LIMIT Merupakan LncRNA Imunogenik dalam Kekebalan Kanser Dan Imunoterapi

Abstrak

MHC-I membentangkan antigen tumor kepada CD{1}} sel T dan mencetuskan imuniti anti-tumor. Manusia mungkin mempunyai 30,000-60,000 RNA bukan pengekodan panjang (lncRNA). Walau bagaimanapun, ia masih kurang difahami sama ada lncRNA boleh menjejaskan imuniti tumor. Di sini, kami mengenal pasti LncRNA, yang mampu Menginduksi MHC-I dan Imunogenisiti Tumor (LIMIT) pada manusia dan tikus. Kami mendapati IFN dirangsang LIMIT, LIMIT cis-activated guanylate binding protein (GBP) gugusan gen dan GBP mengganggu perkaitan antara HSP90 dan faktor kejutan haba-1 (HSF1) - dengan itu mengakibatkan pengaktifan HSF1 dan transkripsi MHC-I jentera, tetapi bukan PD-L1. Pengaktifan CRISPR berpandukan RNA bagi LIMIT meningkatkan GBP dan MHC-I, dan meningkatkan imunogenisiti tumor dan terapi pusat pemeriksaan.

Menyenyapkan LIMIT, GBP dan/atau HSF1 mengurangkan MHC-I, imuniti antitumor terjejas dan keberkesanan imunoterapi yang tumpul. Secara klinikal, transkrip dan protein isyarat LIMIT, GBP dan HSF1-yang dikaitkan dengan MHC-I, sel T yang menyusup tumor dan tindak balas sekatan pusat pemeriksaan dalam pesakit kanser. Secara keseluruhannya, kami menunjukkan LIMIT ialah lncRNA imunogenik kanser yang tidak diketahui sebelum ini dan paksi LIMIT-GBP-HSF1 mungkin boleh disasarkan untuk imunoterapi kanser.

Kata kunci 

RNA bukan pengekodan panjang; HAD; MHC-I; IFN ; GBP; HSF1; HSP90; PD-L1; PD-1; imuniti sel T; imunoterapi kanser

pengenalan

Sekatan pusat pemeriksaan melepaskan CD8+ kuasa imun pengantaraan sel T terhadap kanser1. Kompleks histokompatibiliti utama-I (MHC-I) memainkan peranan penting dalam penyebuan dan pengaktifan sel T8+ CD2. Walau bagaimanapun, MHC-I sering dikurangkan dalam sel-sel kanser, mengakibatkan pengelakan imun tumor dan rintangan imunoterapi3,4. Adalah penting untuk memahami cara memulihkan ekspresi MHC-I tumor dan menghidupkan semula tindak balas imun antitumor5. LncRNA muncul dengan cepat bersama-sama dengan kemajuan dalam penjujukan RNA dalam, meliputi lebih banyak lokus dalam genom manusia daripada gen pengekodan protein6. LncRNA mengawal gen pengekodan protein pada pelbagai peringkat7-9 dan memainkan peranan penting dalam pencetakan genomik10, pembezaan sel11 dan perkembangan kanser12. Walau bagaimanapun, identiti, cara tindakan, fungsi, dan kaitan klinikal lncRNA tertentu dalam imuniti kanser dan imunoterapi masih tidak diketahui. Di sini, kami mengenal pasti LIMIT sebagai lncRNA imunogenik kanser yang tidak diketahui sebelum ini. LIMIT menjejaskan jentera MHC-I dan imuniti antitumor. Kami mendapati bahawa LIMIT menyasarkan GBP secara tempatan, dengan itu membentuk lata molekul LIMIT-GBP-HSF1-MHC untuk mengubah imuniti antitumor dan keberkesanan imunoterapi tumor. Kerja kami bukan sahaja mendedahkan biologi lncRNA imunogenik yang tidak diketahui sebelum ini, LIMIT tetapi juga mencadangkan bahawa paksi LIMIT-GBP-HSF1 mungkin disasarkan untuk imunoterapi kanser.

LIMIT ialah lncRNA imunogenik

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem imun

Untuk meneroka gen pengawalseliaan yang tidak diketahui dalam imuniti tumor, berdasarkan penyusupan sel T CD{0}} tumor, kami membahagikan melanoma manusia (TCGA, SKCM) kepada jenis tumor panas dan sejuk dan menganalisis korelasi gen imunogenik. Sebagai tambahan kepada transkrip CD8A, IFN dan MHC-I (HLA-ABC), kami mendapati bahawa calon lncRNA telah diperkaya dalam tumor panas, antara 3926 calon lncRNA yang dijelaskan oleh GENCODE13 (Rajah 1a; Jadual Tambahan 1). Berdasarkan kajian fungsian dalam eksperimen berikut, kami menetapkan calon lncRNA ini sebagai LIMIT: lncRNA Inducing MHC-I dan Immunogenicity of Tumor (LIMIT). Dalam dataset melanoma manusia, tahap LIMIT berkorelasi positif dengan IFN , MHC-I dan CD8 (Rajah 1b-d). Selaras dengan ini, Analisis Pengayaan Set Gene (GSEA) mendedahkan bahawa ekspresi LIMIT berkorelasi dengan gen tindak balas IFN, persembahan antigen melalui MHC-I, dan pengaktifan imun (Rajah 1e-h). Selain itu, tahap LIMIT berkorelasi dengan kadar tindak balas imunoterapi pusat pemeriksaan yang dipertingkatkan 14-17 (Rajah 1i) dan dikaitkan dengan kemandirian pesakit dengan melanoma (Rajah 1j). Selain itu, ungkapan LIMIT berkorelasi dengan IFN , MHC-I dan CD8 merentas pelbagai jenis kanser (Data Lanjutan Rajah 1a-l). Oleh itu, LIMIT ialah lncRNA imunogenik yang berpotensi.

Kami mengesahkan jika LIMIT ialah lncRNA. Pembuangan utara menunjukkan bahawa LIMIT adalah lebih kurang 2 kb panjang dalam sel melanoma A375 manusia (Rajah 1k). Kami menggunakan penguatan pesat hujung cDNA (RACE) dan mencirikan hujung cDNA LIMIT dalam kedua-dua sel melanoma manusia (A375) dan tetikus (B16) (Rajah 1l, m). Seterusnya, kami mengklonkan panjang penuh LIMIT dalam kedua-dua manusia dan tikus dan menyelaraskannya dengan jujukan genom yang sepadan (Data Lanjutan Rajah 2a, b). LIMIT manusia terletak dalam kromosom 1, dengan 1967 nukleotida dan 6 ekson (Data Lanjutan Rajah 2a), manakala Had tetikus terletak dalam kromosom 3, dengan 1634 nukleotida dan 7 ekson (Data Lanjutan Rajah 2b). LIMIT tidak mengandungi jujukan Kozak yang sah. Apabila kami menyediakan RNA daripada pecahan nuklear dan sitoplasma sel A375, LIMIT dikesan terutamanya dalam pecahan nuklear (Rajah 1n). Oleh itu, LIMIT tidak mempunyai potensi pengekodan protein. Secara kolektif, LIMIT memenuhi semua kriteria untuk ditakrifkan sebagai lncRNA. Terutama, dalam lokus LIMIT, calon lncRNA, pseudogene GBP1 (GBP1P1) ditemui dalam karsinoma hepatoselular (HCC)18. Walau bagaimanapun, LIMIT menunjukkan persamaan yang rendah dengan GBP1P1 atau GBP1 (Data Lanjutan Rajah 2c, Jadual Tambahan 2). Oleh itu, LIMIT bukan GBP1P1. Korelasi yang tinggi antara LIMIT dan tandatangan gen responsif IFN (Rajah 1e) menunjukkan bahawa IFN boleh merangsang ekspresi LIMIT. Sesungguhnya, rawatan dengan IFN mendorong ekspresi LIMIT, seperti yang ditunjukkan oleh pembongkaran Utara (Rajah 1k) dan RNA-seq dalam sel A375, HT29, Meijuso, dan A549 (Rajah 1o). Walau bagaimanapun, rawatan dengan sitokin lain, seperti IFN dan TNF, gagal mendorong ekspresi LIMIT (Rajah 1k). Selain itu, IFN gagal mendorong LIMIT dalam STAT1 kalah mati (KO) sel A375 (Rajah 1p). Oleh itu, LIMIT ialah IFN - lncRNA responsif yang tidak diketahui sebelum ini dalam kedua-dua sel manusia dan tetikus.

LIMIT menambah ekspresi MHC-I

faedah suplemen cistanche-bagaimana untuk menguatkan sistem imun

Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Enhance Immunity

【Minta lebih lanjut】 E-mel:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Untuk mengkaji fungsi LIMIT dalam sel tumor, kami mula-mula mengetuk LIMIT dengan RNA jepit rambut kecil (shLIMIT). Kami menggunakan alat Blast untuk memilih LIMIT shRNA yang tidak mempunyai calon di luar sasaran (Jadual Tambahan 3-6). ShLIMIT tidak menyasarkan gen pengekodan GBP (Data Lanjutan Rajah 3a). Dalam sel A375, shLIMIT menindas ekspresi LIMIT (Rajah 2a), tetapi tidak menjejaskan fosforilasi STAT1 (Rajah 2b) sebagai tindak balas kepada IFN - menunjukkan bahawa LIMIT tidak menjejaskan isyarat gen IFN global. MHC-I dan PD-L1 ialah gen sasaran IFN19-21. ShLIMIT membawa kepada penurunan dalam ekspresi MHC-I (Rajah 2c), tetapi bukan PD-L1 (Data Lanjutan Rajah 3b), sebagai tindak balas kepada rangsangan IFN. Selaras dengan data manusia ini, Had pembungkaman dalam sel melanoma murine YUMM1.7 atau sel kanser kolon CT26 mengakibatkan pengurangan ekspresi MHC-I sebagai tindak balas kepada IFN (Rajah 2d-g). Dalam sel A375, shLIMIT bukan sahaja mempengaruhi ekspresi MHC-I (HLA-ABC, HLA-E, dan HLA-F) tetapi juga ekspresi MHC-II (HLA-DRA dan HLA-DMA); manakala LIMIT tidak mengubah ekspresi gen isyarat IFN lain (Data Lanjutan Rajah 3c). Oleh itu, LIMIT mengambil bahagian dalam peraturan ekspresi MHC-I dan MHC-II yang disebabkan oleh IFN tanpa mengubah laluan isyarat IFN global.

LIMIT ialah gen yang terganggu dengan intron besar, menduduki sekitar 17 kb dalam genom. Kami gagal mengetepikan lokus LIMIT dengan sgRNA berpasangan dan Cas9. Memandangkan terdapat 5 tapak pengikat STAT1/IRF1 yang diramalkan dalam penganjur LIMIT, kami mereka bentuk 4 sgRNA berpasangan untuk memadamkan tapak pengikatan ini dalam penganjur LIMIT (Data Lanjutan Rajah 3d). Kami menjana sel A375 dengan pemadaman promoter LIMIT dalam kesemua 4 kombinasi sgRNA. Kami mendapati IFN tidak lagi cekap untuk mendorong ekspresi LIMIT dan MHC-I dalam sel tumor dengan pemadaman promoter LIMIT jika dibandingkan dengan sel jenis liar (Rajah 2h, i). Kami juga menggunakan sistem pengaktifan CRISPR yang dipandu RNA untuk mengaktifkan ekspresi Had dalam sel tumor22. Kami menubuhkan 4 RNA panduan yang menyasarkan rantau promoter Limit (sgLimit) dan dinyatakan bersama dengan dCas{16}}VPR, pengaktif transkrip tiga pihak yang digabungkan dengan nuklease-null Cas9, ke dalam sel B16 (Data Lanjutan Rajah 4a). Kesemua 4 sgLimit mempertingkatkan ungkapan Had, serta MHC-I (Data Lanjutan Rajah 4b, c). Apabila kami mengalihkan sel B16 dengan sgLimit terkumpul dan sgRNA tidak menyasarkan (sgNT), sgLimit mendorong ungkapan Had dan MHC-I, tetapi bukan PD-L1 (Rajah 2j, k). Oleh itu, Hadkan secara terpilih menyasarkan MHC-I, tetapi bukan PD-L1. Secara keseluruhannya, percubaan kehilangan dan keuntungan fungsi menunjukkan bahawa LIMIT boleh mengubah 1.5-3 ekspresi MHC-I lipatan dalam berbilang sel kanser merentas tikus dan manusia. Kami seterusnya menyiasat sama ada ekspresi MHC-I yang diubah oleh LIMIT memberi kesan kepada pembunuhan tumor pengantaraan sel T khusus CD{43}} T secara in vitro. Untuk tujuan ini, kami mula-mula menumbangkan B2M secara genetik dengan shRNA khusus dalam ovalbumin (OVA)--yang menyatakan sel B16. shRNA-B2M menghasilkan pengurangan 1.5-kali ganda dalam ungkapan OVA-H2Kb (Data Lanjutan Rajah 4d). Apabila sel B16-OVA yang membawa shFluc dan shB2M diinkubasi dengan sel OT-I, kami memerhatikan penurunan dalam OT-I pengantara shB2M-B16-pembunuhan sel OVA jika dibandingkan dengan shFluc-B{{63 }}Sel OVA (Data Lanjutan Rajah 4e-g). Data mencadangkan bahawa 1.5-3-perubahan kali ganda dalam ekspresi MHC-I yang dikawal oleh LIMIT boleh menjadi relevan dari segi fungsi dalam mempengaruhi aktiviti CTL khusus TAA. Untuk mengesahkan ini, kami mengaktifkan LIMIT dalam sel B{70}}OVA yang menyatakan shellac dan shB2M. Seperti yang dijangkakan, pengaktifan CRISPR LIMIT menyebabkan ekspresi MHC-I yang minimum dalam sel shB2M, berbanding dengan sel kawalan (Rajah 2l). Sehubungan itu, sel OT-I mengantarkan pembunuhan tumor yang minimum dalam sel shB2M-OVA-B16 jika dibandingkan dengan sel kawalan (Rajah 2m, n). Data menunjukkan bahawa ekspresi MHC-I yang disebabkan oleh LIMIT adalah penting dalam pengaktifan dan fungsi sel T khusus TAA. Sel pembentang antigen (APC), termasuk makrofaj dan sel dendritik (DC), mengekspresikan MHC-I, menghadirkan antigen kepada, dan mengaktifkan sel T khusus TAA. Kami melanjutkan kajian kami daripada sel tumor kepada APC. IFN merangsang ekspresi Had dengan kuat dalam DC dan makrofaj yang berasal dari sumsum tulang (Data Lanjutan Rajah 4h, i). Kami mengalihkan makrofaj dengan Had penyasaran siRNA berlabel 5'FAM (siLIMIT). Mengetuk LIMIT menghasilkan ekspresi MHC-I yang lebih rendah sebagai tindak balas kepada rangsangan IFN, berbanding dengan kawalan (Data Lanjutan Rajah 4j, k). Oleh itu, LIMIT ialah lncRNA responsif IFN dan boleh menggalakkan ekspresi MHC-I dalam kedua-dua sel tumor dan APC.

LIMIT meningkatkan imuniti anti-tumor

Kebaikan cistanche tubulosa-Antitumor

Ekspresi MHC-I yang tidak mencukupi memberikan pengelakan imun tumor dan rintangan imunoterapi3. Untuk memahami peranan Had dalam tindak balas imun antitumor dalam vivo, kami menyuntik kawalan (shFluc) dan Had-membungkam (shLimit) YUMM1.7 sel tumor ke dalam NOD scid c-deficient (NSG, kekurangan imun) dan jenis liar C57BL/6 tikus (kompeten imun). Berbanding dengan tumor kawalan, tumor shLimit YUMM1.7 berkembang setanding dalam tikus NSG (Rajah 3a), manakala berkembang lebih cepat dalam tikus jenis liar (Rajah 3b). Di samping itu, kami menyuntik tumor shLimit CT26 ke dalam tikus BALB/c jenis liar. Sekali lagi, Had pembungkaman menghasilkan pertumbuhan tumor CT26 yang dipertingkatkan dalam model kompeten imun (Rajah 3c). Data menunjukkan bahawa Had pembungkaman boleh menjejaskan imuniti anti-tumor dan memudahkan pertumbuhan tumor dalam cara yang bergantung kepada imun. Untuk menyokong perkara ini, kami mengesan pengurangan sel CD3+, IFN + dan TNF + T dalam tumor shLimit YUMM1.7 (Rajah 3d, e). Bersama-sama, menyenyapkan Had menjejaskan imuniti anti-tumor. Untuk menentukan ekspresi MHC-I dan MHC-I: SIINFEKL dalam vivo, kami menubuhkan sel YUMM1.7 yang menyatakan OVA secara stabil (YUMM1.7-OVA) dan ditransduksi dengan Had penyasaran shRNA atau Fluc. Selepas rawatan IFN, kami mengesan pengurangan ekspresi permukaan OVA-H2Kb dalam sel shLimit-YUMM1.7 (Data Lanjutan Rajah 5a). Kami menyuntik shLimit YUMM1.7-sel OVA dan shFluc-YUMM1.7-sel OVA ke dalam tikus C57BL/6. Kemudian, kami membedah tisu tumor dan mengesan ekspresi H2Db dan OVA-H2Kb dalam sel tumor. Kami memerhatikan pengurangan H2Db dan OVA-H2Kb dalam shLimit-YUMM1.7-sel OVA jika dibandingkan dengan sel kawalan (Data Lanjutan Rajah 5b-f). Data menunjukkan bahawa Had boleh menjejaskan MHC-I dan MHC-I: ekspresi antigen dalam vivo. Kami juga menginokulasi sel B16 kawalan (sgNT) dan Pengaktifan Had (sgLimit) ke dalam tikus C57/BL6 jenis liar. Seperti yang dijangkakan, sgLimit (Pengaktifan had) secara mendadak mengurangkan pertumbuhan tumor (Rajah 3f). Ini disertai dengan peningkatan bilangan sel T yang menyusup tumor dan pengaktifan (Rajah 3g, h). Melanoma B16 ialah model tumor yang agak tidak sensitif terhadap sekatan PD-L123. Selaras dengan ini, sekatan PD-L1 gagal mengawal pertumbuhan tumor sgNT B16 pada tikus. Menariknya, Hadkan pengaktifan dalam tumor B16 dengan tindak balas tumor tersensitisasi sgLimit kepada sekatan PD-L1, seperti yang ditunjukkan oleh perkembangan tumor yang dikurangkan (Rajah 3i). Secara keseluruhannya, Hadkan mempotensikan imuniti tumor dan pemekaan tindak balas imunoterapi tumor.

LIMIT cis-mengaktifkan GBP untuk meningkatkan MHC-I dan imuniti tumor

Kami seterusnya meneroka bagaimana LIMIT mempengaruhi MHC-I dan imuniti tumor. LncRNA boleh mengawal selia secara tempatan ekspresi gen jiran24. LIMIT disetempatkan rapat dengan gugusan gen, protein pengikat guanylate (GBP), dalam kedua-dua genom manusia dan tetikus (Data Lanjutan Rajah 2a, b). Kami bertanya sama ada LIMIT mungkin mengawal selia ungkapan GBP. Menyenyapkan LIMIT mengurangkan tahap prekursor dan mRNA GBP matang (Rajah 4a), dan protein GBP1-5 (Rajah 4b) dalam sel A375 manusia sebagai tindak balas kepada rawatan IFN. Data menunjukkan bahawa LIMIT boleh mempromosikan transkripsi GBP dalam cis. Untuk menyokong kemungkinan ini, Had menyenyapkan juga mengurangkan ekspresi Gbp2 dalam tetikus YUMM1.7 dan sel CT26 (Data Lanjutan Rajah 6a, b). Tambahan pula, pengaktifan CRISPR Had mendorong ekspresi Gbp2 dalam sel B16 (Rajah 4c). Untuk menguji sama ada LIMIT boleh menukar kawal selia GBP, kami memaksa ekspresi LIMIT cDNA ke dalam sel A375. Kami mendapati GBP1 dan pelbagai faktor imun (termasuk IRF1, HLA-ABC dan PD-L1) tidak diubah oleh LIMIT overexpression (Data Lanjutan Rajah 6c). Oleh itu, LIMIT ialah lncRNA bertindak cis yang mampu mendorong ekspresi GBP. Di kalangan ahli keluarga Gbp, Gbp2 ialah ahli keluarga Gbp yang dominan dalam sel tetikus (Data Lanjutan Rajah 6d). Untuk menguji sama ada LIMIT boleh mengawal MHC-I melalui GBP, kami menubuhkan sel YUMM1.7 yang stabil yang membawa shellac, shLimit, shGbp2 atau shLimit plus shGbp2. Kami mendapati bahawa sebagai tindak balas kepada rangsangan IFN, shLimit dan shGbp2 membawa kepada penurunan yang setanding dalam ekspresi Gbp2 dan MHC-I; secara serentak menyenyapkan Had dan Gbp2 gagal untuk mengubah tambahan ekspresi Gbp2 dan MHC-I (Rajah 4d, e). Selain itu, kami tertanya-tanya sama ada ekspresi berlebihan GBP boleh menyelamatkan ekspresi MHC-I yang dikurangkan-MHC-I dalam Had mengetuk sel tumor. Kami memaksa ungkapan GBP1 dalam sel shLIMIT A375 (GBP1OE) dan merawat sel ini dengan IFN . Kami mendapati bahawa shLIMIT menghasilkan ekspresi MHC-I yang dikurangkan dalam sel kawalan, tetapi tidak dalam sel GBP1OE (Data Lanjutan Rajah 6e). Ungkapan PD-L1 dan IRF1 tidak terjejas oleh shLIMIT atau GBP1OE (Data Lanjutan Rajah 6e, f). Oleh itu, Had boleh mengawal selia ekspresi MHC-I dalam cara yang bergantung kepada GBP. Kami seterusnya menyuntik sel YUMM1.7 dengan Had dan/atau Gbp2-menyenyapkan ke dalam tikus C57BL/6. Had Membungkam dan menyenyapkan GBP sama-sama menghasilkan pertumbuhan tumor yang lebih cepat berbanding kumpulan kawalan, manakala menyenyapkan LIMIT dan GBP secara serentak tidak menjejaskan perkembangan tumor (Rajah 4f). Tambahan pula, kami mengesan penurunan bilangan sel T yang menyusup tumor dan pengaktifan dalam tumor shLimit, tumor shGbp2 dan tumor shLimit ditambah shGbp2 (Rajah 4g dan Data Lanjutan Rajah 6g). Bersama-sama, LIMIT menambah ekspresi MHC-I dan imuniti tumor dalam cara yang bergantung kepada GBP. GBP ialah gen responsif IFN dalam fibroblas25 dan makrofaj26 dalam konteks pertahanan perumah terhadap patogen. Walau bagaimanapun, peranan GBP dalam imuniti kanser tidak diketahui. Memandangkan menyenyapkan GBP mengurangkan ekspresi MHC-I dan pengaktifan sel T CD{71}} (Rajah 4g dan Data Lanjutan Rajah 6g), kami membuat hipotesis bahawa GBP mungkin menjejaskan keberkesanan imunoterapi kanser. Untuk menguji hipotesis ini, kami menyenyapkan Gbp2 dalam sel MC38, model tumor yang sensitif kepada imunoterapi23. Seperti yang dijangkakan, menyenyapkan Gbp2 dalam sel MC38 mengurangkan ekspresi MHC-I semasa rawatan IFN (Rajah 4h), dan sebahagian besarnya memansuhkan keberkesanan sekatan PD-L1 (Rajah 4i). Ini, bersama-sama dengan data yang disebutkan di atas, mencadangkan penglibatan LIMIT dan GBP dalam mengawal keberkesanan imunoterapi kanser. Bagi menyokong kemungkinan ini, analisis data klinikal mendedahkan bahawa tahap ekspresi GBP yang tinggi berkorelasi dengan LIMIT, ekspresi MHC-I dan tindak balas imunoterapi (Data Lanjutan Rajah 6h-j) pada pesakit dengan melanoma14-17. Tambahan pula, tahap ekspresi GBP dikaitkan secara positif dengan kemandirian pesakit (Data Lanjutan Rajah 6k). Untuk mengesahkan sama ada GBP adalah gen responsif IFN dalam sel kanser, kami merangsang sel A375 dengan IFN dan sitokin lain. GBP telah diinduksi oleh IFN, tetapi sedikit dipengaruhi oleh sitokin imun yang lain (Rajah 4j). Seterusnya, kami menggunakan sistem CRISPR-Cas9 untuk menyasarkan jujukan kongsi antara GBP1-5 dan menjana GBP1-5 kalah mati (KO) sel A375 (Gamb. 4k). Kami mendapati bahawa IFN kurang merangsang transkrip jentera gen MHC-I (Rajah 4l) dan permukaan protein HLA-ABC dalam sel GBP KO A375 (Rajah 4m). Oleh itu, LIMIT cis-mengaktifkan GBP untuk meningkatkan jentera MHC-I dan imuniti tumor.

GBP mengaktifkan HSF1 untuk merangsang MHC-I dan imuniti tumor

Untuk menunjukkan cara GBP boleh mengawal ekspresi MHC-I dan imuniti tumor, kami memaksa ekspresi GBP dalam sel A375. Menariknya, ekspresi berlebihan GBPs meningkatkan ekspresi MHC-I manusia - seperti yang ditunjukkan oleh qRT-PCR (Rajah 5a), pewarnaan permukaan membran (Rajah 5b), dan pembongkaran Barat (Rajah 5c). Data menunjukkan bahawa GBP boleh mengaktifkan MHC-I pada tahap transkrip. Secara konsisten, overexpression Gbp2 meningkatkan ekspresi MHC-I tetikus dalam sel YUMM1.7 dan B16 (Rajah 5d). Untuk mengenal pasti faktor transkripsi yang mengawal MHC-I melalui GBP sebagai tindak balas kepada IFN , kami melakukan ramalan bioinformatik dengan PROMO27. Kami mendapati 8 faktor transkripsi diubah oleh IFN dalam sel A375, yang mungkin menyasarkan HLA-ABC, HSPA5, CALR dan TAP1. Selain beberapa faktor yang terkenal, aktiviti HSF1 sangat didorong oleh IFN (Data Lanjutan Rajah 7a). Dengan memproses set data ChIP-seq dalam ENCODE28, kami mendapati bahawa kedua-dua STAT1 dan HSF1 telah diperkaya dalam penganjur gen berkaitan MHC-I dengan corak pengikatan yang berbeza (Data Lanjutan Rajah 7b). Kami melakukan ujian ChIP dengan antibodi anti-HSF1 dalam sel A375 yang dirangsang IFN. HSF1 diperkaya dalam penganjur HLA-ABC, HSPA5, CALR dan TAP1, tetapi bukan HPRT1, kawalan negatif (Rajah 5e). Keputusan menunjukkan bahawa HSF1 adalah faktor transkripsi untuk MHC-I. HSF1 biasanya diaktifkan oleh gangguan proteostasis29. Untuk menguji sama ada pengaktifan HSF1 akan meningkatkan ekspresi MHC-I, kami merawat sel A375 dengan senarai tekanan30: kejutan haba, tekanan oksidatif (Luperox), perencat terjemahan (puromycin), proteasome (MG-132) dan pendamping (17-AAG). Menariknya, tekanan ini secara universal merangsang ekspresi MHC-I - manakala KRIBB11, perencat HSF1, mengurangkan kesan ini (Rajah 5f dan Data Lanjutan Rajah 7c). Oleh itu, pengaktifan HSF1 secara amnya mendorong ekspresi MHC-I. Kami seterusnya mempersoalkan sama ada GBP boleh mengaktifkan HSF1. Ekspresi paksa GBPs mendorong aktiviti luciferase wartawan HSF1 HSE-Luc (Rajah 5g), serta fosforilasi HSF1 (Rajah 5h). Ini menunjukkan bahawa GBP boleh mengaktifkan HSF1. IFN gagal mendorong ekspresi HSPA5 dalam sel GBP-KO A375 (Rajah 5i). Oleh itu, IFN mengaktifkan HSF1 dengan mendorong ekspresi GBP. Tambahan pula, rawatan dengan KRIBB11, perencat HSF1, membatalkan pengawalseliaan MHC-I yang dimediasi oleh overexpression GBP1 (Rajah 5j). Oleh itu, GBP merangsang ekspresi MHC-I dalam1-cara bergantung pada HSF. Untuk mengukuhkan hubungan mekanistik antara GBP dan HSF1, kami menyenyapkan Gbp2 dan/atau Hsf1 dalam sel MC38 (Rajah 5k). Selepas rawatan IFN, pembungkaman Gbp2 atau Hsf1 sahaja mengurangkan ekspresi MHC-I, tetapi pada masa yang sama menyenyapkan Gbp2 dan Hsf1 gagal memodulasi tambahan ekspresi MHC-I (Rajah 5l). Untuk menunjukkan perkaitan fungsian interaksi antara GBP dan HSF1 dalam imuniti tumor, kami menyuntik sel tumor MC38 yang menyatakan shellac, shGbp2, shHSF1, atau shGbp2 ditambah shHSF1 ke dalam tikus C57BL/6. Berbanding dengan kawalan shFluc, menyenyapkan Gbp2 dan menyenyapkan Hsf1 secara perbandingan mempercepatkan pertumbuhan tumor (Rajah 5m), dan mengurangkan bilangan sel T yang menyusup tumor dan pengaktifan (Rajah 5n dan Data Lanjutan Rajah 7d). Lebih-lebih lagi, penyenyapan Gbp2 dan Hsf1 secara serentak gagal menjejaskan pertumbuhan tumor dan sel T yang menyusup tumor (Rajah 5m, n dan Data Lanjutan Rajah 7d). Secara keseluruhannya, GBP merangsang ekspresi MHC-I dan imuniti antitumor dengan mengaktifkan HSF1.

Paksi LIMIT-GBP-HSF1 memacu MHC-I dan imuniti tumor

manfaat cistanche untuk lelaki-menguatkan sistem imun

Kami seterusnya mengkaji bagaimana GBP mengaktifkan HSF1 untuk mengubah ekspresi MHC-I dan imuniti tumor. Di bawah keadaan biasa, HSF1 monomerik dikaitkan dengan dan ditindas oleh pendamping, seperti HSP9031. Gangguan interaksi mereka membenarkan trimerisasi dan pengumpulan HSF1 dalam nukleus, mengakibatkan pengaktifan transkrip gen sasarannya32. Kami membuat hipotesis bahawa GBP boleh mengganggu hubungan antara HSP90 dan HSF1, mengakibatkan pengaktifan HSF1. Untuk menguji kemungkinan ini, kami merawat sel A375 dengan IFN dan melakukan Co-IP dengan antibodi HSP90. Kami mendapati GBP endogen yang disebabkan oleh IFN dikaitkan dengan HSP90 (Rajah 6a). Selain itu, kami mengalihkan sel A375 dengan Flag-GBP1 eksogen dan melakukan eksperimen Co-IP dengan antibodi Bendera. HSP90 telah dikesan dalam produk IP daripada sel transfected Flag-GBP1, tetapi bukan sel kawalan vektor-transfected (Rajah 6b). Pewarnaan imunofluoresensi menunjukkan bahawa GBP dan HSP90 sebahagian besarnya disetempatkan bersama dalam sitoplasma (Rajah 6c). Apabila kami mengalihkan sel 293T dengan peningkatan dos plasmid GBP1, HSP{30}}HSF1 yang berkaitan telah dikurangkan dalam cara yang bergantung kepada dos (Rajah 6d). Data menunjukkan bahawa GBP berinteraksi dengan HSP90 dan interaksi ini mengganggu hubungan antara HSF1 dan HSP90. HSP90 ialah pendamping untuk pelbagai lipatan dan kestabilan protein, kami mempersoalkan sama ada GBP boleh mengubah aktiviti pendamping HSP90. Walaupun perencat HSP90 menindas ekspresi protein pelanggan HSP90 (seperti RAF1, BCL2, dan CDK433), ekspresi berlebihan GBP gagal berbuat demikian (Rajah 6e). Oleh itu, GBP berinteraksi dengan HSP90 dan mengeluarkan HSP90-HSF1 yang berkaitan, tetapi tidak mengubah aktiviti HSP90. Kemudian, kami secara langsung mengkaji peranan HSF1 dalam ekspresi MHC-I. Kami merawat sel A375 dengan IFN dengan kehadiran perencat HSF1 KRIBB11. Seperti yang dijangkakan, rawatan dengan KRIBB11 mengurangkan ekspresi mRNA yang dirangsang IFN bagi gen berkaitan MHC-I, termasuk HLA-ABC, TAP1, HSPA5 dan CALR, tetapi bukan IRF1 (Rajah 6f). Menariknya, KRIBB11 mengurangkan ekspresi MHC-I yang disebabkan oleh IFN, tetapi mempunyai kesan minimum pada ekspresi PD-L1 (Rajah 6g). Oleh itu, HSF1 boleh mengawal ekspresi MHC-I yang disebabkan oleh IFN tanpa mengubah isyarat IFN global. Untuk menyiasat sama ada HSF1-MHC-I yang dikawal berfungsi, kami menkultur B16-OVA dengan sel OT-I dengan kehadiran KRIBB11 dan IFN . KRIBB11 menghalang ekspresi teraruh IFN bagi MHC-I terikat OVA (Data Lanjutan Rajah 8a). Selaras dengan ini, KRIBB11 juga menindas kesan sitotoksik pengantara sel OT-I pada B16-OVA (Data Lanjutan Rajah 8b). Untuk melanjutkan pemerhatian kami kepada tumor tambahan, kami menyenyapkan Hsf1 dengan shHsf1 dalam sel YUMM1.7 dan CT26. Mendiamkan Hsf1 mengakibatkan penurunan ekspresi MHC-I dalam YUMM1.7 (Rajah 6h, i) dan sel CT26 (Data Lanjutan Rajah 8c) sebagai tindak balas kepada rangsangan IFN. Dalam sel YUMM1.7, menyenyapkan HSF1 gagal menjejaskan ekspresi Gbp2 sebagai tindak balas kepada IFN (Rajah 6h), menunjukkan bahawa Gbp2 bukan gen sasaran HSF1. Dalam sel shHsf1 YUMM1.7, KRIBB11 gagal menyekat ekspresi MHC-I yang dirangsang IFN (Data Lanjutan Rajah 8d). Data menunjukkan bahawa HSF1 meningkatkan ekspresi MHC-I sebagai tindak balas kepada IFN , dan Hsf1 ialah sasaran mekanistik KRIBB11 untuk mengawal selia MHC-I. Memandangkan HSF1 mempengaruhi ekspresi MHC-I, kami membuat hipotesis bahawa HSF1 mengawal imuniti anti-tumor dalam vivo . Untuk menguji hipotesis ini, kami menyuntik kawalan dan sel tumor shHsf1 YUMM1.7 ke dalam tikus NSG dan C57BL/6. Kami mendapati bahawa membungkam HSF1 sebahagiannya melambatkan perkembangan tumor YUMM1.7 dalam tikus NSG (Rajah 6j), menyokong bahawa Hsf1 membantu mengekalkan homeostasis protein dan perkembangan tumor dalam model kekurangan imun. Walau bagaimanapun, menyenyapkan Hsf1 secara mendadak mempercepatkan pertumbuhan tumor YUMM1.7 dalam tikus C57BL/6 jenis liar (Rajah 6k). Data menunjukkan bahawa Hsf1 mungkin secara mengejutkan mempromosikan imuniti anti-tumor yang kuat dalam model kompeten imun. Untuk menyokong perkara ini, kami mengesan pengurangan peratusan sel CD penyusupan tumor{144}}, Ki{145}}, IFN + dan TNF + T (Rajah 6l dan Data Lanjutan Rajah 8e) dalam tumor shHsf1 YUMM1.7 berbanding dengan kawalan scramble shFluc. Di samping itu, kami menyuntik sel shHsf1 CT26 ke dalam tikus BALB/c jenis liar. Sekali lagi, menyenyapkan Hsf1 menghasilkan pertumbuhan tumor CT26 yang dipertingkatkan (Data Lanjutan Rajah 8f). Ini disertai dengan pengurangan peratusan sel CD yang menyusup tumor3+, Ki67+, IFN + dan TNF + T (Data Lanjutan Rajah 8g, h). Secara keseluruhannya, data menunjukkan bahawa paksi GBP-HSF1 memacu ekspresi MHC-I dan imuniti antitumor. Untuk menyambungkan Hsf1 dan LIMIT secara mekanikal, kami menyenyapkan LIMIT dalam sel A375. Membungkam LIMIT mengurangkan aktiviti transkripsi HSF1 sebagai tindak balas kepada IFN , seperti yang ditentukan oleh ujian wartawan luciferase (HSE-luc) (Rajah 6m). Data mencadangkan LIMIT menyumbang kepada pengaktifan HSF1 sebagai tindak balas kepada IFN . Untuk menguji potensi penglibatan HSF1 dalam induksi LIMIT-mediated MHC-I, kami merangsang LIMIT melalui pengaktifan CRISPR dalam sel B16, dengan kehadiran KRIBB11. Kami mendapati bahawa pengawalseliaan MHC-I, yang disebabkan oleh pengaktifan LIMIT, telah dimansuhkan oleh perencat HSF1 (Rajah 6n). Data menunjukkan bahawa LIMIT meningkatkan ekspresi MHC-I dalam{184}}cara bergantung pada HSF. Akhir sekali, kami menganalisis pautan antara LIMIT, GBP, dan HSF1 dalam konteks ekspresi MHC-I, imuniti tumor, dan imunoterapi pada pesakit kanser. Analisis klinikal menunjukkan bahawa gen isyarat HSF{187}}berkait dengan ekspresi MHC-I, penyusupan sel T CD8+ dan kemandirian pesakit (Data Lanjutan Rajah 9a-c). Dalam kajian sekatan pusat pemeriksaan imun pada pesakit dengan karsinoma sel basal34, analisis penjujukan RNA sel tunggal mendedahkan 2 kelompok tumor; satu gugusan tumor lebih sensitif terhadap rawatan anti-PD{197}} seperti yang ditunjukkan oleh populasi tumor yang berkurangan (Data Lanjutan Rajah 9d). Menariknya, kluster tumor sensitif pusat pemeriksaan imun ini menyatakan tahap gen isyarat HSF{199}}yang lebih tinggi serta jentera gen MHC-I (Data Lanjutan Rajah 9e). Selain itu, dalam kajian sekatan pusat pemeriksaan imun pada pesakit dengan melanoma35, analisis proteomik menunjukkan bahawa ekspresi protein GBP, gen isyarat HSF1, dan MHC-I adalah lebih tinggi dalam responden klinikal berbanding bukan responden (Data Lanjutan Rajah 9f). Selain itu, kami melihat korelasi positif antara GBP1 dan HSF{208}}gen isyarat dalam kanser manusia (Data Lanjutan Rajah 9g). Data menyokong bahawa paksi LIMIT-GBP-HSF1 boleh mengaktifkan ekspresi MHC-I, dan menyokong imuniti anti-tumor (Data Lanjutan Rajah 10).

Perbincangan

Tumbuhan cistanche herba Cina-Antitumor

Manusia mempunyai 30,000-60,000 lncRNA. Walau bagaimanapun, identiti dan fungsi biologi sebahagian besar daripada potensi lncRNA ini masih kurang difahami. Dalam bidang biologi kanser, lncRNA telah banyak dikaji dalam model kekurangan imun, meninggalkan jurang pengetahuan lncRNA dalam konteks sistem imun. Sebilangan kecil lncRNA dilaporkan menjejaskan fungsi sel imun36,37, perkembangan kanser, dan keberkesanan kemoterapi38,39. Walau bagaimanapun, sama ada lncRNA tertentu terlibat dalam imuniti antitumor dan tindak balas imunoterapi masih tidak dijawab. Dalam kajian ini, kami telah mengenal pasti bahawa LIMIT ialah lncRNA responsif IFN yang tidak dicirikan sebelum ini dalam kedua-dua sel manusia dan tetikus. LIMIT boleh mendorong ekspresi MHC-I dan MHC-II, menggalakkan tindak balas imun tumor pengantaraan sel T dan meningkatkan keberkesanan imunoterapi. Oleh itu, LIMIT ialah lncRNA imunogenik tumor yang tidak diketahui sebelum ini. Laluan isyarat IFN memainkan peranan penting dalam menentukan tindak balas terapeutik terhadap imunoterapi kanser40 melalui pelbagai mekanisme19,20,41,42. Mutasi genetik dalam gen isyarat IFN menyumbang kepada rintangan sekatan pusat pemeriksaan pada pesakit kanser43-48. Walau bagaimanapun, isyarat IFN boleh mendorong ekspresi PD-L1 yang menghalang49. Oleh itu, adalah ideal untuk mengenal pasti dan menyasarkan gen isyarat IFN utama yang secara selektif menjadi pengantara imuniti anti-tumor, dan bukannya pengelakan imun tumor. Selaras dengan tanggapan ini, kami menunjukkan bahawa LIMIT mengantara MHC-I dan MHC-II upregulation, tetapi tidak menjejaskan ekspresi PD-L1 sebagai tindak balas kepada IFN . Oleh itu, LIMIT mungkin diletakkan secara unik untuk menjadi sasaran imunogenik untuk imunoterapi kanser. Beberapa strategi telah dicadangkan untuk menyasarkan secara terapeutik lncRNAs patogenik50. Walau bagaimanapun, cara untuk meningkatkan tahap lncRNA yang bermanfaat masih mencabar. Memandangkan lncRNA bertindak cis berfungsi secara tempatan, ekspresi paksa lncRNA ini mungkin tidak dapat mengesan dengan tepat51. Walaupun lncRNA bertindak trans mungkin berfungsi melalui struktur sekunder tertentu, ekspresi berlebihan lncRNA ini mungkin tidak dapat menjana struktur semula jadinya kerana tiada pendamping RNA yang sesuai52. Dengan menggunakan strategi pengaktifan CRISPR yang dipandu RNA22, kami secara langsung mengaktifkan ekspresi LIMIT dalam sel tumor dalam model praklinikal. Pengaktifan CRISPR LIMIT berpandukan RNA boleh memacu ekspresi MHC-I tumor dan mempotensikan terapi sekatan pusat pemeriksaan. Memandangkan kehilangan tandatangan gen MHC-I dan IFN kerap berlaku dalam tumor manusia, kami mencadangkan pengaktifan CRISPR bagi lncRNA yang bermanfaat, seperti LIMIT, boleh menyelamatkan ekspresi MHC-I tumor dan menjadi pendekatan terapeutik yang berpotensi. Semasa mencari mekanisme LIMIT mempengaruhi imuniti tumor, kami menjelaskan bahawa LIMIT menyasarkan GBP secara cis. GBP memainkan peranan dalam imuniti semula jadi26,53,54. Tikus yang tidak mempunyai keseluruhan kluster Gbps menunjukkan tindak balas anti-Toxoplasma gondii yang lemah55. Walau bagaimanapun, sebelum kerja kami, sambungan mekanistik antara LIMIT dan GBP, dan fungsi biologi GBP dalam imuniti tumor dan imunoterapi tidak dapat ditentukan. Kami telah mendapati bahawa GBP diperlukan untuk ekspresi MHC-I tumor yang disebabkan oleh IFN, CD{46}} kecekapan membunuh sel T dan terapi pusat pemeriksaan yang berkesan. Data menunjukkan bahawa GBP adalah gen sasaran yang berpotensi untuk meningkatkan imunogenisitas tumor. Kami secara tidak dijangka mendapati bahawa GBP mengaktifkan HSF1 untuk merangsang ekspresi gen berkaitan MHC-I dan MHC-I. Pengaktifan HSF1 yang dimediasi oleh perencat HSP90 berkorelasi dengan kawalan tumor dalam model imunokompeten. Walau bagaimanapun, walaupun terdapat beberapa ujian klinikal dengan perencat HSP90, tiada satu pun perencat HSP90 yang dinilai telah diluluskan oleh FDA untuk terapi kanser, setakat ini. Fakta yang mengecewakan ini menimbulkan kemungkinan bahawa perencat HSP90 mungkin memudaratkan imuniti tumor. Ketoksikan perencat HSP90 ini boleh menggalakkan pemusnahan beberapa protein pelanggan HSP90, seperti RAF1 dan BCL2, yang mungkin kritikal untuk percambahan sel T effector dan survival59,60. Memandangkan GBPs berinteraksi dengan HSP90 dan mengeluarkan HSP90-menipu HSF1, tetapi tidak mengubah aktiviti HSP90, data kami mencadangkan bahawa penyasaran GBP mungkin merupakan strategi yang sebelum ini tidak dihargai dan selamat untuk mengaktifkan HSF1 bagi imunoterapi kanser. Ringkasnya, kami mengenal pasti LIMIT sebagai lncRNA imunogenik kanser yang tidak diketahui sebelum ini. Kerja kami mencadangkan bahawa menyasarkan paksi isyarat LIMIT-GBP-HSF1 boleh menyelamatkan ekspresi dan fungsi MHC-I, memberikan pendekatan imunoterapeutik kanser yang menjanjikan.

Kaedah

Eksperimen haiwan

NSG wanita berumur enam hingga lapan minggu (NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl/SzJ, Stok# 005557), C57BL/6 (C57BL/6J, Stok# 000664), BALB/c (BALB /cJ, Stok# 000651), dan OT-1 (C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J, Stok# 003831) telah diperoleh daripada Makmal Jackson. Semua tikus dikekalkan di bawah keadaan bebas patogen. Bilik haiwan mempunyai suhu terkawal (18-23 darjah ), kelembapan (40-60%) dan kitaran 12 terang/12 gelap. Sel YUMM1.7 (1 × 105), CT26 (1 × 105), MC38 (2.5 × 106), dan B16 (1 × 105) telah disuntik secara subkutan ke dalam rusuk kanan tikus. Untuk rawatan anti-PD-L1 dalam model MC38, 5 mg/kg anti-PD-L1 (InVivoMAb, 10F.9G2) dan antibodi kawalan (InVivoMAb, LTF-2) diberikan secara intraperitoneal pada hari 6, 9, dan 12 inokulasi selepas tumor. Untuk rawatan anti-PD-L1 dalam model B16, 5 mg/kg anti-PD-L1 (InVivoMAb, 10F.9G2) dan antibodi kawalan (InVivoMAb, LTF-2) diberikan secara intraperitoneal pada hari 0, 3, 6, 9, 12 dan 15 selepas inokulasi tumor. Diameter tumor diukur menggunakan kaliper. Isipadu tumor dikira dengan Panjang × Lebar × Lebar/2. Kajian haiwan telah dijalankan di bawah kelulusan Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi di Universiti Michigan (PRO00008278). Kajian ini mematuhi semua peraturan etika yang berkaitan mengenai penyelidikan haiwan. Dalam mana-mana eksperimen, saiz tumor xenograf tidak melebihi 2 cm dalam mana-mana dimensi, dan tiada haiwan yang mengalami kembung perut yang teruk ( Lebih daripada atau sama dengan peningkatan berat badan asal 10%. Saiz sampel dipilih berdasarkan data awal. Selepas inokulasi tumor, tikus secara rawak dan ditugaskan kepada kumpulan yang berbeza untuk rawatan.

Reagen

KRIBB11 dan 17-AAG telah dibeli daripada Cayman Chemical. MG-132, Puromycin dan Luperox adalah daripada Sigma-Aldrich. IFN manusia rekombinan (285-JIKA), IFN (8499-JIKA), TNF (210-TA), IL-1 (201-LB), IL{{ 9}} (206-IL) dan tetikus IFN (485-MI) adalah daripada R&D.

Plasmid

Untuk menjana HSE-LUC, jujukan DNA yang sepadan dengan unsur kejutan haba (HSE) telah disintesis, disepuh dan diikat menjadi plasmid3-asas PGL (Promega). FLAG-HSF1 ialah hadiah daripada Stuart Calderwood (Addgene #32537). Untuk ekspresi paksa GBP1, GBP2, GBP5, dan tetikus Gbp2 manusia, urutan pengekodan masing-masing telah dikuatkan PCR daripada cDNA yang dijana daripada sel A375 atau sel B16 yang telah dirawat IFN dan kemudiannya dimasukkan ke dalam plasmid Bendera PCI. Plasmid PCI-Flag telah disediakan dengan memasukkan jujukan Kozak berikut ditambah tag Bendera ditambah jujukan 5 × Glycine ke dalam plasmid PCI-neo (Promega) antara NheI dan XhoI. Untuk menjatuhkan LIMIT manusia dan LIMIT tetikus, shRNA direka bentuk dan dimasukkan ke dalam plasmid PLKO.1 (Addgene #10879). ShRNA yang menyasarkan firefly luciferase (shFluc) berfungsi sebagai kawalan negatif. Untuk menyasarkan kawasan promoter Had untuk pengaktifan CRISPR, sgRNA (sgLimit) telah direka bentuk dan dimasukkan ke dalam plasmid phU6- sgRNA (Addgene #53188). SgRNA bukan sasaran (sgNT) berfungsi sebagai kawalan negatif. Untuk memadamkan tapak pengikat STAT1/IRF1 dalam penganjur LIMIT, sgRNA berpasangan (psgLIMIT) telah direka bentuk dan dimasukkan ke dalam plasmid PX459 (Addgene #48139). Untuk menjatuhkan tetikus Hsf1 dan Gbp2, shRNA telah direka bentuk dan dimasukkan ke dalam plasmid PLKO.1 (Addgene #10879). Untuk mengalahkan GBP1-5, sgRNA telah direka bentuk dan dimasukkan ke dalam plasmid PX459 (Addgene #48139). Urutan sasaran disenaraikan dalam Jadual Tambahan 7. Urutan primer disenaraikan dalam Jadual Tambahan 8.

Kultur sel

Talian sel melanoma manusia A375 (CRL-1619), garisan sel melanoma tetikus, B16-F0 (CRL-6322) dan YUMM1.7 (CRL-3362 ), talian sel kanser kolon tikus CT26 (CRL-2638) dan 293T (CRL-3216) telah dibeli daripada American Type Culture Collection (ATCC). Talian sel kanser kolon tikus MC38 telah digunakan sebelum ini di makmal Zou23,48. B{15}} sel OVA telah ditubuhkan seperti yang dilaporkan sebelum ini42. A375 STAT1 KO, A375 GBP1-5 KO dan barisan sel pemadaman promoter A375 LIMIT telah dijana dalam kajian ini. Semua garisan sel telah diuji untuk pencemaran mycoplasma secara rutin dan disahkan negatif untuk mycoplasma. Sel telah dikultur dalam medium RMPI (Gibco #11875) ditambah dengan 10% FBS, kecuali sel A375 dan 293T, 2 baris terakhir telah dikultur dalam DMEM (Gibco #11965) ditambah dengan 10% FBS. Semua sel dikekalkan pada 37 darjah dan 5% CO2. Untuk kejutan haba, sel dimasukkan ke dalam inkubator pada 43 darjah dan 5% CO2 selama 2 jam. Untuk menjana talian sel knockdown, zarah lentiviral dihasilkan melalui pemindahan plasmid shRNA PLKO.1 dengan psPAX2 (Addgene #12260) dan pMD2.G (Addgene #12259) (4:3:1) ke dalam sel 293T, dan seterusnya ditransduksi menjadi tumor sel dengan polibrena (Sigma-Aldrich, 8 ug/ml) semalaman. 48 jam selepas pemindahan, sel telah dipilih dengan puromycin (1-2 ug/ml) untuk tambahan 2 minggu. Untuk mewujudkan garisan sel kalah mati, plasmid sgRNA PX{51}} dipindahkan ke dalam sel tumor selama 2 hari dan dipilih oleh puromycin (1-2 ug/ml) untuk 2 hari tambahan. Sel-sel tersebut kemudiannya dicairkan secara bersiri dan disemai ke dalam 96 plat perigi. Selepas 2-3 minggu, koloni sel tunggal telah dipisahkan dan disalut semula ke dalam 6 plat perigi. Selepas pertemuan sel, separuh daripada sel telah dituai dan disahkan untuk kecekapan kalah mati (KO) melalui Western blotting. Untuk menggunakan sistem pengaktifan CRISPR untuk mengaktifkan Had tetikus, phU6-sgRNA telah dipindahkan bersama-sama dengan SP-dCas9-VPR (Addgene #63798) ke dalam sel B16. Semua pemindahan dilakukan dengan lipofectamine 2000 (Thermofisher) pada nisbah 1 ug plasmid: 2 ul transfection regent. Dos pemindahan ditentukan dengan titrasi.

Ujian aktiviti Luciferase

Sel A375 telah ditransfeksi dengan HSE-LUC dan PRL-SV40P (Addgene #27163) selama 24 jam, bersama-sama dengan PCI-neo (vektor) atau GBP1, GBP2 selama 48 jam. Sel A375 shFluc atau A375 shLIMIT telah ditransfeksi dengan HSE-LUC dan PRL-SV40P (Addgene #27163) selama 24 jam dan kemudian dirawat dengan IFN selama 48 jam tambahan. Aktiviti Luciferase untuk firefly luciferase (HSE-LUC) dan renilla luciferase (PRL-SV40P) diukur dengan Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). Aktiviti luciferase kelip-kelip relatif telah dinormalisasi dengan aktiviti renilla luciferase.

Pewarnaan permukaan dan analisis sitometri aliran (FACS)

Sel telah trypsinized dan dibasuh dengan penimbal MACS (PBS, 2% FBS, 1 mM EDTA). Pewarnaan permukaan dilakukan dengan menambahkan antibodi berikut pada penggantungan sel dalam penimbal MACS 50 ul: anti-HLA-ABC (G46-2.6, BD Biosciences), anti-H2-Db (KH95, BD Biosains), anti-H2-Dd (34-2-12, BD Biosains), anti-OVA-H2-Kb (eBio25-D1.16, eBiosains) dan anti-PD-L1 (MIH1, BD Biosains). Selepas mengeram selama 30 minit, sel telah dibasuh dengan penimbal MACS dan dianalisis pada cytometer aliran BD Fortessa.

Analisis PCR kuantitatif (qPCR).

Jumlah RNA telah diasingkan daripada sel dengan penulenan lajur (Direct-zol RNA Miniprep Kit, Zymo Research) dengan rawatan DNase. cDNA telah disintesis menggunakan Kit Sintesis cDNA RevertAid First Strand (Thermo Fisher Scientific) dengan primer heksamer rawak. PCR Kuantitatif (qPCR) telah dilakukan pada cDNA menggunakan Fast SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific) pada Sistem PCR Masa Nyata StepOnePlus (Thermo Fisher Scientific). Ekspresi gen dikira menggunakan primer yang disenaraikan dalam Jadual Tambahan 8. Perubahan lipatan dalam ekspresi mRNA dikira dengan kaedah ΔΔCt menggunakan ACTB sebagai kawalan endogen. Keputusan dinyatakan sebagai perubahan lipatan dengan menormalkan kepada kawalan.

blotting utara

Analisis Northern blot dilakukan dengan 10 ug daripada jumlah RNA yang disediakan daripada sel A375 prarawatan IFN, IFN, dan TNF. RNA telah diselesaikan dengan mendenaturasi elektroforesis gel agarose (Ambion) dan dipindahkan ke membran Hybond-XL (GE Healthcare). LIMIT dikesan menggunakan probe DNA berlabel digoxin dengan DIG Northern Starter Kit (Roche). Urutan siasatan yang menyasarkan LIMIT disenaraikan dalam Jadual Tambahan 7.

Penguatan pantas cDNA berakhir (RACE)

RACE dilakukan untuk mengenal pasti hujung cDNA LIMIT manusia atau Had tetikus dengan Kit Penguatan cDNA SMARTer RACE (Clontech). Primer untuk RACE disenaraikan dalam Jadual Tambahan 8.

Klon LIMIT penuh

Selepas mendapatkan urutan akhir cDNA, LIMIT penuh telah dikuatkan PCR dan dimasukkan ke dalam plasmid PCI-neo antara XhoI dan NotI. Primer klon untuk LIMIT manusia dan Had tetikus disenaraikan dalam Jadual Tambahan 8.

Pecahan sel untuk RT-PCR

Sel A375 prarawatan IFN dikumpul daripada plat 15 cm dengan mengikis dan dibasuh sekali dengan PBS sejuk. Sel-sel telah dipeli dengan sentrifugasi pada 7{10}}0 g selama 5 minit dan dilisiskan dengan penimbal lisis hipotonik (10 mM Tris (pH 7.5), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0.3% (vol/vol) NP{{ 12}}, 10% (vol/vol) gliserol) untuk mengumpul pecahan sitoplasma. RNA sitoplasma diperoleh melalui pemendakan etanol semalaman pada -20 darjah, diikuti dengan pengekstrakan semula menggunakan reagen TRIZOL. Baki pelet nuklear telah dibasuh tiga kali dengan penimbal lisis hipotonik, diikuti dengan pengekstrakan dengan reagen TRIZOL mengikut arahan pengilang. RNA yang diasingkan daripada pecahan nuklear atau sitoplasma telah ditranskripsi terbalik dan RT-PCR untuk LIMIT dengan primer yang ditunjukkan. ACTB yang tidak disambungkan atau matang digunakan sebagai kawalan untuk RNA nuklear atau sitoplasma. Primer untuk ACTB disenaraikan dalam Jadual Tambahan 8.

Western blotting

Sel-sel telah dibasuh dalam PBS sejuk dan dilisekan dalam penimbal lisis 1 × RIPA (Pierce) dengan perencat protease 1 × (Pierce). Lysates diinkubasi pada ais selama 10 minit dan dibersihkan dengan sentrifugasi pada 15,000g selama 15 minit. Kepekatan protein dikira menggunakan kit ujian protein BCA (Thermo Fisher). Protein 30 mikrogram dicampur dengan penimbal sampel (Thermo Fisher) dengan -ME dan didenaturasi pada 95 darjah selama 5 minit. Sampel dipisahkan oleh SDS-PAGE dan dipindahkan ke Membran Nitrocellulose (Bio-Rad). Membran disekat dengan 5% w/v susu kering tanpa lemak dan diinkubasi dengan antibodi primer semalaman pada 4 darjah dan antibodi sekunder konjugasi HRP (CST) selama 1 jam pada suhu bilik. Isyarat telah dikesan menggunakan Clarity dan Clarity Max Western ECL Blotting Substrates (Bio-Rad) dan ditangkap menggunakan Sistem Pengimejan ChemiDoc (Bio-Rad). Antibodi adalah seperti berikut: anti-manusia GBP1-5 (Santa Cruz, 166960, 1: 500), anti-HSF1 (CST, 12972, 1: 1,000), anti-Phospho HSF1 (Abcam , 76076, 1: 1000), antiGBP1 (Proteintech, 15303, 1: 1,000), anti-Gbp2 (Proteintech, 11854, 1: 1,000) , anti-HSP90 (CST, 4877, 1: 1,000), anti-HSPA5 (CST, 3177, 1: 1,000), anti-STAT1 (CST, 9172, 1: 1 ,000), anti-Phospho-STAT1 (CST, 9167, 1: 1000), anti-RAF1 (CST, 9422, 1: 1000), anti-BCL2 (CST, 2870, 1 : 1000), anti-CDK4 (CST, 12790, 1: 1000), dan anti-GAPDH (Proteintech, 60004, 1: 5,000). Untuk penghapusan Barat MHC-I manusia, jumlah lisat sel telah didenaturasi dalam penimbal sampel tanpa -ME (bukan pengurangan) untuk mengekalkan jambatan disulfida dan konformasi protein yang akan dikesan oleh antibodi anti-HLA-ABC (W6/32). , Novus Biologicals, 64775, 1: 1,000).

Co-imunoprecipitation (Co-IP)

Sel telah dikumpulkan dengan penimbal lisis IP (Pierce, 87787) ditambah perencat protease. Kepekatan protein ditentukan dengan kit ujian protein BCA. 200-500 sampel protein ug telah ditambahkan pada 1-3 ug antibodi primer anti-HSP90 (Proteintech, 13171) atau anti-HSF1 (CST, 12972), dan diinkubasi dengan goyang lembut pada 4 darjah semalaman. Kemudian, sampel diinkubasi lagi dengan 20 ul Protein A/G PLUS-Agarose (Santa Cruz, sc-2003) selama 2 jam pada 4 darjah ; dan disentrifugasi pada 7500 ×g selama 30 saat pada 4 darjah . Pelet sel dibasuh 4 kali dengan penimbal lisis IP, digantung semula dengan penimbal sampel 40 ul 2 × dengan -ME, dan dipanaskan selama 5 minit pada 95 darjah. Sampel protein yang didenaturasi telah dianalisis oleh Western blot. Untuk IP Bendera, lisat sel diinkubasi dengan 20 ul EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel (Sigma Aldrich) dan dibasuh, didenaturasi dan dianalisis seperti yang diterangkan di atas.

Pewarnaan imunofluoresensi

Sel A375 yang dipasang pada coverlips dirawat dengan IFN selama 24 jam. Selepas mencuci 2 kali dengan PBS, sel telah ditetapkan dengan 4% PFA selama 15 minit dan dibasuh 2 kali dengan PBS selama 5 minit setiap satu. Kemudian, sel telah diresapkan dengan 0.5% triton x-100 dalam PBS selama 10 minit dan dibilas 2 kali dengan PBS selama 5 minit setiap satu. Antigen telah disekat dengan 10% serum kambing biasa dalam PBS selama 30 minit. Kemudian, antibodi utama ditambah pada 1:50 pencairan antibodi GBP{18}} tetikus anti-manusia (Santa Cruz, 166960) atau antibodi HSP90 anti-manusia arnab (CST, 4877) dan diinkubasi pada 4 darjah semalaman. Selepas itu, sel-sel telah dibasuh dan diinkubasi dengan pencairan 1:500 antibodi anti-tikus kambing sekunder berlabel Qdot 605 (Thermo Fisher, Q11002) atau AF488-antibodi anti-arnab kambing sekunder berlabel (Thermo Fisher, A11034), dan kemudian dipasang pada slaid kaca dengan reagen ProLong Gold yang mengandungi DAPI. Imej pendarfluor konfokal dikumpul menggunakan objektif rendaman minyak 63X (Leica SP5 Inverted 2-Photon FLIM confocal).

Kromatin immunoprecipitation (ChIP)

ChIPs dilakukan dengan kromatin silang silang dari sel A375 yang dirawat IFN dan sama ada antibodi HSF1 (CST, 12972) atau IgG Arnab Normal (CST, 2729), menggunakan Kit IP Chromatin Enzimatik ChIP Plus (Manik Magnetik) (CST, 9005) Simple ChIP Plus. DNA yang diperkaya dikira oleh PCR masa nyata menggunakan primer yang disenaraikan dalam Jadual Tambahan 8. Jumlah DNA imunopresipitasi dalam setiap sampel diwakili sebagai isyarat berbanding dengan jumlah kromatin input, yang bersamaan dengan 1.

Pengasingan sel OT-I dan kultur bersama dengan sel tumor OVA+

Tikus C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J (OT-I) (stok JAX #003831) telah dibeli daripada The Jackson Laboratory. Limpa telah dihomogenkan, dan sel tunggal digantung dalam 2 ml Penampan Lysis Sel Darah Merah (Sigma-Aldrich) selama 1 minit. Splenosit telah dipel, dibasuh dan digantung semula pada 2 × 106 sel per ml dalam medium kultur RPMI yang mengandungi 1 ug/ml OVA257-264 peptida, 5 ug/ml rekombinan tikus IL-2 dan 40 μM { {15}} mercaptoetanol. Sel-sel tersebut diinkubasi pada suhu 37 darjah selama 5 hari. Untuk menyediakan kultur bersama sel tumor OT-I dan OVA+, splenosit dikumpulkan selepas 5-hari pengaktifan. Sel OT-I telah disucikan menggunakan CD tetikus EasySep8+ Kit Pengasingan Sel T (Stemcell). B16-Sel OVA telah disemai semalaman. Sel OT-I kemudiannya ditambah ke dalam kultur pada nisbah yang berbeza. Semua sel telah dikumpulkan oleh trypsinization dan dianalisis oleh flow cytometry (FACS).

Sel dendritik yang berasal dari sumsum tulang (BMDCs) dan makrofaj (BMDMs)

Sumsum tulang telah diasingkan daripada C57BL/6 femur tikus dan dikultur dalam media lengkap RPMI1640 dengan 20 ng/ml GM-CSF (R&D). Sel telah diinkubasi pada 37 darjah dan 5% CO2. Medium 10 ml tambahan dengan 20 ng/ml GM-CSF telah ditambah pada hari ke-3. Pada hari ke-7, sel-sel yang tidak patuh dan longgar dalam supernatan kultur telah dituai dengan mencuci lembut dengan PBS, dan dianggap BMDC. Sel-sel yang melekat dianggap BMDM.

Profil sel imun intratumoral

Untuk mengukur sel T intratumoral dan ekspresi sitokin efektor sel T, penggantungan sel tunggal disediakan daripada tisu tumor segar dengan melalui penapis sel 100 μm secara fizikal. Sel imun diperkaya dengan sentrifugasi kecerunan ketumpatan. Untuk pewarnaan sitokin, sel imun intratumoral diinkubasi dalam medium kultur RPMI yang mengandungi PMA (5 ng/ml), ionomycin (500 ng/ml), brefeldin A (1: 1,000), dan Monessen (1: 1). ,000) pada 37 darjah selama 4 jam. 2-3 ul Anti-CD45 (30-F11, BD Biosciences), anti-CD90 (53-2.1, BD Biosciences), anti-CD3 (145-2C11, BD Antibodi Biosains), anti-CD4 (RM4-5, BD Biosciences) dan anti-CD8 (53-6.7, BD Biosciences) telah ditambah selama 20 minit untuk pewarnaan permukaan. Sel-sel kemudiannya dibasuh dan digantung semula dalam 1 ml larutan Fix/Perm (BD Biosciences) yang baru disediakan pada suhu 4 darjah semalaman. Selepas dibasuh dengan penimbal Perm/Wash (BD Biosciences), sel telah diwarnakan dengan 2-3ul anti-Ki67 (B56, BD Biosciences), anti-TNF (MP6-XT22, BD Biosciences), dan anti-IFN (XMG1.2, BD Biosciences) selama 30 minit, dicuci, dan dibetulkan dalam 4% formaldehid (Sigma Aldrich). Semua sampel dibaca pada cytometer LSR Fortessa dan dianalisis dengan perisian FACS DIVA v. 8.0 (BD Biosciences).

Pengiraan markah tandatangan

Kami menggunakan ekspresi gen yang dinormalkan untuk mentakrifkan tandatangan berikut: CD{0}} penyusupan sel T (CD8A, CD8B, PRF1 dan GZMB), ungkapan MHC-I (HLA-A, HLA-B dan HLA-C) , dan isyarat HSF1 (HSPA1A, HSPA1B, HSPA5 dan HSP90B1).

Analisis statistik

Untuk eksperimen berasaskan sel, tiga kali ganda biologi dilakukan dalam setiap eksperimen tunggal secara umum, melainkan dinyatakan sebaliknya. Untuk kajian haiwan, tidak kurang daripada 5 ulangan setiap kumpulan telah digunakan. Haiwan telah rawak ke dalam kumpulan yang berbeza selepas inokulasi sel tumor. Penyiasat tidak buta terhadap peruntukan semasa eksperimen dan penilaian hasil. Data ditunjukkan sebagai nilai min dengan terbitan piawai. Analisis statistik dilakukan menggunakan perisian GraphPad Prism8 (GraphPad Software, Inc.). Ujian-t 2-dua ekor telah digunakan untuk membandingkan kumpulan rawatan dengan kumpulan kawalan; Fungsi kelangsungan hidup dianggarkan oleh kaedah Kaplan-Meier dan ujian peringkat log digunakan untuk mengira perbezaan statistik.

Ketersediaan data

Data RNA-seq (GSE99299) dan data sel tunggal yang diproses (GSE123814) diperoleh daripada Gene Expression Omnibus (GEO). Data proteomik MS (PXD006003) diperoleh daripada repositori PRIDE. Dataset kanser TCGA diperoleh daripada UCSC Xena (//xena.ucsc.edu/). Data RNA-seq dan maklumat klinikal untuk ujian klinikal ICB disediakan oleh pengarang yang sepadan. Semua data mentah yang menyokong penemuan kajian ini boleh didapati daripada pengarang yang berkaitan atas permintaan. Data sumber disediakan dalam kertas ini.

Ketersediaan kod

Semua analisis yang digunakan dalam kajian ini dilakukan mengikut manual Prism Graphpad versi 8.0 dan tapak web dalam talian di http://xena.ucsc.edu/. Tiada kod atau algoritma baharu dibangunkan semasa kajian ini.

Data Lanjutan

Data Lanjutan Rajah 1:

LIMIT berkorelasi dengan gen imun effector merentas pelbagai jenis kanser.

Data Lanjutan Rajah 2:

Lokus genetik dan jujukan LIMIT manusia dan Had tetikus.

Data Lanjutan Rajah 3: LIMIT menambah ungkapan MHC-1.

Data Lanjutan Rajah 5:

LIMIT menambah ungkapan MHC{1}} yang dimuatkan antigen dalam vivo.

Data Lanjutan Rajah 6:

LIMIT cis mengaktifkan GBP untuk meningkatkan MHC-1 dan imuniti tumor.

Data Lanjutan Rajah 7:

GBP mengaktifkan HSF1 untuk merangsang ekspresi MHC-I.

Data Lanjutan Rajah 8:

HSF1 memacu ekspresi MHC-I dan imuniti tumor.

Data Lanjutan Rajah 9:

Gen isyarat HSF1 dikaitkan dengan MHC-I dan imuniti tumor.

Data Lanjutan Rajah 10: Skim yang menunjukkan cara paksi LIMIT-GBP-HSF1 mempengaruhi MHC-I dan imuniti tumor

Bahan Tambahan

Rujuk versi Web di PubMed Central untuk bahan tambahan.

Ucapan terima kasih

Kami berterima kasih kepada ahli makmal Zou atas input intelektual mereka. Kerja ini disokong sebahagiannya oleh geran penyelidikan daripada geran US NIH/NCI R01 (CA217648, CA123088, CA099985, CA193136, CA152470) (WZ), dan (CA216919, CA213566, CA120458, dan NIH) Geran Pusat Kanser Michigan Rogel (CA46592).

Rujukan

1. Zou W, Wolchok JD & Chen L PD-L1 (B7-H1) dan PD-1 sekatan laluan untuk terapi kanser: Mekanisme, penanda bio tindak balas dan gabungan. Sci Transl Med 8, 328rv324, doi:10.1126/ scitranslmed.aad7118 (2016).

2. Schumacher TN & Schreiber RD Neoantigens dalam imunoterapi kanser. Sains 348, 69–74, doi:10.1126/sains.aaa4971 (2015). [PubMed: 25838375]

3. Garcia-Lora A, Algarra I & Garrido F MHC kelas I antigen, pengawasan imun, dan pelarian imun tumor. J Cell Physiol 195, 346–355, doi:10.1002/jcp.10290 (2003). [PubMed: 12704644]

4. Antigen dan keganasan MHC Festenstein H & Garrido F. Nature 322, 502–503, doi:10.1038/322502a0 (1986). [PubMed: 3461283]

5. Garrido F, Aptsiauri N, Doorduijn EM, Garcia Lora AM & van Hall T Keperluan mendesak untuk memulihkan MHC kelas I dalam kanser untuk imunoterapi yang berkesan. Curr Opin Immunol 39, 44–51, doi:10.1016/ j.coi.2015.12.007 (2016). [PubMed: 26796069]

6. Hon CC et al. Atlas RNA bukan pengekodan panjang manusia dengan hujung 5' yang tepat. Alam 543, 199– 204, doi:10.1038/alam21374 (2017). [PubMed: 28241135]

7. Mercer TR, Dinger ME & Mattick JS Long bukan pengekodan RNA: cerapan tentang fungsi. Nat Rev Genet 10, 155–159, doi:10.1038/nrg2521 (2009). [PubMed: 19188922]

8. Ponting CP, Oliver PL & Reik W Evolusi dan fungsi RNA bukan pengekodan yang panjang. Sel 136, 629– 641, doi:10.1016/j.cell.2009.02.006 (2009). [PubMed: 19239885]

9. Wilusz JE, Sunwoo H & Spector DL ​​RNA bukan pengekodan yang panjang: kejutan berfungsi daripada dunia RNA. Genes Dev 23, 1494–1504, doi:10.1101/gad.1800909 (2009). [PubMed: 19571179]

10. Kung JT, Colognori D & Lee JT RNA bukan pengekodan panjang: masa lalu, sekarang dan masa depan. Genetik 193, 651–669, doi:10.1534/genetik.112.146704 (2013). [PubMed: 23463798]

11. Flynn RA & Chang HY RNA bukan pengekodan panjang dalam pengaturcaraan nasib sel dan pengaturcaraan semula. Sel Stem Sel 14, 752–761, doi:10.1016/j.stem.2014.05.014 (2014). [PubMed: 24905165]

12. Huarte M. Peranan lncRNA yang muncul dalam kanser. Nat Med 21, 1253–1261, doi:10.1038/nm.3981 (2015). [PubMed: 26540387]

13. Frankish A et al. Anotasi rujukan GENCODE untuk genom manusia dan tetikus. Asid Nukleik Res 47, D766–D773, doi:10.1093/nar/gky955 (2019). [PubMed: 30357393]

14. Riaz N et al. Tumor dan Evolusi Persekitaran Mikro semasa Imunoterapi dengan Nivolumab. Sel 171, 934–949 e916, doi:10.1016/j.cell.2017.09.028 (2017). [PubMed: 29033130]

15. Hugo W et al. Ciri Genom dan Transkripmik Tindak Balas kepada Terapi Anti-PD-1 dalam Melanoma Metastatik. Sel 168, 542, doi:10.1016/j.cell.2017.01.010 (2017).

16. Van Allen EM et al. Hubungan genomik tindak balas terhadap sekatan CTLA{1}} dalam melanoma metastatik. Sains 350, 207–211, doi:10.1126/science.aad0095 (2015). [PubMed: 26359337]

17. Nathanson T et al. Mutasi Somatik dan Homologi Neoepitope dalam Melanoma Dirawat dengan Sekatan-4 CTLA. Cancer Immunol Res 5, 84–91, doi:10.1158/2326-6066.CIR-16-0019 (2017). [PubMed: 27956380]

18. Sui J et al. Analisis sistematik tandatangan berkaitan lncRNA novel sebagai penanda bio prognostik untuk Karsinoma Hepatoselular. Cancer Med, doi:10.1002/cam4.1541 (2018).

19. Kaplan DH et al. Demonstrasi sistem pengawasan tumor yang bergantung kepada interferon gamma dalam tikus imunokompeten. Proc Natl Acad Sci USA 95, 7556–7561, doi:10.1073/pnas.95.13.7556 (1998). [PubMed: 9636188]

20. Penyampaian Antigen Fruh K & Yang Y oleh MHC kelas I dan pengawalannya oleh interferon-gamma. Curr Opin Immunol 11, 76–81 (1999). [PubMed: 10047537]

21. Dong H et al. B7-H1 yang berkaitan dengan tumor menggalakkan apoptosis sel T: mekanisme potensi pengelakan imun. Nat Med 8, 793–800, doi:10.1038/nm730 (2002). [PubMed: 12091876]

22. Perez-Pinera P et al. Pengaktifan gen berpandukan RNA oleh faktor transkripsi berasaskan CRISPR-Cas9-. Kaedah Nat 10, 973–976, doi:10.1038/nmeth.2600 (2013). [PubMed: 23892895]

23. Lin H et al. Ungkapan hos PD-L1 menentukan keberkesanan regresi tumor yang disekat oleh sekatan laluan PD-L1. J Clin Invest 128, 1708, doi:10.1172/JCI120803 (2018). [PubMed: 29608143]

24. Sun Q, Hao Q & Prasanth KV RNA Bukan Pengekodan Panjang Nuklear: Pengawal Selia Utama bagi Ekspresi Gen. Trend Genet 34, 142–157, doi:10.1016/j.tig.2017.11.005 (2018). [PubMed: 29249332]

25. Cheng YS, Colonno RJ & Yin FH Interferon induksi protein fibroblast dengan aktiviti mengikat guanylate. J Biol Chem 258, 7746–7750 (1983). [PubMed: 6305951]

26. Kim BH et al. Protein pengikat guanylate yang disebabkan oleh interferon dalam pengaktifan inflammasom dan pertahanan perumah. Nat Immunol 17, 481–489, doi:10.1038/ni.3440 (2016). [PubMed: 27092805]

27. Messeguer X et al. PROMO: pengesanan unsur kawal selia transkripsi yang diketahui menggunakan carian yang disesuaikan dengan spesies. Bioinformatik 18, 333–334, doi:10.1093/bioinformatics/18.2.333 (2002). [PubMed: 11847087]

28. Konsortium, EP Ensiklopedia bersepadu unsur DNA dalam genom manusia. Alam 489, 57–74, doi:10.1038/alam11247 (2012). [PubMed: 22955616]

29. Dai C & Sampson SB HSF1: Penjaga Proteostasis dalam Kanser. Trends Cell Biol 26, 17–28, doi:10.1016/j.tcb.2015.10.011 (2016). [PubMed: 26597576]

30. West JD, Wang Y & Morano KA Pengaktif molekul kecil tindak balas kejutan haba: sifat kimia, sasaran molekul dan janji terapeutik. Chem Res Toxicol 25, 2036–2053, doi:10.1021/tx300264x (2012). [PubMed: 22799889]

31. Zou J, Guo Y, Guettouche T, Smith DF & Voellmy R Penindasan faktor transkripsi kejutan haba pengaktifan HSF1 oleh HSP90 (kompleks HSP90) yang membentuk kompleks sensitif tekanan dengan HSF1. Sel 94, 471–480 (1998). [PubMed: 9727490]

32. Dayalan Naidu S & Dinkova-Kostova AT Peraturan faktor kejutan haba mamalia 1. FEBS J 284, 1606–1627, doi:10.1111/febs.13999 (2017). [PubMed: 28052564]

33. Whitesell L & Lindquist SL HSP90 dan pendamping kanser. Nat Rev Cancer 5, 761–772, doi:10.1038/nrc1716 (2005). [PubMed: 16175177]

34. Yost KE et al. Penggantian klon sel T khusus tumor berikutan sekatan PD-1. Nat Med 25, 1251–1259, doi:10.1038/s41591-019-0522-3 (2019). [PubMed: 31359002]

35. Harel M et al. Proteomik Tindak Balas Melanoma kepada Imunoterapi Mendedahkan Ketergantungan Mitokondria. Sel 179, 236–250 e218, doi:10.1016/j.cell.2019.08.012 (2019). [PubMed: 31495571]

36. Heward JA & Lindsay MA RNA bukan pengekodan panjang dalam pengawalan tindak balas imun. Trends Immunol 35, 408–419, doi:10.1016/j.it.2014.07.005 (2014). [PubMed: 25113636]

37. Flores-Concha M & Onate AA Long Non-coding RNAs dalam Peraturan Tindak Balas Imun dan Imuniti Terlatih. Genet Depan 11, 718, doi:10.3389/fgene.2020.00718 (2020). [PubMed: 32793280]

38. RNA Bukan Pengekodan Panjang Schmitt AM & Chang HY dalam Laluan Kanser. Sel Kanser 29, 452–463, doi:10.1016/j.ccell.2016.03.010 (2016). [PubMed: 27070700]

39. Sun TT et al. LncRNA GClnc1 Menggalakkan Karsinogenesis Gastrik dan Boleh Bertindak sebagai Perancah Modular Kompleks WDR5 dan KAT2A untuk Menentukan Corak Pengubahsuaian Histone. Cancer Discov 6, 784–801, doi:10.1158/2159-8290.CD-15-0921 (2016). [PubMed: 27147598]

40. Sharma P, Hu-Lieskovan S, Wargo JA & Ribas A Primary, Adaptive, and Acquired Resistance to Cancer Immunotherapy. Sel 168, 707–723, doi:10.1016/j.cell.2017.01.017 (2017). [PubMed: 28187290]

41. Peng D et al. Pendiaman epigenetik kemokin jenis TH1-membentuk imuniti tumor dan imunoterapi. Alam 527, 249–253, doi:10.1038/alam15520 (2015). [PubMed: 26503055]

42. Wang W et al. Sel T CD8(+) mengawal ferroptosis tumor semasa imunoterapi kanser. Nature 569, 270–274, doi:10.1038/s41586-019-1170-y (2019). [PubMed: 31043744]

43. Gao J et al. Kehilangan Gen Laluan IFN-gamma dalam Sel Tumor sebagai Mekanisme Penentangan terhadap Terapi Anti-CTLA-4. Sel 167, 397–404 e399, doi:10.1016/j.cell.2016.08.069 (2016). [PubMed: 27667683]

44. Zaretsky JM et al. Mutasi Berkaitan dengan Rintangan Diperoleh kepada Sekatan PD-1 dalam Melanoma. N Engl J Med 375, 819–829, doi:10.1056/NEJMoa1604958 (2016). [PubMed: 27433843]

45. Manguso RT et al. Pemeriksaan CRISPR in vivo mengenal pasti Ptpn2 sebagai sasaran imunoterapi kanser. Alam 547, 413–418, doi:10.1038/alam23270 (2017). [PubMed: 28723893]

46. ​​Shin DS et al. Rintangan Utama kepada PD-1 Sekatan Ditengahkan oleh Mutasi JAK1/2. Cancer Discov 7, 188–201, doi:10.1158/2159-8290.CD-16-1223 (2017). [PubMed: 27903500]

47. Sucker A et al. Rintangan IFNgamma yang diperolehi menjejaskan imuniti anti-tumor dan menimbulkan lesi melanoma yang tahan sel T. Nat Commun 8, 15440, doi:10.1038/ncomms15440 (2017). [PubMed: 28561041]

48. Li J et al. Mutasi pemacu epigenetik dalam bentuk ARID1A fenotip imun dan imunoterapi kanser. J Clin Invest, doi:10.1172/JCI134402 (2020).

49. Benci JL et al. Isyarat Interferon Tumor Mengawal Program Rintangan Multigenik kepada Sekatan Pusat Pemeriksaan Imun. Sel 167, 1540–1554 e1512, doi:10.1016/j.cell.2016.11.022 (2016). [PubMed: 27912061]

50. Arun G, Diermeier SD & Spector DL ​​Penyasaran Terapeutik RNA Bukan Pengekodan Panjang dalam Kanser. Trend Mol Med 24, 257–277, doi:10.1016/j.molmed.2018.01.001 (2018). [PubMed: 29449148]

51. Gil N & Ulitsky I Peraturan ekspresi gen oleh cis-acting long non-coding RNAs. Nat Rev Genet 21, 102–117, doi:10.1038/s41576-019-0184-5 (2020). [PubMed: 31729473]

52. Jones AN & Sattler M Cabaran dan perspektif untuk biologi struktur lncRNAs-contoh Xist lncRNA A-ulang. J Mol Cell Biol 11, 845–859, doi:10.1093/jmcb/mjz086 (2019). [PubMed: 31336384]

53. Shenoy AR et al. GBP5 menggalakkan perhimpunan radang NLRP3 dan imuniti dalam mamalia. Sains 336, 481–485, doi:10.1126/sains.1217141 (2012). [PubMed: 22461501]

54. Tretina K, Park ES, Maminska A & MacMicking JD Protein pengikat guanylate yang disebabkan oleh Interferon: Penjaga pertahanan perumah dalam kesihatan dan penyakit. J Exp Med 216, 482–500, doi:10.1084/ jem.20182031 (2019). [PubMed: 30755454]

55. Yamamoto M et al. Sekumpulan p65 GTPases yang boleh diinduksi interferon-gamma memainkan peranan penting dalam pertahanan perumah terhadap Toxoplasma gondii. Kekebalan 37, 302–313, doi:10.1016/ j.immuni.2012.06.009 (2012). [PubMed: 22795875]

56. Mbofung RM et al. Perencatan HSP90 meningkatkan imunoterapi kanser dengan mengawal selia gen tindak balas interferon. Nat Commun 8, 451, doi:10.1038/s41467-017-00449-z (2017). [PubMed: 28878208]

57. Proia DA & Kaufmann GF Mensasarkan Protein Kejutan Haba 90 (HSP90) sebagai Strategi Pelengkap kepada Sekatan Pusat Pemeriksaan Imun untuk Terapi Kanser. Cancer Immunol Res 3, 583–589, doi:10.1158/2326-6066.CIR-15-0057 (2015). [PubMed: 25948551]

58. Yuno A et al. Penilaian Klinikal dan Pemprofilan Biomarker Perencat Hsp90. Kaedah Mol Biol 1709, 423–441, doi:10.1007/978-1-4939-7477-1_29 (2018). [PubMed: 29177675]

59. Charo J et al. Ekspresi berlebihan Bcl{1}} meningkatkan kemandirian sel T khusus tumor. Kanser Res 65, 2001– 2008, doi:10.1158/0008-5472.CAN-04-2006 (2005). [PubMed: 15753400]

60. Owaki H et al. Raf-1 diperlukan untuk pengeluaran IL2 sel T. EMBO J 12, 4367–4373 (1993). [PubMed: 8223446]