Cara mengekspresikan dalam buah pinggang dan saluran kencing manusia oleh defensin manusia 5

Untuk maklumat lanjut:ali.ma@wecistanche.com

John David Spencer et al

Abstrak

latar belakang:Mekanisme yang mengekalkan kemandulan dalam saluran kencing tidak difahami sepenuhnya. Kajian terbaru telah melibatkan kepentingan peptida antimikrobial (AMP) dalam melindungi saluran kencing daripada jangkitan. Di sini, kami mencirikan ungkapan dan kaitan AMP manusia alpha-defensin 5 (HD5) dalam manusia.buah pinggangdan saluran kencing dalam subjek normal dan dijangkiti.

Metodologi/Penemuan Utama:Menggunakan RNA yang diasingkan daripada manusiabuah pinggang, ureter dan tisu pundi kencing, kami melakukan PCR masa nyata kuantitatif untuk menunjukkan bahawa DEFA5, pengekodan gen HD5, dinyatakan secara konstitutif di seluruh saluran kencing. Dengan pyelonephritis, ekspresi DEFA5 meningkat dengan ketara dalambuah pinggang. Menggunakan analisis imunoblot, pengeluaran HD5 juga meningkat dengan pyelonephritis. Imunostaining HD5 setempat ke urothelium pundi kencing dan ureter. Dalam buah pinggang, HD5 terutamanya dihasilkan dalam nefron distal dan tubul pengumpul. Menggunakan immunoblot dan ujian ELISA, HD5 tidak dikesan secara rutin dalam sampel air kencing manusia yang tidak dijangkiti manakala bermakna pengeluaran HD5 kencing meningkat dengan jangkitan saluran kencing E.coli.

Kesimpulan/Kepentingan:DEFA5 dinyatakan di seluruh saluran kencing dalam subjek yang tidak dijangkiti. Khususnya, HD5 dinyatakan di seluruh urothelium saluran kencing yang lebih rendah dan dalam tubul pengumpulbuah pinggang. Dengan jangkitan, ekspresi HD5 meningkat dalambuah pinggang, dan paras menjadi dapat dikesan dalam air kencing. Untuk pengetahuan kami, penemuan kami mewakili yang pertama untuk mengukur ekspresi dan pengeluaran HD5 dalam buah pinggang manusia. Selain itu, ini adalah laporan pertama untuk mengesan kehadiran HD5 dalam sampel air kencing yang dijangkiti. Keputusan kami menunjukkan bahawa HD5 mungkin mempunyai peranan penting dalam mengekalkan kemandulan saluran kencing.

Cistanche UK untuk penyakit buah pinggang, klik di sini untuk mendapatkan sampel

pengenalan

Saluran kencing, selain daripada meatus uretra, biasanya steril walaupun berdekatan dengan flora najis. Mekanisme tepat di mana saluran kencing mengekalkan kemandulannya tidak difahami dengan baik. Mekanisme yang dicadangkan yang menyumbang kepada pertahanan saluran kencing termasuk aliran air kencing, perubahan dalam pH air kencing dan osmolariti, pengosongan pundi kencing yang kerap, komponen pertahanan kimia uroepitelium, dan penumpahan/kemasukan epitelium sel imun effector dengan rangsangan bakteria [1]. Di samping itu, peptida antimikrobial (AMP) baru-baru ini telah ditunjukkan mempunyai peranan penting dalam mengekalkan kemandulan saluran kencing [2]. AMP, yang berfungsi sebagai antibiotik semula jadi yang dihasilkan oleh hampir semua organisma, adalah komponen di mana-mana sistem imun semula jadi. AMP ialah molekul kationik yang dinyatakan oleh sel putih fagositik dan sel epitelium. Pada manusia dan mamalia lain, defensin ialah keluarga utama AMP. Defensin biasanya mempunyai aktiviti antimikrob spektrum luas terhadap bakteria, virus, kulat dan protozoa gram-positif dan gram-negatif gram-negatif [2,3]. Defensin pada mulanya disintesis sebagai preproprotein dan menjalani pemprosesan untuk menjadi matang, peptida aktif secara biologi [4]. Pada manusia, defensin dikelaskan kepada satu daripada dua keluarga bergantung pada corak penyambung disulfida mereka - alpha-defensin atau beta-defensin [5].

Dalam saluran kencing, beta-defensin diekspresikan secara meluas di seluruh uroepitelium. Sel epitelium melapisibuah pingganggelung Henle, tubulus distal, dan saluran pengumpul secara konstitutif mengekspresikan beta-defensin 1 manusia (hBD1). Walaupun tahap kencing hBD1 tidak mencukupi untuk membunuh bakteria yang menyerang, hBD1 menyediakan salutan antimikrobial bertindak pantas pada lumen tiub dan menghalang jangkitan dengan menghalang lampiran bakteria pada urothelium [6]. Kajian baru-baru ini menunjukkan bahawa keadaan redoks hBD1 dengan ketara mempengaruhi potensi antimikrob, sehingga peptida yang dikurangkan adalah lebih kuat daripada bentuk teroksida berkaitan disulfida [7]. Kepentingan ini pada permukaan urothelial belum ditentukan. Satu lagi defensin, beta-defensin 2 manusia (hBD2) tidak dinyatakan secara konstitutif dalam tisu buah pinggang yang sihat; Walau bagaimanapun, ekspresi hBD2 disebabkan oleh jangkitan [8].

Tidak seperti beta-defensin, peranan alpha-defensin yang berasal dari epitelium tidak diterangkan dengan baik dalam saluran kencing. Ekspresi dan fungsi alpha-defensin HD5 dan HD6 kebanyakannya telah dilaporkan dalam usus kecil di mana ia dirembeskan oleh Panethcells ke dalam crypts usus dan menyumbang kepada keseimbangan mikrobiota usus [9]. HD5 juga telah dilokalkan dalam saluran genital lelaki dan wanita, dengan bukti menunjukkan bahawa ia boleh diinduksi dan penting dalam membasmi jangkitan [10,11,12]. HD5 kencing telah dikesan pada pesakit yang telah menjalani pembinaan semula pundi kencing ileal dan pengalihan saluran kencing di mana sumber pengeluaran HD5 terutamanya dikreditkan kepada sel Paneth ileal [13,14]. HD5 mempunyai aktiviti antibakteria terhadap bakteria gram-positif uropatogenik biasa dan bakteria gram-negatif [15]. HD5 juga mempunyai aktiviti antimikrob terhadap virus uropatogenik seperti adenovirus dan virus BK [16,17,18]. Dalam kajian ini, kami memberikan penerangan awal dan kuantifikasi ekspresi HD5 dalam manusiabuah pinggangdan seterusnya mentakrifkan ekspresinya dalam saluran kencing yang lebih rendah semasa kemandulan dan jangkitan.

Keputusan

MRNA DEFA5 secara konstitutif dinyatakan dalam pundi kencing manusia, ureter, dan buah pinggang

PCR masa nyata kuantitatif menunjukkan bahawa semua spesimen pundi kencing, ureter dan buah pinggang yang diuji tanpa jangkitan secara konstitutif menyatakan DEFA5. Ungkapan DEFA5 adalah jauh lebih besar di saluran kencing yang lebih rendah berbanding di saluran kencing atas(p= 0.014). Dalam pundi kencing (n=4), min ungkapan DEFA5 ialah 4,656637 transkrip setiap 10 ng RNA dan dalam ureter (n=4) bermakna ungkapan DEFA5 ialah 4,1126170 transkrip setiap 10 ncRNA (Rajah 1A) . Dalam buah pinggang (n=6), purata ungkapan DEFA5 ialah 2,9376274 transkrip setiap 10 ng RNA. Ekspresi DEFA5 dianalisis secara berasingan dalam korteks buah pinggang, medula dan pelvis. Ekspresi DEFA5 tidak berbeza dengan ketara mengikut kawasan buah pinggang(p= 0.45).

Ekspresi DEFA5 dan ekspresi peptida HD5 meningkat dengan pyelonephritis

Analisis PCR masa nyata kuantitatif yang dilakukan pada tisu buah pinggang dengan pyelonephritis menunjukkan peningkatan ketara dalam ekspresi DEFA5 berbanding dengan tisu buah pinggang yang tidak dijangkiti. Dengan pyelonephritis (n= 6), min ekspresi DEFA5 meningkat kepada7,82961,052 transkrip setiap 10 ng RNA (p= 0.019) (Rajah 2A).

Untuk menilai lagi peningkatan dalam ekspresi ini dengan pyelonephritis, kami melakukan analisis imunoblot pada tisu buah pinggang yang sama yang digunakan untuk analisis PCR masa nyata untuk menilai peningkatan serentak dalam pengeluaran peptida HD5 (Rajah 2B, panel tengah). Analisis imunoblot, menggunakan antisera HD5 poliklonal, menunjukkan pengeluaran peptida HD5 yang lebih ketara dalam tisu buah pinggang dengan pyelonephritis (n=6) berbanding dengan tisu buah pinggang yang tidak dijangkiti(n=6). Tisu buah pinggang yang tidak dijangkiti menyatakan 300625 ng HD5/gram berat tisu basah manakala tisu buah pinggang dengan pyelonephritis menyatakan 600621 ng HD5/gram berat tisu basah (p,0.0001). Blots telah disiasat semula dengan GAPDH untuk berfungsi sebagai kawalan pemuatan (Rajah 2B, panel tengah) dan noda perak juga dilakukan untuk mengesahkan pemuatan protein yang sama (Rajah 2B, panel atas).

Peptida HD5 dihasilkan di seluruh buah pinggang dan saluran kencing manusia

Imunostaining dilakukan untuk menyetempatkan pengeluaran HD5 dalam saluran kencing. Imunohistokimia (IHC) menunjukkan bahawa HD5imunoreaktiviti hadir di seluruh urothelium ureter dan pundi kencing semua spesimen yang disiasat (n=4, Rajah 3). IHC juga menunjukkan bahawa HD5 dihasilkan dalam tubulus korteks buah pinggang dan medula semua spesimen (n= 6, Rajah 4). Immunofluorescence (IF) menunjukkan bahawa ekspresi HD5 adalah yang paling besar dalam nefron distal dan tubul pengumpul (Rajah 5). Interstitium dan glomeruli tidak menunjukkan imunoreaktiviti HD5. Imunostaining yang ditunjukkan dalam Rajah 3, 4, dan 5 dilakukan menggunakan antibodi anti-HD5 monoklonal tetikus (8C8) yang mengiktiraf propeptida HD5 (Abcam, Cambridge, MA). Keputusan adalah serupa apabila menggunakan antibodi anti-HD5 poliklonal arnab yang mengiktiraf propeptida HD5 dan peptida matang (data tidak ditunjukkan) - menunjukkan bahawa HD5 disimpan sebagai propeptida.

Dengan pyelonephritis, imunostaining HD5 meningkat dengan ketara. Imunoreaktiviti HD5 meningkat sepanjang nefron proksimal, nefron distal dan tubul pengumpul (Rajah 4 dan Rajah 5). Seperti dalam spesimen yang tidak dijangkiti, glomeruli dan interstitium tidak menunjukkan ekspresi HD5 dengan jangkitan. Kawalan negatif tidak menunjukkan imunoreaktiviti HD5.

Air kencing manusia yang dijangkiti mengandungi boleh diukur

kepekatan peptida HD5

Analisis imunoblot, menggunakan antiserum poliklonal arnab yang mengesan prekursor proHD5 dan bentuk yang diproses selanjutnya mengenal pasti tahap HD5 yang boleh diukur dalam 13 daripada 15 sampel air kencing yang diuji yang dijangkiti E.coli uropatogenik (Rajah 6A dan B). Apabila ada, paras HD5, dinormalkan kepada kreatinin air kencing, berjulat antara 299.8–669.7630 ng HD5/mg air kencing Cr (110.67 ng/mL–276.67 ng/mL), yang sepadan dengan 11.10–27.67 nmol/L. Sampel air kencing yang dijangkiti (n=15), HD5 berada pada atau di bawah had pengesanan (,50 ng). Ujian imunosorben berkaitan enzim (ELISA) pada sampel air kencing yang sama, menggunakan antibodi monoklonal tetikus (8C8) yang hanya mengesan prekursor proHD5, mengesan tahap proHD5 yang boleh diukur dalam 13 daripada 15 sampel yang dijangkiti yang diuji. Kepekatan proHD5 urin berjulat dari 122.78–490.060.03 ng HD5/mg urin Cr (30.02 ng/mL–200.5 ng/mL) apabila ada (Rajah 7).

Perbincangan

Dalam kajian ini, kami menyediakan pencirian awal HD5 dalam buah pinggang, ureter dan pundi kencing manusia. HD5 telah ditunjukkan sebagai AMP penting yang menghalang jangkitan invasif dalam usus dan dikawal selia dalam saluran kemaluan semasa jangkitan [11,18,19,20,21]. AMP yang berasal dari epitelium, seperti HD5, telah terbukti penting dalam mengekalkan kemandulan dalam saluran kencing [8,22,23,24]. Kekurangan dalam pertahanan mukosa semula jadi ini boleh mengakibatkan jangkitan akut dan/atau kronik [25,26].

Keputusan PCR masa nyata kuantitatif kami menunjukkan bahawa DEFA5 secara konstitutif dinyatakan dalam buah pinggang, ureter dan pundi kencing manusia. Ekspresi DEFA5 meningkat dari saluran kencing atas ke saluran kencing yang lebih rendah – berikutan aliran aliran kencing dan semakin dekatnya dengan titik pencerobohan mikrobiota. Untuk pengetahuan kami, ini adalah kajian pertama untuk mengukur ekspresi DEFA5 dalam buah pinggang dan pundi kencing manusia. Baru-baru ini, Townes et al menunjukkan bahawa ureter distal normal boleh mengekspresikanDEFA5 [14]. Keputusan kami juga mencadangkan bahawa DEFA5 secara konstitutif dinyatakan oleh ureter distal. Walaupun ungkapan DEFA5 dalam saluran kencing hampir 100-kali ganda lebih rendah daripada yang terdapat dalam tisu gastrousus, ekspresi uroepitelial basal DEFA5 adalah setanding dengan ungkapan amp trek kencing yang diterangkan sebelum ini seperti cathelicidin, hBD-1, hBD -2, dan ribonuclease 7[6,8,22,24,27].Berbeza dengan saluran gastrousus matang yang DEFA5 dinyatakan pada tahap tinggi dalam kedua-dua keadaan kesihatan dan jangkitan/keradangan, kuantitatif masa nyata kami Data PCR menunjukkan bahawa ekspresi DEFA5 dalam buah pinggang dikawal dengan ketara dengan jangkitan [27,28,29]. Corak ekspresi yang boleh diinduksi ini adalah sama dengan ekspresi DEFA5 dalam saluran pembiakan wanita di mana ekspresi DEFA5 meningkat dengan salpingitis [30]. Dalam saluran kencing, Townes et al telah menunjukkan trend ke arah ekspresi ureter DEFA5 yang lebih besar pada pesakit dengan UTI yang telah menjalani pengalihan kencing saluran ileal [14].

Analisis imunoblot kami melengkapkan data PCR masa nyata dengan menunjukkan bahawa pengeluaran peptida HD5 meningkat dengan pyelonephritis. Corak teraruh pengeluaran HD5 ini adalah serupa dengan yang dilihat pada sesetengah ahli keluarga beta-defensin.hBD2 menunjukkan corak teraruh pengeluaran dengan jangkitan saluran kencing dan/atau pyelonephritis kronik [8,31,32]. Pengeluaran HD5peptida telah ditunjukkan meningkat dalam saluran kemaluan wanita atas dan uretra lelaki dengan keradangan [11,30].

Menggunakan immunostaining, kami menunjukkan bahawa HD5 dihasilkan secara seragam di seluruh urothelium ureter dan pundi kencing. Oleh kerana sebahagian besar UTI terhasil daripada flora tahi yang naik ke dalam pundi kencing, keputusan ini menunjukkan bahawa ekspresi HD5 hadir di lokasi di mana pendedahan mikrob berlaku paling kerap [33]. Oleh itu, HD5 berada pada kedudukan yang ideal untuk mencegah jangkitan mikrob menaik. Dalam buah pinggang, HD5 terutamanya dihasilkan dalam nefron distal dan tubul pengumpul. Penemuan ini mencadangkan bahawa HD5 dihasilkan di lokasi di mana ia akan diletakkan untuk mempunyai aktiviti antimikrob yang optimum. Kajian terdahulu telah menunjukkan bahawa sifat antimikrob defensin bergantung kepada kepekatan garam - dengan kepekatan garam yang lebih tinggi mengurangkan aktiviti antimikrobial [23,34,35]. Kami membuat spekulasi bahawa kepekatan garam rendah nefron distal dan tubul pengumpul memberikan persekitaran yang menggalakkan untuk aktiviti antimikrob HD5.

Analisis imunoblot dan ELISA juga menunjukkan bahawa HD5 dirembeskan ke dalam air kencing pada tahap rendah. Memandangkan saiz (8.1 kDa dan 3.7 kDa) dan cas positif proHD5 dan HD5 yang diproses sepenuhnya, ada kemungkinan beberapa peptida HD5 kencing berasal, sekurang-kurangnya sebahagiannya, daripada turasan plasma. Namun, terdapat sedikit bukti yang menunjukkan bahawa HD5 berterusan dalam plasma [27]. Di samping itu, untuk muncul dalam air kencing, HD5 perlu melepaskan mekanisme penyerapan peptida yang cekap dalam tubul proksimal [6,36]. Akhirnya, sampel air kencing yang digunakan menjalani sentrifugasi sebelum ujian dilakukan, mengeluarkan sumber selular HD5. Pada kepekatan yang dikesan, HD5 kencing tidak mungkin menjadi antimikrob secara langsung terhadap mikroorganisma uropatogenik kerana HD5 yang diproses sepenuhnya mempunyai kepekatan perencatan minimum (MIC) antara 6–10 mg/mL terhadap bakteria uropatogen gram negatif biasa [15]. Walau bagaimanapun, kepekatan permukaan mukosa mungkin lebih tinggi. Tambahan pula, analisis imunoblot menunjukkan bahawa kepekatan HD5 jauh lebih besar dalam buah pinggang. Keputusan ini menunjukkan bahawa HD5 terlibat dalam pertahanan mukosa saluran kencing. Corak analog dilihat denganhBD1, di mana kepekatan urin hBD1 tidak mencukupi untuk mempamerkan aktiviti antimikrob tetapi kepekatan peptida yang lebih tinggi dikesan berhampiran tubul renal [6,31].

Kerana IHC menunjukkan bahawa proHD5 adalah bentuk utama HD5 dalam buah pinggang dan kerana kedua-dua matang dan proHD5 dikesan dalam air kencing, kami membuat spekulasi bahawa HD5 terutamanya dirembeskan sebagai molekul prekursor dan kemudian menjalani pemprosesan proteolitik untuk menghasilkan bentuk matang - serupa dengan gastrousus. dan saluran genitouriner [11,30,37]. Dalam usus kecil, sel Paneth menghasilkan trypsin, yang membelah propeptida HD5 supaya peptida yang diproses sepenuhnya adalah bentuk utama dalam lumen usus [37]. Dalam uretra lelaki, pemprosesan utama dan enzim pengaktifan untuk HD5 ialah protease neutrofil yang disumbangkan oleh

neutrofil direkrut ke tapak jangkitan [11]. Sumbangan trypsinogen epitelium, trypsin kencing dan/atau protease neutrofil pada pemprosesan HD5 dalam saluran kencing semasa jangkitan masih perlu ditentukan. Selain itu, kesan perubahan dalam persekitaran kencing pada fungsi HD5 (perubahan dalam osmolariti, pH, dan kepekatan kationik) juga masih perlu ditentukan.

Kesimpulannya, ini adalah kajian pertama untuk mengenal pasti dan mengukur ekspresi dan pengeluaran HD5 dalam saluran kencing. Keputusan kami menunjukkan bahawa HD5 ialah AMP yang berasal dari epitelium yang mungkin memainkan peranan penting dalam imuniti semula jadi uroepitelium manusia yang menghalang pemindahan patogen yang menyerang ke dalam peredaran. Penjelasan tentang faktor-faktor yang mengawal pengeluaran HD5 boleh memberi gambaran baru tentang patogenesis UTI pada pesakit yang berisiko untuk UTI dan pesakit dengan jangkitan kronik.

Kaedah

Kelulusan belajar

Keizinan bertulis yang dimaklumkan diperoleh daripada semua pesakit yang mengambil bahagian dalam kajian ini. Bagi subjek yang berumur kurang daripada 18 tahun, kebenaran bertulis ibu bapa/penjaga telah diperolehi. Lembaga Semakan Institusi Hospital Kanak-Kanak Nationwide (NCH) meluluskan kajian ini bersama-sama dengan proses persetujuan dan dokumen (IRB07-00383).

Tisu Manusia dan Sampel Air Kencing

Ureter distal dan tisu pundi kencing (n= 4) yang tidak dijangkiti diperoleh daripada kanak-kanak yang menjalani implantasi semula ureter atas sebab selain daripada jangkitan berulang. Sampel buah pinggang yang tidak dijangkiti (n=6) diperoleh daripada pesakit yang menjalani nefrectomy untuk tumor buah pinggang. Sampel tisu bebas daripada tanda makroskopik penyakit atau keradangan. Tisu buah pinggang daripada pesakit dengan pyelonephritis kronik telah disediakan oleh Rangkaian Tisu Manusia Koperasi (n=6) [38]. Dua ahli patologi bebas mengesahkan diagnosis histopatologi pyelonephritis. Sampel tisu dibekukan atau dipelihara sebagai bahagian yang dibenamkan parafin tetap formalin neutral. Bahagian tisu buah pinggang yang tidak dijangkiti telah dibedah ke dalam korteks, medula atau pelvis buah pinggang sebelum disimpan(n=4).

Sampel air kencing yang tidak dijangkiti dan dijangkiti diperoleh daripada kanak-kanak yang dihantar ke jabatan kecemasan NCH atau klinik nefrologi. Diagnosis UTI dibuat oleh budaya air kencing yang positif menurut American Academy of PediatricsGuidelines [39]. Semua sampel air kencing yang dijangkiti mempunyai.106 CFU/mL E.coli. Nilai pH air kencing adalah antara 5.5 hingga 8.5 (min air kencing 6.9). Komposisi ion urin tidak diukur. Sampel air kencing telah disentrifugasi untuk mengeluarkan sedimen air kencing, dan koktel perencat protease telah ditambah (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).