Kesan Angiotensin II terhadap Pengeluaran Erythropoietin dalam Buah Pinggang dan Hati

Untuk maklumat lanjut. kenalantina.xiang@wecistanche.com
Abstrak: Thebuah pinggangadalah tapak utama penghasilan erythropoietin dalam badan. Kami membangunkan kaedah baharu untuk pengesanan protein EPO melalui pembongkaran Barat yang digabungkan dengan deglycosylation. Pengesanan Epo deglycosylated membolehkan pemeriksaan perubahan kecil dalam pengeluaran Epo. Menggunakan kaedah ini, kami menyiasat kesan angiotensin II(ATII) pada pengeluaran Epo dalam buah pinggang. ATII merangsang kepekatan Epo plasma; Ekspresi mRNA Epo, HF2a, dan PHD2 dalam segmen nefron dalam korteks buah pinggang dan medula luar; dan ekspresi protein Epo dalam korteks buah pinggang. Hibridisasi in situ dan imunohistokimia mendedahkan bahawa ATII merangsang mRNA Epo dan ekspresi protein bukan sahaja dalam tubul proksimal tetapi juga dalam saluran pengumpul, terutamanya dalam sel-sel berinterkalasi. Data ini menyokong peraturan pengeluaran EPO dalam buah pinggang oleh sistem renin-angiotensin-aldosteron (RAS).

Kata kunci: erythropoietin; angiotensin I; sistem renin-angiotensin-aldosteron; deglycosylation; Western blotting; HIF2 ; tubul proksimal; saluran pengumpulan

Klik untuk mengetahui kegunaan cistanche

1. Pengenalan

Erythropoietin (EPO)merangsang pengeluaran eritrosit dalam sumsum tulang[1]. Hipoksia dan anemia merangsang pengeluaran Epo oleh buah pinggang [1-4]. Hipoksia yang teruk dan anemia teruk menyebabkan peningkatan lebih daripada 500-kali ganda dalam kepekatan Epo serum [5]. Walau bagaimanapun, keadaan sedemikian jarang berlaku dan kebanyakan orang tidak mengalaminya semasa hidup mereka. Kepekatan EPO serum pada orang normal adalah rendah dan ekspresi protein Epo dalam buah pinggang kawalan terlalu rendah untuk dikesan [5-8]. Kami membangunkan kaedah penghapusan Barat yang baharu dan mendapati bahawa Epo terdeglycosylated ialah penanda tepat bagi ekspresi Epo [5,9]. Protein EPO dalam buah pinggang dikesan pada 34-43 kDa, dan deglycosylation menggunakan PNGase mengalihkan jalur kepada 22 kDa. Jalur Eoo luas tertumpu kepada jalur 22 kDa yang sempit, yang mengakibatkan peningkatan sensitiviti pengesanan sebanyak 10-100-kali ganda [5,9]. Oleh itu, pengesanan perubahan kecil dalam pengeluaran Epo telah menjadi mungkin.

Sistem renin-angiotensin-aldosteron (RAS) mengawal air buah pinggang dan perkumuhan elektrolit untuk mengekalkan homeostasis cecair badan [10,11]. Perencat RAS menyebabkan anemia dengan mengurangkan pengeluaran Epo. Kim et al. melaporkan bahawa angiotensin II (ATI) meningkatkan pengeluaran Epo melalui angiotensin 1 reseptor(AT1R)-pengantara tindak balas pertumbuhan awal-1(Egr-1) ​​dalam sel-sel O buah pinggang manusia 786-[12,13 ] Kato et al. melaporkan bahawa tikus transgenik yang mempunyai gen renin dan angiotensinogen menunjukkan erythrocytosis dan tikus kalah mati yang kekurangan renin dan angiotensinogen menunjukkan anemia [14,15]. Anemia tikus angiotensinogen-knockout telah diselamatkan oleh infusi ATII, menunjukkan bahawa laluan genetik daripada angiotensinogen kepada AT memainkan peranan penting dalam pengeluaran Epo yang disebabkan oleh ATII. Laporan ini mencadangkan bahawa pengeluaran Epo dikawal bukan sahaja oleh hipoksia atau anemia tetapi juga oleh RAS [4,12,14-18]. Dalam laporan kami sebelum ini, kami menunjukkan bahawa aldosteron merangsang pengeluaran Epo oleh sel-sel interkalasi saluran pengumpul [7]. Dalam laporan ini, kami mengkaji kesan ATII pada pengeluaran Epo olehbuah pinggangdanhati.

Maklumat lanjutan:Cistanchebersifat manis, masin dan hangat. Ia tergolong dalam meridian buah pinggang dan usus besar. Cistanche boleh melindungimiokardium iskemia, menurunkan lipid darah, menentang aterosklerosis, dan antitrombosis, mengurangkan rintangan vaskular periferi, menurunkan tekanan darah, dan menentang hati berlemak dan aktiviti farmakologi lain. JumlahglukosidaCistanche boleh meningkatkan kemandirian hepatosit kultur primer dengan ketara Dalam erti kata lain, jumlah glukosida Cistanche boleh mengurangkan apoptosis dengan meningkatkan ekspresi gen perencatan dan mengurangkan ekspresi gen pro-apoptosis melalui apoptosis. apoptosis dan nekrosis, meningkatkan kadar survival sel dan mencapai kesan perlindungan pada hepatosit primer. Dalam eksperimen tetikus, 15 peratus air rebusan Cistanche boleh membaiki struktur tisu sel hati dan meningkatkan kandungan glikogen hepatik pada tikus yang mengalami senaman tekanan, untuk mencapai kesan perlindungannya pada hati.

2. Keputusan

2.1.Kepekatan Epo Plasma

Pentadbiran ATI meningkatkan kepekatan Epo plasma daripada 1.4 ± 0.2 kepada 2.9 ±0.3 mIU/mL (Rajah la).

2.2.Epo mRNA Ekspresi dalam Korteks Renal dan Microdissected Proximal Convoluted Tubul (PCT) dan Medullary Thick Ascending Limbs (MAL)

ATII merangsang ekspresi Epo dan HIF2& mRNA dalam korteks buah pinggang sebanyak 13.2±4.7 dan11.4±0.6kali sebanyak A1dan A10, masing-masing(n=3-4)dan9.6±3.7 dan8 .6±2.6 kali ganda oleh A1 dan A10, masing-masing (n=3-4)(Rajah lbc).Dalam PCT yang dibedah mikro, ATI meningkatkan mRNA Epo sebanyak 3.4±0.7 dan 2.4± 0.2 kali sebanyak 10-9 M dan 10-6M ATII, masing-masing (n=3)dan HIF2& mRNA sebanyak 2.0±{{5{{ 54}}}}.2 dan 2.3± 0.8 kali sebanyak 10-9M dan 10-6 M ATII, masing-masing (n=3)(Rajah 1ld,e). ATII juga meningkatkan ekspresi mRNA Epo dalam MAL sebanyak 4.3±1.0 dan6.5±2.0kali sebanyak 10-M dan10-6MATImasing (n=3)(Rajah1f

2.3. Hibridisasi In Situ Epodan Kesan ATII

Ekspresi mRNA EPO diperhatikan dalam nefron kortikal di bawah keadaan basal, seperti yang dilaporkan sebelum ini [19].ATII merangsang ekspresi mRNA Epo dalam PCT, MAL, dan saluran pengumpul kortikal dan medulla (CCD dan OMCD) selepas 2 jam (Rajah 2:2a, 2d). ). Ekspresi mRNA HIF2a meningkat dalam kebanyakan segmen nefron dan sel peritubular kedua-dua korteks dan medulla (Rajah 2:2-4b,2-4e). Ekspresi mRNA PHD2 juga meningkat dalam MAL, CCD dan OMCD (Rajah 2:3-4c, 3-4f).ATII gagal mendorong ekspresi mRNA Epo dalam sel peritubular korteks buah pinggang.

2.4. Analisis Western Blotting bagi Pengeluaran Epo Terinduksi ATI dalam Buah Pinggang dan Hati

Kesan fludrocortisone, agonis aldosteron, telah diperiksa menggunakan Western blotting yang digabungkan dengan deglycosylation. Jalur Epo terdeglycosylated pada 22 kDa diperhatikan dalam tikus kawalan (C2, C4, dan C6 dalam Rajah 3a sebelah kanan), menunjukkan bahawa Epo dihasilkan dalam tikus kawalan. Fludrocortisone secara signifikan merangsang ekspresi Epo deglycosylated pada 2 dan 4 jam selepas suntikan. Ungkapan menjadi sama dengan tikus kawalan selepas 6 jam. Seterusnya, kesan ekspresi ATIIon Epo telah diperiksa. Kesan ATI pada pengeluaran Epo adalah lebih besar dalam korteks buah pinggang berbanding medula luar buah pinggang (Rajah 3b). Kesan ATI pada pengeluaran Epo tidak diperhatikan dalam medula dalaman buah pinggang (data tidak ditunjukkan). Ekspresi protein Epo yang bergantung kepada dos ATI (Rajah 3c).AT meningkatkan pengeluaran Epo terdeglycosylated dalam korteks buah pinggang sebanyak 1.6±0.2 dan3.4±0.3 kali sebanyak1dan 10 mg/kg masing-masing. (n=6-8). Sebaliknya, pengeluaran EPO tidak dilihat di hati, walaupun selepas pentadbiran ATII (Rajah 3d).

2.5. Imunohistokimia Pengeluaran Epo oleh Buah Pinggang

Oleh IHCof tikus, dalam keadaan basal, pewarnaan Epo didapati dari tubul proksimal ke saluran pengumpul (tubul proksimal

3. Perbincangan

Pengesanan Epo oleh Western blotting adalah sukar sehingga kami menemui ujian berpasangan deglycosylation [5,7,9,20-26]. Dalam hipoksia dan anemia yang teruk, pengeluaran EPO dirangsang ke tahap yang tinggi dan pengesanan Epo adalah mudah [2-5]. Walau bagaimanapun, keadaan sedemikian jarang berlaku dalam vivo. Kami mendapati bahawa Epo dihasilkan oleh buah pinggang walaupun dalam keadaan terkawal. Pengesanan Epo dalam buah pinggang kawalan adalah sukar, walaupun dengan Western blotting kami. Deglikosilasi Epo oleh PNGase meningkatkan keamatan jalur Epo pada 22 kDa, membolehkan untuk mengesan tahap EPO yang lebih rendah. Menggunakan kaedah ini, kami menyiasat kesan fludrocortisone dan ATII pada pengeluaran Epo.

ATll meningkatkan ekspresi mRNA Epo dalam korteks buah pinggang. Seterusnya, kami mengkaji kesan ekspresi mRNA Epo ATIIon dalam PCT terdisseksi mikro dan MAL.ATll meningkatkan ekspresi mRNA Epo dalam PCT dan MAL, Kami juga mengkaji kesan ATI oleh hibridisasi in situ (ISH). ISH mendedahkan bahawa ATI meningkatkan ekspresi mRNA Epo bukan sahaja dalam

tubul proksimal tetapi juga dalam tubul distal. Tambahan pula, kami menyiasat ekspresi protein Epo oleh Western blotting. Deglycosylation-coupled Western blotting telah digunakan dalam kajian ini. Keputusan menunjukkan bahawa ATIl bergantung kepada dos meningkatkan ekspresi protein Epo dalam buah pinggang tetapi tidak dalam hati. Kepekatan Epo plasma meningkat sebanyak 2-3-kali ganda, yang serasi dengan laporan sebelumnya 4,68,12. Tahap pengeluaran EPO dalam darah ini tidak boleh diukur dengan Western blotting. Walau bagaimanapun, penghapusan Barat yang digabungkan dengan deglycosylation menjadikan pengesanan mungkin, dan ATII meningkatkan ekspresi protein Epo dengan ketara dalam buah pinggang. Imunohistokimia juga menunjukkan bahawa ATlI meningkatkan ekspresi protein Epo dalam kedua-dua tubul proksimal dan distal. Kesan ATII adalah sama dengan fludrocortisone dalam sel interkalasi saluran pengumpul [7]. Kajian kami adalah yang pertama yang menunjukkan penyetempatan intrarenal pengeluaran Epo yang disebabkan oleh ATII oleh ISH dan IHC.

AT Il juga meningkatkan ekspresi mRNA HIF2 dalam korteks buah pinggang dan tubul berbelit proksimal, menunjukkan bahawa peningkatan dalam pengeluaran Epo oleh ATII disebabkan oleh rangsangan HIP2, sama seperti aldosteron [7l. Kajian kami menunjukkan bahawa pengeluaran EPO oleh buah pinggang dikawal oleh sistem renin-angiotensin-aldosteron. Peranan ATIⅡ pada pengeluaran Epo dalam buah pinggang telah dicadangkan [4,12,16-18]. Jelkmann mencadangkan kesan tidak langsung angiotensin Ⅱl sebagai faktor pertumbuhan untuk pro-genitor erythrocytic myeloid |4|. Kim et al. melaporkan dengan jelas bahawa angiotensin IImerangsang pengeluaran Epo melalui pengaktifan Egr{12}} pengantara AT1R oleh kinase protein teraktif p21Ras-mitogen/kinase(ERK) kinaseERK/2 yang dikawal selia isyarat ekstraselular dalam sel O buah pinggang manusia [12.13 ]. Peranan laluan genetik dari angiotensinogen ke ATII telah diperiksa oleh Kato et al. [14,15]. Mereka menunjukkan bahawa tikus transgenik yang mempunyai gen renin dan angiotensinogen mempamerkan erythrocytosis. Mereka juga melaporkan bahawa tikus kalah mati yang kekurangan renin dan angiotensinogen menunjukkan anemia yang diselamatkan oleh infusi ATIl, menunjukkan bahawa laluan genetik daripada angiotensinogen kepada ATll memainkan peranan penting dalam pengeluaran Epo yang disebabkan oleh ATI. Mekanisme pengeluaran Epo di bawah keadaan hipoksik dan basal yang teruk mungkin berbeza, tetapi beberapa langkah seperti rangsangan HIF2 mungkin sama. Keupayaan untuk menghasilkan Epo adalah berbeza antara sel interstisial buah pinggang dan nefron. Pengesanan HIF2 oleh Western blotting tidak berjaya dalam kajian ini; kami tidak dapat mengesan jalur HIF2 pada sekitar 115 kDa, walaupun dengan menggunakan sc-46691, sc-13596, Ab8365 dan NB100-122.

4. Bahan dan Kaedah

4.1.Bahan dan Haiwan

Tikus Sprague-Dawley jantan (SLC Jepun, Hamamatsu, Jepun) dan tikus C57BL/6J (Charles River Jepun, Yokohama, Jepun) telah digunakan. Tikus diberi 1 atau 10 mg/kg ATI(A1 dan A10, masing-masing), dan tikus diberi 5 mg/kg ATII melalui suntikan intraperitoneal. Kumpulan kawalan disuntik dengan garam. Selepas 4 jam, tikus disuntik dengan anestetik campuran (0.3 mg/kg medetomidine, 4.0 mg/kg midazolam dan 5.0 mg/kg butorphanol), dan darah adalah diambil dari aorta abdomen. Buah pinggang dan hati telah dibedah selepas meresap 20 mL PBS ke dalam aorta abdomen. Dalam sesetengah eksperimen, hirisan buah pinggang diinkubasi dalam kolagenase(jenis 1, C-0130; Sigma-Aldrich, Burlington, NJ, USA) dan kompleks vanadil ribonukleosida (R-3380; Sigma-Aldrich) selama 20 minit , dan PCT dan MAL telah dipisahkan secara mikro, seperti yang diterangkan sebelum ini [7]. Microdissected PCT atau MAL diinkubasi dengan ATI atau kenderaan selama 2 jam pada 37 darjah. Tikus telah dibius dengan 1.5 peratus isoflurane dalam 30 peratus O2 (campuran 100 peratus O, dan udara) selepas 2.4, dan 6h. Buah pinggang segera dikeluarkan dan dipotong secara membujur. Potongan buah pinggang utama telah diperbaiki dengan rendaman dalam 4 peratus paraformaldehid/0.1 M penampan fosfat sejuk ais semalaman dan diproses dalam parafin untuk analisis histologi.

Protokol kami telah disemak dan diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Institusi Pusat Perubatan Universiti Kitasato (2018032, 2019029) dan Pusat Pengajian Perubatan Universiti Kitasato (2019-141).

4.2. PCR Masa Nyata

RNA diekstrak daripada buah pinggang, hati, dan PCT atau MAL yang didisseksi mikro menggunakan Qiacube dan RNeasy Mini Kit (74106; Qiagen, Venlo, Belanda), seperti yang diterangkan sebelum ini [5]. cDNA telah disintesis menggunakan Kit Sintesis cDNA untai pertama Takara PrimeScript II (6210; Takara, Otsu, Jepun). PCR masa nyata telah dilakukan menggunakan probe daripada Applied Biosystems(GAPDH Rn01775763 g1, Epo Rn00667869 m1.HIF2 Rn00576515 m1. HIFla Rn01472831 m1, PHD2 Rn00710295 m1, Ekspresi TaqLR, MAXM, TaqLR, Ekspresi TaqLR dan USA). dalam kawalan dan tikus ATII dibandingkan menggunakan AACT.

4.3. Hibridisasi Dalam Situ

ISH telah dilakukan, seperti yang diterangkan sebelum ini [5,27]. Secara ringkasnya, jumlah RNA daripada buah pinggang tikus (636612; BDBioscieces Clontech) telah ditranskripsikan secara terbalik dengan kit RNA PCR (AMV), ver. 3.0 (RR019; Takara) dan probe cRNA untuk Epo (no. akses GenBank NM 007942).HIF2 (Penyertaan GenBank no. NM 010137), atau PHD2(nombor penyertaan GenBank NM_053207) telah dijana dengan primer PCR berekor rantau promoter T7. Bahagian hibrid telah dirawat secara berturut-turut dengan 0.1 peratus avidin, 0.01 peratus larutan biotin, 0.5 peratus kasein/TBS, antibodi serpihan anti-DIG F (ab') biri-biri berkonjugasi lobak pedas (HRP) (11207733910; Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) larutan tyramide .biotinylated, dan streptavidin konjugasi HRP (P0397; DakoCytomation, Glostrup, Denmark). Bahagian telah diwarnakan menggunakan sistem cecair DAB (BSB 0016: Bio SB.Santa Barbara.CA, USA) dan hematoxylin Mayer (30002; Muto Pure Chemicals, Tokyo, Jepun).

4.4. Imunohistokimia

Bahagian buah pinggang telah dicemari imun, seperti yang diterangkan sebelum ini [7,28]. Secara ringkasnya, bahagian tersebut disekat dengan 5 peratus serum kambing biasa dan bertindak balas dengan antibodi Epo anti-manusia poliklonal arnab (sc-7956,1:50; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), diikuti oleh Histofine Noda Mudah MAX-PO(414341F; Nichirei Biosains, Tokyo, Jepun). Bahagian telah diwarnakan menggunakan sistem cecair DAB dan diwarnakan dengan hematoksilin Mayer.

Imej diperoleh menggunakan mikroskop optik (Axioplan 2; Carl Zeiss, oberkochen, Jerman) dengan kamera digital (AxioCam MRcb; Carl Zeiss). Imej yang ditangkap dianalisis menggunakan sistem analisis imej (AxioVision Rel.4.6; Carl Zeiss).

4.5. Analisis Western Blotting dengan Deglycosylation

Analisis Western blotting telah dilakukan, seperti yang diterangkan sebelum ini [4,6,7]. Protein dikumpul daripada korteks buah pinggang dan hati menggunakan CelLytic MT(C-3228; Sigma-Aldrich) dan digunakan untuk Western blotting. Sampel buah pinggang dan hati telah dideglikosilasi menggunakan N-glycosidase F（PNGase,4450; Takara, seperti yang diterangkan sebelum ini. Secara ringkasnya, 1 μL 10 peratus SDS telah ditambah kepada 10μL sampel buah pinggang atau hati dan direbus selama 3 minit. Kemudian, 11 uL penimbal penstabil 2x telah ditambah dan sampel dipusingkan. Selepas penambahan 1-2 μL PBS atau PNGase, sampel diinkubasi dalam mandi air selama 20 jam pada 37 darjah . Selepas pengeraman, sampel dipusing ke bawah dan supernatan dikumpulkan dan digunakan untuk SDS-PAGE (10-20 peratus gel kecerunan: Cosmo Bio No,414893. Tokyo. Jepun). Penampan penstabil 2× mengandungi 125 mM Tris- HCl (pH8.6),48mMEDTA,4 peratus Nonidet P-40 dan 8 peratus 2-mercaptoethanol. Epo manusia rekombinan (rhEpo, 587102; BioLegend, San Diego, CA, Amerika Syarikat) digunakan sebagai kawalan positif. Selepas SDS-PAGE, protein dipindahkan ke membran PVDF (Immobilon-P; IPVH00010: Merck Millipore, Burlington.NI.USA) dengan 120 mA selama 60-90 min. Membran telah disekat dengan susu skim 5 peratus (Morinaga, Jepun) selama 60 minit dan diinkubasi dengan antibodi terhadap Epo (sc-5290, 1:500; Santa Cruz Biotechnology) selama 60 minit pada suhu bilik. Selepas mencuci, membran diinkubasi dengan antibodi sekunder (IgG anti-tikus kambing(H tambah L);115-035-166, 1:5000; Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA, USA) selama 60 minit. Jalur telah divisualisasikan oleh ECL Select Western Blotting Detection System (RPN2235; GE Healthcare Bio-Science AB, Chicago, IL, USA) dan LAS4000 (Fujifilm, Tokyo, Jepun).

4.6. Pengukuran Kepekatan Epo Plasma

Plasma dikumpulkan daripada tikus kawalan dan ATI yang dirawat pada 4 jam selepas suntikan peritoneal. Kepekatan EPO plasma diukur oleh CLEIA (SRL, Tokyo, Jepun) menggunakan Access Epo oleh Beckman Coulter (Brea, CA, Amerika Syarikat).

4.7. Plasma E

Data dinyatakan sebagai min ± SEM. Kepentingan statistik dilakukan menggunakan Statistik Excel (BellCurve, Tokyo, Jepun). Kepentingan statistik dianalisis menggunakan ujian-f atau analisis bukan parametrik menggunakan ujian Kruskal-Wallis dan pelbagai perbandingan oleh ujian Shirley-Williams. p-Nilai<0.05 were="" considered="" statistically="">

5. Kesimpulan

Sebagai kesimpulan, kajian kami menunjukkan bahawa ATII meningkatkan mRNA Epo dan ekspresi protein dalam tubul renal proksimal dan distal. Digabungkan dengan kajian terdahulu kami, pengeluaran Epo oleh buah pinggang di bawah keadaan basal dikawal oleh sistem renin-angiotensin-aldosteron.