Spektrometri Jisim Tandem Resolusi Tinggi Mengenalpasti Corak Ganglioside Tertentu dalam Penyakit Buah Pinggang Diabetes Awal Pesakit Diabetes Mellitus Jenis 2

Abstrak:

Memandangkan maklumat berharga yang diberikan oleh glycospingolipids sebagaipenanda molekuldan data terhad yang tersedia untuk pengesanan dan pencirian mereka dalam pesakit yang menderitaPenyakit buah pinggang diabetes jenis 2(DKD), kami membangunkan dan melaksanakan kaedah unggul berdasarkan spektrometri jisim (MS) resolusi tinggi (HR) dan MS (MS/MS) tandem untuk penentuan gangliosida dalam air kencing.pesakit DKD. Kajian ini tertumpu kepada: (i) ujian kebolehlaksanaan dan prestasi HR MS dan MS/MS dalam pemetaan danpenjujukan gangliosida buah pinggang dalam DM Jenis 2pesakit; (ii) penentuan perubahan dalamganglioside urin DKDpesakit diperingkat penyakit yang berbeza-normo-, mikro-, dan makroalbuminuria-dalam ujian perbandingan dengan kawalan yang sihat. Disebabkan resolusi tinggi dan ketepatan jisim, saringan MS perbandingan mendedahkan bahawa status sialylation komponen ganglioside; pengubahsuaian mereka oleh O-asetil, CH3COO−, O-fucosyl, dan O-GalNAc; serta komposisi ceramide mewakili kemungkinan penanda untuk pengesanan awal DKD, penilaian perkembangan penyakit, dan rawatan susulan. Selain itu, penyiasatan struktur oleh MS/MS menunjukkan bahawa GQ1d(d18:1/18:0), GT1 (d18:1/18:0) dan GT1b(d18:1/18:{{ 23}}) isomer dikaitkan dengan makroalbuminuria, yang memerlukan penyiasatan lanjut berhubung dengan peranannya dalam DKD.

Kata kunci: nanoelectrospray; spektrometri jisim tandem resolusi tinggi; saringan; analisis pemecahan; penyakit buah pinggang kencing manis; biomarker ganglioside

1. Pengenalan

Diabetes mellitus (DM) jenis 2 kekal sebagai cabaran terapeutik dengan kelaziman global yang sentiasa meningkat, walaupun kemajuan saintifik dalam bidang ini. Dikaitkan dengan kerosakan jangka panjang makrovaskular dan mikrovaskular yang dahsyat, DM Jenis 2 membawa kepada peningkatan kematian. Penyakit buah pinggang diabetes (DKD) adalah penyebab paling biasa penyakit buah pinggang peringkat akhir (ESRD) di negara maju dan membangun [1,2]. Oleh itu, pengesanan awal DKD dan pengurusan optimum DM Jenis 2 adalah penting untuk mengurangkan komplikasi, morbiditi dan kematian. Pada masa ini, diagnosis dan perkembangan DKD bergantung pada pengukuran albuminuria dan pengurangan berterusan dalam kadar penapisan glomerular (eGFR), kedua-dua parameter menunjukkan ramalan sederhana status buah pinggang masa hadapan. Sejarah semula jadi DKD merangkumi beberapa peringkat klinikal, termasuk yang berikut: hiperturasan glomerular awal, berlakunya mikroalbuminuria atau makroalbuminuria, penurunan kadar penapisan glomerular, dan ESRD. Walau bagaimanapun, penyelidikan baru-baru ini menganggap albuminuria sebagai penanda keadaan yang semakin merosot [3].

Dalam dekad yang lalu, minat khusus telah ditunjukkan dalam konsep subtelosentrik, mengikut mana tubul proksimal dan petak tubulointerstitial boleh mempunyai peranan penting dalam permulaan dan perkembangan DKD [4-6]. Dalam konteks ini, pembangunan biomarker glikomik prognostik dan ramalan semakin mendapat perhatian dan telah menjadi tumpuan banyak kumpulan penyelidikan selama ini [7-11].

Gangliosides mewakili kelas tertentu glikosfingolipid dengan struktur kompleks yang dikenal pasti dalam semua tisu dan cecair badan dan terutamanya banyak dalam sistem saraf pusat (CNS) [12]. Sebagai juzuk penting membran dwilapisan sel neuron, gangliosida memainkan peranan penting dalam perkembangan otak, kematangan dan penuaan, pengantara lekatan sel, pengaktifan, percambahan, motilitas dan pertumbuhan. Gangliosides terdiri daripada seramida dengan komposisi berbeza berkenaan dengan asas sphingoid, sisa asid lemak yang berakar ke dalam lapisan luar membran dan rantai oligosakarida bersialilasi yang meliputi membran dan mengambil bahagian dalam interaksi khusus dan penting dengan molekul lain dalam persekitaran sekeliling. Melalui perolehan permukaan sel normal, yang dikenali sebagai "penumpahan permukaan sel", gangliosida dilepaskan, pada tahap tertentu, ke dalam ruang antara sel.

Oleh kerana ekspresi, pengedaran, dan struktur gangliosida dikenali sebagai sel dan jenis tisu khusus dan berbeza-beza semasa perkembangan tisu, kematangan, penuaan, dan yang paling penting, dalam keadaan patologi [12], gangliosida dianggap antara yang paling berharga. penanda diagnostik dan bakal agen terapeutik.

Beberapa kaedah menggunakan serpihan biopsi serum atau buah pinggang telah digunakan untuk pengenalpastian ganglioside buah pinggang dalam pesakit DM Jenis 2, seperti imunostaining lapisan nipis [7,8], kromatografi lapisan nipis berprestasi tinggi (HPTLC) [9], spektrofotometri [10]. ], dan spektrometri jisim (MS) [11].

Memandangkan maklumat berharga yang boleh diberikan oleh gangliosides sebagai penanda molekul tisu neuron [12] dan data terhad yang tersedia setakat ini dalam pengesanan dan pencirian glikosfingolipid dalam air kencing pesakit DKD, kami membangunkan dan melaksanakan kaedah unggul berasaskan pada nanoelectrospray (nanoESI) MS resolusi tinggi (HR) untuk penentuan gangliosida dalam air kencing pesakit DM. Pilihan untuk HR MS ini dipandu oleh kelebihan yang ditawarkan oleh kaedah ini dalam analisis campuran kompleks gangliosida yang diekstrak daripada air kencing manusia. Kuasa penyelesaian yang lebih tinggi bagi instrumen: (i) membolehkan pengesanan ion dengan nilai m/z rapat, yang sebaliknya tidak boleh didiskriminasikan dalam sampel berbilang komponen heterogen yang mengandungi spesies pelbagai panjang dan seni bina rantai glycan dan komposisi yang berbeza bagi seramida; (ii) pada asasnya menghapuskan keperluan untuk pengasingan campuran sama ada dengan kaedah kromatografi cecair atau elektroforetik sebelum analisis MS; (iii) memberikan ketepatan jisim yang tinggi, yang sangat meningkatkan kebolehpercayaan pengenalan struktur; dan (iv) menawarkan bukan sahaja wawasan yang lebih baik tentang kerumitan gangliosidome yang berkaitan dengan DM tetapi juga data tentang spesies yang mempunyai peranan biomarker yang berpotensi berdasarkan keyakinan tinggi dalam penentuan jisim untuk kedua-dua ion molekul dan serpihan.

Kajian rintis ini, dengan tujuan untuk mencirikan gangliosida air kencing dengan peranan biomarker dalamdiagnosis awal DKD, telah ditumpukan kepada: (a) menguji kebolehlaksanaan dan prestasi HR MS dan tandem MS (MS/MS) melalui disosiasi akibat perlanggaran tenaga tinggi (HCD) dalam pemetaan gangliosida buah pinggang dalam pesakit DM Jenis 2; (b) penentuan perubahan dalam ekspresi campuran ganglioside asli daripada sampel air kencing pesakit DM Jenis 2 dalam ujian perbandingan dengan kawalan sihat dan pencirian biomarker yang ditemui. Untuk tujuan ini, kami mengoptimumkan platform bioanalitik moden berdasarkan nanoESI HR MS pada instrumen Orbitrap yang ditala untuk operasi dalam mod ion negatif dalam kedua-dua penyaringan MS dan pemecahan MS/MS untuk analisis struktur terperinci.

2. Keputusan dan Perbincangan

2.1. Pemeriksaan Perbandingan Sampel oleh nanoESI HR MS

Sampel ganglioside A1, A2, A3, dan C telah diselitkan oleh nanoESI satu demi satu ke dalam Orbitrap MS dan disaring dalam mod ion negatif di bawah keadaan instrumental yang sama. Dalam setiap kes, jumlah isyarat arus ion (TIC) diperoleh selama 2 minit, menghasilkan spektrum daripada pengumpulan 100 imbasan. Disebabkan oleh kepekaan kaedah yang tinggi, walaupun dalam keadaan terhad masa yang digunakan, spektrum jisim yang diperoleh menampilkan nisbah isyarat-ke-bunyi yang tinggi dan corak ion molekul yang kaya.

Penilaian data pemetaan yang dijana di bawah keadaan yang sama mendedahkan perbezaan yang ketara dalam bilangan dan jenis komponen ganglioside yang dinyatakan dalam sampel A1, A3, dan C, manakala tiada perbezaan antara sampel A1 dan A2 diperhatikan. Keputusan ini diringkaskan dalam Jadual 1, yang secara perbandingan menyenaraikan struktur yang dikenal pasti dalam campuran asli A1, A3, dan C, bersama-sama dengan nilai m/zexp eksperimen bagi isyarat yang dikesan dan nilai m/zteor teori yang sepadan dengan struktur yang dicadangkan.

Resolusi tinggi dan ketepatan jisim platform MS yang digunakan meningkatkan diskriminasi dan pengenalan berdasarkan ukuran jisim yang tepat tidak kurang daripada 37 komponen ganglioside dan fucoganglioside air kencing yang berbeza dalam tiga sampel. Spesies yang ditemui tergolong dalam 15 kelas yang berbeza, termasuk pengubahsuaian rantai glycan utama (Jadual 2), dan telah diberikan ketepatan jisim purata yang sangat baik iaitu 4 ppm.

Penilaian terperinci struktur dalam Jadual 1 mendedahkan bahawa daripada semua sampel, campuran A3, yang sepadan dengan makroalbuminuria (oleh itu, kepada peringkat lanjut DKD), mengandungi bilangan tertinggi sebatian gangliosida berbeza, iaitu, 19, diikuti oleh sampel C, dengan 12 spesies berbeza, dan sampel A1, dengan 10.

Berbanding dengan sampel A1 dan C, A3 juga: (i) merangkumi bilangan spesies tertinggi dengan rantai O-glycan terpanjang kepunyaan kelas G1 dan kepelbagaian komposisi seramida yang paling menonjol; (ii) menunjukkan bilangan kelas ganglioside tertinggi yang dinyatakan-12 berbanding hanya 6 dalam sampel A1 dan 6 dalam sampel C, masing-masing; (iii) mengandungi bilangan gangliosida yang paling tinggi, yang mempamerkan teras sakarida yang diubah oleh O-asetil bukan karbohidrat, serta pengubahsuaian berkaitan biologi O-fucosyl dan O-GalNAc karbohidrat; (iv) ialah satu-satunya ekstrak urin yang mengandungi struktur ganglioside yang diubah suai oleh lampiran O-GalNAc, iaitu GalNAc-GS1(t18:1/18:0), dikesan sebagai molekul terdeprotonasi dan tersodiasi empat lapis pada m/z 1176.8266 , dan GalNAc-GQ1(d18:1/18:0), sebagai molekul terdeprotonasi berganda pada m/z 1310.1271. Seperti yang boleh dilihat dalam Rajah 1a-c, menunjukkan bahagian kelas ganglioside yang dinyatakan dalam tiga sampel, dan dalam histogram perbandingan yang digambarkan dalam Rajah 2, ekstrak A3 memaparkan status sialylation tertentu, yang dikuasai oleh polysialocompounds. Kecuali untuk gangliotetraose bermonosialilasi GM1(d18:1/16:1) yang dikesan sebagai [M-2H+ ] 2− pada m/z 756.9078 dan GM3 yang dimonosialisasikan(d18:0/24: 0) dikesan sebagai molekul terdeprotonasi berganda pada m/z 645.3956, kesemua 17 spesies lain mengandungi lebih daripada satu residu Neu5Ac dalam bahagian glycan mereka. Lebih-lebih lagi, kerana tidak kurang daripada tujuh trisialo GT1, empat pentasialo GQ1, dan juga GS1 berheptasial telah ditemui, jelas sekali, bersebelahan dengan bilangan tambahan dan kepelbagaian struktur, panjang teras glycan, dan pengubahsuaian persisian mereka, sialisis keseluruhan yang tinggi. kandungan mewakili satu lagi ciri khusus untuk makroalbuminuria.

Jadual 1. Spesies ganglioside telah dikenal pasti dalam sampel A1, A3, dan C melalui saringan (-) nanoESI Orbitrap MS. d: asas sphingoid dihidroksilasi; t: asas sphingoid trihidroksilasi.

Pemerhatian yang berkaitan secara klinikal juga muncul daripada ujian perbandingan A1 vs. C. Manakala dalam sampel kawalan, C, tahap sialisis tertinggi gangliosida yang dikesan ialah empat, dikenal pasti melalui dua gangliotetraose GQ1 tetrasialylated GQ1 yang berbeza dalam komposisi aglikon lipid mereka, dalam sampel A1, tahap sialisis tertinggi ialah empat. Di sebelah gangliosida di-, tri-, dan tetrasialylated, campuran A1 mengandungi pentasialo gangliotetraose GP1(d18:1/18:0), dikesan sebagai [M-4H+ ] 4− ion pada m/z 676.5569, yang telah diberikan ketepatan jisim yang sangat baik iaitu 2.95 ppm. Data sedemikian yang berkaitan dengan status sialisis sampel yang disiasat menunjukkan bahawa tahap sialisis gangliosida buah pinggang mengikut ciri C < A1 < A2=A3, pemerhatian yang menekankan ketepatan pengubahsuaian ini, walaupun dalam peringkat normoalbuminuria Pesakit DM jenis 2. Tahap sialylation meningkat dengan perkembangan penyakit, yang menjadikannya parameter molekul yang perlu dipertimbangkan bukan sahaja untuk pengesanan awal DKD tetapi juga untuk penilaianPerkembangan DKDdankeberkesanan rawatan.

Jadual 2. Pandangan berjadual bagi kelas ganglioside air kencing yang dikenal pasti bersama dengan ekspresi pembezaan mereka dalam sampel A1, A3, dan C. Simbol: x=kelas telah dikesan; -=kelas tidak dikesan.

Pemeriksaan terperinci terhadap perlembagaan aglikon mendedahkan bahawa, kecuali perbezaan ketara dalam komposisi rantai glycan, gangliosida yang dinyatakan dalam tiga sampel juga menunjukkan perbezaan dalam struktur seramida mereka. Perubahan yang paling ketara pada bahagian lipid adalah berkaitan dengan proses trihidroksilasi bes sphingoid yang kurang biasa, yang berlaku dalam campuran ganglioside A1 dan A3, dan panjang luar biasa rantai asid lemak, yang terdapat dalam A3 semata-mata. Setiap sampel A1 dan A3 didapati mengandungi dua spesies dengan asas sphingoid trihidroksilasi seramida. Oleh itu, GT1(t18:0/18:0) dan GT1(t18:0/20:0) ditemui dalam sampel A1, manakala lebih banyak struktur kompleks trihidroksilasi GT1(t18:1/24:3) dan Fuc-GT3(t18:1/18:3) ditemui dalam sampel A3.

Hebatnya, sampel A3 juga menunjukkan bukti spesies yang mengandungi asid lemak rantaian sangat panjang (VLCFA). VLCFA dianggap sebagai struktur lipid yang jarang berlaku merangkumi 23 hingga 27 atom karbon dalam rantai asid lemak. Empat spesies VLCFA luar biasa yang membawa 24 atom karbon dalam rantai asid lemak telah dikesan dalam sampel A3: GM3(d18:0/24:{{10}}), GT1(t18:1 /24:3), O-Ac GT1(d18:0/24:0), dan Fuc-GT1(d18:0/24:0), yang mana satu struktur juga mempunyai trihidroksilasi asas sphingoid yang tidak biasa dan tiga ikatan berganda dalam rantai asid lemak, manakala dua struktur masing-masing mempunyai lampiran pada teras glikan O-Ac dan kumpulan fukosil.

Ciri-ciri bahagian seramida dalam sampel A1 dan A3, yang tidak ditemui dalam sampel kawalan; persamaan antara A1 dan A2; dan perbezaan ketara yang dikesan dalam A3 menunjukkan bahawa, bersebelahan dengan komposisi karbohidrat dan status sialylation, struktur bahagian lipid dalam gangliosida buah pinggang adalah satu lagi penanda yang mungkin bagi DKD awal. Selain itu, pengubahsuaian dalam komposisi seramida nampaknya bergantung pada peringkat albuminuria; ceramida kompleks, mempamerkan trihidroksilasi asas sphingoid dan VLCFA nampaknya dikaitkan dengan peringkat albuminuria lanjutan. Memandangkan bilangan luar biasa tiga ikatan berganda dalam rantai asid lemak ditemui hanya dalam sampel A3 melalui dua spesies berbeza, Fuc-GT3(t18:1/18:3) dan GT1(t18:1/24:3), nampaknya, mekanisme pembentukan ikatan berganda juga berkaitan dengan perkembangan DKD.

Kesan negatif yang ditimbulkan oleh pengumpulan lipid dalam buah pinggang, pada kedua-dua tahap glomerular dan tiub, adalah khusus sel. Selain itu, lipotoksisiti dikaitkan dengan pelbagai jenis lipid, antaranya gangliosida memaparkan peranan peringkat pusat [13].

Kandungan buah pinggang gangliosides, antara kelas lipid lain, telah meningkat dalam podosit, serta sel tubul proksimal, dalam model tetikus DN [14]. Tubul proksimal mungkin terdedah kepada tahap lipid kencing yang tinggi, termasuk gangliosida, disebabkan peningkatan kandungan asid lemak bagi setiap molekul albumin pada awal DKD [15]. Akibat langsung pengumpulan lipid dalam segmen nefron adalah berkaitan dengan pengubahsuaian struktur dan fungsi, yang membawa kepada pemprosesan albumin terjejas pada awal perjalanan DM Jenis 2.

Sebilangan besar kajian yang menumpukan pada pencirian ganglioside buah pinggang bergantung pada model eksperimen nefropati diabetik. Untuk pengetahuan terbaik kami, ini adalah kajian translasi manusia pertama daripada penyelidikan asas kepada kebolehgunaan klinikal untuk melaporkan corak ganglioside kencing tertentu pada pesakit dengan DM Jenis 2. Kepentingan praktikal kajian kami adalah dalam demonstrasi persatuan tahap sialylation gangliosides kencing dan struktur seramida mereka dengan DKD awal, dipentaskan oleh tahap albuminuria.

Perkhidmatan Sokongan Wecistanche-Pengeksport cistanche terbesar di China:

E-mel:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Beli Untuk Butiran Spesifikasi Lebih Lanjut:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

DAPATKAN EKSTRAK CISTANCHE ORGANIK SEMULAJADI DENGAN 25% ECHINACOSIDE DAN 9% ACTEOSIDE UNTUK JANGKITAN BUAH PINGGANG