Hypoxic Mesenchymal Stem Cell-derived Extracellular Vesicles Memperbaiki Fbrosis Renal Selepas Iskemia–reperfusion Cedera Dengan Memulihkan Pengoksidaan Asid Lemak Berantara CPT1A

Abstrak

1. Latar belakang

Fibrosis buah pinggang adalah proses patologi biasa penyakit buah pinggang kronik yang disebabkan oleh pelbagai faktor. Prarawatan hipoksik sel stem mesenchymal boleh meningkatkan keberkesanan vesikel ekstraselular yang dirembeskan (MSC-EVs) dalam pelbagai penyakit, tetapi tidak jelas sama ada ia boleh memperbaiki fibrosis buah pinggang dengan lebih baik. Penyelidikan terkini menunjukkan bahawa pemulihan pengoksidaan asid lemak (FAO) boleh mengurangkan fibrosis buah pinggang. Dalam kajian ini, kami bertujuan untuk mengkaji sama ada prarawatan hipoksik dengan vesikel ekstraselular MSC (Hypo-EVs) boleh meningkatkan FAO untuk memulihkan fibrosis buah pinggang dan menyiasat mekanisme asas.

2. Kaedah

Hypo-EVs telah diasingkan daripada MSC (hP-MSC) yang diperoleh daripada plasenta manusia yang telah dirawat hipoksia, dan Norm-EV telah diasingkan daripada hP-MSC yang dibiakkan dalam keadaan biasa. Kami menggunakan model fibrosis buah pinggang yang disebabkan oleh iskemia-reperfusi (I / R) dalam vivo. Tikus telah disuntik dengan PBS, Hypo-EV, atau Norm-EV sejurus selepas pembedahan dan hari 1 selepas pembedahan. Fungsi buah pinggang, patologi buah pinggang, dan fibrosis buah pinggang dinilai untuk penilaian kerosakan buah pinggang. Untuk penerokaan mekanistik, pengoksidaan asid lemak (FAO), perubahan morfologi mitokondria, pengeluaran ATP, dan protein jisim mitokondria dikesan dalam vivo. Potensi membran mitokondria dan pengeluaran spesies oksigen reaktif (ROS) telah disiasat secara in vitro.

3. Keputusan

Kami mendapati bahawa Hypo-EV memberikan kesan terapeutik yang unggul pada pemulihan kerosakan struktur buah pinggang, pemulihan fungsi buah pinggang, dan pengurangan fibrosis buah pinggang. Sementara itu, Hypo-EV meningkatkan FAO mitokondria dalam buah pinggang dengan memulihkan ekspresi enzim pengehad kadar kunci FAO carnitine palmitoyl-transferase 1A (CPT1A). Secara mekanikal, penambahbaikan homeostasis mitokondria, yang dicirikan oleh struktur mitokondria yang diperbaiki, pemulihan jisim mitokondria dan pengeluaran ATP, perencatan tekanan oksidatif, dan peningkatan potensi membran mitokondria, sebahagiannya menerangkan kesan Hypo-EV pada meningkatkan FAO mitokondria dan dengan itu melemahkan I/ R kerosakan.

4. Kesimpulan

Hypo-EVs menindas fibrosis buah pinggang dengan memulihkan FAO mitokondria yang dimediasi CPT1A, yang kesannya boleh dicapai melalui peraturan homeostasis mitokondria. Penemuan kami menyediakan sokongan mekanisme lanjut untuk pembangunan terapi bebas sel untuk fibrosis buah pinggang.

5. Kata kunci

Sel stem mesenchymal, Hipoksik, Vesikel ekstraselular, Mitokondria, Pengoksidaan asid lemak, Fibrosis buah pinggang.

Klik di sini untuk membeli suplemen Cistanche

pengenalan

Penyakit buah pinggang kronik (CKD) adalah penyakit teruk yang mengancam kesihatan manusia dan juga merupakan isu awam global yang penting. Insiden global, kelaziman, dan kematian CKD adalah ketara, dan meningkat, dan kelaziman adalah kira-kira 10 peratus di kalangan orang dewasa di seluruh dunia [1, 2]. Kecederaan iskemia-reperfusi (I/R) buah pinggang dikaitkan dengan fibrosis buah pinggang dan CKD progresif [3, 4]. Fibrosis buah pinggang dianggap sebagai proses patologi biasa yang membawa kepada CKD dan penyakit buah pinggang peringkat akhir. Walau bagaimanapun, pada masa ini tiada terapi berkesan yang berjaya mencegah atau membalikkan fibrosis [5].

Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles (MSC-EVs) telah dilaporkan memainkan peranan regeneratif dan antifibrotik dalam beberapa model praklinikal CKD [6-9]. Walau bagaimanapun, hasil rendah MSC-EV adalah faktor pengehad untuk pengeluaran terapi bebas sel secara besar-besaran [10]. Prasyarat hipoksia merangsang aktiviti paracrine MSC dan meningkatkan fungsi dan pengeluaran EV dan dianggap sebagai pendekatan kejuruteraan untuk meningkatkan potensi terapeutik EV [11, 12]. Satu kajian baru-baru ini menunjukkan bahawa MSC prasyarat hipoksia lebih penting daripada MSC yang tidak dirawat dalam mencegah fibrosis dan keradangan buah pinggang [13]. Walau bagaimanapun, peranan EV yang berasal dari MSC yang diprasyaratkan hipoksia dalam fibrosis buah pinggang masih belum ditubuhkan.

Mekanisme patologi fibrosis buah pinggang telah dikaji semula dalam banyak kajian baru-baru ini [14-16], terutamanya dalam bidang peraturan metabolik [17]. Adalah diketahui bahawa sel tubular proksimal (PTC) adalah sel yang paling memerlukan tenaga dalam buah pinggang dan memainkan peranan penting dalam perkembangan fibrosis tubulointerstitial [18, 19]. Pengoksidaan asid lemak (FAO) ialah sumber tenaga utama PTC [19, 20]. Keputusan kajian transkrip genom luas menunjukkan bahawa ekspresi enzim metabolik utama yang berkaitan dengan FAO dan pengawal selia transkripsi telah menurun dengan ketara dalam model manusia dan tetikus dengan fibrosis tubulointerstitial [20]. Di samping itu, memulihkan metabolisme asid lemak boleh melindungi tikus daripada fibrosis tubulointerstitial [17, 20]. Satu kajian baru-baru ini mengesahkan bahawa overexpression enzim pengehad kadar utama carnitine palmitoyl-transferase 1A (CPT1A) boleh meningkatkan FAO dalam sel epitelium tubular renal, mengurangkan ekspresi mediator keradangan, dan membawa kepada pengurangan ketara fibrosis dalam tiga model eksperimen [21]. ]. Oleh itu, terapi sasaran FAO mungkin merupakan strategi terapeutik yang berpotensi berkesan untuk pengurangan fibrosis.

Mitokondria memainkan peranan yang sangat diperlukan dalam mengawal selia FAO. Kajian terdahulu menunjukkan bahawa astragaloside IV boleh meningkatkan FAO dengan mengawal aktiviti mitokondria semasa penuaan [22]. Pemusnahan homeostasis mitokondria memainkan peranan penting dalam kecederaan awal penyakit buah pinggang, pembaikan yang tidak normal selepas kecederaan, dan patogenesis CKD [23, 24]. Di bawah keadaan fisiologi dan patologi, pelbagai mekanisme menyelaras untuk mengekalkan homeostasis mitokondria, termasuk pertahanan antioksidan, pembaikan DNA mitokondria, gabungan dan pembelahan mitokondria, autophagy mitokondria, dan biogenesis mitokondria [25]. Beberapa kajian telah menunjukkan bahawa MSC-EV boleh melemahkan kerosakan mitokondria dengan menstabilkan DNA mitokondria [26], menghalang pembelahan mitokondria, dan merangsang pertahanan antioksidan mitokondria dan pengeluaran adenosin trifosfat (ATP) dalam model kecederaan buah pinggang akut (AKI) [27, 28] . Kajian terdahulu menunjukkan bahawa rawatan Hypo-EVs mempunyai kesan yang lebih baik untuk menggalakkan angiogenesis, percambahan, dan penghijrahan, dan menghalang keradangan dan apoptosis daripada rawatan Norm-EVs [29-31]. Walau bagaimanapun, penyelidik belum menentukan secara konklusif sama ada hasil terapeutik Hypo-EV dalam fibrosis bergantung kepada homeostasis mitokondria.

Matlamat kajian ini adalah (1) untuk meneroka sama ada pra-rawatan hipoksik vesikel ekstraselular (Hypo-EV) yang diperoleh daripada MSC mempunyai kesan anti-fibrosis yang lebih baik; (2) untuk menentukan sama ada Hypo-EV mengurangkan fibrosis yang disebabkan oleh reperfusi iskemia dengan meningkatkan FAO pengantara CPT1A; (3) untuk mengkaji sama ada kesan perlindungan Hypo-EV pada FAO berkaitan dengan peraturan homeostasis mitokondria.

Serbuk cistanche

Kaedah

1. Kultur sel dan prakondisi hipoksia

MSC yang berasal dari plasenta manusia (hP-MSC) disediakan oleh Institut Yayasan, Akademi Sains Perubatan China dan dikultur dalam medium Campuran Sederhana/Nutrien F-12 (DMEM/F12, Gibco) Dulbecco dengan 10 peratus serum lembu janin (FBS, Corning) ditambah dengan 100 U/mL penicillin-streptomycin (Gibco) dan dikekalkan pada 37 darjah dalam suasana CO2 5 peratus yang lembap. Selepas hP-MSC mencapai 60 peratus –70 peratus pertemuan, media kultur telah digantikan dengan FBS exosome-depleted (SBI, 50A-1) dan telah dikultur pada 37 darjah , 5 peratus CO2, 21 peratus O2 atau pada 1 peratus O2, 94 peratus N2, dan 5 peratus CO2 untuk tambahan 48 jam. Medium kemudiannya dikumpulkan untuk pengasingan EV, dan EV yang dikumpul daripada prarawatan hipoksik MSC (1 peratus O2) dipanggil Hypo-EV, dan MSC biasa (21 peratus O2) dipanggil Norm-EV. Hanya hP-MSC dari petikan 6-10 digunakan untuk eksperimen selanjutnya.

2. Kultur dan rawatan sel

Sel epitelium tiub proksimal renal manusia (HK-2, ATCC, USA) telah dibiakkan dalam DMEM/F12 dengan 10 peratus FBS dan ditambah dengan 100 U/mL penicillin-streptomycin. Sel-sel dikekalkan pada 37 darjah dalam suasana lembap yang mengandungi 5 peratus CO2. Kami menggunakan dua pendekatan untuk meniru CKD secara in vitro. Model hipoksia/reoksigenasi sel (H/R) dilakukan seperti yang dilaporkan sebelum ini [32]. Secara ringkas, sel HK-2 terdedah kepada keadaan hipoksik (37 darjah , 1 peratus O2, 94 peratus N2 dan 5 peratus CO2) selama 12 jam dalam medium bebas glukosa dan serum untuk menyebabkan kecederaan hipoksik. Selepas itu, medium telah diganti, dan sel-sel diletakkan di bawah keadaan normal (21 peratus O2) untuk reoksigenasi 24 jam. Kumpulan kawalan telah dikultur dalam keadaan normal (21 peratus O2) mengikut reka bentuk eksperimen. Kaedah lain ialah mengeram sel HK-2 dengan mengubah faktor pertumbuhan beta-1 (TGF- 1) pada kepekatan akhir 10 ng/mL selama 48 jam seperti yang dilaporkan sebelum ini [13]. Semasa pengoksigenan semula atau TGF- 1- masa yang dirangsang Norm-EV atau Hypo-EVs (100 ug/mL medium nutrien) telah ditambahkan pada sel.

3. Pengasingan dan pengenalan MSC‑EV

EV yang diperolehi MSC telah diasingkan menggunakan kaedah ultrasentrifugasi pembezaan. Secara ringkas, medium kultur telah disentrifugasi pada 4 darjah seperti berikut: 500×g selama 10 min, pada 2,000×g selama 20 min dan 10,000×g selama 30 min. Medium telah ditapis melalui penapis 0.22-μm sebelum ultrasentrifugasi pada 100,000×g selama 2 jam. Akhirnya, pelet EV telah digantung semula dalam PBS dan ultracentrifuged selama 2 jam tambahan untuk membuang protein yang mencemari, dan kemudian EV yang telah disucikan dituai dalam PBS dan disimpan pada-80 darjah untuk kegunaan selanjutnya. Kepekatan protein Norm-EVs dan Hypo-EVs telah diperiksa menggunakan ujian protein asid bicinchoninic (BCA, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Amerika Syarikat). Struktur membran dwilapisan berbentuk sfera biasa bagi EV telah diperhatikan menggunakan mikroskop elektron penghantaran (TEM). Western blotting digunakan untuk memeriksa kualiti EV, dan taburan saiz EV diperiksa oleh penyerakan cahaya dinamik (DLS).

Cistanche tubulosa

4. Eksperimen haiwan

Tikus C57BL/6 SPF jantan (7-9 minggu) dibekalkan oleh Sains dan Teknologi Haiwan Eksperimen Sibeifu (Beijing, China) dan diberi makan secara adaptif selama 4 hari di pusat haiwan di Hospital Besar PLA Cina sebelum eksperimen. Tikus dibahagikan secara rawak kepada empat kumpulan: kumpulan kawalan, salin penampan fosfat (PBS), kumpulan Norm-EV, dan Hypo-EV. Tikus kumpulan PBS, Norm-EV, dan Hypo-EVs tertakluk kepada reperfusi iskemia buah pinggang seperti yang diterangkan sebelum ini [33, 34]. Secara ringkas, tikus dibius dengan pentobarbital (50 mg/kg) melalui suntikan intraperitoneal. Rambut dorsal di atas buah pinggang tikus dibersihkan dan kemudian saluran pedikel buah pinggang dua hala terdedah. Untuk mendorong iskemia buah pinggang, arteri buah pinggang kiri diapit dengan pengapit vaskular nontraumatik selama 30 minit dan buah pinggang kanan dikeluarkan serentak. Selepas itu, reperfusi dimulakan dengan melepaskan pengapit. Buah pinggang diperhatikan selama 5 minit untuk memastikan reperfusi selepas pengapit dikeluarkan. Meja operasi dan suhu bilik dikekalkan pada 37 darjah semasa pembedahan. Dalam model rawatan, 100 ug Norm-EVs atau Hypo-EVs dalam 0.15 mL pelarut PBS diberikan melalui suntikan vena ekor sejurus selepas pembedahan dan hari (D) 1 selepas pembedahan dalam kumpulan Norm-EVs dan Hypo-EVs, masing-masing. Jumlah PBS yang sama diberikan melalui suntikan urat ekor dalam kumpulan PBS. Tikus telah dibunuh pada D 2, D 7, dan D 14 selepas pembedahan (Rajah 1a).

5. Pengintegrasian MSC‑EV

Untuk mengesahkan sama ada EV boleh dihayati oleh buah pinggang yang cedera. Pewarnaan pendarfluor Dil (Yeasen) dilakukan untuk melabelkan EV. Te Norm-EVs atau Hypo-EVs (200 ug) yang dibubarkan dalam 100 μL PBS diinkubasi dengan 4 μM Dil pada 37 darjah selama 1 jam. Pewarna yang tidak terikat kemudian dikeluarkan menggunakan lajur putaran eksosom (Invitrogen). Di/Norm-EV dan Dil/Hypo-EV telah digantung dalam PBS untuk kegunaan seterusnya. Dil/Norm-EVs atau Dil/HypoEVs(100 ug) disuntik secara intravena ke dalam tikus model kecederaan iskemia-reperfusi (I/R) melalui urat ekor sejurus selepas pembedahan dan pada D 1 selepas pembedahan seperti yang dinyatakan di atas. Pada hari 1, 3, 5 dan 7, tikus telah diimej serta-merta menggunakan Perisian Imej Hidup 4.4 (PerkinElmer). Selain itu, buah pinggang telah dikumpul dan diperhatikan pada sistem pengimejan optik pada D 7. Semua isyarat pengimejan bioluminescence (BLI) diukur dengan sinaran purata dari kawasan yang menarik (ROI).

6. Mikroskop elektron penghantaran (TEM)

Sebanyak 1 mm3 tisu buah pinggang telah ditetapkan dalam 2.5 peratus glutaraldehid (pH 7.4) pada 4 darjah selama 24 jam. Kemudian, tisu itu dibetulkan dengan 1 peratus asid osmium selama 2-3 jam, dehidrasi dengan aseton dan etanol, dan dibenamkan dengan resin epoksi. Selepas itu, ultramikrotome digunakan untuk menyediakan bahagian ultranipis dengan ketebalan 60 nm, yang kemudiannya diwarnakan dengan 3 peratus uranil asetat dan plumbum sitrat. Akhirnya, bahagian itu diperhatikan di bawah TEM (Jepun).

7. Analisis fungsi buah pinggang

Sampel darah dikumpulkan dari urat ekor pada D 3, dan tahap nitrogen urea darah (BUN) dalam tikus telah diuji menggunakan kit yang sesuai (Bioassay).

8. Penilaian histopatologi buah pinggang

Tisu buah pinggang telah ditetapkan dalam 10 peratus formalin selama 48 jam, tertanam dalam parafin, dipotong pada ketebalan 3 μm, diwarnai dengan reagen pewarnaan Masson oleh protokol standard, dan diperhatikan menggunakan mikroskop (Olympus, Tokyo, Jepun). Peratusan kawasan pemendapan kolagen dikira menggunakan perisian ImageJ. Terdapat sekurang-kurangnya 10 medan rawak tidak bertindih bagi setiap haiwan untuk pemarkahan.

9. Imunohistokimia

Bahagian buah pinggang yang tertanam parafin telah dirawat terlebih dahulu menggunakan pengambilan antigen pengantara haba dengan penimbal natrium sitrat (pH 6, penyelesaian pengambilan epitope 1) selama 20 minit, diikuti dengan pengeraman dengan antibodi primer semalaman pada 4 darjah . Bahagian tersebut kemudiannya diinkubasi dengan antibodi sekunder terbiotinilasi, dan 3,3'-diaminobenzidine (DAB) digunakan sebagai kromogen. Bahagian-bahagian itu kemudiannya diwarnakan balas dengan hematoxylin dan diperhatikan dengan mikroskop optik. Antibodi utama yang digunakan adalah seperti berikut: CPT1A (ab128568, Abcam), dan Vimentin (ab92547, Abcam).

10. Imunofluoresensi

Sel atau tisu telah meresap dengan 0.2 peratus Triton X-100 selama 5 minit, disekat dengan serum biri-biri selama 30 minit dan diinkubasi dengan -aktin otot licin ( -SMA, 1:200, 55135, Proteintech) atau kolagen I (1:100, ab270993, Abcam) antibodi selama 16-18 jam pada 4 darjah, diikuti dengan pengeraman dengan antibodi sekunder terkonjugasi Cy3 (merah) pada suhu bilik selama 1 jam. Nukleus telah dibalas dengan DAPI. Pewarnaan pendarfluor bahagian tisu telah diimejkan oleh mikroskop pendarfluor confocal.

11. Analisis Western blotting

Buah pinggang, sel, atau pelet EV telah dilisekan dalam penimbal lisis RadioImmune Precipitation Assay (RIPA) yang mengandungi fenilmetilsulfonil fluorida (PMSF), dan penggantungan supernatan yang diperolehi selepas sentrifugasi diukur menggunakan kit ujian protein BCA (Thermo Fisher Scientific). Sampel protein dengan kualiti yang sama (20 ug/lorong) telah ditambah kepada 10 peratus atau 12 peratus gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida (SDS-PAGE) dan kemudian dipindahkan daripada gel SDS-PAGE ke membran. Membran telah disekat selama 2 jam pada suhu bilik dengan larutan kasein 1X dan kemudian diinkubasi dengan antibodi primer pada 4 darjah terhadap protein berikut: -SMA (ab7817, Abcam), vimentin (ab92547, Abcam), gliseraldehid 3- fosfat dehidrogenase (GAPDH, 60004-1- Ig, Proteintech), aktin (20536-1-AP, Proteintech), PGC1 (ab191838, Abcam), CPT1A (ab128568, Abcam), subunit sulfur besi kompleks dehidrogenase suksinat B (SDHB , 10620-1-AP, Proteintech), subunit cytochrome c oxidase IV (COXIV, ab202554, Abcam) dan ATPB (17247-1-AP, Proteintech). Membran kemudian diinkubasi dengan antibodi sekunder yang sepadan selama 1.5 jam pada suhu bilik dan dibasuh tiga kali. Imej telah dianalisis menggunakan perisian ImageJ.

12. Tindak balas rantai polimerase masa nyata kuantitatif (RT‑qPCR)

Mula-mula, RNA telah diekstrak daripada sel-sel yang dilisekan atau tisu buah pinggang menggunakan reagen Trizol (Invitrogen), dan kemudian RNA disintesis kepada cDNA mengikut arahan pengilang menggunakan kit ReverTra Ace qPCR RT (Toyobo). Tindak balas rantai polimerase masa nyata kuantitatif dilakukan menggunakan SYBR Select Master Mix (Life Technologies) dan sistem pengesanan RT-qPCR (ABI). Primer untuk gen berikut telah disintesis: PPAR ke hadapan TTTGCCAAGGCTATCCCAGG, terbalik GTCACAGAACGGCTTCCTCA,

PGC1 ke hadapan AATGCAGCGGTCTTAGCACT, undur CTGAGCAGGGACGTCTTTGT, ACOX2 TCATCCAACGTGACCCAGTG, undur CAG CAAGGACTCTGTCAGCA, CPT2 hadapan CATCGT ACCCACCATGCACT, undur CTCCTTCCCAATGCC GTTCT, 18S AGCATCGAATCAATCACT, 18S AGCATCGAATCAATCACT ekspresi setiap gen sasaran telah dinormalisasi oleh gen 18S dan dikira oleh 2−ΔΔCT kaedah.

13. Pengukuran potensi membran mitokondria

Potensi membran mitokondria (MMP) telah dikesan menggunakan JC-1 (Beyotime). Mula-mula, larutan kerja pewarnaan JC-1 diperoleh dengan menambahkan 8 mL air ultratulen untuk setiap 50 μL JC-1 (200X), yang dipusingkan dengan kuat untuk larut sepenuhnya, dan kemudian 2 mL JC{{ 7}} penimbal pewarnaan (5X) telah ditambah. Kedua, sel dalam plat enam liang telah dibasuh dua kali dalam PBS, dan kemudian 1 mL larutan kerja pewarnaan JC{11}} ditambah dan dibiarkan selama 20 minit pada 37 darjah C. Akhirnya, sel telah dibasuh dengan PBS sekali lagi , dan 2 mL larutan kultur sel telah ditambah. Imej visual diperoleh menggunakan mikroskop pendarfluor.

Kapsul cistanche

14. Pengesanan spesies oksigen reaktif (ROS) mitokondria

Penjanaan ROS mitokondria diukur dengan mikroskop pendarfluor menggunakan Mito-SOX Red (Thermo Fisher Scientific). Larutan kerja reagen MitoSOX (2.0 mL, 5 μM) telah ditambahkan untuk menutup sel dalam plat enam liang, diikuti dengan pewarnaan dengan MitoSOX Red selama 10 minit pada 37 darjah . Kemudian, sel-sel telah dibasuh dengan PBS tiga kali, dan imej yang divisualisasikan diperoleh menggunakan mikroskop pendarfluor.

15. Pengesanan ATP

Pengeluaran ATP ditentukan melalui Kit Ujian ATP Dipertingkat (Beyotime, China, Cat. No: S0027) mengikut protokol pengeluar.

16. Analisis statistik

Kuantifikasi dan graf dianalisis menggunakan GraphPad Prism 7 (La Jolla, CA, USA) dan dibentangkan sebagai min ± ralat piawai min. Perbezaan antara berbilang kumpulan telah dianalisis menggunakan analisis varians (ANOVA), dan keertian statistik ditetapkan pada P < 0.05.

Perbincangan

Dalam kajian ini, kami memberi tumpuan kepada FAO dalam fibrosis buah pinggang, dan kami mengenal pasti enzim metabolik (CPT1A) dan pengawal selia transkripsi (PGC1, PPAR ) FAO, yang menunjukkan bahawa Hypo-EV boleh membalikkan gangguan metabolisme asid lemak dalam buah pinggang fibrotik yang disebabkan oleh I. /R. Selain itu, kami mendapati bahawa Hypo-EVs memberikan kesan mendalam pada FAO yang dimediasi CPT1A, yang sebahagiannya dikaitkan dengan peraturan homeostasis mitokondria.

Dalam tahun-tahun kebelakangan ini, semakin banyak kajian telah melaporkan kesan perlindungan buah pinggang MSC-EV dalam model vivo CKD dan sejumlah kecil data yang tersedia menunjukkan bahawa EV adalah lebih baik daripada atau sama berkesan dalam perlindungan semula berbanding dengan MSC induk mereka [43] . Rawatan MSC-EV dalam CKD masih di peringkat awal, dan mekanisme kompleks belum ditunjukkan sepenuhnya. AKI adalah salah satu faktor utama CKD, yang membawa kepada penyakit buah pinggang peringkat akhir [44], dan kecederaan I/R buah pinggang adalah faktor utama untuk AKI, jadi kami memilih model fibrosis yang disebabkan oleh I/R untuk mendedahkan mekanisme molekul yang berpotensi yang bagaimana MSC-EV menghalang fibrosis buah pinggang.

Hasil MSC-EV yang rendah adalah faktor pengehad untuk pengeluaran terapi bebas sel secara besar-besaran. Oleh itu, pelbagai pendekatan yang berpotensi untuk meningkatkan hasil EV telah dikaji, termasuk pengoptimuman keadaan kultur MSC, perancah berasaskan matriks ekstraselular tiga dimensi, dan peraturan biogenesis EV [10]. Antaranya, penyaman hipoksik MSC adalah kaedah yang sah untuk menambah kesan rawatan EV dalam pelbagai penyakit, seperti penyembuhan patah tulang [30], penyembuhan luka diabetes [29], dan pembaikan miokardium [45]. Kajian kami menyediakan bukti untuk tindakan EV yang dipertingkatkan oleh hipoksia yang dirembeskan oleh MSC. Selain itu, kami juga menunjukkan bahawa EV yang berasal dari MSC prasyarat hipoksik mempunyai kesan perlindungan anti-fibrosis dan buah pinggang yang lebih besar daripada Norm-EV dalam CKD yang disebabkan oleh I/R. Data mengenai miRNA dalam Hypo-EV berbanding Norm-EV telah dilaporkan dengan baik. Banyak kajian telah melaporkan bahawa kandungan miRNA bertanggungjawab untuk kesan bermanfaat Hypo-EV dalam banyak penyakit [30, 46]. Berbanding dengan Norm-EV, 215 miRNA telah dikawal selia dan 369 miRNA dikurangkan dalam Hypo-EV yang berasal dari adiposa, yang terutamanya mengawal metabolisme sel, pembezaan, dan fungsi TGF [29]. Walau bagaimanapun, mekanisme di mana Hypo-EV mengawal fungsi metabolisme masih kurang difahami dalam CKD. Sebilangan besar literatur menunjukkan bahawa FAO dikurangkan dalam fibrosis buah pinggang dan menyumbang kepada patogenesisnya [47]. Selaras dengan laporan, kajian kami menunjukkan bahawa ekspresi gen enzim metabolik utama yang berkaitan dengan FAO (CPT1A, CPT2, dan ACOX2) dan faktor pengawalseliaan transkripsi FAO (PPAR dan PGC1 ) telah menurun dengan ketara dalam fibrosis buah pinggang yang disebabkan oleh I / R.

Selain itu, pemulihan metabolisme lipid adalah strategi yang berpotensi untuk merawat fibrosis buah pinggang [48]. Ekspresi berlebihan CPT1A dalam tubul buah pinggang adalah penyumbang penting kepada peningkatan fungsi dalam FAO dan mengakibatkan perlindungan fungsi buah pinggang dan fibrosis dengan menghalang disfungsi mitokondria, pembezaan TEC, dan keradangan dalam model haiwan CKD [21]. Data kami menunjukkan bahawa Hypo-EVs boleh membalikkan FAO yang rosak dalam fibrosis yang disebabkan oleh I/R, yang menunjukkan bahawa kesan terapeutik Hypo-EV dalam fibrosis buah pinggang adalah sebahagiannya hasil daripada memulihkan FAO.

Kerosakan dalam isyarat PPAR buah pinggang mengurangkan aktiviti laluan FAO dan perkembangan fibrosis buah pinggang yang memburukkan [49]. Pentadbiran fenofibrate, agonis PPAR, memulihkan kecacatan pengoksidaan lemak dan fibrosis tubulointerstitial dalam CKD [50, 51]. PGC-1 ialah coactivator PPAR dalam kawalan transkrip kapasiti FAO mitokondria [39]. Kami menyiasat sama ada HypoEV boleh meningkatkan isyarat PPAR dan memulihkan FAO dalam kecederaan I/R. Keputusan kami menunjukkan bahawa tiada perbezaan yang jelas dalam ungkapan PGC-1 dan PPARa antara Norm-EV dan Hypo-EV. Oleh itu, mesti ada faktor lain yang menggalakkan berlakunya proses ini. Mitokondria adalah kuasa untuk FAO untuk menjana tenaga untuk sel [52]. Disfungsi mitokondria adalah kritikal dalam patogenesis fibrosis buah pinggang [53]. Pemulihan homeostasis mitokondria telah muncul sebagai strategi terapeutik yang menjanjikan untuk mencegah kecederaan buah pinggang dan mempercepatkan pembaikan buah pinggang [25]. Kajian terbaru menunjukkan bahawa MSC-EV mempunyai kesan perlindungan terhadap kerosakan mitokondria yang disebabkan oleh AKI, yang melindungi TEC daripada penghinaan dengan mengurangkan pemecahan mitokondria, menormalkan potensi membran mitokondria, dan membalikkan penghapusan mtDNA dan kecacatan OXPHOS mitokondria [26, 27]. Keputusan kami menunjukkan bahawa rawatan Hypo-EVs memulihkan peralihan morfologi mitokondria yang tidak normal, peningkatan jisim mitokondria, dan fungsi mitokondria yang dipertingkatkan dalam buah pinggang fibrotik. Penemuan kami menunjukkan bahawa kesan Hypo-EV pada FAO boleh dicapai dengan mengawal homeostasis mitokondria.

Terdapat beberapa batasan dalam kajian kami. Sebagai contoh, data kami menunjukkan bahawa Hypo-EV mempunyai kesan antifibrotik yang lebih baik dalam tikus kecederaan I/R daripada Norm-EV. Walau bagaimanapun, kami tidak menentukan ungkapan perbezaan kandungan antara Norm-EV dan Hypo-EV dan juga tidak menilai cara khusus yang Hypo-EV mempengaruhi homeostasis mitokondria dalam kajian ini.

Manfaat Cistanche

Kesimpulan

Ringkasnya, data kami menunjukkan bahawa Hypo-EVs menghalang fibrosis buah pinggang dengan memulihkan CPT1Amediated FAO, dan kesan ini boleh dicapai dengan mengawal homeostasis mitokondria. Penemuan kami memberikan sokongan mekanikal selanjutnya untuk pembangunan terapi bebas sel untuk fibrosis buah pinggang.

Rujukan

1. Kalantar-Zadeh K, Jafar TH, Nitsch D, Neuen BL, Perkovic V. Penyakit buah pinggang kronik. Lancet. 2021;398(10302):786–802.

2. Xie Y, Bowe B, Mokdad AH, Xian H, Yan Y, Li T, Maddukuri G, Tsai CY, Floyd T, Al-Aly Z. Analisis Kajian Beban Global Penyakit menyerlahkan global, serantau dan nasional trend epidemiologi penyakit buah pinggang kronik dari 1990 hingga 2016. Kidney Int. 2018;94(3):567–81.

3. Ronco C, Bellomo R, Kellum JA. Kecederaan buah pinggang akut. Lancet. 2019;394(10212):1949–64.

4. Zheng Z, Li C, Shao G, Li J, Xu K, Zhao Z, Zhang Z, Liu J, Wu H. Hippo-YAP/ MCP-1 pembaikan maladaptif tiub pengantara menggalakkan keradangan dalam pemulihan gagal buah pinggang selepas AKI iskemik. Kematian Sel Dis. 2021;12(8):754.

5. Yan H, Xu J, Xu Z, Yang B, Luo P, He Q. Mentakrifkan sasaran terapeutik untuk fibrosis buah pinggang: mengeksploitasi biologi patogenesis. Biomed Pharmacother. 2021;143:112115.

6. Shi Z, Wang Q, Zhang Y, Jiang D. Vesikel ekstraselular yang dihasilkan oleh sel stem mesenchymal sumsum tulang melemahkan fibrosis buah pinggang, sebahagiannya dengan menghalang laluan RhoA/ROCK, dalam model tikus UUO. Sel Stem Res There. 2020;11(1):253.

7. Kholia S, Herrera Sanchez MB, Cedrino M, Papadimitriou E, Tapparo M, Deregibus MC, Bruno S, Antico F, Brizzi MF, Quesenberry PJ, Camussi G. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles memperbaiki kecederaan buah pinggang dalam nefropati asid aristolochic . Biol Dev Sel Hadapan. 2020;8:188.

8. Birtwistle L, Chen XM, Pollock C. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles untuk menyelamatkan kecederaan buah pinggang. Int J Mol Sci. 2021;22(12):6596.

9. Huang Y, Yang L. Sel stem mesenchymal dan vesikel ekstraselular dalam terapi terhadap penyakit buah pinggang. Sel Stem Res There. 2021;12(1):219.

10. Phan J, Kumar P, Hao D, Gao K, Petani D, Wang A. Kejuruteraan sel stem mesenchymal untuk meningkatkan keberkesanan eksosom dan hasil untuk terapi bebas sel. J Vesikel Sel Tambahan. 2018;7(1):1522236.

11. Bister N, Pistono C, Huremagic B, Jolkkonen J, Giugno R, Malm T. Hipoksia dan vesikel ekstraselular: ulasan tentang kaedah, kargo vesikular dan fungsi. J Vesikel Sel Tambahan. 2020;10(1): e12002.

12. Yang Y, Lee EH, Yang Z. Sel stem mesenchymal terkondisi hipoksia dalam aplikasi penjanaan semula tisu. Tisu Eng Bahagian B Rev 2021.

13. Ishiuchi N, Nakashima A, Doi S, Yoshida K, Maeda S, Kanai R, Yamada Y, Ike T, Doi T, Kato Y, Masaki T. Sel stem mesenchymal prasyarat hipoksia menghalang fibrosis buah pinggang dan keradangan dalam reperfusi iskemia tikus. Sel Stem Res There. 2020;11(1):130.

14. Panizo S, Martinez-Arias L, Alonso-Montes C, Cannata P, Martin-Carro B, Fernandez-Martin JL, Naves-Diaz M, Carrillo-Lopez N, Cannata-Andia JB. Fibrosis dalam penyakit buah pinggang kronik: patogenesis dan akibat. Int J Mol Sci. 2021;22(1):408.

15. Humphreys BD. Mekanisme fibrosis buah pinggang. Annu Rev Physiol. 2018;80:309–26.

16. Nastase MV, Zeng-Brouwers J, Wygrecka M, Schaefer L. Menyasarkan fibrosis buah pinggang: mekanisme dan sistem penyampaian ubat. Adv Drug Deliv Rev. 2018;129:295–307.

17. Zhao X, Kwan JYY, Yip K, Liu PP, Liu FF. Menyasarkan disregulasi metabolik untuk terapi fibrosis. Nat Rev Drug Discov. 2020;19(1):57–75.

18. Qi R, Yang C. Sel epitelium tubular renal: mediator fibrosis tubulointerstitial yang diabaikan selepas kecederaan. Kematian Sel Dis. 2018;9(11):1126.

19. Gewin LS. Fibrosis buah pinggang: keutamaan tubul proksimal. Matriks Biol. 2018;68:248–62.

20. Kang HM, Ahn SH, Choi P, Ko YA, Han SH, Chinga F, Park AS, Tao J, Sharma K, Pullman J, Bottinger EP, Goldberg IJ, Susztak K. Pengoksidaan asid lemak yang rosak dalam sel epitelium tubular renal mempunyai peranan penting dalam perkembangan fibrosis buah pinggang. Nat Med. 2015;21(1):37–46.

21. Miguel V, Tituana J, Herrero JI, Herrero L, Serra D, Cuevas P, Barbas C, Puyol DR, Marquez-Exposito L, Ruiz-Ortega M, Castillo C, Sheng X, Susztak K, Ruiz-Canela M, Salas-Salvado J, Gonzalez MAM, Ortega S, Ramos R, Lamas S. Tubul renal Cpt1a overexpression melindungi daripada fibrosis buah pinggang dengan memulihkan homeostasis mitokondria. J Clin Invest. 2021;131(5):e140695.

22. Luo Z, Wang Y, Xue M, Xia F, Zhu L, Li Y, Jia D, Chen S, Xu G, Lei Y. Astragaloside IV memperbaiki metabolisme lemak dalam hati tikus yang semakin tua melalui penyasaran aktiviti mitokondria. J Sel Mol Med. 2021;25(18):8863–76.

23. Bhargava P, Schnellmann RG. Energetik mitokondria dalam buah pinggang. Nat Rev Nephrol. 2017;13(10):629–46.

24. Jiang M, Bai M, Lei J, Xie Y, Xu S, Jia Z, Zhang A. Disfungsi mitokondria dan peralihan AKI-ke-CKD. Am J Physiol Fisiol Renal. 2020;319(6): F1105–16.

25. Tang C, Cai J, Yin XM, Weinberg JM, Venkatachalam MA, Dong Z. Kawalan kualiti mitokondria dalam kecederaan dan pembaikan buah pinggang. Nat Rev Nephrol. 2021;17(5):299–318.

26. Zhao M, Liu S, Wang C, Wang Y, Wan M, Liu F, Gong M, Yuan Y, Chen Y, Cheng J, Lu Y, Liu J. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles melemahkan kerosakan dan keradangan mitokondria dengan menstabilkan DNA mitokondria. ACS Nano. 2021;15(1):1519–38.

27. Cao H, Cheng Y, Gao H, Zhuang J, Zhang W, Bian Q, Wang F, Du Y, Li Z, Kong D, Ding D, Wang Y. Penjejakan in vivo vesikel ekstraselular terbitan sel stem mesenchymal bertambah baik fungsi mitokondria dalam kecederaan iskemia-reperfusi buah pinggang. ACS Nano. 2020;14(4):4014–26.

28. Gu D, Zou X, Ju G, Zhang G, Bao E, Zhu Y. Sel stromal mesenchymal diperolehi vesikel ekstraselular memperbaiki kecederaan reperfusi iskemia renal akut dengan menghalang pembelahan mitokondria melalui miR-30. Sel Stem Int. 2016;2016:2093940.

29. Wang J, Wu H, Peng Y, Zhao Y, Qin Y, Zhang Y, Xiao Z. Eksosom yang berasal dari sel stem adiposa hipoksia menggalakkan penyembuhan luka diabetes yang berkualiti tinggi melibatkan pengaktifan laluan PI3K/Akt. J Nanobioteknologi. 2021;19(1):202.

30. Liu W, Li L, Rong Y, Qian D, Chen J, Zhou Z, Luo Y, Jiang D, Cheng L, Zhao S, Kong F, Wang J, Zhou Z, Xu T, Gong F, Huang Y, Gu C, Zhao X, Bai J, Wang F, Zhao W, Zhang L, Li X, Yin G, Fan J, Cai W. Eksosom yang berasal dari sel stem mesenchymal hipoksik menggalakkan penyembuhan patah tulang dengan pemindahan miR{{2} }. Acta Biomater. 2020;103:196–212.

31. Rong Y, Zhang J, Jiang D, Ji C, Liu W, Wang J, Ge X, Tang P, Yu S, Cui W, Cai W. Prarawatan hipoksik vesikel ekstraselular kecil menjadi pengantara pembaikan rawan dalam osteoarthritis dengan menghantar miR{ {1}}a-5hlm. Acta Biomater. 2021;122:325–42.

32. Yang C, Chen Z, Yu H, Liu X. Perencatan Pengganggu Penyenyapan Telomerik 1-Seperti Iskemia Renal yang Dikurangkan dan Fibrosis Akibat Kecederaan Reperfusi dengan Menyekat Tekanan Oksidatif Pengantaraan PI3K/AKT. Dadah Des Devel Ther. 2019;13:4375–87.

33. Qian Y, Qian C, Xie K, Fan Q, Yan Y, Lu R, Wang L, Zhang M, Wang Q, Mou S, Dai H, Ni Z, Pang H, Gu L. Isyarat reseptor P2X7 menggalakkan keradangan dalam sel parenkim buah pinggang yang mengalami kecederaan iskemia-reperfusi. Kematian Sel Dis. 2021;12(1):132.

34. Hu MC, Shi M, Gillings N, Flores B, Takahashi M, Kuro OM, Moe OW. Rekombinan alpha-Klotho mungkin profilaktik dan terapeutik untuk perkembangan penyakit buah pinggang akut hingga kronik dan kardiomiopati uremik. Buah Pinggang Int. 2017;91(5):1104–14.

35. Dubois V, Eeckhoute J, Lefebvre P, Staels B. Sumbangan isotaip PPAR yang berbeza tetapi saling melengkapi kepada homeostasis tenaga. J Clin Investig. 2017;127(4):1202–14.

36. Desvergne B, Wahli W. Peroxisome proliferator-diaktifkan reseptor: kawalan nuklear metabolisme. Endokr Rev. 1999;20(5):649–88.

37. Libby AE, Jones B, Lopez-Santiago I, Rowland E, Levi M. Reseptor nuklear dalam buah pinggang semasa kesihatan dan penyakit. Mol Aspek Med. 2021;78:100935.

38. Bougarne N, Weyers B, Desmet SJ, Deckers J, Ray DW, Staels B, De Bosscher K. Tindakan molekul PPARalpha dalam metabolisme lipid dan keradangan. Endokr Rev. 2018;39(5):760–802.

39. Vega RB, Huss JM, Kelly DP. Coactivator PGC-1 bekerjasama dengan alpha reseptor diaktifkan proliferator peroksisom dalam kawalan transkrip gen nuklear yang mengekod enzim pengoksidaan asid lemak mitokondria. Biol Sel Mol. 2000;20(5):1868–76.

40. Li SY, Susztak K. Peranan peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1alpha (PGC-1alpha) dalam penyakit buah pinggang. Semin Nephrol. 2018;38(2):121–6.

41. Fransen M, Lismont C, Walton P. Sambungan peroksisom-mitokondria: Bagaimana dan mengapa? Int J Mol Sci. 2017;18(6):1126.

42. Aparicio-Trejo OE, Avila-Rojas SH, Tapia E, Rojas-Morales P, Leon-Contreras JC, Martinez-Klimova E, Hernandez-Pando R, Sanchez-Lozada LG, PedrazaChaverri J. Kemerosotan kronik bioenergetik mitokondria dan beta -pengoksidaan menggalakkan peralihan AKI-ke-CKD eksperimen yang disebabkan oleh asid folik. Percuma Radic Biol Med. 2020;154:18–32.

43. Eirin A, Lerman LO. Mesenchymal stem/sel stromal vesikel ekstraselular untuk penyakit buah pinggang kronik: Adakah Kita sudah ada? Hipertensi. 2021;78(2):261–9.

44. Kurzhagen JT, Dellepiane S, Cantaluppi V, Rabb H. AKI: faktor risiko yang semakin diiktiraf untuk pembangunan dan perkembangan CKD. J Nephrol. 2020;33(6):1171–87.

45. Zhu J, Lu K, Zhang N, Zhao Y, Ma Q, Shen J, Lin Y, Xiang P, Tang Y, Hu X, Chen J, Zhu W, Webster KA, Wang J, Yu H. Fungsi reparatif miokardium daripada eksosom daripada sel stem mesenchymal dipertingkatkan dengan rawatan hipoksia sel melalui pemindahan mikroRNA-210 dalam cara yang bergantung kepada nSMase2-. Bioteknol Bernama Sel Artif. 2018;46(8):1659–70.

46. ​​Zhu LP, Tian T, Wang JY, He JN, Chen T, Pan M, Xu L, Zhang HX, Qiu XT, Li CC, Wang KK, Shen H, Zhang GG, Bai YP. Eksosom terhasil daripada sel stem mesenchymal yang ditimbulkan oleh hipoksia memudahkan pembaikan jantung melalui pencegahan kematian sel yang dimediasi miR-125b dalam infarksi miokardium. Theranostics. 2018;8(22):6163–77.

47. Xie YH, Xiao Y, Huang Q, Hu XF, Gong ZC, Du J. Peranan laluan CTRP6/AMPK dalam fibrosis buah pinggang melalui promosi pengoksidaan asid lemak. Eur J Pharmacol. 2021;892:173755.

48. Chen YY, Chen XG, Zhang S. Kebolehgunaan dadah modulasi metabolisme lipid terhadap fibrosis buah pinggang. Acta Pharmacol Sin. 2021.

49. Chung KW, Lee EK, Lee MK, Oh GT, Yu BP, Chung HY. Kemerosotan PPARalpha dan laluan pengoksidaan asid lemak memburukkan fibrosis buah pinggang semasa penuaan. J Am Soc Nephrol. 2018;29(4):1223–37.

50. Han SH, Malaga-Dieguez L, Chinga F, Kang HM, Tao J, Reidy K, Susztak K. Penghapusan Lkb1 dalam sel epitelium tubular renal membawa kepada CKD dengan mengubah metabolisme. J Am Soc Nephrol. 2016;27(2):439–53.

51. Jao TM, Nangaku M, Wu CH, Sugahara M, Saito H, Maekawa H, Ishimoto Y, Aoe M, Inoue T, Tanaka T, Staels B, Mori K, Inagi R. ATF6alpha downregulation of PPARalpha promotes lipototoxicity-induced tubulointerstitial fibrosis. Buah Pinggang Int. 2019;95(3):577–89.

52. Spinelli JB, Haigis MC. Sumbangan pelbagai mitokondria kepada metabolisme selular. Nat Cell Biol. 2018;20(7):745–54.

53. Chung KW, Dhillon P, Huang S, Sheng X, Shrestha R, Qiu C, Kaufman BA, Park J, Pei L, Baur J, Palmer M, Susztak K. Kerosakan mitokondria dan pengaktifan laluan STING membawa kepada keradangan buah pinggang dan fibrosis. Metab Sel. 2019;30(4):784–99.

Zhumei Gao1,2, Chuyue Zhang1,3, Fei Peng1 , Qianqian Chen1 , Yinghua Zhao4 , Liangmei Chen5 , Xu Wang1 dan Xiangmei Chen1,2

1 Jabatan Nefrologi, Pusat Perubatan Pertama Hospital Besar PLA China, Institut Nefrologi Tentera Pembebasan Rakyat China, Makmal Utama Penyakit Buah Pinggang Negeri, Pusat Penyelidikan Klinikal Kebangsaan untuk Penyakit Buah Pinggang, Makmal Utama Beijing Penyelidikan Penyakit Buah Pinggang, Beijing, China.

2 Jabatan Nefropati, Hospital Kedua Universiti Jilin, Changchun, China.

3 Institut Penyelidikan Buah Pinggang, Pusat Penyelidikan Klinikal Kebangsaan untuk Geriatrik dan Bahagian Nefrologi, Hospital China Barat Universiti Sichuan, Chengdu, China.

4 Pusat Pengajian Perubatan Klinikal, Universiti Tsinghua, Beijing, China.

5 Jabatan Nefrologi, Hospital Gabungan Pertama Universiti Jinan, Guangzhou, China.