Pengenalpastian Dan Analisis Fungsi Bifavone Sebagai Perencat Novel Proses Atherogenik Berpotensi Reseptor Sementara Vanilloid 4-bergantung

Sila hubungioscar.xiao@wecistanche.comuntuk mengetahui lebih lanjut

Mazen O.Alharbi, Bidisha Dutta, RishovGoswami, Shweta Sharma, Kaye. Lei &Shaik O. Rahaman

Aterosklerosis, penyakit radang progresif arteri besar, merupakan penyumbang utama kepada peningkatan beban kematian dan morbiditi berkaitan penyakit kardiovaskular di seluruh dunia1. Peristiwa permulaan penting yang membawa kepada aterosklerosis melibatkan pengekalan zarah lipoprotein berketumpatan rendah (oxLDL) yang diubah suai dalam ruang intima aorta subendothelial terutamanya di titik cabang arteri2. Semasa aterogenesis awal, berikutan disfungsi endothelial, monosit darah yang beredar berpindah ke kawasan intima, dan membezakan ke dalam makrofaj tisu3. Dalam ruang intim aorta, pengikatan dan pengambilan oxLDL oleh makrofaj dibantu oleh reseptor pemulung seperti SRA dan CD36 mewujudkan gelung atero-radang suapan yang mengakibatkan perkembangan sel buih sarat lipid, proses kritikal dalam aterosklerosis2-8. Lata peristiwa keradangan yang dicetuskan oleh sel buih membawa kepada pembentukan coretan lemak awal dan akhirnya kemunculan lesi aterosklerosis lanjutan yang dicirikan oleh kehadiran topi berserabut, tisu terkalsifikasi, sel imun, protein matriks, dan lipid2-10. Potensi Penerima Sementara Vanilloid 4 (TRPV4) daripada subfamili TRPV, saluran kation polimod yang tidak selektif yang telap kepada Ca2 plus diungkapkan di mana-mana dalam pelbagai jenis sel termasuk makrofaj11–24. Sebelum ini dikenali sebagai osmosensor, TRPV4 kini dikenali untuk bertindak balas terhadap pelbagai rangsangan biokimia dan biomekanik termasuk haba, kekakuan matriks, osmolariti, faktor pertumbuhan, pH, dan 4 ester phorbol11–24. TRPV4 dilaporkan sebagai pengantara beberapa fungsi fisiologi seperti sensasi sakit dalam keradangan dan neuropati18,22,23, pembezaan dan migrasi myofibroblast 17,25,26, dan pembezaan osteoklas dalam tulang27. Mutasi TRPV4 telah dikaitkan dengan beberapa channelopathies28-31. Kajian terbaru oleh kumpulan kami dan yang lain telah melibatkan kemungkinan peranan saluran ini dalam pelbagai keadaan patologi seperti kecederaan paru-paru22,32, pembentukan sel buih14,16, fbrosis17,33 tisu, tindak balas badan asing13, dan kanser34,35. Sebelum ini, peranan ateroprotektif TRPV4 ditunjukkan, di mana fungsi TRPV4 yang disebabkan oleh agonis kimia dalam sel endothelial ditunjukkan dikaitkan dengan pengaktifan eNOS dan perencatan lekatan monosit ke sel endothelial36. Sebaliknya, kekurangan dalam fungsi TRPV4 telah dikaitkan dengan banyak tindak balas atheroinfammatory termasuk disfungsi endothelial, pengurangan penjanaan sel buih makrofaj, dan penyakit vaskular14,16,37-39. Makmal kami baru-baru ini telah mengenal pasti peranan proaterogenik TRPV4 di mana ia mengawal pembentukan sel buih makrofaj yang disebabkan oleh oxLDL. Secara mekanikal, kami menunjukkan bahawa TRPV4 mempengaruhi pengambilan tetapi tidak mengikat oxLDL dalam makrofaj dalam CD36-cara bebas14. Dalam kajian lain, kami melaporkan keterukan TRPV4-yang bergantung kepada pembentukan sel buih yang disebabkan oleh oxLDL dengan kehadiran lipopolysaccharide dan meningkatkan kekakuan matriks, sekali gus menyediakan hubungan antara penderiaan mekanis dan risiko aterosklerosis16. Dianggap bersama-sama, penemuan ini mencadangkan TRPV4 sebagai sasaran menarik dalam aterosklerosis dan penyakit lain, sekali gus memberi insentif kepada penemuan perencat molekul kecil TRPV4 yang boleh diterjemahkan ke dalam terapeutik yang berkesan secara klinikal. Penggunaan sebatian semula jadi dalam terapeutik telah mendapat perhatian, terutamanya didorong oleh keperluan untuk sebatian kos efektif dan bioserasi berbanding dengan ubat sintetik yang sedia ada. Sebatian semula jadi sepertiflavonoid, alkaloid,polifenol, dan kurkuminoid, menjejaskan penyakit kardiovaskular melalui pelbagai mekanisme seperti perencatanproinflamasiisyarat, pemekaan insulin dan penambahbaikan profil lipid darah dengan menyasarkan laluan AMPK, COX1/2, eNOS dan Nrf240–45. Kajian terkini oleh pelbagai kumpulan telah mengenal pasti dua flavonoid, berberine, dan apigenin, sebagai modulator berpotensi aktiviti TRPV446,47. Kami telah membangunkan dan menggunakan kaedah saringan separa tinggi pemprosesan untuk mengenal pasti antagonis berpotensi TRPV4 daripada perpustakaan sebatian semula jadi menggunakan Pembaca Plat Pengimejan Fluorometrik (FLIPR) berasaskan Ca2 ditambah ujian masuk. Di sini, kami melaporkan pengenalpastian dan analisis kefungsian Linkedin, flavon, sebagai perencat novel proses aterogenik yang bergantung kepada TRPV4-dalam makrofaj, sekali gus meletakkan asas untuk kajian lanjut tentang sebatian semula jadi ini sebagai anti-aterosklerotik kecil semula jadi. sebatian molekul. Linkedin telah dilaporkan untuk memaparkan neuroprotektif,anti-karsinogenik, dananti-radangperanan48,49. Kami melaporkan mekanisme tindakan Linkedin terhadap TRPV4 dalam penetapan pembentukan sel buih makrofaj menggunakan banyak ujian biokimia dan selular.

Sila klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

Bahan dan kaedah Kultur haiwan dan sel

Kami membeli tikus jenis liar C57BL/6 congenik (WT) daripada Charles River Laboratories (Wilmington, Massachusetts, Amerika Syarikat). Garis panduan Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Universiti Maryland telah diikuti untuk semua eksperimen haiwan dan pengarang mematuhi garis panduan ARRIVE. Untuk pengasingan makrofaj pemastautin murine (MRM) yang disebabkan oleh thioglycolate, lavage peritoneal dikumpul selepas 4 hari suntikan thioglycolate intraperitoneal, dan sel-sel dikekalkan dalam 10 peratus serum lembu janin (FBS) yang mengandungi DMEM7,14,16. Barisan sel makrofaj murine (RAW264.7), dan fibroblas dermal manusia (HDF) telah dibeli daripada ATCC (Manassas, VA), dan masing-masing dikultur dengan DMEM atau MEM (Gibco, Waltham, MA). Makrofaj terbitan sumsum tulang Murine (BMDM) telah dituai dari 6- hingga 7-tikus berumur seminggu, seperti yang diterangkan sebelum ini14,50,51. Secara ringkas, tulang paha daripada tikus WT dan TRPV4 KO telah dikumpulkan, dan sumsum tulang femur dikeluarkan dengan media DMEM lengkap dengan 10 peratus FBS. Sel-sel sumsum tulang yang digantung ditapis melalui penapis 70 µm (biosains BD), disentrifugasi, dan dikekalkan dalam medium DMEM ditambah dengan M-CSF (25 ng/mL) selama 7-8 hari pada 37 darjah untuk membolehkan pembezaan menjadi makrofaj.

Reagen

Linkedin dan GSK1016790A (GSK101) telah dibeli daripada Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), dan kit ujian FLIPR Kalsium 6 diperoleh daripada Peranti Molekul (Sunnyvale, CA). LDL asli manusia (VLDL) telah dibeli daripada Stemcell Technologies (Vancouver, Kanada). Kami mengeram LDL dengan 5 µM CuSO4 selama 12 jam pada 37 darjah untuk menyediakan LDL teroksida tembaga (oxLDL)7,14,16. Berlabel pewarna pendarfluor, DiI-oxLDL, dibeli daripada Invitrogen (Carlsbad, CA), dan MCSF daripada R&D (Minneapolis, MN). Antibodi untuk analisis FACS ialah: TRPV4 (Millipore; Burlington, MA), CD36 (R&D; Minneapolis, MN), TLR4, dan TLR6 (Novus Biologicals; Centennial, CO). Antibodi sekunder terkonjugasi PE adalah dari R&D (Minneapolis, MN), dan kawalan isotype terkonjugasi PE adalah dari BD (Franklin Lake, NJ). Untuk tindak balas rantai polimerase kuantitatif (qRT-PCR), kami menggunakan kit RNeasy dari QIAGEN (Redwood City, CA). Semua primer dibeli daripada Bio-Rad (Hercules, CA). Media kultur sel, produk berkaitan kultur sel, dan reagen western blot diperoleh daripada Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA).

Cistanche untuk anti-keletihan

Penyaringan separa tinggi throughput

Kami telah menjalankan saringan separa tinggi pemprosesan untuk antagonis Trpv4 daripada perpustakaan 2000 sebatian semula jadi (MSSP-2000, Johns Hopkins Chemcore) menggunakan ujian kemasukan kalsium berasaskan pembaca plat pengimejan fluorometrik (FLIPR)14,17. Kami mengenal pasti ginkgetin (GGT), sebagai antagonis novel kepada TRPV4. Penyaringan primer dan sekunder telah dilakukan dengan RAW264.7, HDF dan BMDM untuk menilai keupayaan Linkedin dan calon lain untuk menghalang TRPV4-terdapat Ca2 ditambah infux14,17. Sebagai kawalan, kami menggunakan A23187, kalsium ionofor, TRPV4 null BMDMs dan GSK219, antagonis TRPV4 terpilih17. Selepas saringan sekunder, kami mengenal pasti enam sebatian yang menunjukkan perencatan lebih daripada tiga kali ganda TRPV{19}}pengantaraan Ca2 ditambah kemasukan berbanding kawalan kenderaan. Linkedin dikenal pasti sebagai perencat aktiviti TRPV4 yang paling kuat. BMDM (5× 104 sel/telaga) telah disemai ke dalam bersalut kolagen (10 µg/ml) 96-plat hitam bahagian bawah yang jelas dan diinkubasi pada 37 darjah , 5 peratus CO2. Pada hari eksperimen, sel telah dimuatkan dengan pewarna kalsium 6 dalam HBSS, 20 mM HEPES, 2.5 mM probenecid dan diinkubasi selama 45 minit pada 37 darjah. Selepas pengeraman, sebatian perpustakaan telah ditambah kepada setiap telaga kepada kepekatan akhir 2 μM. Plat diinkubasi selama 45 minit lagi pada suhu 37 darjah. Kemasukan Ca2 ditambah disebabkan oleh penambahan 10 nM agonis TRPV4 GSK1016790A dalam sel prarawat kenderaan atau kompaun dan direkodkan dengan mengukur ΔF/F (Max-Min), seperti yang diterangkan sebelum ini17. Data ditunjukkan sebagai unit pendarfluor relatif (RFU).

Imunoblot

Makrofaj peritoneal yang ditimbulkan thioglycolate telah disemai dalam 10 peratus FBS yang mengandungi DMEM dan diinkubasi semalaman. Sel-sel yang tidak dipatuhi telah dibasuh, dan 1 peratus albumin serum lembu (BSA) yang mengandungi DMEM telah ditambah ke dalam pinggan dan diinkubasi selama 3 jam sebelum rawatan Linkedin. Untuk menentukan ekspresi CD36, TRPV4, TLR2, TLR4, TLR6, dan protein GAPDH lisat seluruh sel telah disediakan daripada sel yang dirawat semalaman dengan Linkedin (1 dan 5 µM) atau kenderaan dengan kehadiran atau ketiadaan oxLDL (25 µg/ml ). Untuk menentukan tahap ekspresi p-JNK dan JNK yang dicetuskan LPS, sel telah dirawat dengan Linkedin (5 dan 10 µM) selama 3 jam dan kemudian dirangsang dengan E. coli LPS selama 30 minit. Lisat sel keseluruhan disediakan daripada sel dua kali dibasuh (PBS sejuk ais) menggunakan penampan RIPA dengan koktel perencat protease tambahan (Thermo Scientific, MA). Tompok telah disiasat dengan arnab anti-TRPV4 (Alomone Lab, Jerusalem, Israel), anti-tikus CD36 (R&D, Minneapolis, MN), arnab anti-TLR4, arnab anti-TLR6, arnab anti-JNK, dan arnab anti-p- Antibodi utama JNK (Cell Signaling, Danvers, MA) diikuti oleh antibodi sekunder konjugasi HRP anti-arnab dan anti-tikus (R&D, Minneapolis, MN). Tompok telah dilucutkan dan disiasat semula dengan anti-GAPDH IgG (1:2000; Santa Cruz, Dallas, TX) untuk kawalan pemuatan.

Pembentukan sel buih.MRM yang dicetuskan thioglycolate telah disemai pada penutup kaca dalam plat 12 sumur dengan DMEM, 10 peratus FBS dan diinkubasi pada 37 darjah, 5 peratus CO2 selama 2 jam. GGT (1 atau 10 μM) telah ditambah ke dalam sel, dan selepas 3 jam pengeraman, oxLDL (50 μg/ml) ditambah, dan kultur diinkubasi semalaman pada 37 darjah . LDL asli (50 ug/ml) telah ditambah untuk mengawal telaga kumpulan dan diinkubasi semalaman. Sel telah ditetapkan dalam 4 peratus paraformaldehid diikuti dengan pewarnaan Minyak Merah O untuk mengukur penjanaan sel buih.

Transduksi vektor adenovirus.Kami mengumpul binaan Adenovirus untuk menyatakan Ad(RGD)-tetikus TRPV4 (Ade-TRPV4; ~1010 pfu/ml), dan vektor kosong adenovirus, Ad(RGD)-CMV-null (Ade-Vec; 1011 pfu/ml), daripada Vektor Biolabs, Malvern, PA. Kami menggunakan 1× 108 pfu/ml untuk semua eksperimen. Untuk kajian penjanaan sel buih, makrofaj peritoneal tikus diinkubasi dengan Ade-TRPV4 atau Ade-Vec dalam media DMEM selama 72 jam sebelum penambahan oxLDL untuk menghasilkan sel buih makrofaj.

Pengikatan dan pengambilan ox-LDL.Untuk menilai pengikatan, makrofaj peritoneal dirawat dengan dua dos (1 atau 10 μM) Linkedin atau kenderaan selama 3 jam dan diinkubasi dengan DiI-oxLDL pada 4 darjah selama satu jam. Selepas pra-rawatan dengan Linkedin atau kenderaan, sel diinkubasi dengan DiI-oxLDL pada 37 darjah selama 30 minit untuk menilai pengambilan. Imej telah ditangkap oleh mikroskop pendarfluor (63x), dan Imej J digunakan untuk mengukur keputusan.

Analisis sitometri aliran.Makrofaj peritoneal yang ditimbulkan Thioglycolate telah dibiakkan dalam DMEM, 10 peratus FBS selama 24 jam. Sel yang tidak dipatuhi telah dibasuh, medium bebas serum ditambah, dan sel diinkubasi selama 2 jam diikuti dengan penambahan 5 µM GGT atau kenderaan, dan pengeraman diteruskan selama 3 jam. Sel yang dirawat telah dikikis dari plat dan digantung semula dalam PBS, 2 peratus BSA. Sel-sel telah diinkubasi dengan antibodi primer selama 45 minit diikuti dengan inkubasi 30 minit dengan antibodi sekunder terkonjugasi PE. Sitometer aliran FACSCantoII (BD Bioscience, Ontario, Kanada) telah digunakan untuk memperoleh data. Semua data telah diproses menggunakan perisian FlowJo.

qRT‑PCR.Makrofaj yang disebabkan oleh thioglycolate dirawat dengan 5 µM Linkedin atau kenderaan selama 3 jam; 25 µg/ ml oxLDL telah ditambahkan pada kenderaan atau sel yang dirawat Linkedin, dan pengeraman diteruskan semalaman. Kit Mikro RNeasy (#74,004) daripada QIAGEN telah digunakan untuk mengekstrak jumlah RNA, dan Kit Satu Langkah Hijau SYBR Universal daripada Bio-Rad telah digunakan untuk membalikkan transkripsi RNA. A C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad) telah digunakan untuk memperoleh data. Ekspresi gen ditentukan sebagai jumlah mRNA khusus gen berbanding mRNA GAPDH menggunakan kaedah CT perbandingan yang diterangkan dalam buletin pengguna sistem Bio-Rad qRT-PCR.

Analisis statistik.Data dibentangkan sebagai min ± SEM bagi tiga kali ganda biologi. Perisian GraphPad Prism 7.0 telah digunakan dan pengiraan telah dijalankan menggunakan ujian-t Pelajar untuk dua kumpulan atau ANOVA sehala untuk berbilang kumpulan.

Kelulusan etika.Semua eksperimen ke atas tikus telah dijalankan mengikut garis panduan Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi (IACUC) dan telah diluluskan oleh Jawatankuasa Semakan Taman Universiti Maryland‐College.

Keputusan in Semi high‑throughput screening for antagonists of TRPV4 from a library of natural compounds using a FLIPR‑based Ca2+ influx assay. A library containing a collection of structurally and functionally known natural compounds was screened using a semi high-throughput FLIPR-based Ca2+ influx assay (Fig. 1A) to investigate the modulatory effect of these compounds on TRPV4-elicited Ca2+ influx. Initial screening performed with 2000 compounds on primary human dermal fibroblasts and RAW264.7 cells identified 76 lead compounds that significantly (≥threefold) inhibited GSK101-induced (a TRPV4 specific agonist) Ca2+ influx. We performed a secondary screening of the lead compounds using the same assay on RAW 264.7 cells. We further verified and selected 6 compounds that produced reproducible and significant (>tiga kali ganda; hlm<0.001) inhibition="" of="" trpv4-elicited="" ca2+="" influx="" in="" bmdms="" as="" compared="" to="" the="" vehicle="" control="" (fig.="" 1b).="" our="" screening="" assay="" proved="" to="" be="" a="" high="" confidence="" assay="" for="" detecting="" small="" molecule="" compounds="" with="" trpv4="" inhibitory="" effects="" as="" reflected="" by="" a="" good="" z="" factor="" value="" (0.703).="" we="" have="" used="" a23187="" (a23),="" a="" calcium="" ionophore,="" as="" the="" positive="" control,="" and="" gsk2193874="" (gsk219),="" a="" selective="" small-molecule="" chemical="" inhibitor="" of="" trpv4,="" as="" the="" negative="" control14–17.="" linkedin="" (ggt)="" was="" identified="" as="" one="" of="" the="" most="" potent="" inhibitors="" of="" trpv4="" in="" the="" screening.="" since="" previously="" published="" reports="" showed="" that="" ggt="" has="" an="" anti-inflammatory="" and="" anti-adipogenic="" effect,="" we="" selected="" ggt="" for="" further="" functional="" analysis="" on="" trpv4-dependent="" macrophage="" proatherogenic="">

Rajah 1. Pengenalpastian berasaskan penapisan separa tinggi bagi Linkedin sebagai perencat TRPV4 novel daripada perpustakaan sebatian semula jadi. (A) Carta aliran menunjukkan aliran kerja yang menghasilkan pengenalpastian ginkgetin sebagai perencat TRPV4 yang berpotensi daripada perpustakaan 2000 sebatian semula jadi. (B) Representative FlexStation 3 rakaman menunjukkan kesan perencatan 6 sebatian semula jadi pada TRPV4 agonis (GSK1016790A)-induced Ca2 ditambah kemasukan dalam BMDM yang dimuatkan dengan pewarna kalsium 6 semasa pemeriksaan sekunder. Prarawatan dengan kesemua 6 sebatian menunjukkan kesan perencatan pada kemasukan Ca2 campur TRPV{15}}bergantung berbanding sel yang dirawat dengan kenderaan (kawalan negatif; kenderaan ditambah GSK1016790A (10 nM)) atau kalsium ionofor (A23187, 2 μM). Kami menggunakan antagonis TRPV4 terpilih, GSK2193874 (10 nM), sebagai kawalan negatif. Semua eksperimen diulang tiga kali dalam empat kali ganda. RFU: unit pendarfluor relatif.

Perencatan TRPV4 oleh GGT membatalkan pembentukan sel buih makrofaj yang disebabkan oleh oxLDL.Kajian terdahulu kami menunjukkan bahawa TRPV4-menimbulkan kemasukan Ca2 ditambah terlibat dalam pembentukan sel buih pengantara oxLDL 14,16. Oleh itu, kami menilai kemungkinan pembentukan sel buih dihalang oleh antagonisasi pengantaraan GGT terhadap aktiviti TRPV4. Makrofaj peritoneal murine jenis liar diinkubasi dengan oxLDL untuk mendorong pembentukan sel buih dengan kehadiran atau ketiadaan GGT, dan dianalisis dengan pewarnaan Minyak Merah O. Seperti yang dijangkakan, kami mendapati bahawa penjanaan sel buih meningkat lima kali ganda dalam makrofaj yang dirawat oxLDL berbanding dengan LDL asli (Rajah 2A, B). Walau bagaimanapun, rawatan makrofaj dengan GGT (1 atau 10 µM) sebelum rangsangan dengan oxLDL dengan ketara mengurangkan peratusan sel buih (Rajah 2A, B). Secara kolektif, penemuan ini mencadangkan kesan perencatan GGT pada pembentukan sel buih makrofaj yang mungkin menyasarkan TRPV{12}}yang ditimbulkan Ca2 ditambah kemasukan. Tambahan pula, kami mengekspresikan TRPV4 secara berlebihan dalam makrofaj null TRPV4 dengan menggunakan konstruk adenovirus dan kemudian mendorong pembentukan sel buih dengan menggunakan oxLDL dengan kehadiran GGT. Kami mendapati bahawa ekspresi berlebihan TRPV4 meningkatkan pembentukan sel buih yang disekat apabila kami merawat sel dengan GGT, menunjukkan bahawa perencatan pembentukan sel buih proaterogenik oleh GGT adalah bergantung kepada TRPV4 (Rajah 2C, D).

GGT tidak menyekat tahap asas ekspresi TRPV4 dan reseptor keradangan.Reseptor Scavenger CD36 memainkan peranan utama dalam pengambilan dan pengikatan oxLDL, dan pembentukan sel buih, proses kritikal dalam aterosklerosis4-7,54,55. Baru-baru ini, semakin banyak bukti menunjukkan penglibatan reseptor seperti tol dalam aterosklerosis2,4,56. Untuk menyiasat sama ada GGT menyekat pembentukan sel buih melalui mempengaruhi ekspresi CD36, TLR4, TLR6, dan TRPV4, kami melakukan analisis imunoblot pada dua kepekatan GGT (1 atau 5 µM). Kami mendapati tahap ekspresi serupa CD36, TRPV4, TLR6, dan TLR4 berbanding kawalan yang tidak dirawat (Rajah 3A–D). Analisis sitometri aliran juga mendedahkan tiada perbezaan yang ketara dalam ekspresi permukaan sel protein dengan atau tanpa rawatan GGT (Rajah 3E-H, I-L). Memandangkan semua bersama-sama, keputusan ini menunjukkan bahawa GGT menyekat pembentukan sel buih makrofaj tanpa menghalang tahap asas ekspresi permukaan TRPV4, CD36, TLR4, dan TLR6.

Rajah 2. Perencatan TRPV4 oleh Linkedin membatalkan pembentukan sel buih makrofaj yang disebabkan oleh oxLDL. (A) Makrofaj peritoneal murine yang disebabkan oleh Thioglycolate dirawat semalaman dengan 50 µg/ml oxLDL, diikuti dengan prainkubasi 3 jam dengan kenderaan atau 1 atau 10 µM Linkedin. Sel telah dirawat dengan 50 µg/mL LDL asli (VLDL) sebagai kawalan. Pembesaran asal: 40x. (B) Kuantifikasi keputusan ditunjukkan dalam (A). n{10}} sel/keadaan. ujian-t pelajar; ***hlm<0.001. data="" represent±sem.="" (c)="" trpv4="" ko="" rpms="" were="" transduced="" with="" either="" ade-vec="" or="" ade-trpv4="" and="" were="" untreated="" or="" treated="" with="" ggt="" in="" the="" presence="" of="" oxldl="" for="" 16="" h="" on="" day="" 5="" of="" transduction="" for="" macrophage="" foam="" cell="" formation.="" (d)="" quantification="" of="" the="" results="" shown="" in="" c.="" n="100" cells/condition.="" student's="" t-test;=""><>

Pengambilan oxLDL, tetapi tidak mengikat oleh makrofaj ditindas oleh GGT. Oleh kerana TRPV4 sebelum ini telah ditunjukkan mempunyai peranan dalam pengambilan oxLDL dan pembentukan sel buih14, 16, kami menilai sama ada rawatan dengan GGT menyebabkan kemerosotan dalam pengikatan oxLDL pada permukaan makrofaj. Makrofaj peritoneal WT telah dirawat dengan GGT sebelum inkubasi dengan DiI-oxLDL pada 4 darjah, dan pengikatan dinilai. Keputusan menunjukkan bahawa pengikatan oxLDL pada permukaan makrofaj tidak terjejas dengan ketara oleh rawatan GGT (1 atau 10 µM) berbanding kawalan kenderaan (Rajah 5A–C). Setelah menetapkan bahawa GGT tidak menghalang pengikatan oxLDL, kami seterusnya bertujuan untuk menentukan sama ada pengambilan oxLDL dalam makrofaj telah terjejas oleh rawatan GGT. Menariknya, keputusan kami menunjukkan bahawa terdapat perencatan yang ketara dalam pengambilan oxLDL dalam makrofaj dalam sel prarawatan GGT berbanding kumpulan yang dirawat kenderaan (Rajah 6A, B). Dengan mengambil kira kesemuanya, keputusan ini menunjukkan bahawa GGT menyekat pengambilan oxLDL, tetapi tidak mengikat, dalam makrofaj.

GGT menyekat ekspresi TRPV4 yang disebabkan oleh oxLDL dalam makrofaj.

Oleh kerana kajian kami yang diterbitkan sebelum ini menunjukkan bahawa TRPV4-menimbulkan Ca2 plus memainkan peranan dalam pembentukan sel buih makrofaj yang dimediasi oxLDL14,16, kami berusaha untuk menentukan sama ada GGT menyekat pembentukan sel buih melalui penindasan ekspresi CD36 yang disebabkan oleh oxLDL, TLR2, TLR4, TLR6 atau TRPV4. Kami mendapati bahawa rangsangan semalaman makrofaj dengan oxLDL mengakibatkan peningkatan ketara ekspresi protein TRPV4 berbanding LDL, manakala ekspresi reseptor lain (CD36, TLR2, TLR4, dan TLR6) kekal tidak berubah (Rajah 4A–F). Prarawatan sel dengan GGT sebelum rangsangan dengan oxLDL secara selektif menurunkan tahap ekspresi protein TRPV4 berbanding dengan rawatan kenderaan (Rajah 4A–F). Secara kolektif, penemuan ini mencadangkan kesan perencatan GGT pada ekspresi protein TRPV4, yang mungkin sebahagiannya terlibat dalam penindasan pembentukan sel buih oleh GGT.

Rajah 3. Rawatan Linkedin tidak mengubah jumlah protein atau ekspresi permukaan TRPV4, CD36, dan TLR dalam makrofaj. (A–D) Imunoblot makrofaj lisat seluruh sel selepas rawatan semalaman dengan 1 atau 5 µM Linkedin atau kenderaan. Imunoblot perwakilan menunjukkan jumlah ekspresi protein CD36 (A), TRPV4 (B), TLR6 (C), dan TLR4 (D) dalam sel yang dirawat dan tidak dirawat Linkedin. Tiga replika biologi bebas dan 3 ulangan eksperimen untuk setiap set eksperimen telah dilakukan. (E-H) Analisis sitometrik aliran makrofaj yang dirawat semalaman dengan 5 µM Linkedin atau tidak dirawat menunjukkan ekspresi permukaan TRPV4 (E), CD36 (F), TLR4 (G), dan TLR6 (G) dalam sel yang tidak dirawat dan dirawat Linkedin. Tiga replika biologi bebas dan 30,000 sel bagi setiap keadaan telah dianalisis. (I–L) Analisis kuantitatif keputusan daripada (E–H). Dianalisis dengan ujian-t Dua ekor dengan selang keyakinan 99 peratus. Sel dikira setiap percubaan, 30,000; dua ulangan eksperimen.

GGT menyekat pengaktifan dan keradangan JNK2 proaterogenik dalam makrofaj. Laporan yang diterbitkan daripada makmal kami dan yang lain telah menunjukkan bahawa pengaktifan JNK2 memainkan peranan penting dalam pembentukan sel buih dan aterosklerosis7,57. Untuk menentukan sama ada GGT boleh menghalang pengaktifan JNK1/2, makrofaj dirawat dengan GGT diikuti dengan rangsangan dengan LPS atau oxLDL. Keputusan daripada analisis imunoblot menunjukkan bahawa rawatan dengan GGT menekan dengan ketara fosforilasi oxLDL- atau LPS yang disebabkan oleh JNK1/2 berbanding kawalan yang tidak dirawat atau dirawat LDL asli (Rajah 7A–D). Telah ditunjukkan bahawa pengaktifan JNK dalam makrofaj mendorong transkripsi mediator proinflamasi yang dikaitkan dengan aterosklerosis58-60. Untuk menentukan sama ada GGT berpotensi menyekat ekspresi pengawal selia proinflamasi ini dalam makrofaj, sel prarawatan GGT telah dirangsang dengan oxLDL, dan tahap ekspresi mRNA TNF, IL 6, IL12, IL1 dan MCP1 dikira oleh analisis qRT-PCR. Kami mengesan penurunan regulasi yang ketara dalam tahap ekspresi yang disebabkan oleh oxLDL bagi mRNA TNF , IL12, IL1 dan MCP1 dalam sel yang dirawat GGT berbanding dengan kawalan yang dirawat kenderaan (Rajah 7E–I). Diambil bersama, keputusan ini menunjukkan bahawa GGT menyekat pengaktifan JNK2 proaterogenik dan ekspresi gen keradangan sebagai tindak balas kepada rangsangan oxLDL dalam makrofaj. Perbincangan Sebatian semula jadi seperti flavonoid dan polifenol diketahui memodulasi tindak balas kardiovaskular melalui pelbagai mekanisme, seperti perencatan isyarat proinflamasi, pemekaan insulin, status oksidatif, dan penambahbaikan profil lipid darah40–45. Di sini, kami melaporkan pengenalpastian berasaskan penapisan separa tinggi dan pencirian fungsi Linkedin, sebuah flavon, sebagai perencat novel proses gen/radang Prothero yang bergantung kepada TRPV{32}} dalam makrofaj. Kami secara khusus menunjukkan bahawa i) ginkgetin menyekat TRPV4-mengantarai Ca2 ditambah kemasukan ke dalam makrofaj, ii) sekatan ginkgetin bagi fungsi TRPV4 telah menurunkan dengan ketara pembentukan sel buih yang disebabkan oleh oxLDL dengan menyekat pengambilan oxLDL dalam makrofaj, dan iii) blok ginkgetin Fosforilasi JNK1/2 yang disebabkan oleh LPS dan oxLDL, ekspresi protein TRPV4, dan ekspresi gen radang. Secara agregat, hasil kajian kami menunjukkan bahawa ginkgetin menghalang fungsi makrofaj proaterogenik/radang dalam cara bergantung4-TRPV. Aterosklerosis, penyakit aorta, pada mulanya didorong oleh keradangan dan pembengkakan makrofaj dengan oxLDL, mendorong pembentukan sel buih makrofaj, yang kemudiannya berkembang menjadi ateroma2-10. Memandangkan pembentukan sel buih adalah proses kritikal dalam aterogenesis, pemahaman dan memanipulasi pembentukan sel buih boleh mempunyai potensi terapeutik. Makrofaj diketahui mengekspresikan pelbagai saluran ion dan pam yang menembusi membran, termasuk TRPV4, polimodal mekanosensitif Ca2 ditambah saluran ion telap, yang diaktifkan oleh rangsangan fizikal dan biokimia11–24. Kajian yang diterbitkan oleh makmal kami dan yang lain telah mengenal pasti peranan TRPV4 dalam keradangan makrofaj dan pembentukan sel buih yang disebabkan oleh oxLDL14–16,26. Oleh itu, TRPV4 boleh berfungsi sebagai sasaran yang berdaya maju untuk pengecilan proses proaterogenik.

Rajah 5. Linkedin tidak menyekat pengikatan DiI-oxLDL kepada makrofaj. Makrofaj telah dirawat terlebih dahulu dengan kenderaan atau Linkedin (1 atau 10 µM) selama 3 jam diikuti dengan pengeraman dengan oxLDL berlabel DiI (2.5 µg/mL) selama 1 jam pada 4 darjah . (A) Imej mikroskopik pendarfluor perwakilan (pembesaran asal, 63×) pengikatan DiI-oxLDL pada permukaan membran makrofaj (n=20 sel/keadaan). (B) Keputusan daripada eksperimen A ditunjukkan sebagai profil plot menggunakan perisian NIH ImageJ. (C) Analisis kuantitatif hasil daripada A. n{13}} sel/keadaan. dalam meningkatkan aterosklerosis dengan mengurangkan MMP-2 dan MMP-9 dan meningkatkan tahap NO dan NOS dalam aorta toraks tikus52. Dalam kajian ini, kami menunjukkan bahawa ginkgetin menyekat TRPV{17}}menimbulkan kemasukan Ca2 campur dalam makrofaj. Secara mekanikal, kami menunjukkan bahawa ginkgetin menyekat pengambilan oxLDL, tetapi tidak mengikat, dalam makrofaj. Kajian yang dilakukan secara in vivo dan in vitro mencadangkan peranan kritikal CD36 sebagai reseptor pemulung utama dalam pengambilan oxLDL dan pembentukan sel buih makrofaj2-7. Telah ditunjukkan bahawa tikus null CD36 yang kekurangan ApoE atau LDLR kurang terdedah kepada lesi aterosklerotik5,6. Kajian terdahulu daripada kumpulan kami mengenal pasti peranan penting CD36-Lata isyarat JNK dalam pembentukan sel buih makrofaj7. Reseptor seperti tol TLR2, TLR4, dan TLR6 bertindak sebagai coreceptors dengan berinteraksi dengan CD36 dan telah terbukti terlibat dalam atherogenesis2,56,63. Kami mengkaji kemungkinan kekurangan pembentukan sel buih yang dilihat dalam makrofaj yang dirawat Linkedin adalah disebabkan oleh penurunan ekspresi protein CD36, TRPV4, TLR2, TLR4, atau TLR6. Menariknya, rawatan Linkedin tidak mengurangkan ekspresi protein CD36, TLR2, TLR4, atau TLR6 dengan ketara pada tahap basal atau di bawah keadaan yang dirangsang oxLDL. Walau bagaimanapun, Linkedin secara khusus menyekat regulasi ekspresi protein TRPV4 yang disebabkan oleh oxLDL, manakala ekspresinya pada tahap basal kekal tidak berubah. Dengan mengambil kira kesemuanya, keputusan ini menunjukkan bahawa ginkgetin menyekat pembentukan sel buih yang disebabkan oleh oxLDL melalui mekanisme yang bebas daripada ekspresi CD36 dan TLR, tetapi bergantung kepada TRPV4. Kajian terdahulu dari kumpulan kami dan yang lain menunjukkan bahawa pengaktifan JNK2 terlibat dalam pembentukan sel buih dan perkembangan lesi aterosklerotik7,57. Telah juga dilaporkan bahawa JNK terlibat dalam modulasi MMP-9 dan MMP-13, yang terlalu tertekan dalam lesi aterosklerotik64–68. Memandangkan pautan JNK yang diiktiraf dalam proses aterogenik, kami ingin menentukan sama ada ginkgetin boleh menghalang pengaktifan JNK. Selaras dengan laporan terdahulu, keputusan kami juga menunjukkan bahawa ginkgetin menyekat fosforilasi JNK2 yang disebabkan oleh rangsangan radang dalam makrofaj. Keputusan ini mencadangkan mekanisme yang mungkin di mana Linkedin menyekat pembentukan sel buih. Tambahan pula, kami mendapati penurunan regulasi yang ketara dalam ekspresi TNF, IL12, IL1, dan MCP1 yang disebabkan oleh oxLDL dalam sel yang dirawat ginkgetin berbanding kawalan kenderaan, yang menonjolkan potensi peranan anti-radang ginkgetin sebagai tindak balas kepada oxLDL. Ringkasnya, keputusan kami menunjukkan bahawa ginkgetin menghalang fungsi makrofaj proaterogenik dan keradangan dalam cara bergantung4-TRPV. Penemuan ini dengan itu mengukuhkan rasional untuk penggunaan sebatian semula jadi dalam pembangunan terapeutik yang berpotensi dan/atau reagen kemopreventif.

Rujukan
1. Barquera, S. et al. Tinjauan global mengenai epidemiologi penyakit kardiovaskular aterosklerotik. Gerbang. Med. Res. 46, 328–338 (2015).
2. Moore, KJ & Tabas, I. Biologi selular makrofaj dalam aterosklerosis. Sel 145, 341–355 (2011).
3. Libby, P. Keradangan dalam aterosklerosis. Alam 407, 233–241 (2002).
4. McLaren, JE, Michae, DR, Ashlin, TG & Ramji, DP Sitokin, metabolisme lipid makrofaj dan sel buih: implikasi untuk terapi penyakit kardiovaskular. Prog. Lipid Res. 50, 331–347 (2011).
5. Febbraio, M. et al. Gangguan yang disasarkan terhadap reseptor pemulung kelas B CD36 melindungi daripada perkembangan lesi aterosklerotik pada tikus. J. Clin. melabur. 105, 1049–1056 (2000).
6. Kunjathoor, VV et al. Reseptor Scavenger kelas AI/II dan CD36 adalah reseptor utama yang bertanggungjawab untuk pengambilan lipoprotein berketumpatan rendah yang diubah suai yang membawa kepada pemuatan lipid dalam makrofaj. J. Biol. Kimia. 277, 49982–49988 (2002).
7. Rahaman, SO et al. Lata isyarat bergantung{1}}CD diperlukan untuk pembentukan sel buih makrofaj. Metab Sel. 4, 211–221 (2006).
8. Ross, R. Atherosclerosis-penyakit radang. N Engl J Med. 340(2), 115–126 (1999).
9. Libby P. Mekanisme molekul komplikasi trombotik aterosklerosis. J. Pelatih. Med. 517–527, 2008.
10. Lusis, AJ Atherosclerosis. Alam 407, 233–241 (2000).
11. Matthews, BD et al. Pengaktifan ultra-pantas saluran ion TRPV4 oleh daya mekanikal yang digunakan pada integrin beta1 permukaan sel. Integer. biol. (Camb). 2(9), 435–442 (2010).
12. Sharma, S., Goswami, R. & Rahaman, SO Te TRPV4-paksi isyarat mekanotransduksi TAZ dalam kekakuan matriks- dan TGF 1-peralihan epitelium-mesenchymal teraruh. Sel Mol. Bioeng.12, 139–152 (2019).
13. Goswami, R., Arya, RK, Biswas, D., Zhu, X. & Rahaman, SO Potensi reseptor sementara vanilloid 4 diperlukan untuk tindak balas badan asing dan pembentukan sel gergasi. Am. J. Pathol. 189(8), 1505–1512 (2019).
14. Goswami, R. et al. Saluran telap kalsium TRPV4 ialah pengawal selia baru pembentukan sel buih makrofaj yang disebabkan oleh LDL teroksida. Radic Percuma. biol. Med. 110, 142–150 (2017).