Adakah Persatuan Polimorfisme Gen Rs35667974 IFIH1 Dengan Penyakit Autoimun Satu Kes Epigenetik RNA?

visualisasi—AA, AP dan EEE, penyeliaan—EEE, dan pemerolehan pembiayaan—EEE. Semua pengarang telah membaca dan bersetuju dengan versi manuskrip yang diterbitkan. Abstrak

Interferon teraruh dengan gen helicase C domain-containing protein 1 (IFIH1) mengekodkan helikase RNA sitoplasma atau dikenali sebagai melanoma differentiation-associated 5 (MDA5), RIG-1-like RNA helicase yang mengenali RNA virus dan terlibat dalam semula jadi. imuniti melalui pengiktirafan RNA virus. Setelah mengikat RNA bertali dua (ds), MDA5 membentuk himpunan berfilamen sepanjang dsRNA dan menggunakan tandatangan molekul untuk mendiskriminasi diri sendiri, berbanding bukan diri berdasarkan panjang dsRNA dan metilasi. Varian missensenya rs35667974 melindungi daripada diabetes jenis 1, psoriasis dan arthritis psoriatik, tetapi juga didapati dikaitkan dengan peningkatan risiko untuk ankylosing spondylitis, penyakit Crohn dan kolitis ulseratif. Untuk mendapatkan gambaran tentang peranan kompleks varian ini, kami melakukan analisis struktur MDA5 dalam kompleks dengan dsRNA menggunakan simulasi dinamik molekul.

Data kami mencadangkan bahawa walaupun mutasi Ile923Val varian rs35667974 tidak menjejaskan pengikatan kepada dsRNA asli dengan ketara, ia memaparkan kesan ketidakstabilan dengan kehadiran metilasi uridin 2'-O. Oleh itu, kehadiran 2'-O-metilasi pada dsRNA memperkenalkan tandatangan penderiaan yang membawa kepada pengurangan terpilih keseluruhan aktiviti pemangkin MDA. Kajian ini mewakili penilaian peranan varian rs35667974 kongsi lokus autoimun IFIH1, dilaporkan membawa kepada aktiviti pemangkin yang dikurangkan secara terpilih bagi fenotip MDA5 yang diubah suai dan, sebagai akibatnya, mengurangkan maklum balas negatif terhadap isyarat sitokin dan kemokin serta perlindungan terpilih terhadap autoimun. .

Domain helikase C ialah protein enzim penting yang boleh melepaskan struktur heliks berganda DNA. Ia boleh membantu DNA melengkapkan replikasi, penyuntingan dan penghantaran yang betul dalam proses replikasi, pembaikan dan transkripsi sel, dan merupakan salah satu kunci kepada fungsi normal sel. Pada masa yang sama, imuniti adalah mekanisme pertahanan yang sangat penting dalam tubuh manusia, yang boleh melindungi kita dengan berkesan daripada patogen seperti bakteria dan virus.

Kajian telah menunjukkan bahawa domain helikase C memainkan peranan penting dalam imuniti. Pertama sekali, domain helikase C boleh memastikan kestabilan dan kecekapan pengekodan gen dengan membantu replikasi normal, pembaikan dan transkripsi DNA selular, dengan itu meningkatkan imuniti badan manusia. Kedua, domain helikase C boleh menggalakkan pengiktirafan molekul heterogeniti protein oleh sel, dan mengawal transduksi isyarat sistem imun, dengan itu menyokong fungsi pertahanan badan. Kedua-dua kaedah di atas telah memainkan peranan positif dalam menggalakkan pengekalan dan peningkatan imuniti.

Di samping itu, kajian mendalam tentang hubungan antara domain helikase C dan imuniti juga memberikan inspirasi penting untuk kita menemui ubat baru untuk rawatan kanser dan penyakit berkaitan imun. Pembangunan ubat dan terapi gen yang menyasarkan domain helikase C boleh meningkatkan daya tahan tubuh terhadap kanser dan penyakit berkaitan imun yang lain, dan membantu pesakit menghadapi rawatan dan pemulihan penyakit berkaitan dengan lebih baik.

Ringkasnya, hubungan antara domain helikase C dan imuniti adalah sangat rapat, dan ia memainkan peranan penting dalam memastikan kestabilan gen, menggalakkan imuniti selular, dan menyokong pertahanan badan. Diharapkan melalui kaedah penyelidikan dan rawatan yang berkaitan, kita dapat mengekalkan dan meningkatkan imuniti manusia dengan lebih baik dan mewujudkan kehidupan yang lebih sihat dan lebih baik untuk kita. Dari sudut pandangan ini, kita perlu meningkatkan imuniti peribadi. Cistanche mempunyai kesan yang ketara dalam meningkatkan imuniti kerana pes daging kaya dengan pelbagai bahan antioksidan, seperti vitamin C, vitamin C, karotenoid, dll. Bahan-bahan ini boleh menghilangkan radikal bebas dan mengurangkan tekanan oksidatif. Merangsang dan meningkatkan daya tahan sistem imun.

Klik manfaat cistanche tubulosa

Kata kunci

Polimorfisme nukleotida tunggal (SNP) · Model molekul · Interferon teraruh dengan domain helikase C 1 (IFIH1) · Berkaitan pembezaan melanoma 5 (MDA5) · Metilasi RNA.

pengenalan

Gen dan mekanisme yang terlibat dalam penyakit autoimun, yang menjejaskan kira-kira 5 peratus daripada populasi, masih sukar difahami tetapi data terkumpul menunjukkan bahawa penyakit autoimun yang berbeza boleh berkongsi latar belakang genetik yang sama, dengan itu menunjukkan kewujudan varian yang dikongsi oleh penyakit autoimun yang berbeza. (Zhernakova et al. 2009). Percubaan untuk membongkar maklumat genetik ini ke dalam mekanisme yang bermakna secara biologi yang membawa kepada penyakit merujuk kepada pengenalpastian gen penyebab. Pengenalpastian varian penyebab penyakit adalah tugas yang sukar tetapi perlu dalam usaha untuk mewujudkan kaedah yang berkesan untuk ramalan, pencegahan dan intervensi penyakit (Biros et al. 2005).

Jenis molekul RNA yang berbeza terlibat dalam pengawalseliaan beberapa proses biologi, termasuk RNA messenger (mRNA), pemindahan RNA (tRNA), RNA ribosom (rRNA), mikroRNA (miRNA), dan RNA bukan pengekodan panjang (lncRNA). Molekul RNA mengandungi banyak (lebih daripada 150) pengubahsuaian kimia (Machnicka et al. 2013; Boccaletto et al. 2018). Pengubahsuaian ini secara fungsional dikaitkan dengan semua peringkat metabolisme RNA, seperti struktur, kestabilan dan interaksi, dan memainkan peranan penting dalam beberapa proses biologi, seperti memodulasi replikasi virus dan tindak balas imun antivirus (Machnicka et al. 2013). Antaranya, metilasi ribosa adalah antara pengubahsuaian yang paling banyak ditemui dalam RNA. 2'-O -methyluridine ditemui dalam rRNA, snRNA, snoRNA, dan tRNA Archaea, Bakteria dan Eukariota (Aučynaitė et al. 2018). Ribosa-2′-Ometilasi meningkatkan hidrofobisiti nukleotida dan melindunginya daripada tindakan nuklease (Yildirim et al. 2014).
Bukti terkumpul menunjukkan bahawa 2'-O-metilasi RNA virus (2'OMe-RNA) memainkan peranan penting dalam pengelakan tindak balas imun semula jadi selular dalam sel perumah (Dimitrova et al. 2019). Züst dan rakan sekerja telah menunjukkan bahawa 2′ OMe RNA virus menyumbang kepada pengelakan tindak balas antivirus pengantara interferon (IFN), dengan itu menggalakkan replikasi virus (Züst et al. 2011). Juga, Vitali dan Scadden telah mencadangkan bahawa IU-dsDNA menindas laluan merangsang MDA5 IFN (Vitali dan Scadden 2010).

Interferon yang diinduksi dengan gen helikase C domain 1 (IFIH1) mengekodkan helikase RNA sitoplasma yang juga dikenali sebagai MDA5 (protein yang berkaitan dengan pembezaan Melanoma 5), ​​dan ia adalah reseptor seperti RIG-I (RLR) yang melaksanakan fungsi antivirus dalam imuniti semula jadi. dengan mengesan RNA virus. MDA5 mengenali 0.5–1 kb struktur batang dupleks RNA yang biasanya terbentuk semasa replikasi picornaviral dan mengantara tindak balas imun terhadap jangkitan virus (Nejentsev et al. 2009; Crow 2011). MDA5, apabila dikesan RNA untai dua virus panjang (dsRNA), yang dihasilkan semasa replikasi picornavirus, mengaktifkan laluan isyarat interferon jenis I. Kajian telah menunjukkan bahawa MDA5 membentuk filamen sepanjang dsRNA dan menggunakan dinamik filamen yang bergantung kepada ATP untuk membezakan antara diri dan bukan diri berdasarkan panjang dsRNA (Toro et al. 2015). MDA5 ditunjukkan terlibat dalam modulasi crosstalk antara sel dan sistem imun semula jadi/adaptif melalui pengeluaran tempatan sitokin dan kemokin.

Perubahan dalam ekspresi dan/atau aktiviti MDA5 boleh mencetuskan tindak balas sel kepada dsRNA, hasil sampingan replikasi virus (Colli et al. 2010). Ia juga telah ditunjukkan bahawa mutasi sisa berkaitan pembentukan flamen mengakibatkan kehilangan pembentukan filamen dan isyarat bergantung kepada MDA5-, kecuali sepasang mutasi, yang meningkatkan isyarat secara sederhana. Keputusan ini menunjukkan bahawa mekanisme bebas ATP, iaitu, pengikatan RNA yang lebih ketat dan/atau interaksi protein-protein yang lebih stabil, berkemungkinan bertanggungjawab untuk kestabilan diperhatikan pembentukan filamen MDA5 secara in vitro dan untuk aktiviti isyarat yang lebih tinggi dalam sel (Sohn dan Hur 2016).

Smyth et al. (2006) dan Nejentsev et al. (2009) menerangkan alel jarang gen IFIH1 yang memberikan perlindungan daripada diabetes jenis 1 (T1D). Polimorfisme nukleotida tunggal (SNP) rs35667974 IFIH1 ini, di mana isoleucine terpelihara (kodon [ATT]) pada kedudukan #923 berubah kepada valine (kodon [GTT]), adalah varian yang jarang berlaku kerana frekuensi alel kecil (MAF) ialah C {{ 9}}.010031 (2655 individu dalam jumlah sampel 264690) berdasarkan TOPMED (Taliun et al. 2021) dan C = 0.016267 (3343 individu dalam jumlah sampel 205514) berdasarkan ALFA (Phan et al. 2020; Sherry et al. 2001). Dalam Jadual 1 biogeografi manusia bagi kekerapan polimorfisme di kawasan benua yang berbeza berdasarkan data projek ALFA (Phan et al. 2020; Sherry et al. 2001), dibentangkan. Kajian seterusnya mengesahkan bahawa alel jarang ini mempunyai kesan yang sama pada T1D, psoriasis (PS) (Li et al. 2010), dan psoriatic arthritis (PsA) (Budu-Aggrey et al. 2017). Sebaliknya, SNP ini telah dikaitkan sebagai faktor risiko untuk kerentanan perkembangan ankylosing spondylitis (AS) (Ellinghaus et al. 2016), penyakit Crohn (CD) (Ellinghaus et al. 2016; Budu-Aggrey et al. 2017 ), dan kolitis ulseratif (UC) (Ellinghaus et al. 2016; Budu-Aggrey et al. 2017).

Chistiakov et al. (2010) telah menunjukkan bahawa mutasi kehilangan fungsi E627X dan I923V MDA5 dikaitkan dengan pengeluaran interferon akibat poli(I: C) yang lebih rendah dalam sel mononuklear darah periferal pesakit diabetes jenis 1 dan oleh itu adalah pelindung T1D. Ia juga menyatakan bahawa dalam molekul MDA5, penggantian asid amino I923V berada di sekitar residu H927, yang menyumbang kepada pengikatan dsRNA (Yoneyama dan Fujita 2008). Walau bagaimanapun, varian MDA I923V ditunjukkan mempunyai keupayaan normal untuk mengikat dsRNA tetapi aktiviti pemangkin berkurangan sebanyak 2.5-kali ganda (Shigemoto et al. 2009). Oleh itu, polimorfisme ini nampaknya tidak menjejaskan secara besar sifat mengikat asid nukleotida helikase penderia RNA sitoplasma ini tetapi mengubah fungsinya dengan mekanisme yang masih tidak diketahui.

Hubungan antara polimorfisme IFHI1 dan kejadian jangkitan enterovirus dalam T1D dan perkaitan antara varian MDA5 I923V dan kekerapan RNA enteroviral dalam pesakit T1D telah ditemui (Looney et al. 2015). Tambahan pula, kajian terbaru tentang MDA5- dan tikus MAVSknockout menunjukkan peranan penting protein ini dalam pengantaraan tindak balas interferon jenis 1 terhadap virus Coxsackie B (Wang et al. 2010). Protein pemimpin mengovirus ditunjukkan untuk menghalang ekspresi IFN- dengan menyekat dimerisasi IRF3 yang diperlukan untuk pengaktifan faktor ini (Hato et al. 2007). Pemerhatian ini menunjukkan bahawa varian yang mengganggu fungsi IFIH1 dalam tindak balas antiviral hos telah dipilih secara negatif, dan bukannya dipilih secara positif kerana ia memberikan perlindungan daripada T1D (Crow 2011).

Chow et al. (2018) telah menganalisis secara meluas antara lain reseptor seperti RIG-I, manakala Brisse dan Ly (2019) mengkaji secara meluas evolusi dan spesiasi MDA5 dan RIG-I yang berkaitan. Lokasi residu yang diubah di dalam atau berhampiran tapak pengikat RNA dan pengikat ATP atau antara muka filamen membawa kami untuk membuat hipotesis bahawa mutasi yang diperhatikan mungkin meningkatkan kestabilan filamen IFIH1 dengan meningkatkan pertalian intrinsik antara IFIH1 dan dsRNA atau antara IFIH1 molekul dalam filamen atau dengan mengurangkan kecekapan hidrolisis ATP dan, dengan itu, kadar pembongkaran filamen (Rice et al. 2014).

Kerja ini mewakili kajian struktur tentang potensi peranan varian rs35667974 kongsi lokus autoimun IFIH1, dilaporkan membawa kepada fenotip fungsi yang dihalang pengekodan penggantian asid amino Ile923Val dalam produk protein gen IFIH1 MDA5. Yang terakhir ialah gen calon penyebab biologi yang munasabah dikongsi di antara beberapa penyakit, mempengaruhi kawalan ekspresi tempatan sitokin dan kemokin yang melindungi daripada autoimun (Colli et al. 2010). Kerja ini bertujuan untuk meneroka mekanisme pegun yang tidak diketahui di mana penggantian Ile923Val mengurangkan aktiviti pemangkin MDA5 manusia. Dalam kajian ini, kami menyiasat perbezaan dalam interaksi MDA5 dengan dsRNA antara asli dan varian jarang Ile923Val dalam permulaan mekanisme keradangan. Sehubungan itu, kami berhasrat untuk menyiasat tingkah laku dinamik kompleks MDA5 / dsRNA manusia dalam persekitaran berair dengan kehadiran Ile923 atau Val923 apabila uracil 2'-O dimetilasi atau tidak. Analisis struktur kerentanan genetik yang jarang dikongsi atau lokus perlindungan ini boleh memberikan pandangan tentang pemahaman kita tentang patofisiologi penyakit autoimun dan penemuan penyelidikan mungkin menjejaskan pengurusan penyakit yang dikaji yang lebih baik.

Bahan dan Kaedah

Pengambilan Jujukan, Pembinaan Pokok Filogenetik, dan Analisis Pemilihan Positif

Jujukan protein Homo sapiens (ID jujukan: NP_071451.2) telah diambil daripada pangkalan data UniProt (The UniProt Consortium 2021). Untuk mencari homolog merentas spesies, carian BLAST dilakukan dengan Mega BLAST (National Center for Biotechnology Information, NCBI, Bethesda, MD, USA) di pangkalan data protein RefSeq dan NR (dan PDB dan UniProt) menggunakan Blastp (protein-protein BLAST) dengan parameter lalai (Altschul et al. 1997). 1000 homolog kepada protein MDA5 manusia pada mulanya dipilih dan pemilihan merentas spesies yang memfokuskan pada domain terminal C yang mengandungi jujukan sekitar penggantian I923V manusia digunakan untuk mengenal pasti variasi ini dalam spesies lain. Clustal Omega, program penjajaran jujukan berbilang (Clustal-O) (Sievers et al. 2011), dan pelayan penjajaran jujukan berbilang T-Cofee (Notredame et al. 2000; Di Tommaso et al. 2011) telah digunakan untuk melakukan penjajaran jujukan protein dan perisian bioinformatik platform Unipro UGENE (Okonechnikov et al. 2012) untuk memvisualisasikan berbilang penjajaran secara selektif.

Analisis evolusi digunakan untuk mengenal pasti kedudukan pada jujukan protein yang banyak dipelihara merentas spesies, yang menunjukkan kepentingan struktur (Andreou et al. 2018). Pokok filogenetik telah dibina menggunakan kaedah Kemungkinan Maksimum (Nei dan Kumar 2000) dan model Tamura-Nei (Tamura dan Nei 1993) dengan 500 replika bootstrap (Felsenstein 1985). Pohon awal untuk carian heuristik diperoleh secara automatik dengan menggunakan algoritma Neighbor-Join dan BioNJ pada matriks jarak berpasangan yang dianggarkan menggunakan model Tamura-Nei dan kemudian memilih topologi dengan nilai kemungkinan log yang unggul. Analisis filogenetik melibatkan 52 jujukan nukleotida homolog (39 ortolog dan 13 paralog) gen IFIH1 manusia. Kedudukan kodon yang disertakan ialah 1 tambah 2 tambah 3 tambah Bukan Pengekodan. Terdapat sejumlah 3729 kedudukan dalam set data akhir. Analisis evolusi telah dijalankan menggunakan pakej perisian MEGA11 (Tamura et al. 2021).

Untuk mengesan sama ada gen IFIH1 telah berkembang secara adaptif, kami telah menggunakan program codeml dalam pakej perisian PAML v4.9j (Yang 2007). Jujukan nukleotida dan fail penjajaran jujukan protein yang sepadan telah diserahkan kepada PAL2NAL (Suyama et al. 2006) untuk membentuk fail penjajaran nukleotida input CODEML yang sesuai. Analisis pemilihan positif untuk gen MDA5 ortolog telah dilakukan menggunakan model tapak dan tapak cawangan (Yang et al. 2005; Yang dan Bielawski 2000). Nisbah kadar penggantian bukan sinonim/sinonim (ω=dN/dS) menyediakan ukuran tekanan terpilih pada tahap asid amino. Magnitud nilai dN/dS (ω) mewakili jenis pemilihan: ω<1 for negative selection, ω=1 for neutral selection, and ω>1 untuk pemilihan positif (Yang et al. 2005). Dalam CODEML model tapak (M0, M1, M2, M3, M7, dan M8) dan model tapak cawangan (Clades A dan C) telah dipilih untuk melakukan analisis pemilihan positif (Bielawski dan Yang 2004; Yang dan Nielsen 2002). Dalam model tapak, ujian nisbah kemungkinan (LRT) digunakan untuk menguji pemilihan positif dengan membandingkan tiga pasangan model (M0/M3, M2/M1, dan M7/M8). Analisis telah dilakukan untuk jujukan penuh dan juga urutan C-Terminal Domain (CTD).

Analisis Struktur dan Simulasi Dinamik Molekul

Struktur cryoelectron microscopy (cryo-EM) filamen hMDA5-dsRNA dengan kehadiran ATP (PDB ID: 6GKM) (Yu et al. 2018) (Berman et al. 2000) digunakan sebagai sistem model untuk dinamik molekul ( MD) simulasi. Semua sisa protein diselesaikan (307–1020), 14 pasangan asas RNA terkandas dua kali (dsRNA), dan zink yang diselaraskan dikekalkan, manakala sisa yang hilang telah dimodelkan menggunakan pelayan SWISS-MODEL (Waterhouse et al. 2018). Parameter medan daya dan atom hidrogen telah ditambah menggunakan modul XLEaP AMBER 18 (Case et al. 2005). Medan daya AMBER f14SB (Maier et al. 2015) dan f99OL3 (Zgarbová et al. 2011) masing-masing digunakan untuk protein dan RNA, dengan parameter modrna08 (Aduri et al. 2007) untuk nukleosida yang diubah suai. Mutasi I923V telah diperkenalkan dalam MDA5 dengan mengeluarkan kumpulan metil Cδ I923 secara manual, manakala ribosa U12 yang diubah suai telah dimetilasi pada 2'-O menggunakan residu perpustakaan modrna08 MRU. Ion zink diikat dengan 4 sisa sistein 907, 910, 962, dan 964, menggunakan parameter medan daya yang sesuai untuk mengekalkan sfera koordinasi tetrahedral (panjang ikatan Zn-S 2.35 Å dengan 50 kcal·mol-1·Å–2 pemalar daya dan sudut S–Zn–S 109.5 darjah dengan 25 kcal·mol–1·rad–2).

Dengan cara ini, kami menyediakan 4 sistem untuk simulasi MD: (i) MDA5–dsRNA asli, (ii) MDA5(V923)–dsRNA, (iii) MDA5–dsRNA(2′OMe), dan (iv) MDA5( V923)–dsRNA(2′OMe). Semua sistem telah dilarutkan dalam kotak pelarut oktahedral terpenggal bagi molekul air TIP3P yang telah diseimbangkan, dengan penimbal minimum 10 Å di sekeliling kompleks dan kemudian bilangan ion pembilang yang diperlukan telah ditambahkan untuk mendapatkan peneutralan cas bagi sistem. Simulasi MD telah dilakukan dengan versi dipercepatkan GPU bagi modul PMEMD (Salomon-Ferrer et al. 2013) dalam AMBER 18 dan langkah masa 2 fs. Suhu dikawal menggunakan termostat Langevin dengan kekerapan perlanggaran 1.0 ps–1, manakala tekanan dikawal menggunakan barostat Berendsen dengan masa kelonggaran tekanan 1.0 ps. SHAKE digunakan untuk mengekang ikatan yang melibatkan atom hidrogen dengan toleransi 10-6 Å, manakala interaksi tidak terikat dikira dengan had ruang langsung 10 Å.

Pengurangan tenaga dilakukan pada mulanya untuk 1{{20}},000 langkah dengan sekatan kedudukan 100 kcal·mol–1·Å–2 pemalar daya pada atom bukan hidrogen MDA5-dsRNA. Pelarut kemudian diseimbangkan pada 300 K dan 1 atm melalui pusingan pendek simulasi dalam ensembel NVT dan NPT, masing-masing 100 ps dan 400 ps, ​​sambil mengekalkan sekatan pada atom bukan hidrogen zat terlarut. Selepas itu, pengecilan tenaga dilakukan selama 10,000 langkah, tetapi dengan sekatan kedudukan 10 kcal·mol–1·Å–2 sahaja pada atom C MDA5 dan tulang belakang fosfat dsRNA. Dalam 3 sub secara beransur-ansur dilonggarkan (10.0, 1.0, 0.1 kcal·mol–1·Å–2) sepanjang 1 ns, diikuti oleh 9 ns keseimbangan tanpa sekatan di bawah tekanan malar. Selepas 10 ns penyamaan awal ini (tidak digunakan dalam analisis), 100 ns simulasi pengeluaran dalam ensembel NPT dilakukan untuk setiap sistem pada 300 K dan 1 atm, sambil menyimpan syot kilat sistem setiap 5.0 ps untuk analisis menggunakan CPPTRAJ modul AMBER 18 (Roe dan Cheatham 2013). Semua angka yang menggambarkan model 3D dijana menggunakan sistem grafik molekul PyMOL (v.2.3 binaan sumber terbuka).

Keputusan

Analisis Filogenetik Penggantian Ile923Val MDA5

Evolusi dan spesiasi MDA5 dan RIG-I yang berkaitan disemak secara meluas oleh (Brisse dan Ly 2019). Di sini evolusi IFIH1 digunakan untuk menentukan unsur pemuliharaan dalam urutan MDA5 mengenai polimorfisme tertentu. Analisis evolusi mendedahkan pemuliharaan jujukan yang berat di kalangan MDA5 spesies yang berbeza (984 daripada 1000 jujukan yang disiasat mempunyai isoleucine pada kedudukan setara hMDA #923) dalam domain RD/ CTD, yang menunjukkan kepentingan struktur/fungsi. Polimorfisme rs35667974 dalam exon 14 gen manusia menyebabkan mutasi asid amino terpelihara pada kedudukan 923 dari Ile ke Val dalam hMDA5. Walau bagaimanapun, terdapat enam belas spesies jauh lagi yang mempunyai kedudukan yang sama yang diduduki oleh valine (Rajah 1) yang menunjukkan daya maju perubahan ini merentas spesies dalam domain RD/CTD MDA5 dan domain RS/GY yang hampir homolog bagi isoform X1, X3, dan helikas DHX58 (Rajah 2). Di samping itu, penjajaran jujukan rantau di sekitar kedudukan hMDA #923 (gelung interaksi MDAs CTD) mendedahkan jujukan sederhana hingga sangat terpelihara di kalangan spesies jauh yang menunjukkan kepentingan fungsi merentas spesies di rantau ini.

Pengesanan Pemilihan Positif

Untuk mengesan sama ada gen IFIH1 telah berkembang secara adaptif model tapak dan model tapak cawangan digunakan untuk melakukan analisis pemilihan positif ortolog keseluruhan gen dan domain CTD. Dalam model tapak, tiada tapak pemilihan positif dikenal pasti untuk domain CTD (Jadual 2). M0 membayangkan kadar evolusi malar (ω=dN/dS=0.2) (Jadual 2). Beberapa tapak yang telah menjalani pemilihan positif telah dikenal pasti menggunakan kaedah model tapak M2- dan M8-untuk keseluruhan gen (Jadual Bekalan 1), walaupun tidak dalam kawasan berinteraksi RNA dan domain CTD. Dalam model tapak, ω (dN/ dS) ialah<1 which indicates a highly conserved gene (Table 2, Suppl. Table 1). In the branch-site model, the human branch (as well as the primate's branch) was used as the foreground clade, the ω value was low, and no sites with posterior probability greater than 0.85 were identified (Suppl. Table 2).

Khususnya, untuk model tapak cawangan C untuk domain CTD (Bekalan Jadual 3), 33 peratus daripada tapak berkembang pada kategori ω0=0. 036. Memandangkan tapak yang berkembang di bawah kategori ini tidak membezakan antara jenis cawangan, kedua-dua jenis cawangan mempunyai nilai ω yang sama untuk tapak di bawah kategori ini. Selain itu, 55 peratus daripada tapak berkembang di bawah kategori ω2. Namun, ini mempunyai nilai ω yang bersyarat pada jenis cawangan (ω20=0.25 dan ω21=0). Selain itu, untuk model tapak cawangan C untuk 39 gen MDA5 ortolog (Jadual 4), 33 peratus daripada tapak tersebut berkembang pada kategori ω0=0. 027. Sebaliknya, 41 peratus daripada tapak berkembang di bawah kategori ω2. Namun, ini mempunyai nilai ω yang bersyarat pada jenis cawangan (ω20=0.25 dan ω21=15.32).

Analisis Struktur

Analisis evolusi yang dijalankan menunjukkan bahawa penggantian Ile923Val bukanlah varian unik dalam spesies manusia, kerana Val wujud dalam kedudukan jujukan MDA5 dalam spesies lain juga. MDA5 ialah reseptor RNA untai dua (dsRNA) virus yang memainkan peranan penting dalam imuniti antivirus melalui kekhususannya yang tersendiri untuk RNA virus (Wu et al. 2013). Telah ditunjukkan bahawa 2'-O-metilasi mRNA virus adalah penting untuk tindak balas imun semula jadi, oleh itu telah dicadangkan bahawa 2'-O-metilasi adalah tandatangan molekul untuk membezakan mRNA diri berbanding bukan diri. (Zust et al. 2011). Untuk menyiasat potensi peranan penggantian Ile923Val dalam varian IFIH1 missense rs35667974, kami menganalisis struktur mikroskopi cryoelectron (cryo-EM) filamen MDA5-dsRNA dengan kehadiran ATP (PDB ID: 6GKM) (Yu et al. 2018). Kedudukan 923 terletak pada gelung 921–927 yang berinteraksi secara langsung dengan dsRNA (Rajah 3A). Khususnya, Ile923 terletak 4.8 Å dari 2'-ΟΗ uridin U12, dan interaksinya distabilkan melalui ikatan hidrogen antara His927 bersebelahan dan asas urasil. Penggantian Ile923 oleh Val dalam varian rs35667974 tidak dijangka akan memperkenalkan sebarang pertembungan sterik, dan bukannya meminimumkan interaksi dengan 2′-ΟΗ uridin U12 (Rajah 3B). Sekiranya RNA dimetilasi pada ribosa U12, maka varian MDA5 semula jadi dengan Ile923 memaparkan hubungan van der Waals yang menguntungkan dengan kumpulan 2'-OMe U12 pada 3.6 Å (Rajah 3C), manakala Val923 daripada varian rs35667974 ialah terletak pada 5.0 Å (Gamb. 3D). Perbezaan ini tidak boleh mencadangkan kesan utama penggantian Ile923Val per se; walau bagaimanapun, perubahan struktur yang halus selalunya membawa kepada perubahan fungsi yang ketara melalui gangguan kepada dinamik struktur sistem.

Pengiraan Dinamik Molekul

Untuk menyiasat kesan mutasi I923V MDA5 dalam interaksinya dengan dsRNA, kedua-dua asli dan 2′-Ο-metilasi, kami telah menggunakan simulasi dinamik molekul bagi 4 sistem pada skala masa 100-ns. Dinamik sistem dipantau menggunakan turun naik akar-min-kuasa dua (RMSF) bagi setiap sisa protein dan jarak ikatan hidrogen H927 dengan U12 (Rajah 4). Pengiraan kami mencadangkan bahawa mutasi I923 kepada V923 dalam MDA5 mengakibatkan gangguan kecil dinamik dalam kawasan hubungan RNA (sisa 923-934) dan gelung interaksi antara protein (950-955) kompleks dengan dsRNA asli (Rajah 4C) . Pemerhatian ini adalah serupa dalam kes 2'-O-metilasi dalam U12, walaupun kesan yang lebih ketara diperhatikan dalam dinamik keseluruhan kawasan terminal karboksi mutan MDA5 V923 (Rajah 4D).

Sekarang mempertimbangkan interaksi ikatan hidrogen utama sisa H927 bersebelahan dengan asas urasil, simulasi MD kami mencadangkan bahawa metilasi pada 2'-O tidak menjejaskannya dalam MDA5 asli (Rajah 4E). Walau bagaimanapun, mutasi V923 tidak menjejaskan ikatan hidrogen H927 dalam dsRNA asli tetapi menunjukkan kesan ketidakstabilan dengan kehadiran 2'-O-metilasi (Rajah 4F). Diambil bersama, simulasi MD kami mencadangkan bahawa walaupun kesan mutasi I923V MDA5 dalam interaksi dengan dsRNA asli adalah kecil, kesannya dalam dinamik dan kestabilan kompleks MDA5 / RNA adalah lebih ketara apabila uracil adalah 2'-O-metilasi. .

Perbincangan

Kajian ini mewakili penyiasatan evolusi dan struktur peranan varian rs35667974 kongsi lokus autoimun IFIH1, dilaporkan membawa kepada fenotip fungsi yang diubah suai untuk MDA5 (Downes et al. 2010). Penggunaan model tapak evolusi dan tapak cawangan untuk melakukan analisis pemilihan positif menunjukkan tiada tapak pemilihan positif dalam tapak interaksi RNA di mana polimorfisme rs35667974 berada. Model tapak cawangan tidak menunjukkan mana-mana tapak tertentu telah menjalani pemilihan positif dalam domain CTD.

Ini adalah selaras dengan frekuensi penampilan yang sangat rendah bagi varian Ile923Val walaupun di kalangan populasi manusia (Jadual 1). Walau bagaimanapun, populasi Eropah berbanding dengan yang lain mempunyai perbezaan dalam kekerapan alel C satu susunan magnitud. Tanpa mengabaikan saiz sampel yang kecil, taburan geografi polimorfisme yang dikaji menunjukkan bahawa penampilannya dalam populasi Eropah sebagai titik permulaan mungkin disebabkan oleh keadaan hidup dan pemakanan yang telah berubah sejak beberapa tahun kebelakangan ini. Penyiasatan struktur peranan SNP yang diperiksa telah dilakukan dengan memeriksa struktur kompleks dsRNA-MDA5 (asli dan mutan).

Pada tahap pembentukan kompleks dsRNA-MDA5 pengenalan mutasi Ile923Val mempengaruhi interaksi domain terminal C protein (CTD) dengan dsRNA dengan pengenalan rongga hidrofobik di sebelah gula ribosa satu helai dsRNA. . Kami telah menunjukkan bahawa dalam kes RNA metilasi pada rantai fosforibosil satu helai, kesan dinamik selanjutnya boleh mempengaruhi interaksi mutan sambil tidak menjejaskan jenis liar. Ini adalah selaras dengan kajian eksperimen (Looney et al. 2015; Brisse dan Ly 2019) menunjukkan bahawa kesan polimorfisme Ile923Val yang dikenal pasti di sekitar titik interaksi MDA5-dsDNA mungkin tidak mempengaruhi sifat mengikat dsRNA asli tetapi diubah oleh 2.5-pengurangan kali ganda aktiviti pemangkin (Shigemoto et al. 2009). Selain itu, kajian dinamik molekul telah menunjukkan peranan penting metilasi dalam mutan berkenaan mobiliti dan kestabilan gelung MDA5 941-959 dan 970-977 yang terlibat dalam interaksi dsRNA dan interaksi interprotein dalam pembentukan filamen MDA. Kesan sedemikian boleh menghalang pemasangan filamen MDA5, persatuan MDA5-MAVS, dan pemasangan filamen MAVS yang seterusnya mengaktifkan ekspresi gen interferon jenis I (IFN1: IFN dan IFN ). Dalam kes T1D dan PsA, sebagai akibatnya, tahap aktiviti protein MDA5 berkurangan dan oleh itu pengeluaran IFN yang lebih rendah melindungi daripada autoimun. Pemerhatian ini mencadangkan bahawa beberapa varian IFIH1, diramalkan akan menjejaskan interaksi MDA5 kepada MAVS dan pengurangan pengeluaran IFN akan mengurangkan risiko penyakit, manakala fungsi MDA5 biasa dikaitkan dengannya (Shigemoto et al. 2009).

Ini membawa kepada kesimpulan bahawa seperti dalam kes RNA virus, metilasi dsRNA diri, mutasi yang dikenal pasti RNA, adalah faktor pemilihan / pengaktifan penting untuk pengenalan kesan perlindungan dalam beberapa penyakit autoimun. Hasil daripada kajian ini memperluaskan pengetahuan tentang kepentingan biologi rs35667974 SNP lokus IFIH1 dalam pembangunan penyakit yang disebutkan di atas dan menyerlahkan kepentingan kajian gen yang dikongsi oleh pelbagai penyakit autoimun. Walau bagaimanapun, dalam kajian populasi untuk persatuan genetik SNP dengan penyakit autoimun, menggunakan, contohnya, PCR-RFLP, penjujukan, atau cip genotaip, kes metilasi RNA tidak diambil kira. Oleh itu, adalah penting untuk mengetahui keadaan metilasi dsRNA yang berinteraksi dan kesannya terhadap alel MDA5. Seperti dalam kes pengecaman dsRNA virus (Wu et al. 2013) dan perbezaan antara mRNA diri dan bukan diri (Züst et al. 2011), kehilangan kumpulan metil daripada MDA5 yang berinteraksi, seperti dalam kes mutant Ile923Val MDA5, boleh menjejaskan pembentukan filamen dan induksi interferon jenis I.

Daripada perhatian, Plenge et al. (2013) sebelum ini telah membincangkan potensi varian jarang dalam gen penyakit penyebab untuk mewakili sasaran terapeutik yang diduga untuk campur tangan farmaseutikal. Untuk tujuan ini, fungsi biologi varian penyebab perlu diketahui dalam sebarang percubaan untuk menghubungkan penemuan genetik dengan sasaran terapeutik baru. Oleh itu, mengesan kedudukan varian penyebab dalam struktur 3D protein masing-masing dan menyiasat peranannya dari sudut pandangan struktur/fungsional dalam laluan patogenetik yang membawa kepada penyakit autoimun nampaknya sangat penting untuk pengurusan selanjutnya dan rawatan yang lebih baik. para pesakit. Masih terdapat keperluan tertinggi untuk bergerak melangkaui penemuan SNP yang berkaitan kepada pemahaman yang lebih mendalam tentang varian penyebab untuk menjelaskan mekanisme molekul dan laluan penyakit. Analisis struktur-fungsi lanjut diperlukan untuk menyiasat pengikatan ribosa-2′-Ο-metilasi diri dsRNA kepada MDA5 dan cara ini mempengaruhi pemasangan fibril MDA5. Peranan biologi yang sukar difahami 2'-Ο-metilasi mRNA sebagai sensor perbezaan antara virus dan mRNA diri dalam induksi interferon jenis I mungkin telah diperluaskan kepada sensor pelindung dalam autoimunopati tertentu.

Kesimpulan

Polimorfisme gen rs35667974 IFIH1 yang jarang berlaku melindungi daripada T1D, PS, dan PsA, manakala alel IFIH1 yang dibawa oleh majoriti populasi terdedah kepada penyakit. Pembiayaan bahawa mutan Ile923Val MDA5 berfungsi secara berbeza dalam interaksi dengan dsRNA diri dan khususnya dengan 2'-O-metilasi menunjukkan bahawa dalam beberapa kes varian yang berinteraksi dengan dsRNA metilasi mengganggu pembentukan filamen MDA5, interaksi MAVS, dan pembentukan filamen, dan Isyarat IFN, seperti dalam tindak balas antivirus hos, mungkin telah dipilih secara negatif kerana ia memberikan perlindungan daripada penyakit.

Sumbangan pengarang

Pengkonsepan—AA, AP, EEE dan GNG, metodologi—AA, AP dan EEE, pengesahan—AA, AP, MIZ, GNG dan EEE, penyiasatan—GNG, AA, AP dan MIZ, sumber—GNG, AA, AP dan MIZ, penyusunan data—AA dan AP, penulisan dan penyediaan draf asal—EEE, GNG, AA, AP dan MZ, penulisan, penyemakan dan penyuntingan manuskrip—AA, AP, MZ, GNG dan EEE, visualisasi—AA, AP dan EEE, penyeliaan—EEE, dan pemerolehan pembiayaan—EEE. Semua pengarang telah membaca dan bersetuju dengan versi manuskrip yang diterbitkan.

Pembiayaan

Pembiayaan akses terbuka disediakan oleh HEAL-Link Greece. Kerja ini disokong oleh projek "INSPIRED-The National Research Infrastructures on Integrated Structural Biology, Drug Screening Eforts and Drug Target Functional Characterization" (Grant MIS 5002550), yang dilaksanakan di bawah Tindakan "Reinforcement of the Research and Innovation Infrastructure," dibiayai oleh Program Operasi "Kesaingan, Keusahawanan dan Inovasi" (NSRF 2014–2020) dan dibiayai bersama oleh Greece dan Kesatuan Eropah (Dana Pembangunan Wilayah Eropah).

Ketersediaan Data

Set data yang digunakan dan/atau dianalisis semasa kajian semasa tersedia daripada pengarang yang berkaitan atas permintaan.

Pengisytiharan

Konflik kepentingan

Penulis mengisytiharkan tiada konflik kepentingan. Pembiaya tidak mempunyai peranan dalam reka bentuk kajian; dalam pengumpulan, analisis, atau tafsiran data; dalam penulisan manuskrip, atau dalam keputusan untuk menerbitkan hasilnya.

Kelulusan Etika

Tidak berkaitan.

Persetujuan untuk Menyertai

Tidak berkaitan.

Persetujuan untuk Penerbitan

Tidak berkaitan.

Buka Akses

Artikel ini dilesenkan di bawah Creative Commons Atribusi 4.0 Lesen Antarabangsa, yang membenarkan penggunaan, perkongsian, penyesuaian, pengedaran dan pengeluaran semula dalam sebarang medium atau format, asalkan anda memberikan kredit yang sewajarnya kepada pengarang asal ) dan sumbernya, berikan pautan kepada lesen Creative Commons, dan nyatakan jika perubahan telah dibuat. Imej atau bahan pihak ketiga lain dalam artikel ini disertakan dalam lesen Creative Commons artikel itu melainkan dinyatakan sebaliknya dalam garis kredit kepada bahan tersebut. Katakan bahan tidak termasuk dalam lesen Creative Commons artikel dan penggunaan yang anda maksudkan tidak dibenarkan oleh peraturan berkanun atau melebihi penggunaan yang dibenarkan. Dalam kes itu, anda mesti mendapatkan kebenaran terus daripada pemegang hak cipta.

Rujukan

1. Aduri R, Psciuk BT, Saro P et al (2007) Parameter medan daya AMBER untuk nukleosida diubah suai secara semula jadi dalam RNA. J Chem Theory Comput 3:1464–1475.

2. Altschul SF, Madden TL, Schäfer AA et al (1997) Gapped BLAST dan PSI-BLAST: generasi baharu program carian pangkalan data protein. Asid Nukleik Res 25:3389–3402.

3. Andreou A, Giastas P, Christoforides E, Eliopoulos EE (2018) Cerapan struktur dan evolusi dalam keluarga gen polysaccharide deacetylase bacillus anthracis dan bacillus cereus.

4. Aučynaitė A, Rutkienė R, Tauraitė D et al (2018) Pengenalpastian hidrolase nukleosida 2'-O-methyluridine menggunakan perpustakaan metagenomik. Molekul.

5.Berman HM, Westbrook J, Feng Z et al (2000) Bank data protein. Asid Nukleik Res 28:235–242.

6. Bielawski JP, Yang Z (2004) Kaedah kemungkinan maksimum untuk mengesan perbezaan fungsi di tapak kodon individu, dengan aplikasi untuk evolusi keluarga gen.

7. Biros E, Jordan MA, Baxter AG (2005) Gen pengantara interaksi persekitaran dalam diabetes jenis 1.

8. Boccaletto P, Machnicka MA, Purta E, et al (2018) MODOMICS: pangkalan data laluan pengubahsuaian RNA. kemas kini 2017. Asid Nukleik Res 46:D303–D307.

9. Brisse M, Ly H (2019) Analisis struktur dan fungsi perbandingan reseptor seperti RIG-I: RIG-I dan MDA5.

10. Budu-Aggrey A, Bowes J, Stuart PE et al (2017) Alel pengekodan yang jarang berlaku dalam IFIH1 adalah pelindung untuk arthritis psoriatik. Ann Rheum Dis 76:1321–1324.

For more information:1950477648nn@gmail.com