Kaedah Menjana Dan Menilai Model Ikan Zebra Penyakit Ginjal Manusia Bahagian 1
Apr 24, 2023
ABSTRAK
Gangguan berkaitan buah pinggang menjejaskan berjuta-juta orang di seluruh dunia. Tinjauan pesakit penyakit buah pinggang kronik (CKD) menunjukkan bahawa beban penyakit buah pinggang semakin meningkat setiap tahun. Kajian beban penyakit global (GBD) 2017 meletakkan CKD sebagai penyebab utama kematian ke-12 di seluruh dunia. Oleh itu, pengenalpastian punca penyakit buah pinggang, pembangunan kaedah diagnostik yang tepat, dan terapeutik baru adalah sangat relevan. Organisma model yang menyusun semula penyakit manusia dengan setia memainkan peranan penting dalam memahami proses penyakit dan menyediakan asas yang berharga untuk mencari penawarnya. Zebrafish ialah model yang sangat baik untuk mengkaji perkembangan, patofisiologi, dan aspek molekul penyakit buah pinggang manusia. Dalam ulasan ini, kami meringkaskan pelbagai manipulasi genetik dan eksperimen yang boleh dijalankan dalam ikan zebra untuk lebih memahami patofisiologi penyakit buah pinggang manusia. Kami mencadangkan bahawa kaedah ini akan membantu dalam pembangunan terapi yang berpotensi untuk merawat penyakit buah pinggang.
Menurut kajian yang berkaitan,cistanchemerupakan herba tradisional cina yang telah digunakan sejak berkurun lamanya untuk merawat pelbagai penyakit. Ia telah terbukti secara saintifik mempunyai ciri anti-radang, anti-penuaan, dan antioksidan. Kajian telah menunjukkan bahawa cistanche bermanfaat untuk pesakit yang menghidap penyakit buah pinggang. Bahan aktif cistanche diketahui dapat mengurangkan keradangan, meningkatkan fungsi buah pinggang dan memulihkan sel-sel buah pinggang yang rosak. Oleh itu, menyepadukan cistanche dalam pelan rawatan penyakit buah pinggang boleh menawarkan manfaat yang besar kepada pesakit dalam menguruskan keadaan mereka. Cistanche membantu mengurangkan proteinuria, merendahkan paras BUN dan kreatinin, dan mengurangkan risiko kerosakan buah pinggang selanjutnya. Selain itu, cistanche juga membantu mengurangkan paras kolesterol dan trigliserida yang boleh merbahaya kepada pesakit yang menghidapinyapenyakit buah pinggang.
Untuk maklumat lanjut:
David.deng
@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
KATA KUNCI:CKD, AKI, model ikan zebra penyakit buah pinggang manusia, pronephros, patologi buah pinggang
pengenalan
Buah pinggang adalah salah satu organ penting dalam vertebrata yang membuang bahan buangan dan mengekalkan pH, ion, dan kepekatan metabolit darah dalam julat fisiologi. Buah pinggang merembeskan erythropoietin yang mengawal pengeluaran sel darah merah dan mengaktifkan vitamin D yang membantu tulang menyerap kalsium. Terdapat kira-kira sejuta nefron dalam setiap buah pinggang manusia, yang merupakan unit struktur dan fungsi organ ini. Akibatnya, kecacatan pada nefron menjejaskan struktur dan fungsi buah pinggang. Disfungsi buah pinggang boleh berlaku kerana mutasi genetik, jangkitan, kecederaan, ubat-ubatan, atau pendedahan kepada sebatian toksik dalam persekitaran. Penyakit kronik seperti diabetes, penyakit kardiovaskular, dan hipertensi adalah penyumbang utama kepada beban penyakit buah pinggang (Levey et al., 2010). Fungsi buah pinggang terjejas meningkatkan risiko komplikasi dalam sistem organ lain juga (Thomas et al., 2008). Jenis penyakit buah pinggang yang biasa dan puncanya digariskan dalam Jadual 1.
Penyakit buah pinggang
Penyakit buah pinggang menyumbang kepada sebahagian besar daripada beban penyakit di seluruh dunia. Kira-kira 750 juta orang di seluruh dunia terjejas oleh gangguan berkaitan buah pinggang (Crews et al., 2019). CKD adalah yang paling biasa di kalangan mereka dengan prevalens global sebanyak 13.4 peratus (Hill et al., 2016). Kajian GBD 2010 meletakkan CKD sebagai penyebab utama kematian ke-18 di seluruh dunia, yang telah melonjak ke tangga ke-12 menjelang 2017 kerana menyebabkan jumlah kematian maksimum di seluruh dunia (Jha et al., 2013; Carney, 2020). Menurut kajian GBD pada 2017, kira-kira 697.5 juta kes CKD telah dilaporkan di seluruh dunia, antaranya 1.2 juta orang meninggal dunia. Bilangan kematian akibat CKD dianggarkan meningkat kepada 4 juta menjelang 2040 dalam senario terburuk (Foreman et al., 2018). Satu pertiga daripada pesakit CKD tinggal di dua negara, China dan India (Bikbov et al., 2020). Status CKD dalam kalangan penduduk India tidak jelas kerana kekurangan sistem pengumpulan data yang tepat. Kira-kira 115 juta kes CKD dilaporkan di India pada 2017 (Bikbov et al., 2020). Penyakit yang paling biasa dalam populasi India adalah diabetes dan hipertensi (Geldsetzer et al., 2018). Menurut laporan Majlis Penyelidikan Perubatan India (ICMR), prevalens diabetes dan hipertensi di kalangan penduduk dewasa bandar masing-masing adalah 28 peratus dan 21.4 peratus (Varma, 2015). Antara 40 peratus hingga 60 peratus CKD, kes berlaku kerana komplikasi ini dan bilangannya meningkat dengan pesat (Rajapurkar et al., 2012). Pusat data penyakit buah pinggang Persatuan Nefrologi Antarabangsa melaporkan prevalens CDK sebanyak 16.8 peratus dalam kalangan penduduk India (Ene-Iordache et al., 2016). Punca CKD berbeza-beza di seluruh India. Andhra Pradesh, Odisha dan Goa melaporkan tahap CKD yang tinggi daripada etiologi yang tidak diketahui yang dikenali sebagai nefropati interstisial kronik (Varughese dan Abraham, 2018). Memandangkan bilangan pesakit CKD semakin meningkat di seluruh dunia pada kadar yang membimbangkan, terdapat keperluan mendesak untuk menjalankan analisis menyeluruh tentang punca penyakit buah pinggang biasa untuk mencari cara yang lebih baik untuk pencegahan dan penyembuhannya. Organisma model yang boleh meniru fisiologi manusia dan keadaan berpenyakit boleh menyediakan jalan yang baik untuk menangani masalah di atas. Zebrafish telah menjadi model yang berguna untuk mengkaji perkembangan dan penyakit serta menyediakan cara yang menjanjikan untuk mengenal pasti sasaran dan ubat terapeutik baharu. Dalam ulasan ini, kami telah membincangkan pelbagai kaedah untuk menyusun semula penyakit buah pinggang manusia dalam zebrafish dan bagaimana model ini boleh digunakan untuk memahami patogenik penyakit dan mekanisme molekul yang mendasarinya. Ini mungkin menghasilkan penjanaan pendekatan terapeutik baru untuk pengurusan dan penyembuhan penyakit buah pinggang.
Persamaan antara buah pinggang manusia dan ikan zebra
Perkembangan buah pinggang dalam mamalia adalah unik kerana ia berlaku melalui tiga struktur berbeza semasa embriogenesis: pronephros, mesonephros, dan metanephros. Dua struktur pertama adalah sementara dalam mamalia dan hanya metanephros yang berterusan sepanjang hayat (Smyth et al., 2017; Jain, 2014). Pronephros ialah buah pinggang berfungsi semasa perkembangan embrio dalam vertebrata bawah seperti amfibia dan ikan, yang digantikan oleh mesonephros sebagai buah pinggang berfungsi pada peringkat kemudian (Tahara et al., 1993; Diep et al., 2015). Jadual 2 menerangkan tempoh masa bagi pelbagai bentuk buah pinggang pada manusia, tikus, Xenopus dan ikan zebra.
Walaupun kerumitan keseluruhan buah pinggang meningkat apabila kita bergerak ke arah bentuk yang lebih tinggi, nefron ialah unit struktur dan fungsi semua jenis buah pinggang. Setiap nefron mempunyai tiga bahagian: corpuscle renal untuk menapis darah, tubulus untuk menyerap dan merembeskan bahan terlarut, dan saluran pengumpul untuk mengumpul bahan buangan yang tidak diingini untuk perkumuhan. Epitelium tiub dicorakkan kepada segmen yang berbeza untuk menjalankan fungsi tertentu. Nefron daripada semua bentuk buah pinggang mempunyai corak segmentasi yang sama (Desgrange dan Cereghini, 2015). Organisasi segmen nefron pronephros dan mesonephros ikan zebra adalah serupa dengan metanephros mamalia, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 1. Tubul pronephric ikan zebra dibahagikan kepada tubul berbelit proksimal (PCT), tubul lurus proksimal (PST), dan awal distal (DE). ) dan tubul lewat distal (DL), yang serupa dengan corak pembahagian nefron metanefrik mamalia. Ikan zebra mempunyai kelenjar endokrin bernama corpuscles of Stannius (CS), yang mengekalkan homeostasis kalsium (Krishnamurthy, 1976). CS terbentuk melalui transdifferentiation sel epitelium buah pinggang di antara segmen DE dan DL, yang secara beransur-ansur memisahkan dari tubul dan membentuk kelenjar CS berpasangan yang diposisikan secara retroperitoneal pada permukaan buah pinggang pada ikan dewasa (Roberts dan Ellis, 2012; Naylor et al., 2018). Salah satu perbezaan utama antara ikan zebra dan nefron mamalia ialah kekurangan gelung Henle dalam ikan zebra, yang bertindak sebagai pengganda arus berlawanan untuk menjana kecerunan osmotik medula untuk pemuliharaan air. Segmen ini tidak mempunyai sebarang kegunaan dalam ikan zebra kerana ia adalah ikan air tawar (Elmonem et al., 2018). Setiap segmen mempunyai jenis sel yang berbeza dan ekspresi gen khusus segmen, yang dipelihara dalam kalangan vertebrata (Verlander, 1998; Desgrange dan Cereghini, 2015). Semua jenis buah pinggang mengikut laluan perkembangan yang sama. Empat peringkat berikut terlibat secara berturut-turut dalam pembangunan nefron; A: induksi mesoderm perantaraan untuk membentuk primordium buah pinggang, B: epitelialisasi dan pertumbuhan saluran nefrik, C: corak nefron kepada segmen khusus, dan D: vaskularisasi nefron untuk penapisan darah (Drummond, 2003).
Kaedah untuk menjana model ikan zebra penyakit buah pinggang manusia
Ikan Zebra mempunyai sepasang pronephros yang mula terbentuk selepas 12 jam selepas persenyawaan (hpf) dan berfungsi sepenuhnya sebanyak 48 hpf. Ketersediaan jujukan genom keseluruhan, 71 peratus gen manusia mempunyai sekurang-kurangnya satu ortolog ikan zebra, kemudahan pengendalian, embrio telus, masa penjanaan yang singkat, teknik manipulasi gen yang cekap, kaedah untuk penjanaan ikan transgenik dan pemeriksaan pantasnya menjadikan ikan zebra sebagai organisma model yang paling sesuai untuk mengkaji keabnormalan buah pinggang (Howe et al., 2013; Poureetezadi dan Wingert, 2016). Salah satu ciri penting ikan zebra dewasa ialah keupayaannya untuk menjana semula nefron baru melalui proses neo-nephrogenesis sebagai tindak balas kepada kecederaan buah pinggang (Chambers dan Wingert, 2016). Jadual 3 menerangkan perbandingan antara ikan zebra dan organisma model biasa lain seperti tikus dan Xenopus. Manipulasi genetik dalam ikan zebra telah menunjukkan bahawa komponen genetik novel perkembangan dan fungsi buah pinggang boleh dikenal pasti dengan menggunakan organisma model ini (Poureetezadi dan Wingert, 2016). Terdapat beberapa kaedah untuk menjana model ikan zebra penyakit buah pinggang manusia.
Genetik ke hadapan
Skrin genetik hadapan digunakan untuk mengenal pasti gen yang dikaitkan dengan fenotip yang diminati (Lawson dan Wolfe, 2011). Kedua-dua mutagenesis kimia dan sisipan digunakan dalam skrin genetik hadapan (Patton dan Zon, 2001). Mutagenesis kimia ialah saringan berasaskan tiga generasi di mana lelaki dewasa dirawat dengan mutagen kimia seperti etil metana sulfonat (EMS), etil nitrosourea (ENU), atau mutagen fizikal seperti sinaran gamma untuk menghasilkan beberapa mutasi dalam sel kuman (Varshney dan Burgess, 2014). Ikan yang membawa mutasi kemudiannya disilangkan dengan betina jenis liar untuk menghasilkan ikan F1 yang mengandungi alel unik mutasi yang dijana. Ikan F1 disilang keluar untuk menjana pembawa F2 yang kemudiannya disilang untuk mendapatkan mutan homozigot mereka dalam generasi F3. Keturunan yang mempunyai fenotip yang dikehendaki kemudiannya diasingkan dan digunakan untuk pemetaan dan penjujukan genetik untuk mengenal pasti gen yang bermutasi (Patton dan Zon, 2001). Variasi lain skrin ini, seperti menggunakan diploid haploid dan homozigot, boleh membantu mengurangkan masa dan usaha yang diperlukan untuk mengenal pasti fenotip dan mutasi genetik penyebab (dibincangkan secara terperinci oleh Patton dan Zon, 2001). Barisan wartawan transgenik yang menyatakan protein pendarfluor dalam organ yang diminati boleh digabungkan dengan pemeriksaan genetik ke hadapan konvensional untuk menyaring mutan yang diminati dengan mudah. Skrin mutagenesis berasaskan ENU membawa kepada pengenalpastian ikan zebra mutant mentol cahaya (lib) yang menunjukkan kecacatan pembahagian morfologi dan nefron serupa dengan embrio ikan zebra yang kekurangan asid retinoik (RA). Didapati bahawa mutan lib mempunyai peralihan C ke A pada nukleotida 174 aldh1a2, yang diramalkan akan mensintesis protein terpotong 58 panjang asid amino, sekali gus membatalkan fungsi aldh1a2 dan menjejaskan sintesis RA daripada retinaldehid. Analisis lib, mutan tanpa leher (nls) yang mempunyai mutasi titik dalam domain pemangkin aldh1a2 dan DEAB (perencat sintesis asid retinoik) yang dirawat embrio mendedahkan bahawa tahap RA memodulasi pembahagian nefron dengan mengubah ekspresi spatial bagi faktor transkripsi khusus segmen (Wingert dan Davidson, 2011; Begemann et al., 2001; Mullins et al., 1994). Mutan lain yang dipanggil Zeppelin membantu mengenal pasti brac2 sebagai pengawal selia pembangunan podocyte (Kroeger et al., 2017).
Mutagenesis sisipan ialah kaedah berasaskan transposon atau anti-virus yang digunakan untuk memasukkan DNA secara rawak pada lokus genomik yang berbeza, dan DNA asing ini kemudiannya membantu mengenal pasti gen yang bermutasi (Amsterdam et al., 1999). Makmal Hopkins di MIT melakukan skrin mutagenesis sisipan dalam embrio ikan zebra menggunakan vektor retroviral. Mereka mengenal pasti 12 gen yang dikaitkan dengan fenotip buah pinggang yang rosak yang menunjukkan sista di kawasan tiub glomerular, di antaranya empat dikaitkan dengan pembentukan silia (Sun et al., 2004). Kelemahan pendekatan genetik ke hadapan ialah proses pemeriksaan adalah rumit dan memakan masa. Walau bagaimanapun, kemajuan dalam teknologi penjujukan baharu telah menjadikan pendekatan genetik ke hadapan lebih cekap.
Gen kalah mati menggunakan nuklease boleh atur cara
Salah satu kelebihan utama menggunakan ikan zebra sebagai organisma model ialah ketersediaan teknik penyuntingan genom yang cekap seperti CRISPR/Cas, TALEN, dan ZFN (Sertori et al., 2016). CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)/ Cas9 ialah teknologi penyuntingan genom yang paling serba boleh dan biasa digunakan dalam ikan zebra. Chimera CRISPR RNA (crRNA) dan trans-activating crRNA (tracrRNA) direka sebagai RNA panduan tunggal (sgRNA), yang bersama-sama dengan protein/mRNA Cas9 disuntik ke dalam embrio ikan zebra pada peringkat satu sel (Varshney et al. , 2016). SgRNA mengikat pada jujukan DNA sasaran 20bp bersebelahan dengan jujukan NGG protospacer bersebelahan (PAM) dalam genom, Cas9 kemudian menjana potongan dua helai dalam jujukan DNA sasaran. Ini kemudian sebaik-baiknya dibaiki dengan penyambungan hujung bukan homolog, yang merupakan mekanisme pembaikan yang terdedah kepada ralat yang mengakibatkan penjanaan sisipan/pemadaman rawak (indel) yang membawa kepada perubahan dalam bingkai bacaan urutan pengekodan, dan akibatnya, membatalkan fungsi gen yang diminati. Metodologi lanjutan telah dibangunkan dalam beberapa tahun kebelakangan ini untuk meningkatkan keberkesanan teknik penyuntingan genom berasaskan CRISPR (Liu et al., 2019). Adalah mungkin untuk memadamkan serpihan DNA yang besar menggunakan dua atau lebih sgRNA pada satu masa (Kim dan Zhang, 2020). Ia juga mungkin untuk menyasarkan berbilang gen secara serentak dalam satu embrio ikan zebra (Shah et al., 2016). Banyak kajian telah dijalankan untuk menjana mutan ikan zebra untuk menyusun semula penyakit buah pinggang manusia dengan menggunakan teknologi CRISPR/Cas9. Kalah mati CRISPR-pengantara protein membran ciliary Arl13b menghasilkan penjanaan mutan yang meniru "sindrom Joubert" (Cantagrel et al., 2008). Dilaporkan bahawa mutasi dalam gen ELMO1 manusia menyumbang kepada nefropati diabetik. ikan zebra mutan elmo1 mempamerkan fenotip yang dilihat dalam embrio hiperglisemik yang dihasilkan oleh ketukan gen pdx1 seperti glomerulus yang lebih besar, podosit yang rosak, leher yang lebih pendek, dan hiperfiltrasi, sekali gus menyerlahkan fungsi pemuliharaan gen ini (Sharma et al., 2016). Ikan zebra magi2a mutan mempamerkan sindrom nefrotik tahan steroid yang juga diperhatikan pada orang yang mengalami mutasi dalam MAGI2 (Jobst-Schwan et al., 2019). Pemerhatian ini menyerlahkan kesesuaian ikan zebra sebagai organisma untuk memodelkan penyakit buah pinggang manusia.
Kaedah lain untuk menjana mutan ikan zebra ialah Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALEN) berdasarkan penyuntingan genom. Dalam teknik ini, domain pengikatan DNA TALE terdiri daripada monomer, setiap monomer terdiri daripada ulangan tandem 34 sisa asid amino yang mengikat kepada nukleotida tertentu dalam jujukan DNA. Urutan TALE ini berasal daripada bakteria patogen Xanthomonas yang mengubah transkripsi gen dalam sel perumah (Boch dan Bonas, 2010). Konstruk sasaran TALEN terdiri daripada isyarat penyetempatan nuklear, domain pengikat DNA, dan domain nuklease FokI pada termini karboksil mereka. TALEN bekerja secara berpasangan dengan tapak pengikatnya terletak pada helai DNA bertentangan yang dipisahkan oleh jujukan spacer 12 hingga 25 bp. Konstruk mengikat tapak sasaran dalam nukleus dan menjana pemecahan dua helai, yang kemudiannya dibaiki oleh sambungan hujung yang tidak homolog (Liu et al., 2014). Ikan zebra mutan yang dihasilkan oleh CRISPR atau TALEN boleh mengaktifkan gen yang mengimbangi kehilangan gen yang diminati, sekali gus menyukarkan untuk mendedahkan fungsi gen (Rossi et al., 2015). Walau bagaimanapun, adalah mungkin untuk mengenal pasti gen pampasan ini dengan analisis transkrip menggunakan kaedah penjujukan generasi akan datang (NGS), yang boleh membantu mengenal pasti fungsi gen yang diminati. Pengenalpastian gen dan laluan molekul yang mengimbangi kehilangan fungsi gen boleh membantu mencari kaedah rawatan baru untuk mutasi gen yang menyebabkan penyakit serius (El-Brolosy dan Stainier, 2017).
Gen knock-down menggunakan oligos antisense morpholino
Morpholinos ialah oligonukleotida bukan anionik yang agak stabil berbanding dengan oligomer DNA atau RNA mereka (Summerton, 1999). Oligonukleotida antisense morpholino mengikat kepada mRNA protein sasaran di tapak permulaan terjemahannya dan menyekat terjemahannya. Satu lagi jenis oligos antisense morpholino boleh menyasarkan persimpangan splicing dan menyekat penyambungan pra-mRNA (Summerton, 1999). Kesan oligo Morpholino-antisense bersifat sementara dan boleh digunakan untuk mengkaji peranan perkembangan awal gen yang diminati. Suntikan oligo morpholino-antisense dilakukan pada 1-4 peringkat sel embrio ikan zebra dan kesannya boleh dilihat sehingga 3-5 hari selepas persenyawaan (pdf) (Bill et al., 2009). Morpholino antisense oligonucleotides sering memaparkan kesan luar sasaran (Robu et al., 2007). Eksperimen kawalan seperti eksperimen menyelamat perlu dilakukan dengan menyuntik morpholino bersama mRNA yang tidak boleh disasarkan oleh oligo antisense ini untuk mengesahkan kekhususannya (Eisen dan Smith, 2008). Morfolino yang diaktifkan foto telah dibangunkan, yang aktivitinya boleh dikawal secara spatial dan sementara oleh pendedahan UV (Tallafuss et al., 2012). Banyak kajian telah dijalankan menggunakan gen morpholino antisense oligo-mediated knock-down untuk memahami penyakit buah pinggang manusia. Contohnya, penurunan gen nephrocystin-3 membawa kepada pembentukan sista dan hidrosefali dalam embrio ikan zebra dengan cara yang serupa dengan penyakit jenis nephronophthisis-3 (Zhou et al., 2010).
Antibiotik aminoglycoside yang biasanya digunakan untuk merawat banyak jangkitan yang mengancam nyawa terkenal dengan kesan nefrotoksik dan ototoksiknya (Mingeot-Leclercq dan Tulkens, 1999). Gentamicin ialah antibiotik yang biasa digunakan yang boleh menyebabkan kecederaan buah pinggang akut (AKI) dalam ikan zebra. Gentamicin menyebabkan perataan epitelium sempadan berus, kehilangan epitelium tiub, ubah bentuk struktur glomerulus, fosfolipidosis lisosom, dan pengumpulan leukosit atau serpihan sel dalam lumen tiub, yang meniru overdosis gentamicin pada manusia (Cianciolo Cosentino201 et al., ). Ikan zebra boleh menjana semula dan menggantikan nefron yang rosak. Penghinaan Gentamicin boleh digunakan untuk mengkaji pertumbuhan semula buah pinggang dalam ikan zebra (Kamei et al., 2015). Kecederaan Gentamicin mendorong tindak balas penjanaan semula yang mencetuskan sel stem buah pinggang untuk menjalani peringkat spesifikasi, percambahan, dan pembezaan untuk menjana nefron baharu. Ia mengambil masa sekitar 14 hingga 21 hari dalam ikan dewasa untuk menjana semula nefron (Diep et al., 2011; McCampbell et al., 2015). Cisplatin, yang digunakan sebagai ubat kemoterapi untuk merawat tumor, juga mempunyai kesan nefrotoksik, seperti yang diperhatikan dalam ikan zebra (Hentschel et al., 2005). Etimicin ialah aminoglikosida lain yang boleh digunakan sambil meniru nefrotoksisiti rendah dan ototoksisiti dalam embrio ikan zebra (Shao et al., 2020). Oleh itu, AKI dan penjanaan semula buah pinggang boleh dikaji dalam ikan zebra dengan bantuan antibiotik ini.
Kecederaan mekanikal pada buah pinggang
Pronephros ikan zebra boleh cedera secara fizikal menggunakan reseksi, tikaman atau cryoinjury. Kecederaan pembedahan boleh dilakukan dengan menggunakan pinset halus untuk menikam kawasan pronephros yang dikehendaki untuk mencipta model AKI. Teknik ini digunakan untuk merosakkan saluran pronefrik berhampiran kloaka, yang menjejaskan aliran cecair dan menyebabkan pembentukan sista dalam masa 30 minit (Kramer-Zucker, 2005). Didapati bahawa pengurangan kadar aliran bendalir dalam pronephros menjana tekanan belakang di tapak kemasukan bendalir, menyebabkan pengembangan luminal tubul dan pembentukan sista. Satu lagi kumpulan penyelidik membuat halangan dalam tubul pronefrik pada 50 hpf atau dalam tubul mesonefrik 12-ikan zebra berumur sebulan dengan menggunakan pinset untuk mencubit kawasan berhampiran tubul pengumpul distal (Hellman et al., 2010). Mereka mendapati bahawa parut tubul membawa kepada peningkatan dalam kadar denyutan silia dan penyelarasan faktor transkripsi foxj1a yang mengawal ekspresi gen lipogenik. Ini menunjukkan bahawa kecederaan pada tubul pronephric menjana isyarat mekanosensori berasaskan silia untuk mengekalkan homeostasis nefron.
Kecederaan buah pinggang akibat laser
Ablasi sel pengantara laser digunakan sebagai alat untuk mengkaji kecederaan buah pinggang dan meniru AKI dalam ikan zebra. Johnson et al., (2011) telah menerangkan kaedah untuk ablasi pengantaraan laser diikuti dengan pengesanan nefron yang menjana semula. Mereka menyuntik 40 kDa dextran-FITC dalam somit batang embrio ikan zebra pada 48-55 hpf untuk melabelkan sel epitelium tubul proksimal, yang kemudiannya disasarkan untuk ablasi pengantaraan laser pada 72 hpf. Embrio yang ablasi kemudiannya disuntik semula dengan rhodamine dextran untuk mengesan sel epitelium tubul proksimal. Mereka mendapati bahawa tubul proksimal yang dibangunkan sepenuhnya telah terbentuk pada hari ke-7 selepas ablasi pengantaraan laser (Johnson et al., 2011). Alternatif lain ialah menggunakan garis transgenik khusus buah pinggang untuk mengenal pasti sel untuk ablasi pengantaraan laser dan memantau tingkah laku sel jiran. Cahaya laser violet dengan panjang gelombang 405 nm digunakan untuk menyasarkan tubul pronephric Tg(atp1a1a.4:GFP) zebrafish (Palmyre et al., 2014). Oleh kerana spektrum pengujaan GFP terletak dalam julat cahaya biru hingga ungu, ia menyerap cahaya laser 405 nm, yang bertindak sebagai sinki tenaga yang berpotensi menyebabkan kecederaan pada sel epitelium sasaran. Eksperimen ini membawa kepada penemuan bahawa penghijrahan sel adalah tindak balas utama epithelia yang cedera. Penghijrahan sel kolektif menyebabkan regangan mekanikal yang memberikan rangsangan untuk percambahan sel untuk membaiki tubul yang cedera. Untuk menentukan masa apabila tubul pronefrik ikan zebra memperoleh keupayaan penjanaan semula, Yakulov et al., (2018) menggunakan 2-laser foton untuk mengablasi sebahagian kecil tubul pronefrik dalam Tg(cldn2b:lyn-GFP) embrio pada titik masa yang berbeza dan mengikuti proses penjanaan semula. Mereka mendapati bahawa ablasi tubul pronephric 2-embrio berumur sehari telah dibaiki dengan pantas melalui tindak balas migrasi, manakala 1-embrio berumur sehari tidak mempunyai keupayaan ini. Mereka menjalankan pemprofilan ekspresi gen bagi embrio ikan zebra yang cedera dan mendapati bahawa cxcr4b dan mika terlibat dalam proses pembaikan ini (Yakulov et al., 2018).
Genetik kimia
Molekul bioaktif kecil boleh digunakan untuk mengganggu fungsi protein dan memahami peranan biologinya. Sebilangan besar perpustakaan kimia tersedia secara komersil atau boleh dibuat khas untuk menyelidik fungsi protein. Perpustakaan molekul kecil ini termasuk perencat kinase, perencat protease, reseptor nuklear, dan ligan yang boleh digunakan untuk mengenal pasti peranan laluan isyarat yang terlibat dalam perkembangan dan fungsi organ (Kawasumi dan Nghiem, 2007). Dalam beberapa dekad kebelakangan ini, ikan zebra telah muncul sebagai organisma model vertebrata yang kuat untuk pemeriksaan kimia berdaya tinggi dan pemarkahan fenotip (Kaufman et al., 2009). Cao et al., (2009) menggunakan pendekatan skrin kimia untuk mengenal pasti sebatian yang boleh membalikkan fenotip yang disebabkan oleh mutasi dalam pkd2 (gen penyebab PKD) dan ift172 (gen yang bertanggungjawab untuk pembentukan silia). Mereka mendapati bahawa perencat pan-histone deacetylase (pan-HDAC) trichostatin A (TSA) dan asid valproik (VPA) perencat HDAC khusus kelas-I boleh menyekat pembentukan sista buah pinggang dalam model kalah mati pkd2 (Cao et al., 2009). ). Oleh itu, genetik kimia boleh menjadi alat yang berguna untuk mengenal pasti calon ubat baru yang sama ada boleh membalikkan atau menyekat keadaan penyakit.
Model kecederaan buah pinggang yang boleh disebabkan secara genetik
Model ablasi tisu yang boleh diinduksi secara genetik boleh digunakan dalam ikan zebra di mana nitroreduktase bakteria (NTR) dinyatakan di bawah kawalan promoter pilihan yang memacu ekspresi NTR dalam segmen tertentu pronephros. NTR menukar metronidazole kepada metabolit sitotoksik yang boleh menyebabkan kematian kepada sel yang mengekspresikan NTR (Curado et al., 2008). Zhou dan Hildebrandt (2012) menggunakan teknik ini untuk mendorong kecederaan podosit dengan menyatakan NTR di bawah kawalan promoter podocin dalam garisan ikan zebra Tg(pod: NTR-mCherry). Mereka juga membangunkan garis transgenik berganda VDBP-GFP (protein pengikat Vitamin D yang ditandakan dengan GFP) sebagai pengesan proteinuria bersama-sama dengan garis Tg(pod: NTR-mCherry). Rawatan dengan metronidazole menyebabkan kecederaan podocyte yang mengakibatkan edema seluruh badan dan pengumpulan VDBP-GFP dalam tubul proksimal, meniru fenotip sindrom nefrotik manusia (Zhou dan Hildebrandt, 2012).
Kaedah untuk menilai perkembangan dan fungsi pronephros dalam ikan zebra
Kami telah menerangkan kaedah untuk menjana model penyakit buah pinggang manusia dengan menggunakan ikan zebra. Penciptaan model penyakit menggunakan organisma lain adalah langkah awal, yang perlu dinilai untuk keupayaannya untuk menyusun semula pelbagai aspek penyakit yang dilihat pada manusia dengan setia. Zebrafish menawarkan banyak kelebihan yang boleh digunakan untuk menilai dengan cepat keupayaannya untuk berfungsi sebagai pengganti untuk memahami penyakit buah pinggang manusia seperti yang dibincangkan di bawah.
Saringan berasaskan morfologi
Selalunya embrio ikan zebra mutan menunjukkan perbezaan morfologi, berbanding dengan jenis liar yang boleh dinilai dengan mudah melalui pemerhatian di bawah mikroskop. Ketelusan embrio ikan zebra dan keupayaannya untuk bertahan sehingga 5 hari walaupun dengan kecacatan perkembangan yang teruk adalah kelebihan utama dalam skrin berasaskan morfologi. Perubahan morfologi yang biasa diperhatikan dalam embrio ikan zebra dengan pronephros yang cacat termasuk edema perikardial, sista pronefrik, paksi badan melengkung, dan hidrosefalus (Poureetezadi dan Wingert, 2016; Outtandy et al., 2019). Edema adalah salah satu tanda biasa buah pinggang yang rosak yang juga dilihat pada kekurangan organ lain seperti perkembangan jantung (Hanke et al., 2013). Mutan dengan kecacatan buah pinggang boleh membina sista kerana percambahan ver-sel epitelium lain, seperti yang boleh diperhatikan dengan mudah di bawah mikroskop (Zhao dan Malicki, 2007; Yamaguchi et al., 2006). Paksi badan melengkung sering dilihat pada mutan yang mempunyai kecacatan silia pronephric. Ikan zebra mutan seperti Locke (lok), shen yantf214a(pemalu), garbustm304 (grb), dan zatortg238a (zar) adalah beberapa contoh lain yang menunjukkan paksi badan melengkung (Zhao dan Malicki, 2007). Mutan ikan zebra dengan kecacatan buah pinggang menunjukkan pelbagai kecacatan morfologi dalam embrio yang sama. Kejatuhan dua gen polycystin pkd1a dan pkd1b membawa kepada paksi badan melengkung secara lisan, hidrosefali, rawan, dan kecacatan kraniofasial dengan frekuensi rendah sista pronephric (Mangos et al., 2010). Mutan protein pengangkutan intraflagellar ift57, ift88, dan ift172, di mana silia rosak, mempunyai paksi badan melengkung ventral (Lunt et al., 2009). Oleh itu, mutan ikan zebra dengan buah pinggang yang rosak mempamerkan banyak ciri morfologi yang boleh dikenal pasti dengan mudah.
Untuk maklumat lanjut: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
