Penyiasatan Ketoksikan Ifosfamide Mendorong Pengawal Selia Hulu Biasa dalam Hati dan Buah Pinggang

Kenalan: emily.li@wecistanche.com

Hyoung-Yun Han, et al

Abstrak:

Ifosfamide ialah agen pengalkilasi, analog sintetik cyclophosphamide, digunakan untuk merawat pelbagai kanser pepejal. Dalam kajian ini, ketoksikan ifosfamide telah dinilai menggunakan pentadbiran intraperitoneal dos tunggal dan berbilang dalam tikus di bawah garis panduan Amalan Makmal Baik, dan eksperimen microarray tambahan telah diikuti untuk menyokong fifinding toksikologi. Satu dos ifosfamide (50 mg/kg) tidak menyebabkan sebarang perubahan patologi. Sementara itu, ketoksikan buah pinggang yang teruk diperhatikan dalam 7 dan 28 hari kumpulan yang diberikan secara berturut-turut, dengan peningkatan ketara dalam paras nitrogen urea darah dan kreatinin. Dalam analisis senarai tox, gen berkaitan sintesis kolesterol kebanyakannya terjejas dalam hati dan gen berkaitan kegagalan buah pinggang terjejas dalambuah pinggangselepas pentadbiran ifosfamide. Selain itu, faktor pengawalseliaan interferon 7 dipilih sebagai pengawal selia huluan utama yang berubah dalam kedua-duahatidanbuah pinggang, dan didapati berinteraksi dengan gen sasaran lain, seperti peptidase spesifik ubiquitin 18, domain metionin S-adenosyl radikal yang mengandungi 2, dan gen 15 yang dirangsang interferon, yang selanjutnya disahkan oleh analisis RT-PCR masa nyata. Kesimpulannya, mengesahkan semula ketoksikan organ ifosfamide berat sebelah buah pinggang dan mengenal pasti gen yang diubah secara identik dalam kedua-duahatidanbuah pinggang. Kajian toksikogenomik komprehensif lanjut diperlukan untuk mendedahkan hubungan yang tepat antara gen yang disebabkan ifosfamide dan ketoksikan organ.

Kata kunci:ifosfamide; hepatotoksisiti; nefrotoksisiti; ketoksikan intraperitoneal

Cistanche baik untuk hati dan buah pinggang

1. Pengenalan

Ifosfamide ialah agen alkylating, analog sintetik cyclophosphamide, digunakan untuk merawat pelbagai kanser pepejal, termasuk sarkoma dan limfoma. Ifosfamide adalah ubat antikanser tidak spesifik kitaran sel yang mengganggu replikasi DNA dan pengeluaran RNA [1]. Walaupun ifosfamide boleh diterima dengan baik berbanding agen pengalkilasi toksik yang lain, ia diketahui dikaitkan dengan banyak kesan buruk yang mengancam nyawa yang mengehadkan penggunaan klinikalnya [2]. Kesan sampingan utama ifosfamide termasuk kecederaan buah pinggang yang teruk akibat daripada spesies toksik reaktif daripada ifosfamide, termasuk akutbuah pinggang kecederaan, nefritis interstitial, cystitis hemoragik, dan sindrom Fanconi [3]. Di klinik, ketoksikan organ berbilang yang teruk telah dilaporkan pada pesakit yang mengalami ketoksikan buah pinggang awal dan berulang kali kegagalan organ yang disebabkan ifosfamide dos tinggi yang membawa kepada kegagalan organ berikutnya [4,5].

Metabolit toksik ifosfamide, akrolein, dan chloroacetaldehyde, adalah faktor bertanggungjawab utama untuk ketoksikan organ ifosfamide. Kajian terdahulu memberi tumpuan terutamanya kepada faktor yang mempengaruhi penukaran ifosfamide kepada metabolit toksik, terutamanya cytochrome P450 (CYP) [6]. CYP3A4 dan CYP3A5 yang agak banyak dalam buah pinggang membawa kepada perubahan toksik dalam ifosfamide dan mendorong nefrotoksisiti [7]. Akrolein ialah aldehid yang sangat reaktif yang boleh mengaktifkan laluan gen oksidatif reaktif intraselular dan merosakkan organel sel. Chloroacetaldehyde melaporkan penindasan pengaktifan kompleks I dalam rantai pernafasan mitokondria yang mungkin membawa kepada pengurangan glutation intraselular (GSH) dan kematian sel [8].

Kajian toksikologi pelbagai organ adalah lebih membantu dalam memahami kesan sistemik ubat daripada menyasarkan organ tertentu untuk kajian ketoksikan. Hati dan buah pinggang adalah organ utama yang mengambil bahagian dalam metabolisme dan perkumuhan dadah, dan organ utama ini terdedah kepada tindak balas ubat yang merugikan; ketoksikan organ sering mengikuti. Selain itu, penilaian toksikologi integratif boleh membentangkan pelbagai masalah patologi yang boleh membantu memahami dan meramalkan ketoksikan akibat dadah dalam sistem.

Banyak kajian telah menggunakan profil ekspresi gen untuk meramalkan potensi kesan negatif bahan kimia. Walau bagaimanapun, kebanyakan kajian terdahulu memberi tumpuan kepada menilai ketoksikan organ sasaran tunggal, dengan hanya gejala patologi yang terhad [9]. Selain itu, digabungkan dengan pemprofilan gen berasaskan microarray, ia akan menghasilkan pemahaman tahap sistem yang komprehensif tentang ketoksikan yang boleh menghalang potensi ketoksikan berkaitan dadah [10]. Dalam hal ini, pendekatan toksikologi pelbagai organ integratif dengan profil ekspresi gen telah digunakan dalam kajian model ramalan ketoksikan untuk mengatasi data ketoksikan yang diperoleh daripada penilaian ketoksikan organ tunggal, yang tidak mencukupi untuk memahami mekanisme toksik ubat dalam sistem [11].

Dalam kajian ini, kami menerangkan ketoksikan ifosfamide dalambuah pinggangdanhatiselepas pendedahan akut dan berulang dalam tikus Sprague-Dawley (SD). Ujian profil ekspresi gen yang menyokong telah dilakukan untuk mendedahkan gen sasaran biasa yang telah diubah oleh ifosfamide dalam kedua-dua hati danbuah pinggang, mencadangkan pandangan tentang ketoksikan ifosfamide integratif.

2. Keputusan

2.1. Kajian Ketoksikan Dos Tunggal

Tiada ketoksikan diperhatikan dalam kumpulan ifosfamide 12.5, 25, dan 50 mg/kg—bukan kematian, gejala toksik, perubahan berat badan, atau finding histopatologi.

Sementara itu, dalam kajian hematologi, kiraan relatif retikulosit (RET) dan kiraan mutlak neutrofil (NEUA) dan limfosit (LYMA) menurun mengikut cara yang bergantung kepada dos.

2.2. Kajian Ketoksikan Dos Berulang Satu Minggu

Berat badan keseluruhan menurun selepas 1 minggu pentadbiran ifosfamide, dan nilai purata penurunan berat badan dalam kumpulan 100 mg/kg adalah lebih tinggi daripada kumpulan 75 mg/kg (Jadual 1). Sementara itu, berat organ relatif meningkat secara beransur-ansur dalam kumpulan yang dirawat ifosfamide (Jadual 2).

Satu minggu pentadbiran IP ifosfamide berturut-turut menindas indeks hematologi, termasuk RBC, HGB, HCT, MCV, dan PLT, dalam cara yang bergantung kepada dos (Jadual 3). Selain itu, BUN dan CREA meningkat 1.2 kali dalam kumpulan kawalan jika dibandingkan dengan kumpulan ifosfamide (Jadual 4).buah pinggangkecederaandisokong lagi oleh kajian histopatologi.

Tiada tanda histopatologi diperhatikan dalam hati tikus dalam kumpulan ifosfamide 75 dan 100 mg / kg (Rajah 1A). Sementara itu, pihakbuah pinggangdaripada kumpulan ifosfamide 75 dan 100 mg/kg didapati mempunyai gred minimum hingga sedikit perubahan patologi, termasuk degenerasi/dilatasi tubular (1 sederhana dalam kumpulan 100 mg/kg), nekrosis sel tunggal, hiperplasia urothelium, dan pendarahan fokus /kesesakan (Jadual 5). Di samping itu, peningkatan nyata dalam ekspresi KIM-1 dalam kawasan tubul renal diperhatikan dalambuah pinggangdaripada kumpulan 100 mg/kg (Rajah 1B).

2.3. Kajian Ketoksikan Dos Berulang Empat Minggu

Kematian diperhatikan dalam kumpulan 50 (5/10) dan 70 (10/10) mg/kg yang dirawat selepas 21 dan 10 hari pentadbiran berturut-turut. Selain itu, penurunan berat badan dengan peningkatan berat organ relatif,hati, danbuah pinggang, dalam semua kumpulan yang dirawat ifosfamide, menyokong 4-ketoksikan dos berulang minggu.

Analisis biokimia hematologi dan serum dilakukan pada subjek yang masih hidup. Beberapa parameter darah, termasuk RET, RBC, MONA, EOSA, dan LUCA, telah menurun dengan ketara selepas 4 minggu pentadbiran ifosfamide.

Berbanding dengan kumpulan kawalan, analisis biokimia menunjukkan perbezaan statistik selepas 4 minggu pentadbiran ifosfamide. Sebagai contoh, tahap AST dan CK telah meningkat dengan ketara, dan nisbah A/G, GLU dan GGT telah menurun (p < 0.01)="" dalam="" kumpulan="" yang="" dirawat="" 50="" mg/kg,="" jika="" dibandingkan="" dengan="" kawalan="">

2.4. Analisis Ekspresi Gen Terinduksi Ifosfamide

DEG yang disebabkan ifosfamide telah dikenalpasti di dalam hati danbuah pinggangtisu (Jadual 6). Untuk hati, gen yang dinyatakan secara berbeza termasuk 2672 gen pada 100 mg / kg BW / hari, 1283 gen telah dikawal selia, dan 1389 gen telah dikurangkan. Dalam buah pinggang, 401 gen dinyatakan secara berbeza pada 100 mg / kg BW / hari-149 gen telah dikawal selia, dan 252 gen telah dikurangkan. Dalam kedua-dua hati dan buah pinggang, bilangan gen terkawal bawah adalah lebih besar daripada bilangan gen terkawal naik. Ini mungkin mencadangkan bahawa rawatan ifosfamide nampaknya menghalang ekspresi gen.

Keputusan analisis fungsi biologi disenaraikan dalam Jadual 7. 1-minggu pemberian ifosfamide didapati mengubah gen yang berkaitan dengan perkembangan organ, kebanyakannya dalam hati. Di dalambuah pinggang, telah disahkan bahawa gen yang berkaitan dengan penyetempatan sel imun kebanyakannya terjejas.

Dalam analisis laluan kanonik DEG, perubahan dalam sintesis kolesterol dan gen berkaitan laluan persembahan antigen terbukti dalamhatidanbuah pinggangtisu, masing-masing (Rajah 2). Selain itu, isyarat tindak balas fasa LXE/RXR dan akut adalah laluan kanonik terkawal atas biasa dalamhatidanbuah pinggang, yang terlibat dalam homeostasis lipid dan isyarat sitokin radang, masing-masing.

Dalam analisis senarai tox hati, gen berkaitan sintesis kolesterol kebanyakannya terjejas, diikuti oleh protein tindak balas fasa akut positif dan panel kegagalan buah pinggang akut (Jadual 8). Tambahan pula, keputusan senarai buah pinggang mendedahkan bahawa gen yang berkaitan dengan kegagalan buah pinggang secara amnya dipengaruhi oleh ifosfamide, termasuk biomarker glomerulonephritis boleh balik dan panel kegagalan buah pinggang akut.

Berdasarkan pangkalan pengetahuan IPA, pengawal selia huluan biasa mengawal ekspresi gen dalam hati dan buah pinggang selepas rawatan ifosfamide (Rajah 3). IRF7 adalah pengawal selia utama yang berubah dalam kedua-dua hati dan buah pinggang dan didapati berinteraksi dengan gen sasaran lain seperti USP18, RSAD2, dan ISG15. Tambahan pula, analisis RT-PCR masa nyata mengesahkan ungkapan IRF7, USP18, RSAD2, dan ISG15. Walaupun tahap perubahan dalam setiap gen adalah berbeza antara hati dan buah pinggang, ekspresi telah ditindas dalam kedua-dua tisu hati dan buah pinggang selepas 1 minggu pentadbiran ifosfamide. RSAD2 dan USP18 kebanyakannya telah mengubah gen oleh rawatan ifosfamide di hati dan buah pinggang, masing-masing.

3. Perbincangan

Dalam kajian ini, ketoksikan ifosfamide yang komprehensif dalam pelbagai organ telah diterokai dengan dos dan istilah pendedahan yang berbeza melalui laluan IP pada tikus di bawah piawaian GLP. Di klinik, ifosfamide boleh melakukan tindakan antitumor bimodal dengan kesan sitotoksik dan imunomodulator digabungkan dengan imunoterapi pakai [12]. Ifosfamide diketahui terutamanya disingkirkan melalui laluan buah pinggang dan kira-kira 80 peratus daripada dos adalah dalam bentuk yang tidak berubah, nefrotoksisiti adalah kesan sampingan yang biasa diketahui bagi ifosfamide, dan metabolit seperti chloroacetaldehyde dan acrolein bertanggungjawab untuk kegunaan klinikalnya [13, 14].

Dalam kajian ini, 1-kajian ketoksikan berulang minggu adalah sesuai untuk meneroka ketoksikan organ yang berasal dari ifosfamide. Satu minggu pentadbiran ifosfamide menindas indeks darah dalam cara yang bergantung kepada dos, yang mungkin mencerminkan myelosuppression yang berasal dari ifosfamide tipikal. Bersama dengan nefrotoksisiti, beberapa laporan telah menunjukkan bahawa myelosuppression adalah salah satu ketoksikan ifosfamide yang mengehadkan dos utama, dan leukopenia secara amnya lebih teruk daripada trombositopenia [15,16]. Nefrotoksisiti ifosfamide boleh menyebabkan sindrom Fanconi, di mana terdapat kemerosotan fungsi tubul proksimal yang mengakibatkan kerosakan tidak dapat dipulihkan, dan akrolein metabolit toksik menimbulkan urotoksisiti dengan cystitis hemorrhagic [17]. Ini adalah selaras dengan hasil kajian ini. Dalam kajian histopatologi, buah pinggang dan hati telah diperiksa untuk meneroka perubahan patologi yang berasal dari ifosfamide. Dalam kedua-dua kumpulan 75 dan 100 mg / kg yang ditadbir ifosfamide, kawasan besar degenerasi tiub dan pelebaran dikesan dengan hiperplasia urothelium di kawasan pelvis buah pinggang. Tambahan pula, ungkapan KIM-1, molekul kecederaan tubul proksimal buah pinggang, menyokong kehadiran nefrotoksisiti berkaitan ifosfamide. Sementara itu, hanya vakuolasi periportal yang minimum diperhatikan dalam hati. Selain itu, walaupun nilai AST dan ALT menurun dalam cara yang bergantung kepada dos, perubahan itu berada dalam julat rujukan [18]. Sebab yang lebih mendalam untuk penurunan tahap enzim hati perlu dikaji lebih lanjut. Secara amnya diterima bahawa ifosfamide adalah agen pengalkilasi yang jarang dikaitkan dengan hepatotoksisiti, dan hanya beberapa kes telah dilaporkan menyebabkan kecederaan hati, terutamanya apabila digabungkan dengan ubat kemoterapi lain seperti doxorubicin [19].

Baru-baru ini, kemajuan ketara dalam data ekspresi gen dalam toksikologi dengan teknologi pemprosesan tinggi telah membawa kepada penjanaan set data yang cukup besar dalam kajian ketoksikan, dan banyak percubaan telah dibuat untuk menggunakan profil gen kepada ramalan ketoksikan kimia [10,20]. Dalam kajian ini, analisis microarray telah dijalankan untuk menganalisis tindak balas transkrip yang disebabkan oleh pentadbiran ifosfamide, dan DEG dengan perubahan lipatan Lebih besar daripada atau sama dengan 1.5 telah dipilih sebagai gen sasaran dan fungsi biologi, laluan kanonik, dan analisis senarai Tox digunakan. untuk memahami fungsi gen yang disebabkan ifosfamide. Analisis pengatur huluan tambahan telah dilakukan untuk menilai kemungkinan ketoksikan pelbagai organ dalam hati dan buah pinggang.

Dalam kajian ini, DEG berubah 1.5-kali ganda telah dipilih dan gen terkawal adalah lebih dominan sedikit daripada gen terkawal dalam kedua-dua hati (52 peratus ) dan buah pinggang (62 peratus ). Keputusan analisis fungsi biologi menunjukkan bahawa ifosfamide mengubah gen, dengan fungsi biologi yang berkaitan dengan perkembangan tisu yang biasanya diperhatikan dalam kedua-dua hati dan buah pinggang.

Kajian terdahulu oleh Snouber et al. [21] rawatan ifosfamide yang dilaporkan didapati mengurangkan kawalan Nrf-2 laluan tindak balas oksidatif tekanan pengantara dalam kultur mikrobendalir [21]. Selaras dengan kajian terdahulu, laluan tindak balas tekanan oksidatif pengantara NRF2-dimodulasi dengan ketara oleh rangkaian teratas, yang disahkan oleh kedua-dua laluan kanonik dan analisis senarai toksin semasa. Laluan tindak balas oksidatif tekanan pengantaraan Nrf-2 yang diubah sekarang mungkin berkait rapat dengan metabolit toksik ifosfamide. Metabolit toksik ifosfamide berbilang boleh bertindak balas dengan GSH, antioksidan yang kuat, untuk membentuk konjugat di tapak yang berbeza di sepanjang laluan, dan penurunan tahap GSH mengakibatkan ketoksikan yang meningkat, yang menunjukkan implikasi tekanan oksidatif dalam ketoksikan organ ifosfamide [8,22]. ]. Dalam hal ini, mesna dan N-acetylcysteine ​​​​digunakan untuk mengurangkan ketoksikan organ ifosfamide. Mesna berfungsi sebagai detoksifikasi serantau dengan mengikat metabolit toksik ifosfamide, terutamanya terhadap akrolein, melalui penambahan Michael untuk membentuk bahan yang kurang berbahaya [23]. Di samping itu, N-acetylcysteine ​​dilaporkan mempunyai aktiviti antioksidan dan meningkatkan pengurangan GSH di bawah keadaan tekanan oksidatif [24]. Kajian lanjut diperlukan untuk menjelaskan hubungan yang tepat antara penawar ifosfamide dan laluan yang dikawal di bawah keadaan nefrotoksik. Kami boleh membuat spekulasi bahawa pemulihan ketoksikan ifosfamide oleh mesna atau N-acetylcysteine ​​mungkin diikuti oleh laluan tindak balas oksidatif tekanan pengantara Nrf{14}}yang dipertingkatkan.

Dalam kajian ini, isyarat yang berkaitan dengan keradangan biasanya dikawal dalam kedua-dua hati dan buah pinggang, yang boleh dikenali dengan isyarat fasa akut dalam analisis laluan kanonik. Keputusan ini menunjukkan implikasi tindak balas keradangan dalam patofisiologi ketoksikan organ ifosfamide dalam kedua-dua tisu, yang selanjutnya disokong oleh analisis pengawal selia huluan. Dalam analisis pengawal selia huluan, gen berkaitan isyarat IRF7 dan interferon (IFN), termasuk USP18, RSAD2, dan ISG15, telah dipilih sebagai pengawal selia hulu biasa dalam hati dan buah pinggang. IRF7 ialah faktor spesifik limfoid, yang secara konstitutif dinyatakan dalam sitoplasma sel imun, dan juga boleh disebabkan oleh interferon jenis I, jangkitan virus, dan rangsangan luar dalam pelbagai sel [25]. Kajian terdahulu melaporkan sifat pro- atau anti-onkogenik kontroversi IRF7 dalam sel tumor yang pelbagai, dan perubahan dalam ekspresi IRF7 dikaitkan dengan kerosakan DNA [26-28].

Sebagai tambahan kepada peranan pengawalseliaan yang penting dalam IFN jenis I untuk fungsi antivirus, IRF7 dilaporkan untuk menyekat tindak balas keradangan melalui laluan isyarat TLR4 [29]. Selain itu, Stout-Delgado et al. [30] melaporkan bahawa peningkatan oksidatif yang disebabkan oleh penuaan menjejaskan aktiviti IRF7, manakala pengurangan tekanan oleh agen antioksidan meningkatkan aktiviti IRF7. Dalam kajian ini, pentadbiran ifosfamide menindas ekspresi pengawal selia huluan, dan corak ekspresi adalah sama dalam kedua-dua hati dan buah pinggang. Perubahan semasa dalam ekspresi IRF7 mungkin berkaitan dengan tindak balas keradangan dan sifat agen alkylating sitotoksik ifosfamide, yang mungkin mencadangkan IRF7 sebagai sasaran yang menjanjikan untuk ketoksikan organ ifosfamide.

Dalam kajian ini, kami mendapati gen yang secara identik dihalang dalam kedua-dua hati dan buah pinggang selepas pentadbiran ifosfamide, tetapi tafsiran kepentingan toksikologinya hanya tertumpu pada buah pinggang, yang mengehadkan penemuan semasa. Selain itu, kajian pengesahan lanjut yang berkaitan dengan kesan penawar ifosfamide yang tersedia secara komersil pada gen yang kini diubah mungkin menyokong fifindings sekarang.

Kesimpulannya, kajian ketoksikan berulang (1 minggu) pentadbiran ifosfamide didapati mempunyai nefrotoksisiti berat sebelah dan bukannya hepatotoksisiti. Di samping itu, keputusan semasa memberikan bukti untuk mekanisme hepatotoksisiti dan nefrotoksisiti yang disebabkan ifosfamide yang melibatkan perencatan IRF-7. Kajian toksikogenomik lanjut mengenai organ berkaitan imun diperlukan untuk menjelaskan mekanisme toksikologi sistemik ifosfamide, dan untuk menyokong hubungan antara gen dan ketoksikan organ.

4. Bahan dan Kaedah

4.1. Kajian Haiwan

Tikus Sprague–Dawley (SD) bebas patogen spesifik jantan berumur lapan minggu (n=140) diperoleh daripada Orient Bio Inc. (Seongnam, Korea). Haiwan telah diperiksa dan disesuaikan dengan keadaan persekitaran makmal selama seminggu sebelum eksperimen. Semua haiwan ditempatkan dalam sangkar plastik di bawah keadaan makmal terkawal (suhu,23 ± 3 ◦C; kelembapan, 55 ± 10 peratus ; dan 12/12-h kitaran terang/gelap) dengan chow makmal dan air ad libitum. Kajian haiwan itu telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi Institut Toksikologi Korea (Daejeon, Korea), dan semua prosedur dilakukan dengan mematuhi Garis Panduan Pengujian untuk Penilaian Keselamatan Dadah dari Pentadbiran Makanan dan Ubat Korea. Kajian haiwan dibahagikan kepada tiga bahagian: dos tunggal (akut) dan dos berulang (1 minggu dan 4 minggu) kajian ketoksikan pentadbiran berturut-turut. Empat puluh ekor tikus secara rawak diberikan kepada empat kumpulan (kawalan, t1, t2, dan t3) menggunakan sistem Path/Tox (versi. 4.2.2, Xybion Medical Systems Corporation, Lawrenceville, NJ, USA) dalam setiap kajian ketoksikan.

4.2. Eksperimen Ketoksikan

Kajian ketoksikan dibahagikan kepada tiga bahagian: kajian ketoksikan dos tunggal (akut) dan dua dos berulang (dos berturut-turut 1 minggu atau 4 minggu). Bagi setiap kajian ketoksikan, tikus secara rawak diberikan kepada kumpulan yang mencukupi (kawalan, dos 1, dos 2, dan dos 3 untuk kajian ketoksikan tunggal dan 4-minggu; kawalan, dos 1, dan dos 2 untuk 1- kajian ketoksikan minggu) dengan menggunakan sistem Path/Tox (versi. 4.2.2, Xybion Medical Systems Corporation, Lawrenceville, NJ, USA). Dalam kajian ketoksikan, ifosfamide ditadbir melalui laluan intraperitoneal (IP), dan kumpulan kawalan menerima air suling (DW). Dos ifosfamide yang digunakan dalam kajian ketoksikan adalah seperti berikut: kajian ketoksikan akut (12.5, 25, dan50 mg/kg), 1-kajian ketoksikan minggu (75 dan 100 mg/kg BW/hari), dan {{19 }}kajian ketoksikan minggu (25, 50, dan 70 mg/kg BW/hari). Gejala klinikal am haiwan, berat badan, dan kematian direkodkan setiap hari semasa pentadbiran, dan semua haiwan dikorbankan 24 jam selepas pentadbiran ifosfamide terakhir. Sampel darah dikumpul dan dimasukkan ke dalam tiub microcentrifuge dan tiub EDTA-K2 masing-masing untuk biokimia serum dan analisis hematologi. Tisu hati dan buah pinggang telah ditetapkan dalam formaldehid dan tertakluk kepada analisis histopatologi. Imunohistokimia tambahan, analisis microarray, dan RT-PCR masa nyata dilakukan pada tisu hati dan buah pinggang daripada kajian ketoksikan subakut (100 mg/kg BW/hari).

4.3. Analisis Biokimia Hematologi dan Serum

Ujian hematologi standard dilakukan menggunakan sistem hematologi ADVIA 120 (Bayer, Fernwald, Jerman). Penunjuk berikut digunakan: kiraan sel darah putih (WBC), kiraan sel darah merah (RBC), hematokrit (HCT), kepekatan hemoglobin, purata isipadu korpuskular (MCV), purata hemoglobin korpuskular (MCH), kiraan platelet (PLT), limfosit (LYM), monosit (MON), neutrofil (NEU), basofil (BAS), eosinofil (EOS), dan kiraan sel tidak bernoda besar (LUC), dan retikulosit (RET).

Ujian biokimia telah dijalankan menggunakan penganalisis automatik (TBA 120FRNEO; Toshiba Corp., Tokyo, Jepun) dengan serum emparan. Penunjuk biokimia utama ialah alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), alkali fosfatase (ALP), nitrogen urin darah (BUN), kreatinin (CREA), glukosa (GLU), jumlah kolesterol (TCHO), nisbah albumin/globulin (A/G), trigliserida (TG), jumlah bilirubin(TB), gamma-glutamyl transferase (GGT), fosfolipid (PL), kalsium, klorida, natrium tak organik, fosforus dan kalium.

4.4. Pemeriksaan Histopatologi dan Imunohistokimia

Tisu yang dibenamkan parafin dibelah pada ketebalan 5-µm, diwarnai dengan hematoxylin dan eosin (H&E), dan diperiksa secara mikroskopik.

Tisu buah pinggang tertakluk kepada imunohistokimia. Bahagian deparaffinized dan basuh telah diprainkubasi dengan 10 peratus serum kambing untuk menyekat pewarnaan tidak spesifik. Slaid kemudian diinkubasi semalaman dengan antibodi anti-KIM1 utama (1:750; Santa Cruz, CA, Amerika Syarikat). Selepas penyingkiran antibodi utama, bahagian tersebut diproses dengan Kit VECTASTAIN Elite ABC HRP (Vector Laboratories, Peterborough, UK), dan ekspresi KIM1 telah diperiksa di bawah mikroskop cahaya.

4.5. Analisis Mikroarray dan Analisis Interaksi Protein-Protein (PPI).

Hati dan buah pinggang daripada kumpulan 1-minggu (100 mg/kg) telah dihomogenkan dan jumlah RNA telah diekstrak dengan kit mini RNase (Qiagen). Sintesis cDNA dicapai menggunakan Kit Sintesis cDNA (Affymetrix, Affymetrix, Santa Clara, CA, Amerika Syarikat) dan tertakluk kepada analisis microarray dan PPI.

Analisis mikroarray telah dilakukan menggunakan Affymetrix GeneChip Rat {{0}}.0 dengan GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix Santa Clara, CA, USA) dan keputusan diproses menggunakan perisian analisis GeneSpring GX v13.0 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Gen yang diungkap secara berbeza (DEG), yang berubah lebih daripada 1.5-kali ganda selepas pentadbiran ifosfamide, dipilih menggunakan analisis varians sehala (ANOVA) dengan ujian post hoc Tukey. Fungsi biologi dan laluan kanonik DEG terpilih telah dianalisis menggunakan perisian Analisis Laluan Ingenuity (IPA, ver. 9.0; Sistem Ingenuity, Redwood City, CA, Amerika Syarikat), dan analisis pengawal selia huluan telah dilakukan untuk mengenal pasti pengawal selia huluan yang mungkin bertanggungjawab untuk DEG yang diperoleh daripada ketoksikan ifosfamide. Analisis rangkaian interaksi protein-protein (PPI) tambahan DEG dilakukan menggunakan perisian STRING (versi 10), dan interaksi itu disahkan apabila skor keyakinan sederhana melebihi 0.4. Interaksi protein ialah kebarangkalian anggaran bahawa pautan yang diramalkan wujud antara dua protein dalam laluan Kyoto Encyclopedia of Genes and Genoms.

4.6. Kajian RT-PCR Masa Nyata Kuantitatif

Ekspresi gen pengawal selia biasa dalam kajian microarray telah disahkan menggunakan RT-PCR masa nyata kuantitatif. Primer khusus gen diperoleh daripada Bioneer (Daejeon, Korea). Urutan primer adalah seperti berikut: faktor pengawalseliaan interferon 7 (IRF7): hadapan, 5-TGCTTGTCTAGCACCAATAG-3 dan belakang, 5-CACAAGGTCCACTAGAGATG-3; ubiquitin specific peptidase 18 (USP18): hadapan, 5-CTGTAGTTTGTCTCCCAACA-3 dan belakang 5-GAACTGATTACCTCCCACTG-3; domain S-adenosyl metionine radikal yang mengandungi 2(RSAD2): ke hadapan, 5-ACCAATCATCAGAGGTTGAC-3 dan terbalik, 5-CTGCATGATTGTTCTTGGAC-3; gen stimulasi interferon 15 (ISG15): ke hadapan, 5-AAGTCTCCCAAGACCAATTC-3dan terbalik, 5-CTACATTGGCTCTGGATAGG-30.

Jumlah RNA telah ditranskripsikan secara terbalik kepada cDNA menggunakan SuperScript II (Invitrogen, Carls bad, CA, USA) dan primer oligo-dT, mengikut arahan pengilang. Tahap ekspresi mRNA bagi gen berkaitan pengawalseliaan huluan dianalisis menggunakan Sistem PCR Masa NyataStepOnePlus (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) dengan campuran induk anSYBR Green (Applied Biosystems), mengikut protokol pengeluar. Primer RNA ribosom 18S digunakan sebagai kawalan dalaman, dan hasilnya dinyatakan sebagai perubahan lipatan berbanding kumpulan kawalan biasa.

4.7. Analisis statistik

Data dianalisis secara statistik menggunakan pelbagai kaedah perbandingan. Apabila ujian Bartlett tidak menunjukkan sisihan yang ketara daripada kehomogenan varians, analisis varians (ANOVA) digunakan untuk menentukan sama ada mana-mana min kumpulan berbeza pada aras keertian p < {{0}}.05.="" selain="" itu,="" ujian="" dunnett="" digunakan="" untuk="" menentukan="" perbezaan="" data="" antara="" kumpulan="" kawalan="" dan="" rawatan="" apabila="" data="" didapati="" signifikan="" daripada="" ujian="" anova.="" tambahan="" pula,="" apabila="" sisihan="" ketara="" daripada="" homogeniti="" varians="" diperhatikan="" daripada="" ujian="" bartlett,="" ujian="" perbandingan="" bukan="" parametrik,="" ujian="" kruskal–wallis="" (h),="" telah="" dijalankan="" untuk="" menentukan="" sama="" ada="" mana-mana="" kumpulan="" bermakna="" berbeza="" pada="" p=""><0.05. apabila="" perbezaan="" yang="" ketara="" diperhatikan="" dalam="" ujian="" kruskal–wallis="" (h),="" subujian="" peringkat="" dunn="" dijalankan="" untuk="" mengukur="" pasangan="" spesifik="" data="" kumpulan="" yang="" berbeza="" secara="" signifikan="" daripada="" min.="" ujian="" tepat="" fisher="" telah="" dijalankan="" untuk="" membandingkan="" pasangan="" data="" (termasuk="" prevalens="" dan="" peratusan).="" tahap="" kebarangkalian="" ditetapkan="" kepada="" 1="" atau="" 5="" peratus="" .="" analisis="" statistik="" dilakukan="" dengan="" membandingkan="" data="" daripada="" kumpulan="" rawatan="" yang="" berbeza="" dengan="" kumpulan="" kawalan="" menggunakan="" path/tox="" (versi.="" 4.2.2,="" xybion="" medical="" systems="" corporation,="" lawrenceville,="" nj,="">

Penyata Ketersediaan Data:

Data terkandung dalam artikel atau Bahan Tambahan.

Konflik Kepentingan:

Penulis mengisytiharkan bahawa mereka tidak mempunyai kepentingan bersaing.

Rujukan

1. Palmerini, E.; Setola, E.; Grignani, G.; D'Ambrosio, L.; Comandone, A.; Righi, A.; Longhi, A.; Cesari, M.; Paioli, A.; Hakim, R.; et al. ifosfamide dos tinggi dalam pesakit osteosarcoma gred tinggi yang berulang dan tidak boleh direseksi: Siri retrospektif. Sel 2020, 9, 2389. [CrossRef]
2. Klastersky, J. Kesan sampingan ifosfamide. Onkologi 2003, 65, 7–10. [CrossRef]
3. Sprangers, B.; Lapman, S. Kesakitan ifosfamide yang semakin meningkat. Clin. Buah pinggang J. 2020, 13, 500–503. [CrossRef]
4. Elias, AD; Ayash, LJ; Wheeler, C.; Schwartz, G.; Tepler, I.; McCauley, M.; Mazanet, R.; Schnipper, L.; Frei, E., ke-3; Antman, KH ifosfamide/carboplatin/etoposide dos tinggi dengan sokongan sel stem hematopoietik autologus: Keselamatan dan arahan masa hadapan. Semin. Oncol. 1994, 21, 83–85. [PubMed]
5. Mollenkopf, A.; Du Bois, A.; Meerpohl, HG Sequential course dan pengurusan prospektif ketoksikan pelbagai organ yang disebabkan ifosfamide. Geburtshilfe Frauenheilkd. 1996, 56, 525–528. [CrossRef]
6. Aleksa, K.; Matsell, D.; Krausz, K.; Gelboin, H.; Ito, S.; Koren, G. Cytochrome P450 3A dan 2B6 dalam buah pinggang yang sedang berkembang: Implikasi untuk nefrotoksisiti ifosfamide. Pediatr. Nephrol. 2005, 20, 872–885. [CrossRef] [PubMed]
7. Lowenberg, D.; Duri, CF; Desta, Z.; Flockhart, DA; Altman, RB; Ringkasan Klein, TE PharmGKB: Laluan Ifosfamide, farmakokinetik dan farmakodinamik. Farmakogenet. Genom. 2014, 24, 133. [CrossRef] [PubMed]
8. MacAllister, SL; Martin-Brisac, N.; Lau, V.; Yang, K.; O'Brien, PJ Acrolein dan chloroacetaldehyde: Pemeriksaan terhadap sel dan biomarker bebas sel ketoksikan. Kimia. biol. Berinteraksi. 2013, 202, 259–266. [CrossRef]
9. Kim, J.; Shin, M. Model integratif ramalan ketoksikan akibat dadah berbilang organ menggunakan data ekspresi gen. BMC Biomaklumat. 2014, 15, S2. [CrossRef]
10. Alexander-Dann, B.; Pruteanu, LL; Oerton, E.; Sharma, N.; Berindan-Neagoe, I.; Módos, D.; Bender, A. Perkembangan dalam toksikogenomik: Memahami dan meramalkan ketoksikan yang disebabkan oleh kompaun daripada data ekspresi gen. Mol. Omics 2018, 14, 218–236. [CrossRef]
11. An, YR; Kim, JY; Kim, YS Pembinaan model ramalan untuk menilai ketoksikan organ berbilang. Mol. Toksik sel. 2016, 12, 1–6. [CrossRef]
12. Binotto, G.; Trentin, L.; Semenzato, G. Ifosfamide dan cyclophosphamide: Kesan pada pengawasan imun. Onkologi 2003, 65, 17–20. [CrossRef]
13. Schwerdt, G.; Gordjani, N.; Benesic, A.; Freudinger, R.; Wollny, B.; Kirchhoff, A.; Gekle, M. Chloroacetaldehyde- dan acroleinduced kematian sel tubul proksimal manusia. Pediatr. Nephrol. 2006, 21, 60–67. [CrossRef]
14. Ensergueix, G.; Pallet, N.; Joly, D.; Levi, C.; Chauvet, S.; Trivin, C.; Augusto, JF; Boudet, R.; Aboudagga, H.; Touchard, G.; et al. Nefrotoksisiti Ifosfamide pada pesakit dewasa. Clin. Buah pinggang J. 2020, 13, 660–665. [CrossRef]
15. Dechant, KL; Brogden, RN; Pilkington, T.; Faulds, D. Ifosfamide/mesna. Kajian semula aktiviti antineoplastiknya, sifat farmakokinetik, dan keberkesanan terapeutik dalam kanser. Dadah 1991, 42, 428–467. [CrossRef]
16. Pronk, LC; Schrijvers, D.; Schellens, JHM; De Bruijn, EA; Menanam, A.; Locci-Tonelli, D.; Groult, V.; Verweij, J.; Van Oosterom, AT Fasa I mengkaji docetaxel dan ifosfamide pada pesakit dengan tumor pepejal lanjutan. Br. J. Kanser. 1998, 77, 153–158. [CrossRef] [PubMed]
17. Skinner, R. Nefrotoksisiti ifosfamide kronik pada kanak-kanak. Med. Pediatr Oncol. 2003, 41, 190–197. [CrossRef]
18. Sharp, P.; Vilano, JS Tikus Makmal; CRC Press: Boca Raton, FL, USA, 2012.
19. Cheung, MC; Jones, RL; Judson, I. Ketoksikan hati akut dengan ifosfamide dalam rawatan sarkoma: Laporan kes. J. Med. Rep. Kes 2011, 5, 180. [CrossRef]
20. Cui, Y.; Paules, RS Penggunaan transkriptomi dalam memahami mekanisme ketoksikan yang disebabkan oleh dadah. Farmakogenomik 2010, 11, 573–585. [CrossRef]
21. Snouber, LC; Jacques, S.; Monge, M.; Legallais, C.; Leclerc, E. Analisis transkriptomik kesan ifosfamide pada sel MDCK yang ditanam dalam biocip mikrobendalir. Genomics 2012, 100, 27–34. [CrossRef] [PubMed]
22. Dirven, HA; Megens, L.; Oudshoorn, MJ; Dingemanse, MA; van Ommen, B.; Van Bladeren, PJ Glutathione konjugasi ubat sitostatik ifosfamide dan peranan glutathione S-transferases manusia. Kimia. Res. Toksik. 1995, 8, 979–986. [CrossRef]
23. Jeelani, R.; Jahanbakhsh, S.; Kohan-Ghadr, HR; Thakur, M.; Khan, S.; Aldhaheri, SR; Yang, Z.; Andreana, P.; Morris, R.; Abu-Soud, HM Mesna (2-mercaptoetana natrium sulfonat) berfungsi sebagai pengawal selia myeloperoxidase. Radic Percuma. biol. Med. 2017, 110, 54–62. [CrossRef]

24. Alnahdi, A.; John, A.; Raza, H. N-asetil sistein melemahkan tekanan oksidatif dan ketidakseimbangan redoks yang bergantung kepada glutation yang disebabkan oleh rawatan glukosa tinggi/asid palmitik tinggi dalam sel Rin{3}}F pankreas. PLoS ONE 2019, 14, e0226696. [CrossRef]

25. Zhang, L.; Pagano, JS IRF-7, faktor pengawalseliaan interferon baharu yang dikaitkan dengan kependaman virus Epstein–Barr. Mol. Biol Sel. 1997, 17, 5748–5757. [CrossRef]
26. Pagano, JS Virus dan limfoma. N. Inggeris. J. Med. 2002, 347, 78–79. [CrossRef]
27. Romieu-Mourez, R.; Solis, M.; Nardin, A.; Goubau, D.; Baron-Bodo, V.; Lin, R.; Massie, B.; Salcedo, M.; Hiscott, J. Peranan berbeza untuk faktor pengawalseliaan IFN (IRF)-3 dan IRF-7 dalam pengaktifan sifat antitumor makrofaj manusia. Kanser Re. 2006, 66, 10576–10585. [CrossRef]
28. Ning, S.; Pagano, JS; Barber, GN IRF7: Pengaktifan, peraturan, pengubahsuaian dan fungsi. Gen Imun. 2011, 12, 399–414. [CrossRef]
29. Chen, PG; Guan, YJ; Zha, GM; Jiao, XQ; Zhu, HS; Zhang, CY; Wang, YY; Li, HP Swine IRF3/IRF7 melemahkan tindak balas keradangan melalui laluan isyarat TLR4. Oncotarget 2017, 8, 61958. [CrossRef]
30. Stout-Delgado, HW; Yang, X.; Walker, KAMI; Tesar, BM; Goldstein, DR Penuaan menjejaskan regulasi faktor pengawalseliaan IFN 7 dalam sel dendritik plasmacytoid semasa pengaktifan TLR9. J. Immunol. Res. 2008, 181, 6747–6756. [CrossRef]