Senibina Tiga Dimensi Nefron dalam Buah Pinggang Normal Dan Cystic

Kenalan: emily.li@wecistanche.com

Thomas Blanc1,2,7 , Nicolas Goudin3,7 , Mohamad Zaidan1,4,7 , Meriem Garfa Traore3 , Frank Bienaime1,5, Lisa Turinsky1 , Serge Garbay1 , Cle´ment Nguyen1 , Martine Burtin1 , Ge´rard Friedlander1,6 , Fabiola Terzi1,8 dan Marco Pontoglio1,8

Cistanche baik untuk buah pinggang

KATA KUNCI: penyakit buah pinggang sista; buah pinggang; nefron; nefronophthisis;pembersihan tisu

Fungsi buah pinggang amat bergantung kepada struktur tiga dimensi kompleks nefron. Sebarang herotan bentuknya boleh menyebabkandisfungsi buah pinggang. Kaedah histologi tradisional memberikan batasan utama untuk pembinaan semula tisu tiga dimensi. Di sini, kami menggabungkan pembersihan tisu, mikroskop berbilang foton dan pengesanan digital untuk pembinaan semula nefron tunggal di bawah keadaan fisiologi dan patologi. Set daripadanefronberbeza dari segi lokasi, bentuk dan saiz mengikut fungsinya telah dikenalpasti. Menariknya, nefron cenderung terletak pada satah. Apabila teknik ini digunakan pada modelpenyakit buah pinggang sista, sista didapati berkembang hanya dalam segmen nefron tertentu. Di sepanjang segmen yang sama, sista adalah bersebelahan dalam tubul biasa yang tidak mengembang. Selain itu, bentuk sista berbeza-beza mengikut segmen nefron. Oleh itu, penemuan kami menyediakan strategi yang berharga untuk menggambarkan struktur kompleks buah pinggang pada tahap nefron tunggal dan, yang lebih penting, menyediakan asas untuk memahami proses patologi seperti sisogenesis.

Pernyataan Terjemahan

Kaedah pembersihan menyediakan alat unik untuk memahami bagaimana perubahan morfologi membawa kepada akibat patologi. Buah pinggang ialah organ kritikal yang mengekalkan homeostasis badan melalui pengendalian air, metabolit dan elektrolit, yang amat bergantung pada struktur dimensi 3-kompleks nefron. Apabila organisasi struktur ini diubah, patofisiologi buah pinggang berlaku. Dalam kajian ini, kami telah membangunkan kaedah yang berkuasa berdasarkan penjelasan optik,

mikroskopi multifoton, dan pengesanan digital untuk mengkaji buah pinggang pada tahap nefron tunggal di bawah keadaan fisiologi dan patologi. Khususnya, kami menyediakan pembinaan semula dimensi pertama 3-buah pinggang polikistik pada skala nefron tunggal. Kaedah ini boleh digunakan untuk beberapa konteks patologi, membolehkan kita lebih memahami proses kompleks kemerosotan buah pinggang dan, akibatnya, untuk membangunkan strategi terapeutik yang lebih disasarkan.

Buah pinggang mengekalkan homeostasis badan melalui struktur nefron 3-dimensi (3D) kompleksnya. Apabila organisasi struktur ini diubah, patofisiologi buah pinggang berlaku.Penyakit buah pinggang kronikdicirikan oleh perkembangan lesi buah pinggang. Menariknya, ahli patologi telah melaporkan kepelbagaian luas dalam pengedaran lesi semasa penyakit buah pinggang kronik.1,2 Sama ada ini mencerminkan fakta bahawa segmen nefron tertentu boleh rosak secara berbeza, atau secara alternatif, sesetengah nefron mempunyai kerentanan yang berbeza untuk cedera secara keseluruhan. , tidak diketahui. Untuk menangani isu ini, adalah wajib untuk membina semula bentuk 3D nefron dalam konteks patologi.

Untuk pengetahuan kita,nefronhanya dibina semula sepenuhnya menggunakan bahagian 2D bersiri.3–5 Walaupun keratan histologi standard memberikan resolusi tinggi, pembinaan semula 3D adalah susah payah dan sukar diperoleh. Ini disebabkan terutamanya oleh herotan mekanikal, yang merupakan kesan yang tidak dapat dielakkan daripada prosedur penghirisan. Tambahan pula, pembinaan semula 3D daripada imej 2D tidak membenarkan pengimejan langsung struktur 3D dalam tisu yang dipasang sepenuhnya.

Mikroskopi multifoton telah meningkatkan keupayaan kami untuk mengesan perubahan morfologi dalam bahagian tebal. Walau bagaimanapun, had yang ketara ialah kedalaman cetek yang boleh diakses disebabkan oleh penyerakan cahaya. Dengan meminimumkan perbezaan indeks biasan, agen pembersihan telah secara mendadak meningkatkan keupayaan untuk kedalaman imej.6,7 Walaupun fakta bahawa agen pembersihan pertama telah diperkenalkan seabad yang lalu,8 baru-baru ini beberapa protokol penjelasan telah dibangunkan, kebanyakannya untuk otak. .9–17 Kajian terkini telah menunjukkan potensi mereka untuk pengimejan organ pepejal lain, seperti hati, pankreas atau buah pinggang.18–26

cistanche untuk penyakit buah pinggang

Penyakit buah pinggang polikistik, gangguan genetik heterogen yang melibatkan mutasi dalam beberapa gen ciliary, adalah penyakit buah pinggang keturunan yang paling biasa.27,28 Penyakit buah pinggang polikistik dicirikan oleh perkembangan sista yang membawa kepada kemusnahan lengkap buah pinggang.28 Kajian mikrodisseksi mencadangkan bahawa sista boleh berkembang sama ada sebagai "tolak keluar" segmen nefron, seperti dalam polikistik dominan autosomalpenyakit buah pinggang; sebagai pengembangan ektatik saluran pengumpul (CD), seperti dalam polikistik resesif autosomalpenyakit buah pinggang; atau secara eksklusif dalam tubul medula, seperti dalam nephronophthisis (NPHP).27,29 Walau bagaimanapun, bagaimana sista berkembang dalam 3D dan menyusun antara satu sama lain dan tubul jiran biasa masih tidak diketahui.

Di sini, kami menggabungkan pembersihan optik dengan mikroskop multifoton untuk memberikan pandangan baharu tentang caranyanefrondibentuk dan diatur dalam keadaan fisiologi dan bagaimana ia diubah suai semasa penyakit, seperti sisogenesis. Keputusan kami menunjukkan bahawa terdapat 3 jenis nefron dan kapal boleh mempengaruhi organisasi spatial nefron. Menariknya, kami memerhatikan bahawa nefron cenderung terletak pada satah tertentu. Tanpa diduga, apabila kami menggunakan teknik ini pada tikus, kami memerhatikan bahawa sista berkembang hanya dalam segmen nefron tertentu dengan sista fusiform yang bercampur dengan tubul biasa.

KEPUTUSAN

Persediaan eksperimen

Untuk mengkaji bentuk keseluruhannefronberhubung dengan persekitaran mereka, kami menggunakan teknik berdasarkan penjelasan optik dan mikroskop multifoton (Rajah Tambahan S1A). Dengan membandingkan protokol pembersihan optik yang berbeza, kami menentukan bahawa untuk buah pinggang, alkohol benzil / benzil benzoat (BABB) adalah yang paling sesuai dari segi keberkesanan (Rajah Tambahan S1B dan C dan Jadual Tambahan S1).

Pembinaan semula 3D dan pengesanan digital memerlukan imej berkualiti tinggi dengan resolusi tinggi dan nisbah isyarat kepada latar belakang yang tinggi. Kami memerhatikan bahawa isyarat optik yang disediakan oleh pendarfluor asli tidak seragam pada bahagian buah pinggang. Khususnya, imej dari medula adalah kurang kontras dengan nisbah isyarat-ke-latar belakang yang rendah (Tambahan Rajah S2). Untuk menambah baik nisbah isyarat kepada latar belakang, kami mengotorkan bahagian dengan asid berkala–Schiff (Rajah Tambahan S1D), kerana kami secara empirik menyatakan bahawa pewarnaan ini menimbulkan kontras yang tinggi dalam bahagian nipis semasa 2-pendarfluor foton. Walau bagaimanapun, isyarat itu tidak seragam sepanjang bahagian buah pinggang asid berkala tebal-Schiff (Tambahan Rajah S1E). Oleh itu, kami mengotorkan bahagian buah pinggang dengan lektin bergandingan flfluorochrome: aglutinin kacang tanah dan aglutinin kuman gandum, yang mengotorkan glomeruli dan tubul, dan Griffonia simplicifolia agglutinin, yang menandakan saluran darah.30 Hebatnya, dengan gabungan lektin ini, isyarat kepada- nisbah latar belakang telah meningkat secara mendadak secara keseluruhanbahagian buah pinggang, dengan peningkatan yang ketara dalam kedua-dua satah xy dan paksi z (Rajah Tambahan S1E dan Filem Tambahan S1).

Visualisasi segmen nefron 3D

Untuk menggambarkan bentuk keseluruhan nefron, kami mengesan laluan mereka, bermula di kutub kencing glomerulus dan berakhir di persimpangan CD (Filem Tambahan S2). Walaupun fakta bahawa lektin yang digunakan secara global mengikat semua segmen nefron, kami mendapati bahawa apabila diperiksa dengan teliti, lektin ini dicirikan oleh corak tertentu dalam cara mereka mengotorkan membran basal atau luminal dalam segmen nefron yang berbeza. Dalam erti kata lain, kami mengambil kesempatan daripada corak stereotaip pewarnaan lektin untuk mengenal pasti segmen nefron yang berbeza. Dengan cara ini, kita boleh mengenal pasti 6 entiti dengan mudah: tubul proksimal (PT), anggota nipis (TL) gelung Henle (HL), anggota menaik tebal (TAL) HL, tubul berbelit distal (DCT), tubul penyambung (CNT). ), dan CD. Peralihan antara PT dan TL dicirikan oleh kehilangan mendadak isyarat sempadan berus PT tipikal dan oleh penurunan lebar lumen, yang hampir tidak hadir dalam TL (Rajah 1a). Sebaliknya, peralihan antara TL dan TAL dicirikan oleh peningkatan yang ketara dalam diameter tiub luar dan lebar lumen yang agak malar (Rajah 1b). Dalam semuanefron, peralihan TAL kepada DCT didapati secara sistematik pada kutub vaskular glomerulus. Peralihan ini dicirikan oleh pembesaran mendadak diameter tiub luar yang kebanyakannya disebabkan oleh peningkatan ketara dalam diameter lumen (Rajah 1c). Peralihan antara DCT dan CNT dicirikan oleh pengurangan dalam kedua-dua diameter tiub dan lumen (Rajah 1d). Akhirnya, sambungan antara CNT dan CD kortikal dicirikan oleh peningkatan mendadak dalam kedua-dua diameter tiub dan lumen (Rajah 1e). Kuantifikasi peralihan morfologi ini adalah signifikan secara statistik (Rajah 1f), dan kesesuaiannya telah disahkan dengan pewarnaan dengan penanda tiub tertentu (Rajah Tambahan S3-S5 dan Filem Tambahan S3-S5).

Bentuk dan saiz PT berbeza mengikut kedalamannya

Pewarnaan tebalbahagian buah pinggangmembolehkan kami mengesan koordinat evolusi spatial keseluruhan segmen PT. Menariknya, kami mendapati bahawa bentuknya sangat berubah-ubah dan ditentukan oleh kedudukan glomeruli mereka dalam korteks. Di peringkat global, kami mengenal pasti 3 corak. Cor fifirst bertindak balas kepada nefron paling cetek (SNs) (Rajah 2a; Filem Tambahan S6), yang menduduki bahagian paling luar korteks (30 peratus paling luar hampir dengan kapsul buah pinggang). Bahagian berbelit mereka membentuk struktur padat dengan hanya 6 hingga 7 belitan di sekeliling glomerulus mereka sendiri, menduduki ruang yang sangat kecil dan padat. Konvolusi SN ini berakhir dengan pars recta yang panjang dan lurus yang turun ke dalam medula. Di hujung bertentangan spektrum ini, kami memerhati corak keduanefronterletak di bahagian paling dalam korteks (40 peratus lebih kedalaman dalaman), bersebelahan dengan medulla (nefron juxtamedullary [JNs]) (Rajah 2a; Rajah Tambahan S6 dan Filem Tambahan S6). PT mereka dicirikan oleh gelung pendek awal yang secara sistematik turun ke arah papila dan kemudian U berpusing untuk naik ke arah kapsul buah pinggang. Berbeza dengan SN, tubul berbelit proksimal JN dicirikan oleh gegelung besar yang berkembang di sekeliling glomerulus mereka sendiri dan menduduki domain yang besar dan padat longgar dalam korteks juxtamedullary. Bahagian berbelit-belit PT JN mempunyai 10 hingga 15 lilitan, membentuk domain yang besar. Akhirnya, corak ketiga termasuk nefron yang terletak di bahagian tengah korteks (nefron tengah [MNs]) (Rajah 2a; Filem Tambahan S6). Menariknya, tubul ini mempunyai bentuk dan orientasi spatial yang mewakili peralihan antara SN dan JN. Malah, ia mengandungi 8 hingga 9 konvolusi dengan gegelung yang lebih besar daripada SN, tetapi lebih kecil daripada JN. Di samping itu, MN mempunyai pars recta yang lebih panjang daripada JN. Menariknya, perbandingan global bentuk PT menunjukkan bahawa SN dan MN mempunyai corak homogen manakala JN sangat heterogen (Tambahan Rajah S6). Di samping itu, pembinaan semula spatial beberapa nefron mendedahkan bahawa PT tidak pernah bercampur (Filem Tambahan S6), menunjukkan bahawa setiap nefron menduduki ruang individunya sendiri dalam korteks.

Analisis morfometrik mengesahkan perbezaan besar dalam saiz dan bentuk SN dan JN, dengan aspek perantaraan untuk MN. PT JN adalah lebih daripada 2-kali ganda lebih panjang daripada PT SN (Rajah 2b); walau bagaimanapun, kelurusan adalah lebih besar dalam SN berbanding JNs (Rajah 2c), selaras dengan pemerhatian bahawa tubul JN adalah lebih berliku-liku (Rajah 2a; Rajah Tambahan S6).

Rajah 1|Kriteria morfologi yang digunakan untuk mengenal pasti segmen nefron. (a-e) Morfologi segmen berbeza nefron dalam tikus kawalan. Nefron dikesan dari kutub kencing glomerulus ke saluran pengumpul (tubul proksimal [PT]: turquoise; anggota nipis [TL] gelung Henle: kelabu muda; anggota menaik tebal [TAL] gelung Henle: kelabu gelap; tubul berbelit distal [DCT]: merah jambu; tubul penghubung [CNT]: kuning; salur pengumpul kortikal [CCD]: oren). Anak panah menunjukkan diameter segmen nefron yang berbeza. (Bersambung)

Rajah 1|(Sambungan) (f) Kuantifikasi diameter tiub luar bagi segmen nefron yang berbeza. Data dinyatakan sebagai min SEM. Analisis varians diikuti dengan ujian Tukey-Kramer: **P < 0.01,="" ***p=""><>

Rajah 3|Pembinaan semula nefron tiga dimensi (3D) mendedahkan 3 jenis nefron yang berbeza. (a) Imej 3D yang mewakili keseluruhan nefron (panel kiri) dari glomeruli ke saluran pengumpulan dalam korteks superfisial (biru), korteks tengah (hijau), dan kawasan juxtamedular (merah) dalam tikus kawalan. Pembahagian nefron (panel kanan) untuk 3 jenis nefron yang berbeza. Bar ¼ 150 mm. (b) Kuantifikasi jarak antara 2 anggota gelung Henle untuk 3 jenis nefron. (c) Kuantifikasi panjang nefron untuk (sambungan)

Rajah 3|(bersambung) 3 jenis nefron. (d) Kuantifikasi panjang segmen berbeza nefron mengikut jenis nefron. Data dinyatakan sebagai min -SEM. Analisis varians diikuti dengan ujian Tukey-Kramer: juxtamedullary nephron (JN) versus superfificial nephron (SN): ###P < 0.001;="" jn="" lawan="" nefron="" tengah="" (mn):="" *="" p="">< 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001.="" cnt,="" tubul="" penyambung;="" dct,="" tubul="" berbelit="" distal;="" pt,="" tubul="" proksimal;="" tal,="" anggota="" badan="" menaik="" tebal="" gelung="" henle;="" tl,="" anggota="" nipis="" gelung="">

Saiz glomerular berbeza mengikut kedalaman

Kami kemudian menganalisis kedalaman dan diameter glomeruli yang dipilih secara rawak daripada setiap 3 zon. Analisis morfometrik mendedahkan bahawa glomeruli terletak pada purata 783 dan 355 mm dari kapsul buah pinggang dalam JNs dan SNs, masing-masing. Seperti yang dilaporkan sebelum ini, kami mendapati bahawa saiz glomeruli berbeza-beza mengikut kedalaman mereka. Khususnya, isipadu glomerular JN adalah 3 kali lebih besar daripada SN dan MN (Rajah 2d).

Pembinaan semula nefron 3D

Kami kemudian mengesan evolusi spatial seluruh nefron daripada PT ke CNT. Pandangan global pembinaan semula 3D mereka mengesahkan bahawa bentuk nefron berbeza antara SN, MN, dan JN (Rajah 3a; Filem Tambahan S7). Perbezaan ini disebabkan terutamanya oleh struktur PT. Di samping itu, kami mendapati bahawa HL mempunyai organisasi spatial 3D yang berbeza. Khususnya, TL dan TAL lebih jauh dipisahkan dalam JN berbanding SN dan MN (Rajah 3b). Analisis morfometrik mendedahkan bahawa JN secara global 2-kali ganda lebih lama daripada SN (Rajah 3c). Peningkatan panjang telah diedarkan secara berkadar dalam semua segmen, kecuali untuk TAL dan DCT, yang cenderung mempunyai panjang mutlak yang sama dalam semua jenis nefron (Rajah 3d). Ini mencadangkan bahawa pemanjangan nefron adalah proses bercorak homogen yang menghairankan.

Kapal arkuate mempengaruhi lilitan PT juxtamedullary

Untuk mendapatkan perspektif yang lebih komprehensif tentangstruktur buah pinggang, kami mengambil kesempatan daripada pewarnaan Griffonia simplicifolia agglutinin, yang membolehkan kami mengesan kapal arkuate dan cawangannya ke dalam kapal pancaran kortikal (Rajah 4a; Filem Tambahan S8). Menariknya, pembinaan semula 3D nefron dan vesel serentak menunjukkan bahawa vesel arkuate cenderung berada dalam organisasi ruang selari yang mengejutkan dengan tubulus berdekatan. Khususnya, kami memerhatikan bahawa laluan yang diikuti oleh JN tertentu (JN yang dikekang) cenderung mengikuti laluan kapal berdekatan (Rajah 4b; Filem Tambahan S9). Hebatnya, berat sebelah ini (hanya diperhatikan dalam subset nefron JN) menyumbang kepada heterogeniti yang besar dalam bentuk PT (Tambahan Rajah S6). Analisis morfometrik mendedahkan bahawa PT "terkekang" adalah jauh lebih panjang dan lebih berliku-liku (kelurusan dikurangkan) daripada yang "tidak dikekang" (Rajah 4c dan d). Perlu diingat bahawa bahagian berbelit kedua-dua SN dan MN diletakkan di atas kapal arkuate dan tidak dikekang.

Tubul cenderung terletak pada satah

Menariknya, pemeriksaan bentuk 3D nefron menunjukkan bahawa ia cenderung terletak dalam satah (Rajah 5a; Filem Tambahan S10). Untuk mengukur parameter ini dan untuk menilai kecenderungan statistik yang mungkin bagi konformasi ini, kami mengukur kecenderungan umum tubul untuk membengkok keluar dari satah yang ditentukan oleh gelungnya. Pengukuran kami menunjukkan bahawa berbanding dengan model simulasi berjalan rawak yang dihasilkan dengan set sudut dan panjang yang diukur berturut-turut yang sama antara titik berturut-turut (Rajah 5b), tubul cenderung berkembang dengan sisihan yang lebih kecil dari satah (Rajah 5c). Ini menunjukkan bahawa tubulus cenderung untuk menyekat laluan mereka di sepanjang satah. Perbezaan yang diperhatikan adalah sangat signifikan secara statistik (P <>

cistanche boleh meningkatkan fungsi buah pinggang

Pembinaan semula nefron 3D mendedahkan corak khusus untuk pembangunan sista

Untuk menentukan sama ada protokol kami membenarkan pengesanan nefron dalam tisu patologi yang tidak teratur, kami mencirikan bentuk dan taburan ruang sista dalam tikus jck, model NPHP dan penyakit sista yang digunakan secara meluas.31–33 3Imej D menunjukkan bahawa walaupun daripada penampilan sista yang menonjol, kursus 3D umum nefron tidak berbeza dengan ketara daripada tikus kawalan (Filem Tambahan S11). Begitu juga, analisis morfometrik mengesahkan bahawa panjang global nefron, isipadu glomerular, dan panjang setiapnefronsegmen adalah setanding dengan tikus kawalan (Tambahan Rajah S7). Untuk makluman, disebabkan perkembangan sista, kami tidak dapat membezakan TL daripada TAL dalam HL. Semua nefron membina sista fusiform (Filem Tambahan S11 dan S12). Salah satu ciri yang paling menarik ialah pemerhatian bahawa pelebaran sista fusiform berlaku di beberapa lokasi di sepanjang tempat yang sama.nefronsegmen (Filem Tambahan S12 dan S13). Menariknya, kami memerhatikan bahawa sista tidak pernah berkembang di PT dan anggota badan menurun HL (Rajah 6a; Filem Tambahan S12). Sebaliknya, mereka kebanyakannya dikesan dalam anggota menaik HL, DCT, CNT, dan di bahagian atas CD, dalam kesinambungan dengan CNT (Rajah 6a; Filem Tambahan S12). Khususnya, kami mendapati bahawa DCT, serta segmen CNT, mempunyai kebarangkalian yang meningkat secara khusus untuk membina sista di bahagian yang lebih distal masing-masing (Rajah 6b). Analisis morfometrik kuantitatif imej pembinaan semula 3D mendedahkan bahawa jumlah volum sista setiapnefronadalah tinggi dalam CNT (Rajah 7a). Di samping itu, kami mendapati bahawa saiz sista dalam HL dan DCT lebih besar dalam JN berbanding SN dan MN (Rajah 7a; Filem Tambahan S12). Selain itu, kejadian sista adalah lebih tinggi dalam JN berbanding jenis nefron lain (Rajah 7b). Kami juga mendapati bahawa jarak antara glomerular purata (dikira pada 5 glomeruli terdekat) cenderung meningkat terutamanya dalam tikus sista, terutamanya dalam korteks yang lebih cetek (Tambahan Rajah S8).

Pembinaan semula 3D bagi banyak sista mendedahkan bahawa ia sangat berubah-ubah dalam bentuk dan isipadu (Rajah 6c; Filem Tambahan S11 dan S13). Dalam anggota HL menaik, sista mempunyai bentuk fusiform dengan diameter kecil. Dalam DCT, sista mempunyai bentuk yang agak sfera dan lebih besar dan diselingi di antara tubul yang tidak berdilatasi. Menariknya, peralihan antara DCT dan CNT secara sistematik dicirikan oleh struktur nondilat biasa. Sebaliknya, dalam CNT, kami secara sistematik memerhatikan struktur sista diluaskan bersebelahan secara langsung bersentuhan dengan CD. Menariknya, dalam CD, struktur ini secara beransur-ansur mengecil kepada saiz tubul biasa. Lebih jauh, tiada sista lanjut dapat dikesan di bahagian bersebelahan CD. Satu lagi ciri yang konsisten ialah organisasi spatial sista yang unik dalam anggota menaik HL. Malah, walaupun sista lebih dalam dan lebih dekat dengan gelung dalam SN, ia lebih cetek dan lebih dekat dengan DCT dalam JN (Rajah 6c). Sekali lagi, sista menduduki kedudukan pertengahan dalam MNs (Rajah 6c).

Rajah 5|Tubul nefron cenderung untuk berkembang sebagai struktur ffllat. (a) Laluan tipikal tubul proksimal nefron. Laluan ini menggambarkan kecenderungannya untuk berbaring di dalam pesawat. Keselarasan evolusi laluan boleh dilihat dengan lebih baik apabila diputar dengan betul dan diselaraskan dengan sudut pandangan pemerhati (lihat perwakilan kanan segmen tiub yang sama, yang, di sebelah kiri, diwakili pada sudut yang berbeza. sudut). (b) Perwakilan skematik laluan tiub yang terdiri daripada 4 segmen (antara 5 titik mentakrifkan laluan tiub yang diberikan ditunjukkan sebagai contoh). Tahap laluan cenderung untuk pergi "keluar dari satahnya" boleh diwakili oleh sudut yang ditunjukkan di sini sebagai "beta." (Bersambung)

Rajah 5|(Sambungan) Sudut ini diukur di antara segmen p3-p4 berkenaan dengan satah (ditakrifkan oleh titik terdahulu p3, p2 dan p1) dan diwakili oleh segi empat tepat kelabu gelap dalam skema. Pengiraan sudut beta kemudiannya dikira secara rekursif sepanjang set titik dalam laluan tiub. Untuk menilai sejauh mana bias sudut beta ini, kami mensimulasikan berjalan rawak (simulasi Monte Carlo [MCs]) dengan menggunakan set sudut alfa berturut-turut yang sama bagi setiap laluan tiub (diukur antara semua segmen berturut-turut). Pejalan kaki rawak ini menghasilkan laluan dengan set sudut alfa dan sudut beta rawak yang sama. (c) Plot biola taburan global sudut beta dan hasil MC dalam tubul proksimal (PT), anggota nipis (TL) gelung Henle, anggota badan menaik tebal (TAL) gelung Henle, tubul berbelit distal ( DCT), dan tubul penghubung (CNT). MC, P <>

PERBINCANGAN

Kaedah histologi tradisional adalah terhad dalam keupayaan mereka untuk mengesan perubahan patologi yang mempengaruhi bentuk global nefron. Di sini, kami membentangkan pendekatan yang berkuasa berdasarkan pembersihan tisu yang berpotensi untuk menangani soalan penting mengenai seni bina buah pinggang dengan perincian spatial yang tidak pernah berlaku sebelum ini di bawah keadaan normal dan patologi. Keputusan kami mengesahkan kewujudan 3 jenis nefron, yang berbeza dalam lokasi, bentuk dan saiznya, selaras dengan kekhususan fungsinya. Lebih-lebih lagi, kami menunjukkan bahawa nefron cenderung terletak pada satah dan menyesuaikan diri dengan organisasi spatial kapal. Menariknya, apabila kami menggunakan teknik ini pada modelpenyakit buah pinggang sista, kami memerhatikan bahawa sista berkembang dalam semua

nefron, tetapi hanya dalam segmen tertentu. Menariknya, kami menunjukkan bahawa bentuk sista berbeza mengikut segmen nefron, dan sepanjang nefron yang sama, sista berinterkalasi dengan tubul nondilasi biasa. Secara keseluruhannya, keputusan ini memberikan pencirian 3D pertama bagi susunan spatial nefron dan vesel dan yang penting menyediakan asas untuk memahami proses patologi, seperti sisogenesis.

Pembersihan optik buah pinggang adalah mencabar kerana tahap autofluoresensi dan ketumpatan sel yang tinggi. Dengan membandingkan protokol pembersihan yang berbeza, kami mengenal pasti dalam BABB teknik yang berkuasa untuk melaksanakan visualisasi dan pembinaan semula struktur yang terletak di bahagian paling dalambuah pinggang, iaitu medula. Selain itu, BABB adalah pantas dan berskala dan, setelah dibersihkan, sampel boleh disimpan selama berbulan-bulan sebelum pemerolehan imej. Satu lagi kelebihan utama teknik ini ialah kosnya yang rendah. Ejen penjelasan boleh mengakibatkan pengecutan atau pembesaran struktur.9–17 Walau bagaimanapun, kerana pengubahsuaian saiz buah pinggang ini adalah isotropik, ukuran relatif tidak dijangka akan terjejas atau berat sebelah tafsirannya. Salah satu batasan yang paling penting ialah anotasi struktur yang sangat memakan masa. Namun begitu, terdapat semakin banyak teknik berdasarkan pembelajaran mendalam yang harus cepat mengatasi batasan ini.

Selaras dengan keputusan yang diperolehi oleh teknik klasik, kajian kami menunjukkan bahawa nefron berbeza dalam bentuk dan panjang mengikut kedudukannya. Khususnya, kami mendapati bahawa JN mempunyai lebih banyak PT berbelit dan glomeruli yang lebih besar dan 2 kali lebih lama daripada SN. Peningkatan panjang adalah hasil daripada proses yang harmoni kerana pemanjangan mempengaruhi secara berkadar semua segmen nefron. Kami juga memerhatikan bahawa JN mempunyai HL yang lebih besar. Secara keseluruhannya, data ini jelas menunjukkan bahawa mikroanatomi SN dan JN adalah berbeza dengan ketara dan bahawa MN memaparkan ciri perantaraan. Menariknya, kajian fisiologi telah menunjukkan bahawa nefron juga berbeza dari segi fungsi.2 Kejadian morfogenetik yang mendasari perbezaan ini belum diketahui. Oleh itu, adalah menggoda untuk membuat spekulasi bahawa struktur tertentu JN boleh menyumbang kepada kekhususan fungsi mereka.

Menariknya, dengan menyediakan buat kali pertama pembinaan semula 3D nefron dan kapal sekelilingnya, kami menemui kekangan ruang antara kapal arkuate dan subkumpulan nefron. Oleh itu, boleh difikirkan bahawa kapal boleh menentukan jalannyanefronmemanjangkan semasa pembangunan.34,35 Pemeriksaan bentuk 3D nefron digabungkan dengan simulasi pengiraan juga mendedahkan bahawa nefron tidak pernah bercampur dan setiap nefron cenderung terletak dalam satah. Kepentingan fungsional pemerhatian ini masih perlu dijelaskan.

Perkembangan sista semasapenyakit buah pinggang polikistikmasih merupakan proses yang menarik. NPHP, keadaan patologi yang dicirikan oleh perkembangan sista, adalah penyakit genetik yang paling biasa yang menyebabkan penyakit buah pinggang peringkat akhir pada kanak-kanak dan remaja. Dua puluh gen NPHP telah dikenal pasti setakat ini.36 Antaranya, NEK8 mengodkan ahli keluarga kinase berkaitan A yang tidak pernah dalam mitosis, yang memainkan peranan dalam fungsi silia dan perkembangan kitaran sel.37 Nek8 pada asalnya dicirikan sebagai gen yang bermutasi dalam jck tikus.32 Terutamanya, mutasi dalam domain protein yang sama telah ditunjukkan membawa kepada NPHP9 pada manusia.38 2Kajian D mencadangkan bahawa perkembangan sista secara dramatik berbeza antara pelbagai bentuk penyakit buah pinggang polikistik.27,29 Khususnya , dalam NPHP, sista nampaknya diperoleh secara eksklusif daripada CD dan DCT.31 Walaupun bermaklumat, kajian imunohistokimia ini tidak boleh membantah kemungkinan kehilangan penanda tiub tertentu39 secara buatan menyumbang kepada pemerhatian ini. Oleh itu, kajian 3D kami memberikan bukti pertama yang jelas bahawa perkembangan sista ialah proses yang mungkin melibatkan hanya segmen nefron tertentu. Menariknya, walaupun NIMA (Tidak Pernah Dalam gen mitosis A)-Kinase 8 (NEK8) yang Berkaitan dinyatakan dalam sitoplasma semua segmen nefron, ekspresinya dalam silia adalah terhad kepada DCT dan CD. Oleh kerana hanya segmen ini yang terdedah kepada pembentukan sista,31 kita boleh mengandaikan bahawa gangguan fungsi silia NEK8 adalah peristiwa penting untuk pembentukan sista. Menariknya, kami juga telah memerhatikan bahawa sista fusiform berada dalam kesinambungan dengan tubul nondilat biasa. Fakta bahawa mutasi germanium resesif membawa kepada fenotip patologi hanya dalam subset sel menunjukkan bahawa peristiwa kedua mungkin mencetuskan perkembangan sista dalam sel-sel ini, seperti yang dicadangkan untuk polikistik dominan autosomal.penyakit buah pinggang.40,41

Kami juga mendapati bahawa pembesaran sista lebih dominan dalam JN berbanding SN, sekurang-kurangnya mengambil kira sista yang terletak di antara PT dan CNT. Secara konsisten, telah dilaporkan bahawa dalam konteks glomerulosklerosis, lesi glomerular didapati lebih kerap dalam JNs berbanding SNs.1,21,42 Sama ada terlalu banyak kerja disebabkan oleh peningkatan tunggal.nefronKadar penapisan glomerular dan aktiviti pengangkutan/enzimatik menyumbang kepada peningkatan kerentanan JNs untuk merosot adalah hipotesis menarik yang patut disiasat lanjut.

Secara ringkasnya, kami menerangkan teknik baharu untuk imej buah pinggang dalam 3D dengan kekhususan dan resolusi molekul yang mencukupi untuk merekodkan secara terus taburan spatial dan kuantitatif struktur dalaman yang dilabel secara khusus (nefron, vesel dan sista). Memandangkan kemudahan, kelajuan dan keupayaan untuk pengiraan langsung, kami menjangkakan bahawa teknik ini akan menjadi alat yang berkuasa untuk memahami patofisiologi buah pinggang.

Rajah 6|Pembinaan semula nefron tiga dimensi (3D) mendedahkan bahawa sista hanya berkembang dalam segmen nefron tertentu. (a) Imej 3D perwakilan dengan pemaparan isipadu sista keseluruhan nefron (panel kiri) dari glomeruli ke saluran pengumpulan dalam korteks superfisial (biru), korteks tengah (hijau), dan kawasan juxtamedullary (merah) dalam tikus jck. Pembahagian nefron (panel kanan) untuk 3 jenis nefron yang berbeza. Bar ¼ 150 mm. (b) Kebarangkalian untuk membina sista dalam segmen nefron yang berbeza dalam tikus jck. (Bersambung)

Rajah 6|(Sambungan) Paksi mendatar ialah panjang normal nefron bersamaan dengan 50 tong (tubul proksimal [PT], biru; gelung Henle [HL], putih; tubul berbelit distal [DCT], merah jambu; tubul penyambung [CNT], kuning) . (c) Imej pembinaan semula sista 3D perwakilan dengan pemaparan isipadu sista anggota menaik HL (panel kiri), DCT (panel tengah), dan CNT dan saluran pengumpul kortikal (CCD) (panel kanan) dalam cetek (panel atas), tengah (panel tengah), dan juxtamedullary (panel bawah) nefron dalam jck tikus. Bar ¼ 50 mm.

KAEDAH

Haiwan

Semua prosedur haiwan telah diluluskan oleh "Services Vétérinaires de la Préfecture de Police de Paris" dan oleh jawatankuasa etika Université Paris Descartes. Tikus FVB/N berusia dua bulan (n¼ 20) digunakan untuk menyediakan keadaan eksperimen untuk pembersihan buah pinggang. Kajian itu kemudiannya dilakukan dalam 2-tikus jantan jck berumur seminggu (n ¼ 4) dan mengawal rakan sepah (n ¼ 3).

Penyediaan tisu buah pinggang

Sebelum membunuh, tikus telah diberi minyak, melalui kateterisasi intrakardiak, dengan 25 ml garam heparin (1000 IU/l) diikuti dengan 75 ml 4 peratus paraformaldehid dalam garam penampan fosfat (PBS). Eksperimen telah dijalankan di bawah xylazine (Rompun 2 peratus , Bayer, Leverkusen, Jerman, 6 mg/g berat badan) dan ketamin (Clorketam 1000, Vetoquinol SA, Lure, Perancis, 120 mg/g berat badan) anestesia.

Untuk kajian pembersihan, buah pinggang difiksasi dalam 4 peratus paraformaldehid selama 4 jam dan dibenamkan dalam 4 peratus agarose dan 1.5-bahagian tebal mm mengelilingi hilum buah pinggang dipotong dan disimpan dalam PBS pada suhu 4 C.Bahagian buah pinggangpertama kali diwarnakan dan kemudian dibersihkan.

Untuk kajian imunohistokimia pada bahagian nipis,buah pinggangtelah difiksasi dalam 4 peratus paraformaldehid semalaman dan bahagian tertanam paraffifin dan 4-mm dipotong.

mengotorkan

Asid berkala-Pewarnaan Schiff. Bahagian buah pinggang 1.5-mm telah diinkubasi dalam asid berkala cair tulen atau 1:100 PBS–Schiff selama 5 minit pada suhu bilik sebelum dibersihkan.

Imunohistokimia pada bahagian tertanam paraffifin nipis. Bahagian empat mikrometer buah pinggang tertanam paraffifin telah dipanaskan untuk mendapatkan semula antigen dan diinkubasi semalaman pada suhu 4 C dengan lektin bergandingan flfluorochrome untuk mengesan tubulus (rhodamine peanut agglutinin [RL-1072-5] dan rhodamine wheat germ agglutinin [RL{{ 6}}], Vector Laboratories, Burlingame, CA, dicairkan pada 1:200) dan antibodi primer khusus segmen untuk menggambarkan segmen tiub yang berbeza (biotinylated Lotus tetragonolobus lectin [B-1325], Vector Laboratories, dicairkan pada 1: 100; tetikus anti-Calbindin D28K [D-4], Santa Cruz, Heidelberg, Jerman, dicairkan pada 1:200; kambing anti AQP2 [C-17], Santa Cruz, dicairkan pada 1:200) . Keesokan harinya, bahagian tersebut diinkubasi dengan antibodi sekunder selama 1 jam pada suhu bilik (Alexa Fluor 488 conjugate [S32354], Invitrogen; antigoat Alexa Fluor 488 [A-11055], Invitrogen; anti-tikus Alexa Fluor 488 [A-21202], Invitrogen, Carlsbad, CA; semuanya dicairkan pada 1:500) sebelum diwarnakan dengan 40,6-diamidino-2-phenylindole. Semua imej telah diperoleh dengan mikroskop Nikon Eclipse E800 (Champigny sur Marne, Perancis) dan disediakan menggunakan perisian FiJi (versi 1.50).

Pewarnaan lektin pada bahagian tebal. Bahagian buah pinggang setebal 1.5-mm telah diinkubasi pada suhu 4 C selama 1 bulan dalam Texas Red atau flfluorescein isothiocyanate lektin berganding: aglutinin kacang (RL-1072-5) dan aglutinin kuman gandum (RL{{6} }), dicairkan pada 1:100 dalam 0.1 peratus PBS azida dan 0.1 peratus Triton-X. Bahagian kemudiannya dibasuh setiap hari selama 2 minggu dengan PBS sebelum dibersihkan.

Pembersihan optik

Untuk pembersihan Skala, bahagian buah pinggang 1.5-mm telah diinkubasi dalam ScaleA2 (4 M urea, 0.1 peratus Triton X-100, 10 peratus gliserol) atau ScaleB4 (8 M urea, 0.1 peratus Triton X-100) selama 2 minggu, sehingga 1 tahun, pada 4 C.

Untuk pembersihan BABB, bahagian buah pinggang 1.5-mm telah dehidrasi dalam bilasan etanol secara berurutan pada suhu bilik. Sampel kemudian diinkubasi dalam BABB (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) dalam nisbah 1: 2 selama sekurang-kurangnya 2 hari pada 4 C.

Pemerolehan imej mikroskop dua foton

Tisu telah digambarkan dengan gel akueus pada mikroskop multiphoton terbalik (LaVision BioTec) yang dilengkapi dengan Mai Tai HP Titanium-Sapphire Laser (Spectra-Physics, Santa Clara, CA) (Supplementary Figure S1A). Panjang gelombang pengujaan ialah 815 nm pada 8 peratus kuasa. Kami menggunakan 20 objektif rendaman air (XLUMPLFL20XW, Olympus [Tokyo, Jepun]; apertur berangka, 0.95; jarak kerja, 2.0 mm). Untuk pemerolehan pendarfluor, kami menggunakan pengesan bukan descan pada 80 peratus dengan fifilter jalur jalur 593/40 nm.

Langkah pertama terdiri daripada pemerolehan imej mozek 2D pada timbunan z tengah dengan menggunakan parameter pemerolehan suboptimum (400 mm 400 mm dan 1011 1011 piksel, dengan pertindihan 10 peratus dan garis purata pada 2) untuk membimbing pemilihan medan pusat yang paling relevan (Rajah Tambahan S9A). Setelah grid xy dan medan z yang diminati ditakrifkan, parameter telah dilaraskan untuk memperoleh imej berkualiti tinggi. Pendekatan sedemikian mengurangkan kawasan yang diminati kepada 5 12 fifield setiap z tindanan. Kemudian, kami memperoleh 850 z tindanan/hirisan optik (1-mm saiz langkah) yang mengelilingi hilum buah pinggang di bahagian tengahbahagian buah pinggang.

Jahitan, pemprosesan dan pengesanan imej

Setiap timbunan dijubin mengikut kaedah yang dibangunkan oleh Preibisch et al., 43 yang membenarkan jahitan koleksi imej yang besar dengan menggunakan pemalam "Grid/Collection stitching" perisian Fiji (http:// fifiji.sc/Fiji) . Oleh kerana kami melihat peralihan penting antara 2 imej bersebelahan selepas jahitan, kami menulis program pemadanan tersuai dalam Python. Program ini mengimbangi anjakan imej, membolehkan kami menjajarkan imej dengan betul (Rajah Tambahan S9B). Imej yang diperbetulkan dijahit telah dianalisis menggunakan Imaris versi 8.4.2 (Bitplane, Zurich, Switzerland). Tubul dan vesel telah dikesan menggunakan mod manual pakej pengesan fifilamen Imaris dan disertai oleh Imaris Xtension yang kami bangunkan dengan MATLAB (https://www.dropbox.com/s/sm9u5em3orjrpmc/Standalone_Sertai{{12 }} Filamen_Tool.zip?dl¼0) (Rajah Tambahan S9C). Glomeruli dan sista telah dibina semula 3D menggunakan mod manual pakej permukaan Imaris. Organisasi spatial glomeruli 3D telah dipaparkan menggunakan mod manual pakej bintik-bintik Imaris.

Morfometri

Panjang segmen tiub, panjang nefron, dan kelurusan ditentukan menggunakan pakej pengesan fifilamen Imaris. Menurut perisian Imaris, kelurusan dikira sebagai nisbah antara jarak antara 2 titik dan panjang laluan segmen nefron. Tiga puluh satu PT dan 12 keseluruhan nefron telah dibina semula dan diukur dalam 3 tikus jenis liar, manakala 37 PT dan 17 keseluruhan nefron telah dibina semula dan diukur dalam 4 tikus jck. Cyst dan

isipadu glomerular ditentukan menggunakan "pakej permukaan" Imaris. Tiga puluh satu dan 34 glomeruli diukur dalam tikus jenis liar dan jck, masing-masing. Tujuh puluh empat sista diukur secara keseluruhan.

Sudut "keluar dari satah" lilitan tiub (ditunjukkan sebagai "beta") diukur antara satah (ditakrifkan oleh 3 titik berturut-turut) dan arah dengan titik keempat berturut-turut seterusnya dalam angkasa (Rajah 5b). Untuk menilai kepentingan statistik bias yang diperhatikan, kami mensimulasikan taburan sudut beta dengan putaran rawak sudut beta (simulasi Monte Carlo) dalam struktur yang terdiri daripada segmen yang sama dengan set sudut alfa yang sama.

Untuk pengiraan kebarangkalian untuk membina lesi sistik bersamanefronsegmen, kami mewakili setiap nefron dengan satu set titik di angkasa. Setiap titik telah diberi anotasi berkenaan dengan kehadiran sista berbanding struktur normal dan jenis segmen. Kebarangkalian pada setiap panjang piawai (ditetapkan pada 50 tong) dikira sebagai nisbah antara bilangan mata dengan anotasi sistik dan jumlah bilangan mata dalam tong.

Untuk pengiraan jarak antara glomerular purata, kami mempertimbangkan bagi setiap glomerulus jarak jarak glomerulus purata yang dikira pada 5 glomeruli terdekat.

Analisis data dan statistik

Data dinyatakan sebagai min SEM. Perbezaan antara kumpulan eksperimen dinilai menggunakan analisis varians diikuti, apabila signifikan (P < {{0}}.0}5),="" oleh="" ujian="" tukey-kramer.="" apabila="" hanya="" 2="" kumpulan="" dibandingkan,="" ujian="" mann-whitney="" digunakan.="" analisis="" statistik="" dilakukan="" menggunakan="" perisian="" graph="" prism="" (san="" diego,="" ca,="" versi="">

PENDEDAHAN

Semua pengarang mengisytiharkan tiada kepentingan bersaing.

PENGHARGAAN

Kami mengucapkan terima kasih kepada Laboratoire Experimentation Animale et Transgenese (LEAT), Histologi dan Platform Pengimejan Struktur Federative de Recherche Necker atas bantuan teknikal. Kami berterima kasih kepada Pierre Isnard, Marie-Claire Gubler, dan Nicolas Kuperwasser kerana membaca kritis manuskrip itu. Kerja ini disokong oleh Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Université Paris Descartes, Assistance Publique – Hôpitaux de Paris, Agence Nationale de la Recherche, Whoami Laboratoire d'Excellence Who am I, Roche Pharma Research and Early Development (Basel). , Switzerland), dan Institut Roche de Recherche et de Médecine Translationnelle (Paris, Perancis).

SUMBANGAN PENULIS

TB, NG, dan MZ mereka bentuk dan melakukan eksperimen dan menganalisis data. FB, LT, MGT, dan SG juga melakukan beberapa eksperimen dan menganalisis data. MB dan CN melakukan eksperimen tetikus. TB dan MZ turut menyumbang dalam penulisan manuskrip. GF menyemak semula manuskrip. FT dan MP menyediakan rangka kerja konsep dan mereka bentuk kajian, menyelia projek, dan menulis kertas kerja.

cistanche boleh tonify buah pinggang

BAHAN TAMBAHAN

Fail Tambahan (PDF)

Rajah S1. Persediaan percubaan, prosedur pemerolehan dan pemprosesan imej.

Rajah S2. Had isyarat autofluoresensi dalam resolusi xy dan z.

Rajah S3. Imej dua dimensi peralihan antara PT dan TL pada 4-mm bahagian buah pinggang terbenam paraffifin.

Rajah S4. Imej dua dimensi peralihan antara TAL dan DCT pada 4-mm bahagian buah pinggang terbenam paraffifin.

Rajah S5. Imej dua dimensi peralihan antara DCT dan CNT pada 4-mm bahagian buah pinggang terbenam paraffifin.

Rajah S6. Pembinaan semula tiga dimensi mendedahkan 3 bentuk tubul proksimal yang berbeza.

Rajah S7. Pembinaan semula tiga dimensi mendedahkan bahawa panjang dan pembahagian nefron tidak terjejas oleh sista.

Rajah S8. Ketumpatan glomeruli dalam kawalan dan buah pinggang sistik.

Rajah S9. Prosedur pemerolehan dan pemprosesan imej selepas rawatan.

Jadual S1. Perbandingan kaedah pembersihan. Fail Tambahan (Filem)

Filem S1. Pewarnaan lektin meningkatkan dengan ketara resolusi dan nisbah isyarat kepada latar belakang.

Filem S2. Mengesan laluan tubul.

Filem S3. Pembinaan semula tiga dimensi buah pinggang yang dibersihkan menunjukkan persimpangan antara tubul proksimal dan anggota nipis gelung Henle.

Filem S4. Pembinaan semula tiga dimensi buah pinggang yang dibersihkan menunjukkan persimpangan antara anggota menaik tebal gelung Henle dan tubul berbelit distal.

Filem S5. Pembinaan semula tiga dimensi buah pinggang yang dibersihkan menunjukkan persimpangan antara tubul berbelit distal dan tubul penyambung.

Filem S6. Bentuk dan saiz tubul proksimal berbeza mengikut kedalamannya.

Filem S7. Pembinaan semula nefron tiga dimensi dalam tikus kawalan.

Filem S8. Mengesan laluan kapal dari kapal arkuate ke kapal pancaran kortikal.

Filem S9. Pembuluh arkuata memodelkan bentuk tubul proksimal juxtamedulari.

Filem S10. Nefron cenderung berbaring di dalam pesawat.

Filem S11. Pembinaan semula nefron tiga dimensi menunjukkan corak khusus untuk perkembangan sista.

Filem S12. Segmentasi nefron tiga dimensi mendedahkan bahawa sista berkembang dalam segmen nefron tertentu.

Filem S13. Susunan ruang dan perhubungan antara nefron dan salur dalam buah pinggang polikistik

RUJUKAN

1. AR kaya. Kerentanan glomeruli juxtamedullary yang belum dijelaskan sehingga kini dalam nefrosis lipoid. Bull Johns Hopkins Hosp. 1957;100:173–186.

2. Bankir L, Bouby N, Trinh-Trang-Tan MM. Heterogeniti anatomi nefron. Bekalan Int Buah Pinggang 1987;20:S25–S39.

3. Christensen EI, Grann B, Kristoffersen IB, et al. Pembinaan semula tiga dimensi nefron tikus. Am J Physiol Physiol. 2014;306:F664–F671.

4. Zhai XY, Birn H, Jensen KB, et al. Pembinaan semula tiga dimensi digital dan ultrastruktur tubul proksimal tetikus. J Am Soc Nephrol. 2003;14:611–619.

5. Zhai XY, Thomsen JS, Birn H, et al. Pembinaan semula tiga dimensi nefron tetikus. J Am Soc Nephrol. 2006;17:77–88.

6. Puelles VG, Moeller MJ, Bertram JF. Kita boleh melihat dengan jelas sekarang: pembersihan optik dan morfometrik buah pinggang. Curr Opin Nephrol Hypertens. 2017;26:179–186.

7. Seo J, Choe M, Kim SY. Teknik pembersihan dan pelabelan untuk tisu biologi berskala besar. Sel Mol. 2016;39:439–446.

8. Spalteholz W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung. Leipzig, Jerman: S. Hierzel; 1914.

9. Hama H, Kurokawa H, Kawano H, et al. Skala: pendekatan kimia untuk pengimejan pendarfluor FL dan pembinaan semula otak tetikus telus. Nat Neurosci. 2011;14:1481–1488.

10. Ertürk A, Becker K, Jährling N, et al. Pengimejan tiga dimensi organ dibersihkan pelarut menggunakan 3DISCO. Nat Protoc. 2012;7:1983–1995.

11. Kuwajima T, Sitko AA, Bhansali P, et al. ClearT: kaedah pembersihan bebas detergen dan pelarut untuk tisu neuron dan bukan neuron. Pembangunan. 2013;140:1364–1368.

12. Ke MT, Imai T. Pembersihan optik sampel otak fifix menggunakan SeeDB. Curr Protoc Neurosci. 2014;66:2.22.1–2.22.19.

13. Chung K, Deisseroth K. CLARITY untuk memetakan sistem saraf. Kaedah Nat. 2013;10:508–513.

14. Tomer R, Ye L, Hsueh B, Deisseroth K. CLARITY Lanjutan untuk pengimejan cepat dan resolusi tinggi bagi tisu utuh. Nat Protoc. 2014;9:1682–1697.

15. Yang B, Treweek JB, Kulkarni RP, et al. Fenotaip sel tunggal dalam tisu utuh telus melalui pembersihan seluruh badan. sel. 2014;158: 945–958.

16. Susaki EA, Tainaka K, Perrin D, et al. Pengimejan seluruh otak dengan resolusi sel tunggal menggunakan koktel kimia dan analisis pengiraan. sel. 2014;157:726–739.

17. Alanentalo T, Asayesh A, Morrison H, et al. Pengimejan molekul tomografi dan kuantifikasi 3D dalam organ tetikus dewasa. Kaedah Nat. 2007;4:31–33.

18. Parra SG, Chia TH, Zinter JP, et al. Mikroskopi multifoton organ tetikus yang dibersihkan. J Biomed Opt. 2010;15:036017.

19. Renier N, Wu Z, Simon DJ, et al. iDISCO: kaedah mudah dan pantas untuk melabel sampel tisu besar untuk pengimejan volum. sel. 2014;159: 896–910.

20. Lee H, Park JH, Seo I, et al. Penggunaan teknologi pembersihan tisu elektroforesis yang lebih baik, CLARITY, untuk organ pepejal yang utuh termasuk otak, pankreas, hati, buah pinggang, paru-paru dan usus. BMC Dev Biol. 2014;14:1–7.

21. Iversen BM, Amann K, Kvam FI, et al. Peningkatan tekanan dan saiz kapilari glomerular menjadi pengantara glomerulosklerosis dalam korteks juxtamedulla SHR. Am J Physiol Physiol. 1998;274:F365–F373.

22. Angelotti ML, Antonelli G, Conte C, Romagnani P. Pengimejan buah pinggang: daripada cahaya kepada mikroskop resolusi super. Pemindahan Dail Nephrol. 2021;36:19–28.

23. Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE, et al. Pengesahan kaedah tiga dimensi untuk mengira dan mensaiz podosit dalam keseluruhan glomeruli. J Am Soc Nephrol. 2016;27:3093–3104.

24. Pannabecker TL, Dantzler WH, Layton HE, Layton AT. Peranan seni bina tiga dimensi dalam mekanisme penumpuan air kencing medula dalaman buah pinggang tikus. Am J Physiol Physiol. 2008;295:F1271–F1285.

25. Saritas T, Puelles VG, Su XT, et al. Pembersihan optik dalam buah pinggang mendedahkan pembentukan semula tubul pengantara kalium. Sel Rep. 2018;25:2668–2675.e3.

26. Schuh CD, Polesel M, Platonova E, et al. Gabungan pengimejan struktur dan fungsi buah pinggang mendedahkan perbezaan paksi utama dalam endositosis tubul proksimal. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2696–2712.

27. Braun DA, Hildebrandt F. Ciliopathies. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017;9:a028191.

28. Bergmann C, Guay-Woodford LM, Harris PC, et al. Penyakit buah pinggang polikistik. Nat Rev Dis Prim. 2018;4:50.

29. Wilson PD. Penyakit buah pinggang polikistik. N Engl J Med. 2004;350:151–164.

30. Laitinen L, Virtanen I, Saxén L. Perubahan dalam corak glikosilasi semasa perkembangan embrio buah pinggang tikus seperti yang didedahkan dengan konjugat lektin. J Histochem Cytochem. 1987;35:55–65.

31. Smith LA, Bukanov NO, Husson H, et al. Perkembangan penyakit buah pinggang polikistik dalam tikus buah pinggang kistik juvana: pandangan tentang patogenesis, keabnormalan silia dan ciri umum dengan penyakit manusia. J Am Soc Nephrol. 2006;17:2821–2831.

32. Liu S, Lu W, Obara T, et al. Kecacatan dalam kinase keluarga Nek novel menyebabkan penyakit buah pinggang sista pada tikus dan ikan zebra. Pembangunan. 2002;129:5839–5846.

33. Franke M, Baeßler B, Vechtel J, et al. Pemetaan T2 resonans magnetik dan pengimejan berwajaran resapan untuk pengesanan awal sisogenesis dan tindak balas kepada terapi dalam model tetikus penyakit buah pinggang polikistik. Buah Pinggang Int. 2017;92:1544–1554. 34. Barry DM, McMillan EA, Kunar B, et al. Penentu molekul pengkhususan vaskular nefron dalam buah pinggang. Nat Commun. 2019;10: 5705.

35. Perretta-Tejedor N, Jafree DJ, Long DA. Komunikasi endothelial-epitelial dalam penyakit buah pinggang polikistik: peranan isyarat faktor pertumbuhan endothelial vaskular. Isyarat Sel. 2020;72:109624.

36. Srivastava S, Molinari E, Raman S, Sayer JA. Banyak gen-satu penyakit? Genetik nephronophthisis (NPHP) dan gangguan berkaitan NPHP. Pediatr hadapan. 2017;5:287.

37. Goreng AM, O'Regan L, Sabir SR, Bayliss R. Peraturan kitaran sel oleh keluarga kinase protein NEK. J Sel Sci. 2012;125:4423–4433.

38. Otto EA, Trapp ML, Schultheiss UT, et al. Mutasi NEK8 menjejaskan penyetempatan ciliary dan centrosomal dan boleh menyebabkan nephronophthisis. J Am Soc Nephrol. 2008;19:587–592.

39. Wilson PD. Kekutuban apico-basal dalam epithelia penyakit buah pinggang polikistik. Biochim Biophys Acta. 2011;1812:1239–1248.

40. Happé H, Leonhard WN, van der Wal A, et al. Kecederaan tubular toksik pada buah pinggang daripada tikus pemadaman Pkd1-mempercepatkan sisogenesis disertai dengan kekutuban sel planar yang tidak terkawal dan laluan isyarat Wnt kanonik. Hum Mol Genet. 2009;18: 2532–2542.

41. Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA, et al. Suis perkembangan kritikal mentakrifkan kinetik pembentukan sista buah pinggang selepas kehilangan Pkd1. Nat Med. 2007;13:1490–1495.

42. Ikoma M, Yoshioka T, Ichikawa I, Fogo A. Mekanisme kerentanan unik glomeruli kortikal dalam buah pinggang matang kepada sklerosis glomerular fokus yang teruk. Pediatr Res. 1990;28:270–276.

43. Preibisch S, Saalfeld S, Tomancak P. Jahitan optimum global pemerolehan imej mikroskopik 3D berjubin. Bioinformatik. 2009;25: 1463–1465.