Metabolisme In Vitro Dan In Vivo Ekstrak Cistanche Tubulosa dalam Tikus Kemurungan yang Disebabkan Tekanan Normal Dan Kronik Tidak Dapat Diramalkan

Hubungi: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mel:audrey.hu@wecistanche.com

Yang Li, et al

ABSTRAK

Cistanche tubulosa, satu spesies Cistanches Herba, baru-baru ini disahkan mempunyai keberkesanan antidepresan tikus tekanan tidak menentu (CUS) dengan memulihkan homeostasis mikrobiota usus. Dalam makalah ini, kami berhasrat untuk meneroka profil metabolik C. tubulosa dalam tikus model kemurungan normal dan CUS yang disebabkan oleh in vitro dan in vivo. Menggunakan UPLC-Q-TOF-MS, metabolisme gastrousus in vitroEkstrak cistanche tubulosa(CTE) telah dinilai dalam kedua-dua tikus normal dan CUS. Pada masa yang sama, metabolisme in vivo CTE(ekstrak cistanche tubulosa)dalam tikus normal dan tertekan juga disiasat dalam air kencing dan najis tikus. Sebanyak 20 dan 26 metabolit dicirikan daripada in vitro dan in vivometabolism dalam tikus normal dan CUS, masing-masing. CTE(ekstrak cistanche tubulosa)telah dimetabolismekan kepada aglikon dan produk degradasi glikosida phenylethanoid (PhGs) dan iridoid glikosida sama ada oleh mikrobiota usus tikus normal atau tertekan secara in vitro. Metabolit fasa II aglikon dan produk degradasi PhG dan glikosida iridoid adalah metabolit utama dalam air kencing dan najis tikus. Selain itu, keupayaan metabolik untuk menjana glikosida dan aglikon sekunder dalam mikrobiota usus tikus kemurungan adalah jauh lebih lemah daripada mikrobiota usus tikus biasa, yang dikaitkan dengan hidrolase glikosida yang tidak teratur yang dihasilkan oleh mikrobiota usus dalam tikus tertekan CUS. Hasil kajian ini meletakkan asas untuk memahami proses metabolik dan mekanisme terapeutik sifat antidepresan CTE.

Kata kunci: Cistanche tubulosa, KemurunganMetabolisme, In vitro, In vivo, Mikrobiota usus

1. Pengenalan

Cistanches Herba secara rasmi direkodkan sebagai batang sukulen kering Cistanche deserticola (YC Ma) dan C. tubulosa (Schrenk), yang digunakan untuk merawat kekurangan buah pinggang, mati pucuk, kemandulan wanita, morbidleucorrhea, metrorrhagia yang berlebihan, dan sembelit nyanyuk [1]. Kajian farmakologi moden telah menunjukkan bahawa Cistanches Herba mempunyai pelbagai aktiviti biologi seperti anti-neurodegeneration, immunoregulation, dan anti-radang [2,3]. Siasatan kami sebelum ini telah mengesahkannyaEkstrak cistanche tubulosa(CTE), yang terdiri daripada 48.6 peratus glikosida phenylethanoid (PhGs), 6.9 peratus glikosida iridoid dan 20.0 peratus jumlah sakarida, boleh mengurangkan dengan ketara simptom kemurungan bagi tikus kemurungan yang disebabkan oleh tekanan tidak dapat diramal kronik (CUS) dengan ketara. memulihkan homeostasis mikrobiota usus [4]. Kajian terbaru menunjukkan bahawa perubahan dalam komposisi mikrobiota usus dikaitkan dengan perkembangan dan perkembangan kemurungan [5,6]. Kelimpahan relatif genera mikrob telah terganggu dengan ketara dalam tikus model CUSdepressive berbanding dengan kawalan biasa [7]. Dalam pesakit yang tertekan, kepelbagaian dan kekayaan mikrobiota usus juga telah diubah dengan ketara [8]. Selain itu, pelbagai sebatian termasuk phenylethanoid glycosides (PhGs) dan iridoid glycosides dianggap sebagai juzuk utama Cistanches Herba [2,3], yang mudah dimetabolismekan menjadi glikosida sekunder dan aglikon termasuk hydroxytyrosol (HT), 3,4-dihydroxyphenethyl glikosida, asid geniposidik terdeglycosylated, dsb. oleh mikrobiota usus manusia. Metabolit ini lebih mudah diserap melalui usus dan melakukan aktiviti biologi yang konsisten dengan komponen prototaip[9-11]. Oleh itu, kami percaya bahawa semasa berlakunya dan perkembangan kemurungan, gangguan struktur mikroflora usus pasti akan menjejaskan metabolisme ubat-ubatan tradisional Cina (TCM) oral dalam saluran gastrousus, selain menjejaskan keadaan fisiologi hos. Kebanyakan data metabolik sedia ada Cistanches Herba datang daripada kajian metabolik pada haiwan yang sihat[12–15]. Oleh itu, ia akan menjadi lebih penting secara klinikal untuk menyiasat profil metabolik CTE(ekstrak cistanche tubulosa)dalam keadaan patologi dalam menjelaskan komponen bioaktifnya dan memahami mekanisme tindakan untuk keberkesanan anti-depresifnya.

Dalam kajian semasa, kami berhasrat untuk mencirikan profil metabolik CTE(ekstrak cistanche tubulosa)dalam kedua-dua tikus model kemurungan yang sihat dan CUS oleh spektrometri jisim masa penerbangan empat kali ganda kromatografi cecair prestasi ultra (UPLC-Q-TOF-MS). Jus gastrik, cecair usus, dan mikrobiota tikus patologi normal dan kemurungan telah digunakan untuk mensimulasikan proses metabolik CTE(ekstrak cistanche tubulosa)dalam saluran gastrousus secara in vitro, secara bebas dan berurutan. Metabolit in vivo juga dijelaskan selepas pentadbiran oral CTE(ekstrak cistanche tubulosa)dalam tikus normal dan CUS. Kajian ini memberikan pandangan baharu tentang metabolisme dan metabolit aktif CTE(ekstrak cistanche tubulosa)untuk kemurungan.

2. Bahan dan kaedah

2.1. bahan

Batang kering C. tubulosa dikumpul dari Daerah Hetian (Xinjiang, China). Sampel spesimen baucar telah disahkan oleh Prof. Xiaobo Li dan disimpan di herbarium Sekolah Farmasi, Universiti Jiao Tong Shanghai (Shanghai, China). Kaedah pengekstrakan telah digunakan seperti yang dinyatakan dalam penerbitan kami sebelum ini [4]. TheEkstrak cistanche tubulosa(CTE) sampel disimpan pada 4 darjah dan dilarutkan semula dengan air steril sebelum digunakan. Larutan air steril CTE(ekstrak cistanche tubulosa)sampel kemudiannya ditapis melalui 0.22 μm membran, dan turasan dikumpulkan dalam tiub steril.

Echinacoside disediakan oleh makmal Dr. Pengfei Tu, PekingUniversity (Beijing, China). Acteoside, isoacteoside, 2'-acetylacteoside, dan cistanoside A telah dibeli daripada Sichuan Weikeqi BiologicalTechnology Co., Ltd. (Chengdu, China). Hydroxytyrosol, asid caffeic, 3,4-asid dihydroxybenzenepropionic, 3-hydroxyphenylpropionic acid, dan 3-asid phenylpropionic telah dibeli daripada Aladdin IndustrialInc. (Shanghai, China). Ketulenan setiap komponen ditentukan menjadi > 95 peratus oleh HPLC-UV. Acetonitrile gred HPLC dibeli daripadaMerck (Darmstadt, Jerman). Air ternyahion disediakan daripada air suling menggunakan sistem penulenan air Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA). Semua reagen dan bahan kimia lain yang digunakan adalah gred analisis.

2.2. Eksperimen haiwan

Tikus Sprague-Dawley jantan (200 ± 20 g) diperoleh daripada Syarikat Teknologi Haiwan Makmal Sungai Vital Beijing (Beijing, China), dan ditempatkan di Pusat Haiwan Makmal Universiti JiaoTong Shanghai (Shanghai, China). Haiwan-haiwan tersebut adalah suhu bilik terkawal dalam kumpulan-rumah (25 ± 2 darjah, 55 ± 10 peratus kelembapan relatif) dengan kitaran gelap terang-gelap 12:12 jam. Tikus-tikus tersebut dibenarkan masuk secara percuma ke makanan tikus makmal biasa dan air selama 1 minggu. Kemudahan dan protokol haiwan telah diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Haiwan Universiti Jiao Tong Shanghai (Shanghai, China).

Selepas penyesuaian satu minggu, dua belas tikus naif dibahagikan secara rawak kepada dua kumpulan (n=6), kumpulan kawalan dan kumpulan tekanan tidak dapat diramal kronik (CUS). Tikus CUS telah dibangunkan seperti dalam laporan kami sebelum ini [4], yang tertakluk kepada pelbagai tekanan: whitenoise (100 dB) selama 1 jam, pencahayaan stroboskopik intensiti rendah semalaman (120 kilat/min), kekurangan air selama 24 jam, kosong. botol air selama 1 jam (selepas kekurangan air), kekurangan makanan selama 24 jam, kekangan fizikal (1−2 jam), berenang paksa (5 minit), sangkar kotor selama 24 jam (200 mL air dalam 100 g habuk papan), cubitan ekor ( 1 min), kejutan selama 30 minit, kecondongan sangkar 45 darjah selama 24 jam, dan pencahayaan semalaman (12 jam). Penegasan digunakan secara berterusan dan rawak selama 4 minggu, susunan terperinci diterangkan dalam Jadual S1. Selepas 4 minggu tekanan, ujian sucrosepreference, ujian medan terbuka, dan ujian pemakanan yang ditindas kebaharuan dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini [4]. Garis besar CUS dan ujian tingkah laku ditunjukkan dalam Rajah S1. Selepas ujian tingkah laku, sekurang-kurangnya 4 fecalpellets diperolehi daripada setiap tikus dan diletakkan dalam tiub kon steril untuk analisis in vitro CTE(ekstrak cistanche tubulosa)metabolisme.

2.3. Metabolisme gastrousus CTE(ekstrak cistanche tubulosa)oleh tikus normal dan CUS in vitro

2.3.1. Metabolisme CTE(ekstrak cistanche tubulosa)dalam simulasi jus gastrik dan usus

Lima puluh miligram CTE(ekstrak cistanche tubulosa)telah ditambah kepada 10 mL jus gastrik simulasi dan jus usus, masing-masing. Kemudian CTE(ekstrak cistanche tubulosa)telah diinkubasi pada 37 darjah selama 4 jam dalam jus gastrik dan 6 jam dalam jus usus. Campuran kultur(1 mL) telah dipadamkan dengan 3 mL n-butanol tepu air serta-merta pada 0 dan 4 jam dalam jus gastrik, dan pada 0 dan 6 jam dalam jus usus. Kaedah pemprosesan sampel yang digunakan adalah seperti yang dinyatakan sebelum ini [9].

2.3.2. Metabolisme CTE(ekstrak cistanche tubulosa)oleh mikrobiota usus tikus normal dan CUS

Sampel najis tikus normal dan CUS segar mula-mula dicampur dan dihomogenkan dengan 25 kali ganda isipadu sup GAM. Sedimen dialihkan melalui penapisan melalui tiga keping kain kasa. Suspensi kemudiannya diinkubasi pada 37 darjah dalam inkubator anaerobik di mana udara digantikan dengan campuran gas (H2 5 peratus, CO2 10 peratus, N2 85 peratus). Lima puluh miligram CTE telah ditambah kepada 5 mL biasa dan penggantungan tahi tikus CUS secara berasingan, dan penggantungan itu diinkubasi pada 37 darjah selama 48 jam. Campuran yang dikultur telah dikeluarkan dan diekstrak dengan n butanol tepu air pada 0, 12, 24, dan 48 jam. Kaedah pemprosesan sampel telah diterangkan seperti sebelum ini [9].

2.3.3. Metabolisme berurutan CTE(ekstrak cistanche tubulosa)oleh jus gastrik, jus usus, mikrobiota usus tikus normal dan CUS

Pertama, 100 mg CTE(ekstrak cistanche tubulosa)telah ditambahkan pada 1{{10}} mL jus gastrik simulasi dan diinkubasi pada 37 darjah selama 4 jam. Keseluruhan tindak balas telah dipadamkan sebanyak 3 kali ganda isipadu n-butanol tepu air, dan disentrifugasi pada 3000 rpm selama 15 minit, diikuti dengan penyejatan supernatan di bawah aliran nitrogen gas pada 37 darjah. Kedua, sisa itu dilarutkan semula dalam 0.4 mL air steril, ditambah kepada 8 mL jus usus simulasi, dan diinkubasi pada 37 darjah selama 6 jam. Sampel dengan jus gastrik telah dikupas dengan cara yang sama. Akhir sekali, sisa itu dilarutkan semula dalam 0.3 mL air steril, ditambah kepada 6 mL penggantungan najis tikus normal dan CUS masing-masing, dan diinkubasi pada 37 darjah selama 48 jam dalam inkubator anaerobik. Satu mililiter tindak balas telah dipadamkan oleh 3 mL n-butanol tepu air serta-merta pada 0 dan 4 jam dalam jus gastrik, pada 0 dan 6 jam dalam jus usus, dan pada 0, 12, 24, dan 48 jam dalam mikrobiota usus tikus. . Sampel telah diproses secara serupa CTE(ekstrak cistanche tubulosa)dalam jus gastrik simulasi.

2.4. Metabolisme CTE(ekstrak cistanche tubulosa)oleh tikus biasa dan CUS dalam vivo

Setiap tikus dalam dua kumpulan kemudiannya ditempatkan di dalam sangkar metabolik individu. Selepas berpuasa semalaman yang hanya membenarkan akses percuma ke air, semua tikus diberikan secara lisan dengan 2 mL air melalui tiub gastrik. Sampel air kencing dan najis kosong dikumpul daripada semua tikus dari 0 jam hingga 12 jam. Selanjutnya, CTE(ekstrak cistanche tubulosa)(400 mg/kg) telah ditadbir secara gavage. Sampel air kencing dan najis dikumpul dari 0 jam hingga 24 jam. Semua sampel air kencing dan najis disimpan pada suhu -80 darjah serta-merta.

Sampel air kencing dan najis daripada tikus normal dan CUS telah dirawat terlebih dahulu seperti yang diterangkan sebelum ini [12]. Semua sampel yang terhasil dianalisis oleh UPLC-Q-TOF-MS.

2.5. Kaedah analisis

UPLC telah dilakukan pada sistem Waters ACQUITY UPLC (WatersCorp., Milford, MA, USA) dengan lajur ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm × 2.1 mm id, 1.7 μm, Waters Corp. , Amerika Syarikat) dengan elusi kecerunan menggunakan {{10}}.1 peratus asid formik asetonitril (A) dan 0.1 peratus asid formik dalam air(B) pada kadar aliran 0.4 mL/min . Profil kecerunan ialah: 0–5 min (A: 5–20 peratus ), 5–7.5 min (A: 20–30 peratus ), 7.5–10 min (A: 30–70 peratus ), 10–11 min(A : 70–100 peratus ), dan diadakan selama 1.5 min. Kecerunan itu dikitar semula kepada 5 peratus dalam 0.5 minit dan ditahan selama 2.5 minit untuk larian seterusnya. Isipadu suntikan ialah 3 μL. Suhu ketuhar lajur ditetapkan kepada 35 darjah.

Spektrometri jisim telah dijalankan menggunakan spektrometer jisim Waters Vion IMS (Waters Corp., Milford, MA, USA). Pengionan dilakukan dalam mod elektrospray negatif (ESI−). Parameter MS adalah seperti berikut: voltan kapilari, −2.0 kV; voltan kon, 20 V; suhu sumber, 12{15}} darjah ; suhu pelarutan, 500 darjah ; aliran gas kon dan penyahlarutan, masing-masing 50 dan 1000 L/j. Untuk ukuran jisim yang tepat, leucine-enkephalin digunakan sebagai jisim kunci untuk menjana ion [M–H]− (m/z 554.2615). Eksperimen MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) dalam dua fungsi imbasan telah dijalankan seperti berikut:fungsi 1 (tenaga rendah): m/z 50–1000, 0.25 s masa imbasan, 0.02 s kelewatan interscan, 6 tenaga perlanggaran eV; fungsi 2 (tenaga tinggi): m/z50–1000, masa imbasan 0.25 s, kelewatan antara imbasan 0.02 saat, tanjakan tenaga perlanggaran 20–45 eV.

2.6. Pemprosesan data

Data telah diproses menggunakan perisian UNIFI 1.8.1 (Waters Corp.,Milford, MA, USA) untuk pengenalpastian metabolit dalam data mentah imbasan penuh jisim yang tepat yang dikumpul melalui MSE. Sebatian dikenal pasti berdasarkan jisim yang tepat, serpihan dalam spektrometri jisim tenaga tinggi. Ambang keamatan ditetapkan sebagai 100.0 kiraan. Pengenalpastian sasaran, toleransi padanan serpihan dan parameter lain telah ditetapkan secara automatik.

3. Keputusan

3.1. Perubahan tingkah laku dalam tikus kemurungan yang disebabkan oleh CUS

Tikus-tikus dengan simptom kemurungan yang disebabkan oleh CUS dinilai oleh ujian tingkah laku termasuk ujian keutamaan sukrosa, ujian medan terbuka, dan ujian pemakanan yang ditindas baru. Ujian-t pelajar mendedahkan bahawa rujukan sukrosa dalam ujian keutamaan sukrosa (p <.001), jumlah="" jarak="" yang="" diliputi="" dalam="" ujian="" medan="" terbuka="" (p=""><.001), dan="" kependaman="" untuk="" makan="" dalam="" ujian="" penyusuan="" yang="" ditindas="" baru="" (p=""><.01) adalah="" ketara.="" berbeza="" berbanding="" dengan="" kumpulan="" kawalan="" selepas="" 4-minggu="" rawatan="" cus="" (rajah="" 1).="" penemuan="" ini="" menunjukkan="" bahawa="" model="" tekanan="" kronik="" yang="" tidak="" dapat="" diramal="" telah="" berjaya="">

3.2. Pencirian juzuk kimia CTE(ekstrak cistanche tubulosa)

Analisis komprehensif konstituen prototaip CTE(ekstrak cistanche tubulosa)telah dijalankan oleh UPLC-Q-TOF-MS. Secara keseluruhan, 27 juzuk daripada CTE(ekstrak cistanche tubulosa)telah dikesan dan dicirikan secara sementara, termasuk 20 PhG, 5 iridoid dan glikosida iridoid, dan 2 oligosakarida. Maklumat terperinci termasuk masa pengekalan, ion serpihan MS dan MS/MS yang tepat disenaraikan dalam Maklumat sokongan (Jadual S2) untuk memberikan gambaran tentang struktur juzuk kimia ini. UPLC-Q-TOF-MS jumlah ionchromatogram (TIC) CTE ditunjukkan dalam Rajah S2.

3.3. Metabolisme gastrousus CTE(ekstrak cistanche tubulosa)oleh tikus normal dan CUS in vitro

Dalam kajian ini, potensi metabolit CTE(ekstrak cistanche tubulosa)oleh normal dan CUSrat in vitro telah dikesan daripada TIC dan dikenal pasti dengan gabungan komposisi unsur dan spektra jisim serpihan MS/MS selepas membandingkannya dengan sampel kawalan. Semua metabolit daripada CTE(ekstrak cistanche tubulosa)dalam simulasi jus gastrik dan usus, mikrobiota usus tikus normal dan CUS disenaraikan dalam Jadual 1.

3.3.1. Metabolisme CTE(ekstrak cistanche tubulosa)dalam simulasi jus gastrik dan usus

Tujuh metabolit CTE(ekstrak cistanche tubulosa)dalam jus gastrik simulasi telah dikenal pasti secara tentatif dengan jisim yang tepat dan maklumat serpihan MSE: M1 (m/z315.1074, C14H20O8, 1.66 min), M4 (m/z 459.1501, C20H28O12,2.36 min), M5 (m/z 30,15, C20, 30,15). 2.60 min), M7 (m/z179.0338, C9H8O4, 2.85 min), M12 (m/z 785.2481, C35H46O20,4.77 min), M16 (m/z 827.2580, C37H48O23, 6, dan M/z) .1968, C29H36O15, 5.81 min). Deglycosylation, dehydroxylation, dehydrogenation, dan isomerization dianggap sebagai laluan metabolik utama untuk CTE dalam jus gastrik. M4 dan M5 didapati mempunyai berat molekul 2 Da dan 16 Da lebih rendah daripada komponen prototaipnya, decaffeoylacteoside, dan dengan itu dikenal pasti sebagai produk dehidrogenasi dan dehidroksilasinya, masing-masing. M12 dikenal pasti sebagai isomer echinacoside, menghasilkan ion yang sama seperti echinacoside pada m/z 623.2178, 477.1601, 315.1055, 161.0237.

Metabolit yang sama dikesan selepas CTE(ekstrak cistanche tubulosa)pengeraman dalam jus usus. Perlu diperhatikan bahawa kumpulan caffeoyl pada kedudukan C-6′ dalamPhGs mudah dimetabolismekan oleh enzim pencernaan dalam jus usus untuk menghasilkan metabolit dekafeil dan asid kafeiknya.

3.3.2. Metabolisme CTE(ekstrak cistanche tubulosa)oleh mikrobiota usus tikus normal dan CUS

Sebanyak 20 metabolit bio-transformasi daripada CTE(ekstrak cistanche tubulosa)dalam mikrobiota rattestinal normal telah dikesan dan dikenalpasti (Rajah 2). Daripada keputusan itu, didapati bahawa PhG telah terdegradasi kepada aglycone hydroxytyrosol (HT) M2 (m/z 153.0550, C8H10O3, 1.78 min), dan asid caffeic(CA) M7 (m/z 179.0338, C9H8O4, 2.85 min), kemudian mereka selanjutnya dimetabolismekan kepada M3 (m/z 163.0390, C9H8O3, 2.02 min), M6 (m/z181.0501, C9H10O4, 2.76 min), M10 (m/z 195.0655, C10H12O4,4.35 min.) , C9H10O3, 4.36 min) melalui dehidroksilasi, pengurangan dan metilasi. Di samping itu, laluan metabolik pusat yang menghasilkan metabolit langsung sebatian prototaip PhG daripada CTE dalam mikrobiota usus tikus normal ialah pengurangan, methoxylation, deglycosylation, decaffeoyl, dehydrogenation, dan isomerization.

Selepas pengeraman dalam mikrobiota usus tikus kemurungan yang disebabkan oleh CUS, CTE(ekstrak cistanche tubulosa)telah ditukar kepada 20 metabolit melalui laluan metabolik yang sama seperti tikus biasa.

3.3.3. Metabolisme berurutan CTE oleh jus gastrik, jus usus, mikrobiota usus tikus normal dan CUS

Selepas pengeraman berurutan dalam jus gastrik, jus usus, mikrobiota usus tikus normal dan CUS, CTE(ekstrak cistanche tubulosa)telah dimetabolismekan kepada 14 metabolit (termasuk 8 dengan jus gastrik, 7 dengan jus usus, 11 dengan normal, dan 10 dengan mikrobiota usus tikus CUS). Antaranya, M2(HT) dan M11 (3-asid hidroksifenilpropionik, 3-HPP) ialah metabolit akhir PhG selepas pengeraman berjujukan CTE(ekstrak cistanche tubulosa)dalam jus gastrik, jus usus, dan mikrobiota usus. Tiada perbezaan ketara dalam metabolit antara tikus normal dan CUS.

M8, M9, M14, M17, M19, dan M20 hanya dikesan dalam metabolisme bebas CTE oleh mikrobiota usus tikus normal dan CUS. Metabolit ini kebanyakannya adalah perantaraan metabolik yang telah dimetabolismekan sepenuhnya kepada metabolit akhir dalam kajian metabolisme berjujukan CTE dan oleh itu sukar untuk dikesan.

3.3.4. Perbezaan antara kadar metabolisme CTE oleh mikrobiota ratintestinal normal dan CUS

Untuk menjelaskan perbezaan antara kadar metabolisme CTE(ekstrak cistanche tubulosa)oleh mikrobiota usus tikus normal dan CUS, kandungan relatif 27 sebatian prototaip dan 20 metabolit selepas pengeraman dengan jus gastrik, jus usus, mikrobiota usus tikus normal dan CUS ditentukan secara berasingan dan berurutan (Jadual S3 dan S4). Keputusan menunjukkan bahawa walaupun tidak terdapat perbezaan yang signifikan antara CTE(ekstrak cistanche tubulosa)metabolit tikus normal dan kemurungan, perbezaan ketara diperhatikan dalam kadar metabolisme mereka. Contohnya, C2 dan C5 telah dikenal pasti sebagai 8-asid epilognik atau isomernya. Mereka telah dimetabolismekan sepenuhnya dalam sampel normal dalam masa inkubasi 12 jam. Dalam mikrobiota usus tikus yang tertekan secara patologi, bagaimanapun, mereka telah dimetabolismekan secara menyeluruh selepas pengeraman 48 jam. Adalah jelas bahawa kadar metabolisme dalam tikus normal adalah lebih cepat daripada pada tikus CUS. Keputusan yang sama ditemui daripada C18 (isoacteoside). Selain itu, perlu diperhatikan bahawa kawasan puncak M12 (pengisomeran echinacoside) dan M16 (pengisomeran tubuloside A) dalam sampel normal adalah lebih besar daripada yang terdapat dalam sampel CUS, menunjukkan bahawa tindak balas pengisomeran CTE(ekstrak cistanche tubulosa)adalah lebih lazim dalam mikrobiotatan usus tikus biasa dalam mikrobiota usus tikus kemurungan.

3.4. Metabolisme CTE oleh tikus normal dan CUS dalam vivo

Dengan membandingkan sampel biologi kumpulan yang dirawat CTE dengan sampel blankbiologi, sejumlah 26 metabolit (kompaun 1–26) CTE(ekstrak cistanche tubulosa)tikus tidak normal dan CUS telah dikesan (Jadual 2). Kromatogram UPLC biasa bagi sampel air kencing tikus normal dan CUS ditunjukkan dalam Rajah 3.

3.4.1. Pencirian metabolit CTE dalam raturine normal dan CUS

Sebanyak 18 metabolit in vivo CTE(ekstrak cistanche tubulosa)dalam sampel air kencing tikus biasa dikenal pasti secara tentatif. Metabolit degradasi PhGs termasuk HT dan CA, dan metabolit sulfatasi selanjutnya (kompaun 1, 2, 3, 5, 8, dan 16), metilasi (6, 21, 22, dan 24), dan metabolit metoksilasi (13 dan 14) adalah metabolit utama dalam air kencing tikus biasa. Glikosida iridoid mudah dimetabolismekan kepada aglikon (23, 25, dan 26) melalui deglikosilasi. Perlu diperhatikan bahawa tiada komponen prototaip dikesan dalam sampel air kencing tikus biasa.

Dalam sampel air kencing tikus kemurungan, 22 metabolit CTE(ekstrak cistanche tubulosa)telah dikesan dan dicirikan. Satu sebatian prototaip, 8-asid epilognik, telah dikesan dalam air kencing tikus patologi. Metabolit lain adalah selaras dengan yang terdapat dalam air kencing tikus biasa, termasuk metabolit sulfat (1, 2, 3, 8, 10, dan 16), metabolit metilasi (6, 11, 19, dan22), metabolit methoxylated (13 dan 14) HT dan CA, dan theaglycones glikosida iridoid (25 dan 26).

3.4.2. Pencirian metabolit CTE(ekstrak cistanche tubulosa)dalam ratfeces normal dan CUS

Dalam kajian ini, hanya satu metabolit (kompaun 20, 3-HPP) CTE(ekstrak cistanche tubulosa)dikenal pasti dalam najis tikus biasa. Kebanyakan PhG mula-mula terdegradasi kepada CA dan seterusnya menjalani metabolisme selanjutnya kepada mikrob metabolit utamanya, 3-HPP. Dalam sampel najis dari tikus CUS, 3 metabolit dicirikan secara sementara, termasuk 3-HPP (sebatian 16) sulfat (sebatian 16), dan HT tersulfat (sebatian 2 dan 3).

3.4.3. Perbezaan antara metabolit in vivo CTE dalam normal dan CUSrats

Selepas pentadbiran lisan CTE(ekstrak cistanche tubulosa), metabolit in vivo menunjukkan perbezaan yang jelas dalam tikus model yang sihat dan kemurungan. 21 metabolit (kompaun 1-3, 5, 6, 8-14, 16, 17, dan 19-26) telah dikesan dalam kedua-dua sampel tikus yang sihat dan CUS. Sebatian 23 (asid deglycosylatedgeniposidic) dikenal pasti hanya dalam sampel tikus yang sihat, manakala sebatian 4 (HT), 7 (8-asid epilognik), 15 (3, 4-asid dihydroxybenzenepropionic), dan 18 ({{ 19}}Konjugasi glukuronida HPP) hanya dikesan dalam sampel tikus model CUS. Secara ringkasnya, konstituen prototaip hanya dikesan dalam tikus CUS, manakala metabolit lebih fasa II ditemui dalam tikus biasa.

4. Perbincangan

Dalam kajian ini, tiga model inkubasi in vitro termasuk jus gastrik, jus usus, mikrobiota usus tikus normal dan CUS digunakan secara bebas dan berurutan untuk menyiasat profil metabolik gastrousus CTE.(ekstrak cistanche tubulosa)dalam vitro. Didapati bahawa glikosida PhGsand iridoid dalam CTE(ekstrak cistanche tubulosa)telah mudah dimetabolismekan kepada glikosida sekunder dan aglikon mereka oleh mikrobiota usus tikus kemurungan yang disebabkan oleh CUS. Selepas itu, metabolisme dalam vivo CTE(ekstrak cistanche tubulosa)dalam tikus normal danCUS juga telah disahkan. Laluan metabolik yang dicadangkan untuk CTE(ekstrak cistanche tubulosa)dalam tikus kemurungan yang sihat dan CUS ditunjukkan dalam Rajah 4. PhG, seperti echinacoside dan acteoside, telah dimetabolismekan kepada HT dan CA, dan CA menjalani metabolisme selanjutnya kepada metabolit mikrob utamanya, 3-HPP. HT, CA dan 3-HPP kemudiannya dimetabolismekan kepada metabolit tersulfat, metilasi dan metoksilasinya. Glikosida iridoid termasuk asid geniposidik, kankanoside A, dan kankanoside N telah dimetabolismekan kepada aglikonnya melalui deglikosilasi. Ini seterusnya menunjukkan bahawa PhG dan glikosida iridoid dalam CTE(ekstrak cistanche tubulosa)telah mudah dimetabolismekan kepada glikosida sekunder dan aglikon dalam tikus CUS. Metabolit ini biasanya mempamerkan penyerapan usus yang lebih baik dan bioavailabiliti untuk seterusnya diserap ke dalam darah untuk melakukan aktiviti biologi [16-18]. Perlu diingat bahawa pengisomeran adalah berleluasa untuk PhG dalam saluran gastrousus, metabolit yang berkaitan telah dikenal pasti selepas dibandingkan dengan masa pengekalan UPLC sebatian prototaip mereka berdasarkan profil kecerunan UPLC ideal yang dioptimumkan.

Asid kafeik adalah produk degradasi utama CTE(ekstrak cistanche tubulosa)oleh mikrobiota usus tikus patologi kemurungan. Penerbitan terdahulu melaporkan bahawa asid kafeik menghasilkan kesan seperti antidepresi dalam ujian renang paksa pada tikus. Kedua-dua tahap mRNA faktor neurotropik (BDNF) otak yang diperolehi dalam korteks hadapan dan tahap mRNA TrkB dalam theamygdala telah menurun dengan ketara selepas ujian renang paksa, dan pengurangan sebelumnya telah dihalang dengan ketara oleh asid kafeik [19]. Hidroksitirosol ialah aglikon PhGs, yang melindungi neurogenesis dan fungsi kognitif dengan menghalang penurunan regulasi protein saraf BDNF yang disebabkan oleh tekanan [20]. Oleh itu, adalah perlu untuk memberi lebih perhatian kepada beberapa metabolit bioaktif (iaitu, HT dan CA) yang diubah oleh mikrobiota usus selepas pemberian oral.

Di samping itu, penemuan semasa memberikan bukti bahawa dalam mikrobiota usus yang kemurungan, keupayaan metabolik untuk menghasilkan glikosida dan aglikon sekunder adalah lebih lemah daripada mikrobiota usus tikus yang tidak normal itu. Sebabnya mungkin disebabkan oleh perubahan struktur mikrobiota usus yang disebabkan oleh kemurungan, yang membawa kepada penurunan aktiviti enzim metabolik yang dihasilkan oleh mikrobiota usus [21]. Menariknya, kajian terdahulu menunjukkan bahawa filum Bacteroides mengekod gen glikosida hidrolase dan polisakarida liase yang paling banyak untuk hidrolisis glikosida dan pembelahan karbohidrat kompleks dengan mekanisme penyingkiran [22]. Khususnya, Bacteroides spp. termasuk B. caccae, B. dorei, B. finegoldii,B. fragilis, B. intestinalis, B. ovatus, B. thetaiotaomicron, B. uniformis, danB. xylanisolvens menunjukkan jumlah dominan gen yang mengekodGH dan PL. Parabacteroides distasonis juga mempunyai ciri-ciri yang sama [22]. Kajian terdahulu kami mengesahkan bahawa 28-rangsangan tekanan yang tidak dapat diramalkan secara kronik sehari telah mengurangkan kelimpahan relatif bagi genera Bacteroides, Parabacteroides, Butyricimonas dan Weissella, manakala, meningkatkan Ruminococcus dan Deinococcus dalam tikus [4]. Perlu diperhatikan bahawa Bacteroides dan Parabacteroides adalah dua takson mikrob yang paling banyak yang menyumbang kira-kira 20 peratus kelimpahan relatif dalam tikus biasa. Selepas rawatan CUS, kelimpahan relatifBacteroides dan Parabacteroides telah menurun secara mendadak kepada kira-kira 5 peratus dalam tikus model kemurungan. Oleh itu, ini pasti akan membawa kepada pengurangan jumlah enzim GH dan PL dalam tikus CUS, dan seterusnya mengganggu tindak balas deglycosylated oleh mikrobiota usus kemurungan CUS selepas pemberian CTE secara oral.(ekstrak cistanche tubulosa)dalam model tikus.

5. Kesimpulan

Dalam kajian ini, teknik UPLC-Q-TOF-MS telah ditubuhkan dan digunakan untuk menyaring dan mengenal pasti metabolitEkstrak tubulosa cistanchedalam tikus normal dan kemurungan CUS in vitro dan in vivo. Keputusan menunjukkan bahawa CTE(ekstrak cistanche tubulosa)telah dimetabolismekan kepada aglikon dan produk degradasi PhG dan glikosida iridoid oleh mikrobiota usus yang sihat dan tertekan. Selepas pentadbiran lisan CTE(ekstrak cistanche tubulosa), metabolit fasa II aglikon dan produk degradasi PhGs dan iridoidglycosides kebanyakannya ditemui dalam air kencing tikus. Keupayaan metabolik untuk menghasilkan glikosida sekunder dan aglikon dalam mikrobiota ratintestinal kemurungan adalah jauh lebih lemah daripada mikrobiota usus tikus biasa, yang dikaitkan dengan glikosidahidrolases bercelaru yang dihasilkan oleh mikrobiota usus dalam tikus tertekan CUS. Kajian ini memberikan perspektif baru untuk kemudiannya. pembangunan CTE(ekstrak cistanche tubulosa)sebagai antidepresan yang berpotensi.

Ucapan terima kasih

Kerja ini disokong oleh geran daripada Program Penyelidikan dan Pembangunan Utama Negara China (2017YFC1702400).

Lampiran A. Data tambahan

Data tambahan kepada artikel ini boleh didapati dalam talian di HTTPS://doi.org/10.1016/j.jchromb.2019.121728

Daripada: ' Metabolisme in vitro dan in vivo daripadaEkstrak cistanche tubulosadalam tikus kemurungan yang disebabkan oleh tekanan normal dan kronik yang tidak dapat diramalkan' olehYang Li, et al

--Jurnal Kromatografi B 1125 (2019) 121728

Rujukan

[1] Suruhanjaya Farmakope China, The Pharmacopeia of the People's Republic of China, 2015 ed., China Medical Science Press, Beijing, China, 2015, hlm. 135 Bahagian I.
[2] Y. Jiang, P.-F. Tu, Analisis juzuk kimia dalam spesies Cistanche, J. Chromatogr. 1216 (2009) 1970–1979.
[3] Z. Fu, X. Fan, X. Wang, X. Gao, Cistanches Herba: gambaran keseluruhan sifat kimia, farmakologi dan farmakokinetiknya, J. Ethnopharmacol. (2017), https://doi.org/10.1016/j.jep.2017.10.015.
[4] Y. Li, Y. Peng, P. Ma, H. Yang, H. Xiong, M. Wang, C. Peng, P. Tu, X. Li, Kesan seperti antidepresan daripadaEkstrak cistanche tubulosapada tikus tekanan kronik yang tidak dapat diramalkan melalui pemulihan homeostasis mikrobiota usus, Front. Pharmacol. (2018), https://doi.org/10.3389/fphar.2018.00967.
[5] JA Foster, MV Neufeld, paksi Gut-brain: bagaimana mikrobiom mempengaruhi kebimbangan dan kemurungan, Trends Neurosci. 36 (2013) 305–312.
[6] E. Sherwin, TG Dinan, JF Cryan, Perkembangan terkini dalam memahami peranan mikrobiota usus dalam kesihatan dan penyakit otak, Ann. NY Acad. Sci. 12 (2017) e0177977.
[7] Y. Meng, H. Jia, Z. Chao, Y. Yong, Z. Yang, M. Yang, Z. Zou, Variasi dalam mikrobiota usus dan fenotip metabolik tahi yang dikaitkan dengan kemurungan oleh penjujukan gen rRNA 16S dan LC/ Metabolomik berasaskan MS, J. Pharm. Berbiomed. dubur. 138 (2017) 231–239.

[8] JR Kelly, Y. Borre, BC O', E. Patterson, AS El, J. Deane, PJ Kennedy, S. Beers, K. Scott, G. Moloney, Memindahkan blues: mikrobiota usus yang berkaitan dengan kemurungan mendorong perubahan neurobehavioural pada tikus, J. Psychiatr. Res.. 82 (2016) 109–118.
[9] L. Yang, P. Ying, M. Wang, P. Tu, X. Li, Metabolisme gastrousus manusia ekstrak air Cistanches Herba in vitro: penjelasan profil metabolik berdasarkan pengenalan metabolit komprehensif dalam jus gastrik, usus. jus, bakteria usus manusia, dan mikrosom usus, J. Agric. Kimia Makanan. 65 (2017) 7447–7456.
[10] Y. Li, G. Zhou, S. Xing, P. Tu, X. Li, Pengenalpastian metabolit echinacoside yang dihasilkan oleh bakteria usus manusia menggunakan kromatografi cecair berprestasi ultra/spektrometri jisim masa penerbangan empat kali ganda, J. Agric. Kimia Makanan. 63 (2015) 6764–6771.
[11] Y. Li, G. Zhou, Y. Peng, P. Tu, X. Li, Pemeriksaan dan pengenalpastian tiga metabolit glikosida phenylethanoid tipikal daripada Cistanches Herba oleh bakteria usus manusia menggunakan UPLC/Q-TOF-MS, J. Pharm. Berbiomed. dubur. 118 (2016) 167–176.
[12] L. Yang, P. Ying, M. Wang, G. Zhou, Y. Zhang, X. Li, Pemeriksaan pantas dan pengenalpastian perbezaan antara metabolit Cistanche deserticola dan ekstrak air C. tubulosa dalam tikus oleh UPLC- Analisis pengecaman corak gabungan Q-TOF-MS, J. Pharm. Berbiomed. dubur. 131 (2016) 364–372.
[13] C. Q, P. Y, B. X, Z. W, C. L, L. X, Mencirikan secara sistematik metabolit echinacoside dan acteoside daripada Cistanche tubulosa dalam plasma tikus, hempedu, air kencing, dan najis berdasarkan UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Chromatogr. 30 (2016) 1406–1415.
[14] Y. Wang, H. Hao, G. Wang, P. Tu, Y. Jiang, Y. Liang, L. Dai, H. Yang, L. Lai, C. Zheng, Pendekatan untuk mengenal pasti metabolit berjujukan bagi glikosida fenilethanoid biasa, echinacoside, berdasarkan masa perangkap-ion kromatografi cecair
analisis spektrometri jisim penerbangan, Talanta 80 (2009) 572–580.
[15] C. Jia, H. Shi, W. Jin, K. Zhang, Y. Jiang, M. Zhao, P. Tu, Metabolisme echinacoside, antioksidan yang baik, dalam tikus: pengasingan dan pengenalpastian metabolit hempedunya, Metab Dadah. Dispos. 37 (2009) 431–438.
[16] J. Xu, HB Chen, SL Li, Memahami mekanisme molekul interaksi antara ubat-ubatan herba dan mikrobiota usus, Med. Res. Wahyu 37 (2017) 1140–1185.
[17] H. Liu, J. Yang, F. Du, X. Gao, X. Ma, Y. Huang, F. Xu, W. Niu, F. Wang, Y. Mao, Penyerapan dan pelupusan ginsenosides selepas oral pemberian ekstrak Panax notoginseng kepada tikus, Drug Metab. Dispos. 37 (2009) 2290–2298.
[18] JM Laparra, Y. Sanz, S. Schaffer, F. Visioli, Interaksi mikrobiota usus dengan komponen makanan berfungsi dan nutraseutikal, Pharmacol. Res. 61 (2010) 219–225.
[19] H. Takeda, M. Tsuji, T. Yamada, J. Masuya, K. Matsushita, M. Tahara, M. Iimori, T. Matsumiya, Asid kafeik melemahkan penurunan ekspresi mRNA BDNF kortikal yang disebabkan oleh pendedahan kepada paksaan. tekanan berenang pada tikus, Eur. J. Pharmacol. 534 (2006) 115–121.
[20] A. Zheng, L. Hao, C. Ke, X. Jie, Z. Xuan, L. Yuan, C. Cong, J. Liu, Z. Feng, Pentadbiran hidroksitirosol ibu meningkatkan neurogenesis dan fungsi kognitif dalam tekanan pranatal keturunan, J. Nutr. Biokim. 26 (2015) 190–199.
[21] H. Li, J. He, W. Jia, Pengaruh mikrobiota usus terhadap metabolisme dan ketoksikan dadah, Pendapat Pakar. Metab Dadah. Toksik. 12 (2016) 31.
[22] KA El, F. Armougom, JI Gordon, D. Raoult, B. Henrissat, Kelimpahan dan kepelbagaian enzim aktif karbohidrat dalam mikrobiota usus manusia, Nat. Mikrobiol Rev. 11 (2013) 497–504.