et al. Kesan hematopoietik polisakarida larut air daripada Angelica Sinensis pada tikus dengan kehilangan darah akut. Exp Hematol 2010, 38: 437-445.

8. Kuang X, Yao Y, Du JR, et al. Peranan neuroprotective 8F Z-ligustilide terhadap kecederaan iskemia otak depan dalam tikus ICR. Brain Res 2006,1102:145-153.

9. Xin J.Zhang J. Yang Y, et al.Radi Angelica Sinensis yang mengandungi komponen Z-ligustilide menggalakkan neurogenesis dewasa untuk menjadi pengantara pemulihan daripada gangguan kognitif Curr Neurovasc Res 203, 10:304-315.

10. Chen YF, Wu ZM, Xie C, et al.Tahap ekspresi IL-6 dirembeskan oleh sel stromal sumsum tulang pada tikus dengan anemia aplastik.ISRN Hematol 2013:986219.

11. Hatfill SJ, LaCock CJ, Laubscher R, et al. Arole untuk DNA mitokondria dalam patogenesis myelodysplasia akibat sinaran dan leukemia sekunder. Leuk Res 1993,17:907-913.

12. Wang PP, Zhang Y, Dai LQ, et al.Kesan kompleks polisakarida-besi Angelica Sinensis terhadap anemia kekurangan zat besi pada tikus. Chin J Integr Med 2007, 13:297-300.

13. Zhang Y, Cheng Y, Wang N, et al. Tindakan laluan isyarat JAK, SMAD, dan ERK pada penindasan hepcidin oleh polisakarida daripada Angelica Sinensis pada tikus dengan anemia kekurangan zat besi. Fungsi Makanan2014.5: 1381-1388.

14. Qin J, Liu YS, Liu J, et al. Kesan polisakarida Angelica Sinensis pada osteoarthritis in vivo dan in vitro: mekanisme yang mungkin untuk menggalakkan sintesis proteoglycans. Evid Based Complement Alternat Med 2013,79476.

15. Gattermann N. Mutasi DNA mitokondria dalam sistem hematopoietik. Leukemia 2004,18:18-22.

16. Holt IJ, Harding AE, Morgan-Hughes JA. Penghapusan DNA mitokondria otot pada pesakit dengan miopati mitokondria. Alam 1988, 331:717-719.

17. Lestienne P, Ponsot G Sindrom Kearns-Sayre dengan penghapusan DNA mitokondria otot. Lancet 1988, 1:885.

18. Wallace DC, Singh G, Lott MT, et al. Mutasi DNA mitokondria yang dikaitkan dengan neuropati optik keturunan Leber. Sains 1988,242:1427-1430.

19. Wallace DC. Paradigma mitokondria penyakit metabolik dan degeneratif, penuaan, dan kanser: fajar untuk perubatan evolusi. Annu Rev Genet 2005, 39: 359-407.

20. Clay Montier LL, Deng JJ, Bai Y. Perkara nombor: kawalan nombor salinan DNA mitokondria mamalia. J Genet Genomics 2009,36:125-131.

21. Rötig A, Poulton J. Penyebab genetik pengurangan DNA mitokondria pada manusia. Biochim Biophys Acta 2009,1792:1103-1108.

ekstrak cistanche: meningkatkan pembentukan tulang dan meningkatkan ketumpatan tulang