Hubungi:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Klik di sini untuk mendapatkan maklumat tentang Bahagian I (Pengenalan, bahan dan kaedah) artikel ini.

Bagaimanakah ubat-ubatan Cina yang menguatkan buah pinggang menghalang apoptosis neuron dopaminergik?

Shaogang Lin,1 Shuifen Ye,2 Jinmu Huang,1 Yun Tian,3 Yihui Xu,2 Mengqi Wu,2 Jingxia Wang,2 Songying Wu,4 dan Jing Cai, MD, Ph.D.2

BAHAN DAN KAEDAH

Reka bentuk

Pemerhatian perbandingan in vitro farmakologi serum.

Masa dan tetapan

Eksperimen telah dijalankan di Makmal Sitobiologi, Universiti Perubatan Tradisional Cina Fujian, China dari 2010 hingga 2011.

Bahan

Haiwan

Sebanyak 60 ekor tikus Wistar jantan, berumur 8 minggu, seberat 200–220 g, telah dibeli daripada SLAC Laboratory Animal Co., Ltd., Shanghai, China (No. lesen SCXK (Hu) {{4} }). Mereka ditempatkan di Pusat Haiwan Makmal Universiti Perubatan Tradisional Cina Fujian di China pada 20–22 darjah dengan kelembapan 40–60 peratus dan pencahayaan dari 7:00 pagi hingga 7:00 malam Makanan disediakan oleh Pusat Haiwan Makmal Universiti Perubatan Tradisional Cina Fujian. Semua prosedur eksperimen adalah mengikut Cadangan Panduan untuk Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Makmal, yang dirumuskan oleh Kementerian Sains dan Teknologi China[33].

Cistanche untuk meningkatkan fungsi buah pinggang

Dadah

Herba Epimedii, bahagian udara Epimedium sagittatum Maxim berasal dari Wilayah Sichuan, China; Semen Cuscutae, benih matang kering Cuscuta Chinensis Lam., berasal dari Wilayah Shandong, China; dan Herba Cistanches, daun sisik chylocaulous Cistanche deserticola YCMa, berasal dari Wilayah Autonomi Uygur Xinjiang. Semua ubat disediakan oleh Fujian Pharmaceutical Co., Ltd., Wilayah Fujian, China. Herba Epimedii, Semen Cuscutae dan Herba Cistanches, 97.2 g setiap satu, direndam dalam bekas rebusan yang mengandungi 1 500 mL air suling, dipanaskan dengan cepat, direbus, dikekalkan pada 100 darjah hingga membenarkan komponen aktif ubat-ubatan untuk larut dan terpeluwap kepada 540 mL. Jumlah kasar dadah dalam larutan dadah ialah 0.180 g/mL. Penyelesaian itu ditapis, dimasukkan ke dalam botol, dimeteraikan, disterilkan, dan disimpan pada suhu 4 darjah. Selegiline, 5 mg × 10 tablet setiap kit, dibeli daripada Nanjing Sike Pharmaceutical Co., Ltd. (Wilayah Jiangsu, China). Selegiline, 21.6 mg, telah dilarutkan dalam air suling dua kali ganda untuk menyediakan larutan air 540 mL. Kepekatan larutan ubat ialah 0.04 mg/mL. Larutan ubat diletakkan dalam botol, ditutup, disterilkan, dan disimpan pada suhu 4 darjah.

Kaedah

Penyediaan serum yang mengandungi dadah

Kumpulan Herba Epimedii, Semen Cuscutae, Herba Cistanches dan selegiline telah diserap secara intragastrik dengan serum yang mengandungi ubat yang mengandungi 0.180 g/mL Herba Epimedii, Semen Cuscutae atau Herba Cistanches, atau {{ 5}}.04 mg/mL selegiline, dua kali sehari, pada dos 0.1 mL/kg, selama 14 hari berturut-turut. Kumpulan serum kosong ditadbir dengan jumlah air suling yang sama. Haiwan itu telah kehilangan makanan dan air selama 12 jam selepas pentadbiran terakhir. Tikus telah dibius dengan suntikan intraperitoneal dengan 0.3 mL/100 g ketamin hidroklorida. Darah telah diambil dari aorta abdomen dan disentrifugasi pada 1 000 r/min selama 15 minit. Supernatan telah dituai, dinyahaktifkan dalam mandi air pada suhu 56 darjah selama 30 minit, ditapis melalui membran mikroporous 0.22 μm, dan disimpan pada -20 darjah.

Penyediaan larutan 50×Sato

Campuran 60 mL DMEM/F12 (Gibco, Carlsbad, CA, USA), 15 mg insulin lembu (Sigma, St. Louis, MO, Amerika Syarikat), 15 mg transferrin (Sigma), 145.8 mg natrium piruvat (Biosharp, Korea), 12 mg putrescine (Solarbio, Beijing, China), 25 μL natrium selenit (1 mg/mL, 100 mg/100 mL H2O; Sigma), dan 100 μL progesteron (0.315 mg /mL, 15.75 mg/50 mL; Biosharp) telah tertakluk kepada ultrasound dalam mandi ais selama 1.5 jam, ditapis melalui penapis 0.22 μm, diasingkan dan disimpan pada -20 darjah .

Cistanche untuk merawat fungsi buah pinggang

Kultur sel

Sel telah disemai dalam DMEM/F12 ditambah dengan 5 peratus (v/v) serum lembu janin (Gibco), 1 peratus (v/v) glutamin (Sigma), 2 peratus (v/v) 50×Sato's larutan, dan 2 peratus (v/v) penisilin/streptomisin. Sel kemudiannya diinkubasi dalam 5 peratus (v/v) CO2 dan dikekalkan pada kelembapan tepu pada 37 darjah . Sel telah ditrypsin dengan 0.25 peratus (w/v) tripsin dan dilalui. Sel-sel dalam fasa logaritma dikumpulkan untuk eksperimen seterusnya.

Kesan H2O2 terhadap pertumbuhan sel MES23.5

Sel telah disemai dalam 96-plat kultur telaga (5 × 105 sel/telaga), diinkubasi dengan 50, 100, 150, 200, 300 dan 400 μmol/L larutan kultur H2O2 (Shanghai Shiyi Chemicals Reagent Co., Ltd ., Shanghai, China) selepas 24 jam selama 1, 3, 6, 9, 12, 24 jam, diikuti oleh MTT (Sigma) selama 4 jam. Larutan dalam telaga dibuang, dan 150 μL dimetil sulfoksida (Sigma) telah ditambah. Plat kultur digoncang selama 10 minit, dan penyerapan sampel pada 570 nm ditentukan menggunakan pembaca mikroplat automatik (EXL800; Biotek, Winooski, VT, Amerika Syarikat). Penyelesaian kultur DMEM/F12 yang baru disediakan digunakan sebagai kawalan negatif. Dua telaga selari ditetapkan pada setiap titik masa. Eksperimen telah dijalankan dalam tiga kali ganda.

Pengaruh serum yang mengandungi ubat pada kepekatan yang berbeza terhadap pertumbuhan sel MES23.5 yang dirawat H2O2-

Sel telah disemai dan didedahkan kepada serum yang mengandungi ubat yang mengandungi 5, 10, 15, 20, 25, dan 30 peratus (v/v) Herba Epimedii, Semen Cuscutae, Herba Cistanches, dan selegiline atau serum kosong selama 24 jam. Sel dibiakkan lagi dengan larutan kultur yang mengandungi 100 μmol/L H2O2 selama 3 jam, diikuti dengan MTT selama 4 jam. Tiga telaga selari ditetapkan dalam setiap kumpulan. Penyelesaian kultur DMEM/F12 yang baru disediakan digunakan sebagai kawalan negatif. Sel yang dikultur dalam larutan kultur yang mengandungi 100 μmol/L H2O2 dan serum kosong berfungsi sebagai kumpulan model, dan sel yang dikultur dalam serum kosong sahaja berfungsi sebagai kumpulan serum kosong. Eksperimen telah dijalankan dalam tiga kali ganda. Nilai penyerapan purata setiap kumpulan dikira sebagai kadar survival sel.

Sitometri aliran untuk ungkapan FasL, Fas, caspase-3 dan Bcl-2 dalam sel MES23.5

Sel telah disemai dan dirawat seperti sebelumnya. Sel yang dibiakkan dalam 100 μmol / L H2O2 sahaja dianggap sebagai kumpulan model. Antibodi FasL berlabel phycoerythrin dan kawalan isotype FasL (5 μL setiap satu), telah ditambah ke dalam dua tiub (BD, San Jose, CA, Amerika Syarikat), dicampur sama rata dengan sel, disimpan pada suhu bilik dalam gelap selama 15 minit, disentrifugasi pada 1 000 r/min selama 5 minit selepas penambahan 2 mL PBS. Supernatan dibuang, dan sel telah digantung semula menggunakan 500 μL PBS. Panjang gelombang peranti laser untuk sitometri aliran (Facscalibur; BD) ialah 488 nm. Kadar ekspresi sel positif FasL dianalisis dan dikira oleh perisian Cell Quest (BD). Kadar ekspresi sel Fas-, caspase-3- dan Bcl{14}}positif telah dikesan menggunakan kaedah yang sama.

ELISA untuk kandungan faktor pertumbuhan saraf, faktor neurotropik yang berasal dari otak, dan faktor neurotropik yang berasal dari sel glial dalam sel

Sel telah disemai dan dirawat seperti yang diterangkan sebelum ini. Supernatan telah dituai, dan faktor pertumbuhan saraf, faktor neurotropik yang berasal dari otak, dan kandungan faktor neurotropik yang berasal dari sel glial diukur mengikut arahan pengeluar (BD). Penyerapan diukur pada 450 nm menggunakan pembaca mikroplat automatik (EXL800; Biotek, Winooski, VT, Amerika Syarikat).

Analisis statistik

Keputusan dinyatakan sebagai min ± SD. Data dianalisis menggunakan perisian SPSS 18.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Analisis sehala bagi varians telah dijalankan diikuti dengan perbandingan berbilang ujian perbezaan terkecil. Nilai P < 0.05="" dianggap="" signifikan="" secara="">

Cistanche untuk fungsi buah pinggang

Ucapan terima kasih

Kami mengucapkan terima kasih kepada Chen B, Makmal Neurobiologi, Universiti Perubatan Capital, kerana dengan murah hati menyediakan MES23.5dopaminergiksel saraf.

Nota kaki

Pembiayaan: Kajian ini disokong oleh Dana Pembangunan Perubatan Integratif Chen Keji, No. CKJ2010025 dan Asas Utama Pembangunan Masyarakat di Wilayah Fujian, No. 2013Y0059.

Konflik kepentingan: Tiada yang diisytiharkan.

Kelulusan etika: Kajian ini mendapat kebenaran daripada Jawatankuasa Etika Haiwan Universiti Perubatan Tradisional Cina Fujian, China.

(Disemak oleh Diwakarla S, Norman C, Cheng HY, Wang JM)

(Diedit oleh Wang LM, Su LL, Li CH, Song LP, Liu WJ, Zhao M)

RUJUKAN

[1] Zhang ZX, Roman GC, Hong Z, et al. Penyakit Parkinson di China: kelaziman di Beijing, Xian, dan Shanghai. Lancet. 2005;365(9459):595–597. [PubMed] [Google Scholar]

[2] He JC, Wang WW. Kesan Tianma Gauteng Yin padaapoptosisdaripadadopaminergikneuron dalam tikus model penyakit Parkinson. Zhongyi Zazhi. 2010;51(11):1024–1027. [Google Scholar]

[3] Perier C, Bové J, Vila M. Mitokondria dan kematian sel terprogram dalam penyakit Parkinson:apoptosisdan seterusnya. Isyarat Redoks Antioksida. 2012;16(9):883–895. [PubMed] [Google Scholar]

[4] Gallagher DA, Schapira AH. Etiopathogenesis dan rawatan penyakit Parkinson. Curr Top Med Chem. 2009;9(10):860–868. [PubMed] [Google Scholar]

[5] Rangasamy SB, Soderstrom K, Bakay RA, et al. Terapi faktor neurotropik untuk penyakit Parkinson. Prog Brain Res. 2010;184:237–264. [PubMed] [Google Scholar]

[6] Zuccato C, Cattaneo E. Faktor neurotropik yang berasal dari otak dalam penyakit neurodegeneratif. Nat Rev Neurol. 2009;5(6):311–322. [PubMed] [Google Scholar]

[7] Cai DF, Chen XQ, Gao Y. Kesan resipi yangban semak pada fungsi nigrostriatal dalam tikus model parkinsonian selepas rawatan levodopa jangka panjang. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 2002;22(1):43–46. [PubMed] [Google Scholar]

[8] Yang MH, Wang HM, Liu Y. Kesan Bushen Huoxue Decoction pada reseptor anak yatim dan tyrosine hydroxylase dalam otak tikus dengan penyakit Parkinson. Chin J Integr Med. 2011;17(1):43–47. [PubMed] [Google Scholar]

[9] Li SD, Liu Y, Yang MH. Kesan semak Huo Xue yin pada kandungan NF-kB otak dan NO dalam tetikus model penyakit Parkinson. J Tradit Chin Med. 2012;32(1):67–70. [PubMed] [Google Scholar]

[10] Tian Y, Cai J, Chen XZ, et al. Kesan perlindungan khasiat Cinabuah pinggangherba pada neuron neuron striatal dalam tetikus model penyakit Parkinson. Zhongguo Laonian Xue Zazhi. 2011;31(3):440–443. [Google Scholar]

[11] Yu H, Li YH, Feng XL, et al. Pengenalpastian dan ujian aktiviti tyrosine hydroxylase dalam sel MES23.5. Zhongguo Shengwu Huaxue yu Fenzi Shengwu Xuebao. 2004;20(1):95–100. [Google Scholar]

[12] Wang XR. Beijing: Rumah Penerbitan Perubatan Rakyat; 2007. Kaedah dan Teknologi Eksperimen Toksikologi. [Google Scholar]

[13] Lv SJ. Beijing: Akhbar Sains Perubatan China; 2010. Ujian Imunologi Klinikal. [Google Scholar]

[14] Eriksen JL, Wszolek Z, Petrucelli L. Patogenesis molekul penyakit Parkinson. Arch Neurol. 2005;62(3):353–357. [PubMed] [Google Scholar]

[15] Christen Y. Tekanan oksidatif dan penyakit Alzheimer. Am J Clin Nutr. 2000;71(2):621S–629S. [PubMed] [Google Scholar]

[16] Blandini F, Armenteros MT, Fancellu R, et al. Kesan neuroprotektif rasagiline dalam model tikus penyakit Parkinson. Exp Neurol. 2004;187(2):455–459. [PubMed] [Google Scholar]

[17] Zhang XN, Wang HH, Wang ZQ, et al. Kesan perlindungan icariin padaapoptosisdaripada neuron tikus yang dibiakkan terutamanya oleh peptida Aâ25-35. Zhejiang Daxue Xuebao: Pengharaman Yixue. 2007;36(3):224–228. [PubMed] [Google Scholar]

[18] Wang LH, Bu PC, Bao YM. Kesan neuroprotektif ekstrak Cuscuta Chinensis Lam pada kerosakan sel PC12 yang dibezakan neuron yang disebabkan oleh spesies oksigen reaktif. Xibao Shengwu Xue Zazhi. 2005;27:69–72. [Google Scholar]

[19] Sun SL, Wang B, Peng HS. Perencatan ekstrak Dodder kepada miosit jantungapoptosispada tikus yang semakin tua. Zhongguo Laonian Xue Zazhi. 2011;31:642–644. [Google Scholar]

[20] Yang JH, Hu JP, Rena K, et al. Hubungan struktur-aktiviti glikosida phenylethanoid dalam tumbuhan salsa Cistanche pada aktiviti antioksida. Zhong Yao Cai. 2009;32(7):1067–1069. [PubMed] [Google Scholar]

[21] Wu Y, Li L, Wen T, et al. Kesan perlindungan echinacoside pada hepatotoksisiti akibat karbon tetraklorida dalam tikus. toksikologi. 2007;232(1-2):50–56. [PubMed] [Google Scholar]

[22] Cheng SD. Beijing: Rumah Penerbitan Perubatan Rakyat; 2006. Penyakit Parkinson. [Google Scholar]

[23] Yang T. Beijing: Rumah Penerbitan Perubatan Rakyat; 2010. Biologi Sel. [Google Scholar]

[24] Baba N, Koji T, Itoh M, et al. Perubahan timbal balik dalam ekspresi Bcl-2 dan Bax dalam nukleus hipoglosal selepas axotomy pada tikus dewasa: kemungkinan penglibatan dalam induksi kematian sel neuron. Otak Re. 1999;827(1-2):122–129. [PubMed] [Google Scholar]

[25] Zuccato C, Cattaneo E. Faktor neurotropik yang berasal dari otak dalam penyakit neurodegeneratif. Nat Rev Neurol. 2009;5(6):311–322. [PubMed] [Google Scholar]

[26] Peterziel H, Unsicker K, Krieglstein K. TGFbeta mendorong tindak balas GDNF dalam neuron dengan pengambilan GFRalpha1 ke membran plasma. J Sel Biol. 2002;159(1):157–167. [Artikel percuma PMC] [PubMed] [Google Scholar]

[27] Hong M, Mukhida K, Mendez I. Terapi GDNF untuk penyakit Parkinson. Pakar Rev Neurother. 2008;8(7):1125–1139. [PubMed] [Google Scholar]

[28] Chaturvedi RK, Shukla S, Seth K, et al. Faktor pertumbuhan saraf meningkatkan kemandiriandopaminergikcantuman, menyelamatkan neuron dopaminergik nigral, dan memulihkan defisit fungsi dalam model tikus penyakit Parkinson. Neurosci Lett. 2006;398(1-2):44–49. [PubMed] [Google Scholar]

[29] Kavanagh ET, Loughlin JP, Herbert KR, et al. Kefungsian sel PC12 yang dilindungi NGF berikutan pendedahan kepada 6-hidroksidopamin. Biochem Biophys Res Commun. 2006;351(4):890–895. [PubMed] [Google Scholar]

[30] Baquet ZC, Bickford PC, Jones KR. Faktor neurotropik yang berasal dari otak diperlukan untuk pembentukan bilangan yang betuldopaminergikneuron dalam substantia nigra pars compacta. J Neurosci. 2005;25(26):6251–6259. [Artikel percuma PMC] [PubMed] [Google Scholar]

[31] Hung SY, Liou HC, Fu WM. Mekanisme tindakan heme oxygenase-1 terlibat dalam peningkatan ekspresi faktor neurotropik. Neurofarmakologi. 2010;58(2):321–329. [PubMed] [Google Scholar]

[32] Duarte EP, Curcio M, Canzoniero LM, et al. Neuroprotection oleh GDNF dalam otak iskemia. Faktor Pertumbuhan. 2012;30(4):242–257. [PubMed] [Google Scholar]

[33] Kementerian Sains dan Teknologi Republik Rakyat China. Cadangan Panduan Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Makmal. 2006 Sep 30; [Google Scholar]