Kenalan:jerry.he@wecistanche.com

LP Arantes1, ML Machado1, DC Zamberlan1, TL da Silveira1, TC da Silva1, IBM da Cruz1 , EE Ribeiro2, M. Aschner3 dan FAA Soares1

1Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, RS, Brasil 2Universidade Aberta da Terceira Idade, Universidade do Estado do Amazonas, Manaus, AM, Brasil

3Jabatan Farmakologi Molekul, Kolej Perubatan Albert Einstein, Bronx, NY, Amerika Syarikat

Cistanche mempunyai kesan anti-penuaan

Abstrak

Guarana (Paullinia cupana) lazimnya dimakan oleh orang di rantau Amazon dan merupakan bahan utama dalam pelbagai minuman tenaga yang digunakan di seluruh dunia. Lanjutan dalam umur panjang dan kelaziman rendah penyakit berkaitan usia kronik telah dikaitkan dengan pengambilan guarana yang lazim.Yang anti penuaanpotensi guarana juga ditunjukkan dalam Caenorhabditis elegans; bagaimanapun, mekanisme yang terlibat dalam kesannya tidak jelas. Di sini, kami menyiasat laluan dugaan yang mengawal kesan ekstrak etanol guarana (GEE) pada jangka hayat menggunakan C. elegans. Laluan panjang umur utama yang diketahui telah dianalisis melalui cacing mutan dan ujian RT-qPCR (DAF-2, DAF-16, SKN-1, SIR-2.1, HSF{{6 }}). Kemungkinan penglibatan isyarat purinergik juga disiasat. Kajian ini menunjukkan bahawa GEE bertindak melaluiantioksidanaktiviti, laluan DAF-16, HSF-1 dan SKN-1, dan ortolog reseptor adenosin manusia (ADOR-1) untuk memanjangkan jangka hayat. GEE turut menurunkan kawal selia skn-1, daf-16, tuan-2.1 dan hsp-16.2 dalam 9-C. elegans berusia sehari, yang mungkin mencerminkan kurang perlu mengaktifkan gen pelindung ini kerana langsungantioksidankesan. Keputusan kami menyumbang kepada pemahaman kesan guarana dalam vivo, yang mungkin membantu untuk mencegah atau merawat gangguan yang berkaitan dengan penuaan, dan juga mencadangkan isyarat purinergik sebagai sasaran terapeutik yang munasabah untuk kajian umur panjang.

Kata kunci: Penuaan; Antioksida; Guarana; Jangka hayat; Produk semulajadi; Xanthines

pengenalan

Paullinia cupana, juga dirujuk sebagai guarana, adalah tumbuhan asli di lembangan Amazon dan terutamanya biasa di Brazil. Serbuk biji benihnya lazimnya dimakan oleh semua peringkat umur di rantau Amazon terutamanya untuk sifat tonik dan perangsangnya (1). Selain itu, guarana adalah bahan utama dalam pelbagai minuman tenaga yang digunakan di banyak negara (2). Kesan farmakologi guarana lain yang dilaporkan termasuk penurunan berat badan, menurunkan sintesis tromboxane platelet, melindungi daripada lesi gastrik, aktiviti antioksidan, dan kesan anti-radang [untuk semakan lihat: (1)]. Walau bagaimanapun, apabila diambil secara berlebihan, guarana juga boleh menjejaskan kesihatan manusia, menyebabkan kebimbangan, gangguan tidur, dan takikardia, contohnya, disebabkan kandungan kafein yang tinggi (2,3).

Lanjutan umur panjang pada orang yang tinggal di Maués, rantau Amazon di Brazil, telah dikaitkan dengan diet Amazon, termasuk pengambilan guarana yang biasa (4). Tambahan pula, kajian epidemiologi mengaitkan pengambilan guarana dengan kelaziman rendah penyakit berkaitan usia kronik dalam populasi Amazon (5). Baru-baru ini, satu kajian juga menunjukkananti penuaanpotensi ekstrak biji guarana dalam Caenorhabditis elegans (6). Walau bagaimanapun, mekanisme yang mendasari kesan guarana terhadap penuaan tidak dikenalpasti.

C. elegans telah menjadi model yang sesuai untuk memahami tindak balas organisma terhadap pelbagai sebatian sintetik dan semula jadi serta pengaruhnya terhadap penuaan dan jangka hayat. Laluan biologi penting dan pelbagai aspek penuaan adalah serupa dalam nematod dan mamalia, termasuk manusia (7).

Memandangkan peratusan orang tua semakin meningkat di seluruh dunia disertai dengan peningkatan kekerapan penyakit berkaitan usia, adalah penting untuk mengenal pasti terapi yang berkesan dan sasaran terapeutik yang mungkin meningkatkan kualiti hidup (8). Di sini, kami menyiasat laluan dugaan yang mengawal kesan guarana pada jangka hayat menggunakan C. elegans.

Bahan dan Kaedah

Bahan kimia

Agar, etanol (96 peratus ), kloroform, kolesterol, FUDR (5-uoro-20-deoxyuridine), perencat protease, koktel perencat fosfatase, primer tindak balas rantai polimerase (PCR), dan albumin serum lembu (BSA) telah dibeli dari Sigma (AS). Primer TaqMans yang digunakan untuk analisis qRT-PCR dan Trizol dibeli daripada Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific Corporation (USA). Semua reagen lain telah dibeli dari Synth (Brazil).

Terikan dan penyelenggaraan

Strain yang digunakan dalam kajian ini ialah Bristol N2 (jenis liar); CB1370, daf-2 (e1370) III; CF1038, daf-16 (mu86) I; EU1, skn-1(zu67); PS3551, hsf-1(sy441) I; TK22, mev-1(kn1); dan VC199, tuan-2.1(ok434), diperoleh daripada Pusat Genetik Caenorhabditis (CGC), Universiti Minnesota, Amerika Syarikat, serta Escherichia coli OP50. EG6890 strain, ador-1 (ox489), telah dibekalkan daripada makmal Dr. Erik Jorgensen (University of Utah, USA). Strain ini mempunyai pemadaman daripada 1 kb hulu dan tiga ekson pertama gen ador-1, dan telah dilangkau 6 kali; gen ador-1 mengekod ortolog reseptor adenosin manusia (9).

Nematod dikekalkan dan diuji pada 20 darjah pada plat agar medium pertumbuhan nematod (NGM) yang membawa rumput E. coli OP50 (10). Penyegerakan kultur nematod dicapai dengan rawatan pelunturan hermafrodit gravid dan telur dibenarkan menetas semalaman dalam penimbal M9 (42 mM Na2HPO4, 22 mM KH2PO4, 8.5 mM NaCl, dan 1 mM MgSO4) (10).

Penyediaan bahan tumbuhan dan ekstrak

Serbuk biji panggang Paullinia cupana Kunth var. sorbilis (Mart.), guarana, telah diasingkan dan dibekalkan oleh EMBRAPA Oriental (Agropecuary Research Brazilian Enterprise) yang terletak di Amazon Barat di Maués, Amazonas, Brazil. Ekstrak hidro-alkohol diperoleh seperti yang diterangkan di tempat lain (11). Secara ringkas, ekstrak dihasilkan menggunakan 70 peratus etanol. Selepas 24 jam, larutan yang terhasil ditapis, etanol dikeluarkan, dan ekstrak diliofilkan. Xantin dan katekin utama yang dibentangkan dalam ekstrak guarana telah dianalisis dengan menggunakan HPLC, menunjukkan kepekatan berikut: kafein=12.240 mg/g, theobromine=6.733 mg/g dan jumlah katekin{{ 9}}.336 mg/g (11).

Rawatan cacing

Plat NGM yang membawa rumput E. coli OP50 (sebagai sumber makanan) sebelum ini diinkubasi pada 37 darjah semalaman. Ekstrak etanol guarana terliofil (GEE) telah dilarutkan dalam air diautoklaf suling sejuk (121 darjah, 30 min) dan tersebar di atas plat pada kepekatan akhir 100, 500 dan 1,000 mg/mL agar. Larva L1 yang disegerakkan (10) dipindahkan dengan pipet ke permukaan plat rawatan dan dikultur hingga dewasa pada suhu 20 darjah .

Jangka hayat

Analisis jangka hayat bermula pada larva L4 dalam plat NGM yang disemai dengan E. coli OP50 tanpa kehadiran atau kehadiran GEE (hari 0). Haiwan dipindahkan ke pinggan segar dengan atau tanpa GEE setiap hari untuk mengelakkan kekeliruan generasi, dan menjaringkan gol pada masa yang sama sehingga kematian. Ketiadaan tindak balas kepada rangsangan mekanikal dijaringkan sebagai kematian. Cacing ditapis jika ia merangkak keluar dari pinggan, memaparkan organ dalaman tersemperit, atau mati kerana menetas keturunan di dalam rahim. Ujian jangka hayat diulang tiga kali dengan 60-120 cacing setiap ujian. Melalui strain mutan, laluan jangka hayat utama yang diketahui telah dianalisis (12,13): i) daf-2 dan daf-16, faktor pertumbuhan seperti insulin/insulin (IGF){{11} } isyarat (IIS), yang diberi isyarat oleh reseptor DAF-2 melalui laluan PI3-kinase/ AKT yang terpelihara dan ke bawah mengawal DAF-16/FOXO, bertanggungjawab untuk mempromosikan ekspresi gen yang memberikan jangka hayat yang panjang dan rintangan tekanan yang dipertingkatkan; ii) skn-1, yang berkaitan dengan protein keluarga Nrf vertebrata dan menggalakkan ekspresi enzim detoksifikasi sebagai tindak balas kepada tekanan oksidatif, seperti glutathione-S-transferase; iii) tuan-2.1, yang mengekod protein seperti deacetylase histon yang menyepadukan status metabolik dengan jangka hayat, dan dikaitkan dengan sekatan kalori; dan iv) hsf-1, yang mengekodkan faktor transkripsi renjatan haba-1 (HSF-1) dan mendorong pengaktifan pelbagai gen renjatan haba atau pendamping yang terlibat dalam mengekalkan homeostasis konformasi protein antara fungsi penting yang lain. Kemungkinan hubungan antara umur panjang dan isyarat purinergik juga telah disiasat melalui{31}} ketegangan mutan.

Memandangkan bakteria memainkan peranan dalam kematian C. elegans, pertumbuhan E.coli OP50 dinilai dengan kehadiran atau ketiadaan GEE untuk menyiasat sama ada kesan berfaedah boleh menjadi tindak balas kepada sifat antimikrob. Penyerapan bakteria telah diukur dalam tempoh 12-j dalam medium cecair (14).

Jangka kesihatan

Parameter tingkah laku yang berkaitan dengan rentang kesihatan telah dinilai (15). Pengepaman pharyngeal dinilai dengan mikroskop Nikon E200 dengan memerhatikan bilangan pengecutan pharyngeal semasa selang 60-s pada dewasa muda jenis liar.

Kekerapan thrash telah dipilih untuk analisis pergerakan. Orang dewasa muda jenis liar daripada kawalan atau rawatan GEE telah dipilih secara individu dan diletakkan dalam setitik M9. Cacing dibenarkan untuk menyesuaikan diri selama 1 minit dan kemudian bilangan thrashes dikira dengan mikroskop Nikon E200 semasa selang 20-s. Thrash ditakrifkan sebagai perubahan arah lenturan di bahagian tengah badan.

Analisis telah dijalankan dalam tiga ujian bebas. Tiga puluh nematod telah diperiksa setiap kumpulan.

Pengasingan RNA dan tindak balas rantai polimerase masa nyata (RT-qPCR)

Cacing jenis liar dalam 9-cacing dewasa berumur sehari telah dianalisis untuk ekspresi gen yang berkaitan dengan umur panjang dan tindak balas tekanan oksidatif. Selepas dewasa, cacing dipindahkan setiap hari ke pinggan yang mengandungi 150 mM FUDR (5-uoro-20-deoxyuridine) untuk menghalang pembiakan, sama ada GEE atau tiada. RNA daripada 20,000 cacing setiap keadaan telah diasingkan menggunakan Trizol diikuti dengan pengekstrakan kloroform, seperti yang diterangkan sebelum ini (16) dan 1 mg input RNA telah ditranskripsi terbalik kepada cDNA oleh Applied Biosystems kit transkripsi terbalik cDNA berkapasiti tinggi (Applied Biosystems , USA). Analisis ekspresi telah dilakukan oleh analisis Tatasusunan TaqMans Tersuai menggunakan ujian TaqMans Gene Expression yang sepadan untuk mitokondria superoksida dismutase sod-3 (Ce02404515_g1), glutathione-S-transferase gst-4 (Ce{ {16}}g1), gamma glutamylcysteine ​​synthetase gcs-1 (Ce02436726_g1), daf-16 (Ce02422835_g1), tuan-2.1 (Ce02 459018_g1), hsf-1 (Ce02423758_m1), protein kejutan haba hsp-16.2 (Ce02506738_s1) dan skn{ {35}} (Ce02407445_g1) (Biosistem Gunaan). Ekspresi gen sasaran telah dinormalkan kepada nilai ekspresi actin afd-1 (Ce02414 573_m1). Ekspresi relatif setiap gen ditentukan oleh kaedah 2 DDCt (17) dan data dilaporkan sebagai perubahan lipatan dalam tahap mRNA berbanding dengan afd-1. Eksperimen ini dijalankan dalam tiga persediaan cacing bebas, masing-masing dalam tiga kali ganda.

Analisis statistik

Analisis statistik telah dilakukan menggunakan GraphPad Prism versi 5 untuk Windows (GraphPad Software, USA). Keputusan dilaporkan sebagai min ±SD sekurang-kurangnya tiga eksperimen individu. Ujian-t pelajar digunakan untuk membandingkan pasangan kumpulan, manakala ANOVA satu atau dua hala diikuti dengan ujian post hoc Bonferroni digunakan untuk membandingkan tiga atau lebih kumpulan. Semua lengkung kelangsungan hidup dianalisis oleh ujian peringkat log (Mantel-Cox). Kepentingan statistik telah ditentukan sebagai Po0.05.

Keputusan

Dalam kajian kami, kawalan jenis liar C. elegans mempunyai jangka hayat purata 11 hari dan jangka hayat maksimum 14 hari. Dalam media yang mengandungi GEE, purata jangka hayat cacing jenis liar dilanjutkan kepada 13 hari pada 100 mg/mL (18 peratus ) dan kepada 15 hari pada 500 dan 1,000 mg/mL (36 peratus ). Jangka hayat maksimum dilanjutkan dengan purata 28 peratus pada tiga kepekatan yang diuji (Jadual 1). Tiada perbezaan dalam pertumbuhan E. coli dengan kehadiran atau ketiadaan 1,000 mg/mL GEE (data tidak ditunjukkan).

Jangka kesihatan cacing juga dipanjangkan selepas rawatan GEE. Ekstrak itu melambatkan penurunan berkaitan usia dalam pengepaman pharyngeal (100, 500, dan 1,000 mg/mL) dan thrashes (1,000 mg/mL) bermula pada hari ke-9 dewasa ( Rajah 1 A dan B). Sehubungan itu, kepekatan 1,000 mg/mL GEE dan sampel 9-cacing dewasa hari telah dipilih untuk analisis lanjut.

Ekstrak GEE (1,000 mg/mL) memanjangkan jangka hayat purata mev-1 mutan sebanyak 44 peratus dan jangka hayat maksimum sebanyak 77.8 peratus (Jadual 1), menunjukkan hubungan antaraantioksidan

Ujian jangka hayat dilakukan pada 20 darjah . Jangka hayat maksimum diwakili sebagai jangka hayat purata bagi 10 peratus populasi cacing yang paling lama hidup. Setiap eksperimen diulang tiga kali bermula dengan sekurang-kurangnya 60 nematod setiap kumpulan. Data dilaporkan sebagai min±SD. *Po0.05 berbanding kumpulan yang tidak dirawat (ujian peringkat log Mantel-Cox).

Rajah 1. Kesan ekstrak etanolik Guarana (GEE) pada parameter tingkah laku yang berkaitan dengan jangka hayat. Kadar pengepaman pharyngeal (A) dan

kekerapan thrash (B) semasa penuaan dalam cacing jenis liar. Data dilaporkan sebagai min ±SD (n=30 cacing bagi setiap kumpulan). *P o0.05 berbanding kawalan (ANOVA sehala diikuti ujian perbandingan berbilang Bonferroni.

dananti penuaanaktiviti. Ekstrak juga memanjangkan purata jangka hayat daf-2, dan sir 2.1 mutan, membuktikan bahawa ekstrak tidak bertindak melalui laluan ini untuk menggalakkan lanjutan jangka hayat. Sebaliknya, rawatan itu tidak memanjangkan jangka hayat mutan daf-16, skn-1, hsf-1 dan ador-1 (Jadual 1).

PCR menganalisis modulasi gen yang dinilai oleh GEE (Jadual 2). GEE pada 1,000 mg/mL turun terkawal skn-1, daf-16, tuan-2.1 dan hsp-16.2 dalam {{9 }}orang dewasa berumur sehari. Tiada kesan diperhatikan pada ekspresi hsf-1, gst-4, gcs-1 dan sod-3.

Perbincangan

Seperti yang ditunjukkan sebelum ini (1), dalam kajian kami, ekstrak guarana juga memanjangkan jangka hayat dan jangka kesihatan jenis liar C. elegans. Oleh itu, laluan diduga yang mungkin terlibat dalamanti penuaankesan telah disiasat. Di sini,anti penuaankesan ditunjukkan pada kepekatan ekstrak yang lebih tinggi (1,000 lwn 300 mg/mL seperti yang ditunjukkan sebelum ini). Percanggahan ini mungkin disebabkan oleh perbezaan dalam penyediaan ekstrak (hidro-alkohol vs ekstrak akueus)

Jadual 2. Ekspresi mRNA perubahan lipatan gen yang berkaitan dengan umur panjang dan tekanan oksidatif dalam 9-cacing dewasa jenis liar yang dirawat dengan ekstrak etanolik guarana (GEE)

Eksperimen ini dinilai oleh RT-qPCR dan dijalankan dalam tiga persediaan cacing bebas, masing-masing dalam tiga kali ganda. Data dilaporkan sebagai cara perubahan lipatan dalam tahap mRNA berbanding afd-1 (aktin) ±SD. *Po0.05 berbanding tidak dirawat (ANOVA dua hala diikuti ujian perbandingan berbilang Bonferroni).

dan kaedah penyampaian (agar vs medium cecair) dan mungkin hasil daripada hanyut semula jadi dalam variasi genetik dalam populasi cacing (18,19).

Tekanan oksidatif nampaknya menjadi faktor utama yang mengehadkan jangka hayat dalam kedua-dua C. elegans dan manusia dan dikaitkan dengan banyak penyakit berkaitan usia (20,21), yang mengarahkan perhatian ke arahantioksidansebatian dengan kesan dalam vivo. Untuk menyiasat lanjut sama ada GEE boleh memanjangkan jangka hayatantioksidanaktiviti, kesannya pada mev-1 cacing telah dinilai. Strain ini dicirikan oleh pengeluaran berlebihan superoksida dan mempunyai jangka hayat yang lebih pendek berbanding strain jenis liar (22). Selaras dengan yang diterangkan sebelum iniantioksidankesan ekstrak guarana (6), rawatan GEE memanjangkan min dan jangka hayat maksimum cacing mev-1 dengan ketara.

Selain itu, laluan DAF-16, HSF-1 dan SKN-1, yang terlibat dalam isyarat insulin/IGF (IIS), kelihatan penting untuk lanjutan jangka hayat pengantara GEE. IIS yang dikurangkan dikaitkan dengan umur panjang dan penyesuaian kepada keadaan persekitaran yang buruk di C. elegans, Drosophila, mamalia, dan mungkin manusia (13). HSF-1 berfungsi dengan kerjasama DAF-16 untuk mengaktifkan ekspresi gen sasaran biasa, termasuk keluarga sHsp (gen protein kejutan haba kecil) (23). SKN-1/Nrf menyepadukan IIS dan mengawal tindak balas kepada tekanan oksidatif dan ekspresi gen detoksifikasi (24).

DAF-16, HSF-1 dan SKN-1 mungkin juga menjadi pengantara lanjutan rentang kesihatan dan homeostasis protein (25). DAF-16 terlibat dalam pembentukan agregat protein berat molekul tinggi yang kurang toksik (26), dan walaupun HSF-1 mengawal aktiviti pengasingan protein yang membebaskan agregat toksik kecil, ia mungkin mempunyai kesan yang menguntungkan yang menyumbang kepada pembersihan protein melalui metabolisme enzimatik (27,28). SKN-1 paling terkenal sebagai pengawal seliaantioksidandan pertahanan xenobiotik, tetapi ia juga telah terlibat dalam fungsi tambahan yang termasuk proteostasis dan peraturan metabolik (24).

Methylxanthine, sebagai kafein, adalah komponen utama guarana dan diketahui umum bahawa sebatian ini boleh bertindak melalui reseptor adenosin dalam mamalia (29). Kafein telah dikaitkan dengan kesan berfaedah, termasuk kesan berkaitan penuaan (30,31) dan penambahbaikan fenotip kemerosotan kognitif dengan menentang reseptor adenosin A1 dan A2A dalam tikus (32). Oleh itu, kami menguji sama ada lanjutan jangka hayat akibat GEE mungkin juga bergantung pada ADOR-1, homolog reseptor adenosin (33). Keputusan kami menunjukkan bahawa cacing ador-1(ox489) gagal menunjukkan jangka hayat yang dilanjutkan, menunjukkan, buat kali pertama, kemungkinan peranan sistem purinergik dalam lanjutan jangka hayat. Oleh itu, isyarat purinergik boleh dikaji secara menguntungkan pada masa hadapan sebagai sasaran yang berpotensi untuk modulasi umur panjang.

Walaupun GEE mempunyai tahap kafein yang tinggi, dan kajian terdahulu menerangkan kesan kafein dalam cacing (34–36),anti penuaankesan GEE mungkin berkaitan dengan kesan sinergik sebatian yang berbeza. Kepekatan kafein dalam ekstrak adalah jauh lebih rendah daripada kepekatan berkesan yang ditunjukkan sebelum ini dan telah ditunjukkan bahawa ekstrak alkaloid daripada guarana tidak mempunyai kesan faedah yang sama (6). Selain itu, data daripada literatur menunjukkan bahawa ekstrak boleh mempunyai aktiviti farmakologi yang lebih besar daripada sebatian terpencil (37,38).

Penurunan kawal selia skn-1, daf-16, tuan-2.1 dan hsp-16.2 dalam 9-C. elegans berusia sehari yang dirawat dengan GEE mungkin mencerminkan kurang keperluan untuk mengaktifkan gen ini untuk membaiki kerosakan sel semasa penuaan berbanding dengan cacing yang tidak dirawat, mungkin disebabkan oleh langsungantioksidankesan yang dikenakan oleh ekstrak (39,40).

Justeru, kajian ini menunjukkan bahawaanti penuaankesan guarana dimediasi olehantioksidanaktiviti dan laluan DAF-16, HSF-1 dan SKN-1. Selain itu, ADOR-1 juga diperlukan untuk kesan GEE pada jangka hayat, menunjukkan kemungkinan penglibatan sistem purinergik dalam jangka hayat yang panjang. Keputusan kami menyumbang kepada pemahaman kesan guarana dalam vivo, yang mungkin membantu untuk mencegah atau merawat gangguan yang berkaitan dengan penuaan, dan mencadangkan isyarat purinergik sebagai sasaran terapeutik yang munasabah untuk kajian umur panjang.

Ucapan terima kasih

Penulis berterima kasih kepada Genetik Caenorhabditis

Pusat (CGC) di Universiti Minnesota, Amerika Syarikat kerana membekalkan strain cacing dan kepada makmal Dr. Erik Jorgensen (University of Utah, Amerika Syarikat) untuk membekalkan strain EG6890. Kajian ini disokong oleh Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brazil (CNPq), Coordenac¸ão de Aperfeic¸oamento de Pessoal a Nível Superior, Brazil (CAPES), PRONEM/FAPERGS/ CNPq dan MCTI/CNPq #4{72669 3}} dan #475896/ 2012-2. Michael Aschner disokong sebahagiannya oleh geran NIH R01 ES10563. Sumber pembiayaan tidak terlibat

dalam reka bentuk kajian atau tafsiran data.