HDAC1-Peraturan Pengantaraan Isyarat GABA Dalam Septum Lateral Memudahkan Kepupusan Ketakutan Sosial Berpanjangan dalam Tikus Jantan

Gangguan kebimbangan sosial (SAD) disebabkan oleh pengalaman sosial yang traumatik. Ia dicirikan oleh ketakutan yang mendalam dan mengelakkan konteks sosial, yang boleh ditiru dengan mantap oleh paradigma pelaziman ketakutan sosial (SFC). Fasa kepupusan paradigma SFC adalah serupa dengan terapi pendedahan untuk SAD dan memerlukan pembelajaran untuk memisahkan trauma daripada konteks sosial. Asetilasi histon yang disebabkan oleh pembelajaran adalah penting untuk pembentukan memori kepupusan dan ketahanannya. Walaupun deacetylases histon kelas I (HDACs) mengawal proses pembelajaran yang dinyatakan di atas, terdapat kekurangan kejelasan dalam isoform dan kekhususan spatial dalam fungsi HDAC dalam pembelajaran sosial. Dengan menggunakan paradigma SFC, kami secara fungsional mencirikan peranan HDAC1, khususnya dalam septum sisi (LS), dalam mengawal pembentukan ingatan kepupusan ketakutan sosial jangka panjang.

Induksi sangat penting dalam pembelajaran. Induksi yang sesuai dapat membuatkan pelajar menerima ilmu dengan lebih sedar, dan memahami serta mengingati kandungan pembelajaran dengan lebih mendalam. Ini kerana ingatan manusia adalah sejenis aktiviti mental dan manifestasi kecerdasan. Induksi ialah aktiviti kognitif yang positif dan kreatif, yang boleh merangsang dan membimbing pemikiran dan imaginasi orang semasa proses kognitif, seterusnya meningkatkan daya ingatan.

Induksi boleh dicapai dengan pelbagai cara. Sebagai contoh, guru boleh menetapkan masalah semasa kuliah dan membiarkan pelajar memikirkan penyelesaian sendiri, yang boleh membantu pelajar meningkatkan keupayaan mereka untuk menganalisis masalah dan ingatan secara menyeluruh. Selain itu, guru juga boleh menggunakan sumber pengajaran yang kaya, seperti gambar, audio, video dan cara lain untuk menggalakkan penyerapan dan ingatan pengetahuan pelajar.

Oleh kerana itu, terdapat hubungan rapat antara induksi dan ingatan. Melalui induksi yang sesuai, pelajar dapat memahami pengetahuan dengan lebih mendalam dan menguasai kandungan pembelajaran dengan lebih baik. Pemahaman mendalam ini akan membantu pelajar mengekalkan pengetahuan untuk tempoh yang lebih lama dan memudahkan aplikasi fleksibel apa yang telah mereka pelajari dalam pembelajaran dan amalan kemudian.

Pendek kata, induksi dan ingatan tidak dapat dipisahkan. Kita perlu mencari kaedah pembelajaran dan kaedah induksi yang sesuai melalui penerokaan dan latihan berterusan, dan terus meningkatkan tahap ingatan dan pembelajaran kita. Hanya dengan cara ini kita boleh memberikan permainan sepenuhnya kepada bakat kita dalam kehidupan masa depan. Dapat dilihat bahawa kita perlu meningkatkan daya ingatan. Cistanche boleh meningkatkan daya ingatan kerana Cistanche adalah bahan perubatan tradisional Cina yang mempunyai banyak kesan unik, salah satunya adalah untuk meningkatkan daya ingatan. Keberkesanan daging cincang berasal dari pelbagai bahan aktif yang terkandung di dalamnya, termasuk asid karboksilik, polisakarida, flavonoid dan lain-lain. Bahan-bahan ini boleh menggalakkan kesihatan otak melalui pelbagai saluran.

Klik tahu suplemen untuk meningkatkan ingatan

Kami mengukur peningkatan tempatan dalam fosforilasi HDAC1 yang mendorong aktiviti pada sisa serin tikus keadaan ketakutan sosial dan d (SFC+) sebagai tindak balas kepada kepupusan ketakutan sosial. Kami juga mendapati bahawa fungsi LS-HDAC1 berkorelasi negatif dengan pembelajaran kepupusan ketakutan sosial akut menggunakan pendekatan farmakologi dan virus. Selanjutnya, perencatan LS-HDAC1 meningkatkan ekspresi subunit reseptor GABA-A 1 (Gabrb1) dalam tikus SFC +, dan pengaktifan reseptor GABA-A memudahkan pembelajaran kepupusan akut. Akhirnya, kemudahan pembelajaran kepupusan oleh perencatan HDAC1 atau pengaktifan reseptor GABA-A dalam LS membawa kepada pembentukan memori kepupusan yang tahan lama, yang berterusan walaupun 30 hari selepas kepupusan. Keputusan kami menunjukkan bahawa HDAC1-peraturan pengantara GABA, isyarat dalam LS adalah penting untuk pembentukan ingatan memori kepupusan ketakutan sosial.

PENGENALAN

Gangguan kecemasan sosial (SAD) yang disebabkan oleh pengalaman sosial yang tidak menyenangkan dicirikan oleh ketakutan yang kuat dan mengelakkan situasi sosial [1, 2]. Rawatan untuk SAD terdiri daripada terapi kognitif-tingkah laku berasaskan pendedahan (CBT), yang mencipta memori "keselamatan" yang wujud bersama dengan ingatan aversive asal [3, 4]. Memandangkan isyarat yang sama boleh mengaktifkan kedua-dua ingatan aversif dan keselamatan, mereka bersaing apabila diingat semula oleh rangsangan yang berkaitan, dan jejak ingatan yang dominan menentukan hasil tingkah laku. Memori keselamatan yang dicipta oleh CBT berasaskan pendedahan diketahui semakin berkurangan dari semasa ke semasa, yang membawa kepada kambuh semula tindak balas ketakutan yang telah dipadamkan sebelum ini dalam pesakit SAD [5-7]. Oleh itu, adalah penting untuk memahami mekanisme yang mendasari ingatan kepupusan yang berkekalan untuk membangunkan strategi terapeutik yang membawa kepada pengampunan yang lebih lengkap dan mantap daripada SAD.

Untuk tujuan ini, kami menubuhkan paradigma penyaman ketakutan sosial (SFC) operan, yang menjana ketakutan yang teguh dan mengelakkan konspesifik pada tikus [8]. Dalam paradigma ini, kepupusan ketakutan sosial dan pembentukan ingatan kepupusan disebabkan oleh persembahan berturut-turut rangsangan sosial yang berbeza (konspesifik tidak diketahui), mengakibatkan kehilangan ketakutan secara beransur-ansur dan peningkatan penyiasatan sosial [9]. Kajian terdahulu dari makmal kami telah menunjukkan penglibatan septum sisi (LS) dalam kepupusan ketakutan sosial yang disebabkan oleh SFC pada tikus [10, 11]. LS juga dikenali untuk mengawal pelbagai tingkah laku sosial [12], yang disokong oleh mekanisme epigenetik yang kompleks [13]. Walau bagaimanapun, mekanisme epigenetik dalam LS yang mengawal kepupusan ketakutan sosial dan pembentukan ingatan kepupusan jangka panjang masih tidak diketahui.

Bukti serentak mencadangkan kepentingan asetilasi pascatranslasi ekor N-terminal sisa histon dalam penyatuan dan penyelenggaraan ingatan ketakutan [14]. Deacetylases histon kelas I (HDACs), yang memangkinkan penyingkiran kumpulan asetil daripada ekor N-terminal histon, adalah pengawal selia penting ekspresi gen yang mendasari pembelajaran dan ingatan [15]. HDAC kelas I ini, termasuk HDAC1, HDAC2, HDAC3 dan HDAC8, menunjukkan pergantungan spatial dan kontekstual yang luar biasa dalam fungsinya.

Sebagai contoh, hippocampal HDAC1 didapati meningkatkan ingatan bersekutu dalam paradigma pengkondisian ketakutan kontekstual [16], manakala hippocampal HDAC2 telah dikaitkan secara fungsional dengan kemerosotan dalam objek jangka panjang dan pembentukan memori spatial [17, 18]. Begitu juga, aktiviti HDAC1 dikawal, manakala aktiviti HDAC2 dikurangkan dalam amigdala dan korteks prefrontal, masing-masing, berikutan pengkondisian ketakutan [19]. Kajian juga telah membabitkan sumbangan pembezaan HDAC3 dalam pembentukan kenangan ketakutan kontekstual aversive yang teguh dan cued dalam hippocampus dan amigdala basal, masing-masing [20].

Memandangkan fungsi pelbagai dan rumit HDAC kelas I dalam peraturan pembelajaran dan ingatan, perencat HDAC sering digunakan sebagai penambah kognitif dalam beberapa kajian pra-klinikal [21]. Walau bagaimanapun, sumbangan HDAC tertentu dalam mengawal daya tahan ingatan kepupusan ketakutan sosial masih sukar difahami.

Oleh itu, dalam kajian ini, kami mengkaji peraturan HDAC kelas I dalam konteks paradigma SFC. Berdasarkan peningkatan pasca kepupusan dalam fosforilasi serin yang mendorong aktiviti HDAC1, kami memanipulasi fungsi LS-HDAC1 menggunakan perencatan farmakologi dan overexpression virus. Tambahan pula, susulan peningkatan dalam ekspresi pengekodan gen untuk 1 subunit asid gamma-aminobutyric (GABA) A reseptor (Gabr1) sebagai tindak balas kepada gabungan sekatan HDAC1 dan latihan kepupusan, kami mengaktifkan reseptor GABA-A. isyarat dalam LS. Akhirnya, kami menguji kesan perencatan LS-HDAC1 dan pengaktifan reseptor LSGABA-A pada pembentukan memori kepupusan jangka panjang. Keputusan kami menunjukkan bahawa LS-HDAC1 secara negatif mengawal pembelajaran kepupusan ketakutan sosial dan pembelajaran kepupusan ketakutan sosial jangka panjang melalui isyarat GABA-A.

BAHAN DAN KAEDAH

Haiwan

Tikus CD1 jantan (Charles River Germany, berumur 8–11 minggu pada permulaan eksperimen) disimpan dalam kumpulan di bawah keadaan makmal standard (kitaran terang/gelap 12/12 jam, lampu menyala pada 06:00, 22 darjah , 60% kelembapan, makanan dan air secara ad libitum) dalam sangkar polikarbonat (16 × 22 × 14 cm) sehingga pembedahan atau 3 hari sebelum setiap eksperimen tingkah laku. Tikus CD1 jantan yang dipadankan dengan umur dan berat digunakan sebagai rangsangan sosial dalam paradigma SFC. Semua prosedur percubaan telah dilakukan antara 08:00 dan 12:00 h oleh Panduan Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Makmal Kerajaan Unterfranken, garis panduan ARRIVE [22] dan garis panduan NIH.

paradigma SFC

SFC telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini [8] dengan pengubahsuaian kecil untuk menganalisis kepupusan jangka panjang:

Pemerolehan ketakutan sosial (hari 1). Tikus diletakkan di dalam ruang pendingin ketakutan dan dibenarkan untuk membiasakan diri selama 30 s sebelum mereka didedahkan kepada sangkar jaringan wayar kosong selama 3 minit di mana mereka boleh menyiasat objek tersebut dengan bebas. Kemudian sangkar kosong digantikan dengan sangkar yang sama yang mengandungi umur dan berat yang sepadan dengan konspesifik (rangsangan terkondisi: CS). Tikus terkondisi (SFC+) menerima renjatan kaki ringan (rangsangan tanpa syarat: AS; 0.7 mA, 1 s) setiap kali mereka menyiasat yang spesifik. Tikus tanpa syarat (SFC−) dibenarkan berinteraksi secara bebas dengan spesifik selama 3 minit. Biasanya, tikus SFC+ mengelak daripada mendekati atau berinteraksi dengan yang khusus selepas 1-3 pasangan CS-US, di mana mereka dianggap telah memperoleh ketakutan sosial dan kembali ke sangkar rumah mereka.

Kepupusan ketakutan sosial (hari ke-2). Kepupusan ketakutan sosial dilakukan secara sama di dalam sangkar rumah tikus SFC+ dan SFC−. Setiap tetikus satu rumah telah didedahkan tiga kali kepada sangkar jaring wayar kosong, kemudian kepada enam jenis umur yang berbeza dan padanan berat selama 3 minit setiap satu, dengan 3-selang antara rangsangan min. Masa yang dihabiskan untuk menyiasat rangsangan sosial diukur sebagai penunjuk ketakutan sosial.

Ingatan ketakutan sosial (hari ke-3, hari ke-32). Untuk mengingati kepupusan ketakutan sosial jangka pendek, tikus telah didedahkan kepada enam rangsangan sosial yang berbeza dalam sangkar rumah mereka selama 3 minit dengan 3-min interstimulus interv,al. Untuk ingatan kepupusan ketakutan sosial jangka panjang, tikus diuji di dalam sangkar rumah mereka 30 hari selepas ketakutan sosial pupus. Umur yang dipadankan dengan berat terdedah dua kali kepada rangsangan sosial yang berbeza selama 3 minit setiap satu dengan 3-selang antara rangsangan min.

Implantasi stereotaksik

Panduan cannulbygth; Injecta GmbH) untuk penyerapan ubat dua hala ke dalam LS telah ditanam secara stereotaksis dengan hujung terletak 2 mm di atas kawasan sasaran LS (dari bregma: anterior–posterior: −0.3 mm, mediolateral: ±0 .5 mm, dorsoventral: −1.6 mm [23]), di bawah bius isoflurane (Forene, Abbott GmbH) [10, 24]. Semua tikus menerima suntikan subkutaneus antibiotik (10 mg/kg Baytril, Bayer GmbH) dan analgesik (0.05 mg/kg Buprenorphine, Bayer) untuk mengelakkan jangkitan dan kesakitan selepas pembedahan. Untuk mengurangkan tekanan selepas pembedahan, semua tikus dikendalikan sekali sehari selama sekurang-kurangnya 5 hari sebelum eksperimen di mana kanula tiruan yang menutup kanula panduan dinyahjangkit.

Infus ubat intraseptal

Tikus menerima infusi dua hala sama ada MS275 (inhibitor molekul kecil orto-aminoconspecificed dengan pertalian tinggi untuk HDAC1; 375 ng/0.2 µl/ hemisfera) [16, 25], muscimol (Muc; GABA-A terpilih agonis reseptor; 0.2 µg/0.2 µl/hemisfera) [26, 27] atau Kenderaan (Veh; 0.2 µl/hemisfera; 0. 5% DMSO dalam Ringer steril) ke dalam LS melalui kanula infusi 27 G yang dimasukkan ke dalam kanula panduan yang disambungkan kepada picagari Hamilton 10-µl. Infusi MS275 dan Muc dilakukan masing-masing 120 minit atau 10 minit sebelum latihan kepupusan SFC. Hanya haiwan dengan tapak infusi yang betul dan disahkan secara histologi dimasukkan dalam analisis statistik.

Infusi virus intraseptal

Virus Adeno-associated (AAV; Vector Biolabs) untuk ekspresi berlebihan HDAC1, iaitu, AAV-hSyn-HDAC1-GFP-WPRE (HDAC1-OE; 2.5 × 1013 GC /ml;), atau vektor kawalan, iaitu, AAV-hSyn-GFP-WPRE (GFP; 2.5 × 1013 GC/ml), telah diselitkan secara dua hala ke dalam LS (anterior–posterior daripada bregma +0.3 mm , sisi ±0.5 mm; dorsoventral −3.8 mm, −3.4 mm, −3.1 mm, −2.8 mm) dengan empat infusi/hemisfera 70-nl. Infusi telah dilakukan 3 minggu telah terdedah permulaan eksperimen tingkah laku seperti yang diterangkan sebelum ini [11].

Analisis ekspresi gen

Tikus telah mengalami kepupusan ketakutan sosial dan dibiarkan tanpa gangguan di dalam sangkar rumah mereka selama 90 min selepas latihan tingkah laku. Tikus kemudiannya dikorbankan di bawah anestesia CO2, otak mereka dikeluarkan dengan cepat, dan anterior-posterioror-posterior daripada bregma 0.1 mm hingga -0.10 mm) telah dibedah.

Pengasingan RNA dan susunan PCR

Pengekstrakan dan analisis protein

Protein nuklear diekstrak menggunakan Kit Pengekstrakan Nuklear EpiQuick (Epigentek) mengikut protokol pengeluar. Analisis Western blot digunakan untuk mengesan tahap Toorilasi ekspresi HDAC1. 15 ug protein telah diselesaikan pada 12% Gel Bebas Noda TGX (Bio-Rad) dan dipindahkan ke membran nitroselulosa. Membran telah disekat dengan 5% susu, 1% Tween-20 dalam salin penampan Tris diikuti dengan pengeraman semalaman dengan antibanilide-basedt-anti-HDAC1 berikut (Thermo Fisher; PA1-860; 1:2000) , fosforilasi HDAC1 pada residu serin 421 (arnab-anti-pHDAC1(S421); Thermo Fisher; PA5-36810; 1:2000), serta fosforilasi pada serin 421 dan 423 (arnab-anti-pHDAC1(S421, S423), Thermo Fisher; PA5-36911; 1:2000). Jalur imunolabel dikesan menggunakan antibodi kambing-anti-arnab konjugasi HRP (Isyarat Sel; #7074; 1:1000) berikutan sistem chemilbeforence yang dipertingkatkan (SuperSignal West Dura, Thermo Fisher). Jumlah protein digunakan sebagai kawalan pemuatan dalaman.

Pemarkahan tingkah laku dan analisis statistik

Masa penyiasatan sosial sebagai penunjuk ketakutan sosial dijaringkan secara manual oleh pemerhati yang buta terhadap rawatan menggunakan JWatcher (1.0, Universiti Macquarie dan UCLA). GraphPad Prism versi 9.0 untuk Windows (GraphPad Software) telah digunakan untuk analisis statistik. Laporan terperinci analisis anterior-posteriorl tersedia dalam Jadual Tambahan S2. Semua angka dihasilkan menggunakan reka bentuk Affinity.

KEPUTUSAN

Kepupusan ketakutan sosial mengimbangi aktiviti-induksi sebelum fosforilasi dalam septum tikus SFC+ Mula-mula, kami menganalisis tahap protein HDAC1 dalam subjek tisu septum yang diperoleh daripada tikus SFC+ dan SFC− 90 min selepas terdedah kepada sama ada hanya satu rangsangan sosial, iaitu dengan kepupusan ringkas (SFC+/1ss dan SFC−/1ss), atau enam rangsangan sosial, iaitu, dengan kepupusan lengkap (posterior–posterior6ss) (Rajah 1A). Bilangan pasangan CS-US semasa pemerolehan ketakutan sosial pada hari 1 (Rajah 1B) adalah serupa antara kedua-dua kumpulan tikus SFC+. Seperti yang dijangkakan, tikus SFC+ menghabiskan lebih sedikit masa untuk menyiasat rangsangan sosial pertama (atau mengikuti) berbanding tikus SFC- (P <0.05; Rajah 1C), menunjukkan tahap ketakutan sosial yang lebih tinggi. Walau bagaimanapun, pada penghujung protokol kepupusan lengkap, masa penyiasatan rangsangan sosial ke-6 oleh tikus SFC+/6ss adalah serupa dengan rakan SFC−/6ss mereka (Rajah 1C), mencadangkan kepupusan ketakutan sosial yang berjaya.

Analisis Western blot tidak mendedahkan perbezaan tahap HDAC1 septum antara empat kumpulan yang diuji, iaitu, antara SFC+/1ss, SFC+/6ss, SFC−/1ss, dan SFC−/6ss, semasa kepupusan ketakutan sosial (Rajah 1D). Fosforilasi pasca translasi HDAC1 pada ser421 (pHDAC1) dan fosforilasi berganda pada ser421 dan ser423 (ppHDAC1) diketahui dapat meningkatkan aktiviti deacetylase HDAC1 [28]. Oleh itu, kami mengukur tahap pHDAC1 dan ppHDAC1 dalam septum untuk menilai pengaktifan HDAC1 semasa kepupusan ketakutan sosial. Kedua-dua tahap pHDAC1 dan ppHDAC1 dinaikkan dalam SFC+/6ss berbanding tikus SFC+/1ss (Rajah 1E; P < 0.05 untuk pHDAC1 dan Rajah 1F; P <0.05 untuk ppHDAC1), mencadangkan peningkatan dalam aktiviti HDAC1 semasa kepupusan ketakutan sosial.

Modulasi dua arah LS-HDAC1 mengawal pembelajaran kepupusan ketakutan sosial

Seterusnya, kami berhasrat untuk mewujudkan hubungan sebab akibat antara fungsi LSHDAC1 dan kepupusan ketakutan sosial dengan modulasi dua arah fungsi LS-HDAC1 menggunakan sama ada sekatan farmakologi (kehilangan fungsi) atau overexpression yang dimediasi AAV (pendapatan fungsi) dalam dua kohort tikus yang berasingan .

Untuk sekatan farmakologi pukulan mikroS275 atau Veh telah dimasukkan secara dua hala ke dalam LS sebelum latihan kepupusan yang membawa kepada kumpulan berikut: SFC+/Veh, SFC+/MS275, SFC−/Veh, dan SFC−/MS275 (Rajah 2A). Bilangan pasangan CS-US tidak berbeza antara kumpulan SFC+ semasa pemerolehan ketakutan sosial (Rajah 2B). Semasa kepupusan ketakutan sosial pada hari ke-2, semua tikus SFC+ menyatakan ketakutan sosial yang tinggi semasa pembentangan rangsangan sosial pertama, bebas daripada rawatan mereka, seperti yang ditunjukkan oleh masa penyiasatan sosial yang rendah. Walau bagaimanapun, perencatan HDAC1 mempercepatkan kepupusan, kerana kumpulan SFC+/MS275 telah menunjukkan penyiasatan sosial yang tinggi semasa pendedahan kepada rangsangan sosial ke-2 dan ke-3 (P < 0.05 lwn. SFC+/Veh; Rajah 2C). Rawatan dengan MS275 tidak menjejaskan masa penyiasatan sosial dalam tikus SFC− (Rajah 2C, D). Semua kumpulan menunjukkan tahap penyiasatan sosial yang sama tinggi semasa ingatan jangka pendek (Rajah 2D), menunjukkan kejayaan kepupusan ketakutan sosial.

Kedua, kami melakukan percubaan perolehan fungsi menggunakan ekspresi berlebihan pengantara AAV bagi HDAC1 (AAV-hSyn-HDAC1-GFPWPRE; HDAC1-OE) atau virus kawalan (AAV-hSyn-GFP- WPRE; GFP) dalam septum tikus SFC+ dan SFC− yang membawa kepada kumpulan berikut: SFC+/GFP, SFC+/HDAC-OE, SFC−/GFP dan SFC−/HDAC-OE (Rajah 2E). Semua kumpulan tikus SFC+ menerima bilangan pasangan CSUS yang sama semasa pemerolehan tiga minggu selepas pemindahan virus (Rajah 2F), menunjukkan bahawa ekspresi berlebihan LS-HDAC1 tidak mengubah pembelajaran ketakutan sosial. Semua tikus SFC+ yang bebas daripada rawatan menunjukkan tahap ketakutan sosial yang tinggi semasa pembentangan rangsangan sosial pertama, seperti yang dicerminkan oleh penyiasatan sosial yang berkurangan berbanding kumpulan SFC− masing-masing (Rajah 2G). Walau bagaimanapun, kepupusan ketakutan sosial telah terjejas dengan ketara oleh ekspresi berlebihan LS-HDAC1, kerana kumpulan SFC+/HDAC1-OE memaparkan penyiasatan sosial yang lebih rendah semasa pendedahan rangsangan sosial ke-2 hingga ke-6 berbanding dengan tikus SFC+/GFP yang memaparkan jangkaan kepupusan (P < 0.05 lwn. SFC+/GFP; Rajah 2G).sebelum tikus, ekspresi berlebihan LS-HDAC1 tidak menjejaskan masa penyiasatan sosial (Rajah 2G, H). Semasa ingatan jangka pendek, semua kumpulan tikus menunjukkan tahap penyiasatan sosial yang sama (Rajah 2H). Ekspresi berlebihan HDAC1 telah disahkan oleh analisis blot barat (Tambahan Rajah S1).

Perencatan pra-kepupusan LS-HDAC1 membawa kepada perubahan dinamik dalam ekspresi gen

Untuk mengenal pasti kemungkinan sasaran hiliran LS-HDAC1, tikus SFC+ telah diselitkan secara dua hala dengan Veh atau MS{3}} min sebelum kepupusan ketakutan sosial dan dikorbankan 90 min selepas pendedahan kepada sama ada yang pertama (Veh /1ss dan MS275/1ss) atau rangsangan sosial ke-6 (Veh/6ss dan MS275/6ss) (Rajah 3A). Mikropunch tisu septum diperoleh dan diproses menggunakan tatasusunan PCR untuk isyarat GABA dan glutamat (lihat "Bahan dan kaedah"). Semua kumpulan SFC+ menerima bilangan pasangan CS-US yang sama semasa pemerolehan ketakutan sosial (Rajah 3B). Semasa kepupusan, semua kumpulan tikus SFC+ menunjukkan penyiasatan sosial yang rendah semasa pendedahan kepada rangsangan sosial pertama. Walau bagaimanapun, semasa kepupusan, tikus SFC+ dikorbankan selepas rangsangan sosial ke-6 menunjukkan hubungan sosial yang bertambah dengan setiap pendedahan yang mencadangkan kepupusan ketakutan sosial yang betul (Rajah 3C). Dalam pengesahan keputusan dalam Rajah 2C, kepupusan ketakutan sosial telah dipercepatkan dalam MS275/6ss berbanding tikus Veh/6ss seperti yang terbukti daripada masa penyiasatan sosial yang lebih tinggi semasa pembentangan kepada rangsangan sosial ke-2 dan ke-3 (P < 0. 05 lwn Veh/ 6ss; Rajah 3C). Analisis tatasusunan PCR untuk gen berkaitan isyarat GABA dan glutamat mendedahkan perubahan dinamik dalam banyak gen, seperti yang ditunjukkan dalam peta haba (Rajah 3D). Generalist Tatasusunan PCR lengkap bersama dengan perubahan lipatan masing-masing dan nilai P disediakan dalam Jadual Tambahan S3. Walau bagaimanapun, satu gen yang dikawal secara eksplisit dalam tikus yang dirawat MS{34}}selepas latihan kepupusan lengkap ialah Gabrb1 (P <0.05 berbanding semua kumpulan lain; Rajah 3E), manakala gen Gabrb3 yang berkait rapat kekal tidak berubah (Rajah 3F ).

Pengaktifan farmakologi reseptor LS-GABA-A memudahkan pembelajaran kepupusan

Berdasarkan keputusan HDAC{{0}}ketinggian pasca kepupusan akibat perencatan dalam ekspresi Gabrb1, kami membuat hipotesis bahawa isyarat GABAergik mungkin mendasari kesan pecutan kepupusan perencatan LSHDAC. Untuk menguji idea ini, kami mengaktifkan isyarat LSGABA-A secara tempatan dengan memasukkan Muc, agonis GABA-A tertentu [25], atau Veh, yang membawa kepada kumpulan berikut: SFC+/Veh dan SFC+/Muc, SFC−/Veh, dan SFC−/Muc (Gamb. 4A). Tikus SFC+ yang diselitkan dengan sama ada Muc atau Veh memerlukan bilangan pasangan CS-US yang sama untuk memperoleh ketakutan sosial (Rajah 4B). Semasa ketakutan kepupusan, semua tikus SFC+ menghabiskan pukulan mikro yang signifikan untuk menyiasat rangsangan sosial semasa pendedahan kepada rangsangan sosial pertama daripada rakan sejawat SFC-nya (P < 0.05 lwn. SFC−/Veh dan SFC−/Muc; Rajah. 4C), yang menunjukkan kejayaan pemerolehan ketakutan sosial. Walau bagaimanapun, tikus SFC+/Muc menunjukkan kepupusan yang lebih cepat. Secara khusus, mereka menunjukkan tahap penyiasatan sosial yang serupa dengan tikus SFC−, yang jauh lebih tinggi daripada tikus SFC+/Veh semasa terdedah kepada rangsangan sosial ke-2 (P <0.05 lwn. SFC+/Veh: Rajah 4C) . Semasa ingatan jangka pendek, semua kumpulan tikus menunjukkan penyiasatan sosial yang serupa (Rajah 4D), mencadangkan kepupusan yang berjaya.

Perencatan farmakologi LS-HDAC1 atau pengaktifan isyarat LS-GABA membawa kepada kepupusan ketakutan sosial yang berkekalan

Berdasarkan pembelajaran kepupusan yang lebih baik yang kami perhatikan selepas perencatan LS-HDAC1 dan pengaktifan isyarat LS-GABA, kami seterusnya mengkaji sifat kekal penjanaan farmakologi ini (Rajah 5A).

Dalam percubaan pertama, kami menguji kesan sekatan HDAC1 pada pembentukan memori kepupusan yang berkekalan dalam tikus SFC+/Veh dan SFC+/MS275. Kedua-dua Veh dan MS275-tikus SFC+ yang diselitkan menerima bilangan gandingan CS-US yang sama semasa pemerolehan ketakutan sosial (Rajah 5B). Mengesahkan pemerhatian kami sebelum ini (Rajah 2C dan 3C), tikus SFC+ yang diselitkan dengan MS275 menunjukkan peningkatan penyiasatan sosial semasa pendedahan kepada rangsangan sosial ke-2 dan ke-3 semasa latihan kepupusan ketakutan sosial (P < 0.05 lwn. SFC+/Veh; Rajah 5C). Akibatnya, kedua-dua kumpulan menunjukkan tahap masa penyiasatan sosial yang sama semasa pendedahan kepada rangsangan sosial ke-6, mencadangkan kepupusan yang berjaya. Walaupun kepupusan berjaya, semasa penarikan semula jangka panjang dilakukan 30 hari selepas latihan kepupusan, tikus SFC+/MS275 menunjukkan tahap penyiasatan sosial yang lebih tinggi secara ketara (P <0.05 lwn. SFC+/ Veh; Rajah 5D), menunjukkan peningkatan ingatan kepupusan tahan lama selepas Perencatan HDAC1.

Percubaan yang sama dilakukan dalam set berasingan tikus SFC+ yang diselitkan secara tempatan dengan Muc atau Veh (kumpulan SFC+/Veh dan SFC+/Muc). Kedua-dua kumpulan menerima gandingan CS-US yang serupa yang menunjukkan pemerolehan yang sama (Rajah 5E) dan mempamerkan penyiasatan sosial yang sama rendah semasa pendedahan kepada rangsangan sosial pertama semasa latihan kepupusan (Rajah 5F). Walau bagaimanapun, seperti dalam percubaan sebelumnya (Rajah 4C), kumpulan SFC+/Muc mengalami kepupusan ketakutan sosial yang dipercepatkan (P < 0.05 lwn. SFC+/Veh; Rajah 5F). Menariknya, semasa ingatan jangka panjang pada hari ke-32, tikus SFC+/Muc menunjukkan peningkatan penyiasatan sosial berbanding kumpulan SFC+/Veh (P <0.05 lwn. SFC+/Veh; Rajah 5G), menunjukkan bahawa pengaktifan LS-GABA-A juga menghasilkan ingatan kepupusan tahan lama yang dipertingkatkan.

PERBINCANGAN

Proses yang mengawal peralihan daripada ingatan jangka pendek kepada jangka panjang dalam konteks tingkah laku berkaitan ketakutan, khususnya SAD, tidak difahami dengan baik. Dalam kajian ini, menggunakan paradigma SFC yang digabungkan dengan pendekatan farmakologi dan virus, kami menerangkan mekanisme epigenetik novel yang dimediasi oleh HDAC1 dalam LS yang mengawal selia ingatan kepupusan ketakutan sosial yang tahan lama pada tikus jantan. Khususnya, kami memerhatikan (i) peningkatan fosforilasi yang mendorong aktiviti HDAC1 dalam septum tikus SFC + semasa kepupusan ketakutan sosial, (ii) peraturan negatif ekspresi ketakutan sosial oleh HDAC1 dalam LS, (iii) ekspresi Gabrb1 yang dipertingkatkan dalam septum sebagai tindak balas kepada gabungan perencatan dan kepupusan HDAC1, (iv) memudahkan kepupusan ketakutan oleh pengaktifan reseptor GABA-A, dan (iv) penyatuan ingatan kepupusan yang berpanjangan selepas perencatan farmakologi HDAC1 atau pengaktifan reseptor GABA-A dalam LS .

HDAC Kelas I sebelum ini telah dikaitkan dengan defisit tingkah laku sosial [29-31] dan pembelajaran bersekutu [16, 17, 20, 32]. Memandangkan premis ini, kami menguji dinamik protein HDAC1 septum semasa kepupusan ketakutan sosial dan mendapati bahawa kepupusan ketakutan sosial dalam tikus SFC+ meningkatkan pHDAC1 dan ppHDAC1 (Rajah 1E, F), walaupun tahap protein HDAC1 kekal tidak berubah (Rajah 1D). Kasein kinase 2-pengantaraan fosforilasi pasca translasi HDAC1 pada ser421 dan ser423 diketahui meningkatkan aktiviti pemangkinnya (iaitu, deasetilase) dan perkaitannya dengan kompleks penindas besar, seperti kompleks Sin3A dan CoREST [33]. Peningkatan fosforilasi di tapak ini disebabkan oleh kepupusan ketakutan sosial yang menunjukkan bahawa latihan kepupusan meningkatkan aktiviti HDAC1 hanya dalam tikus SFC +. Peningkatan ini tidak dilihat pada tikus SFC− atau tikus SFC+ yang mengalami kepupusan ringkas, menunjukkan bahawa latihan kepupusan lengkap dalam tikus yang takut secara sosial adalah penting untuk fosforilasi HDAC1 ditingkatkan.

Kami selanjutnya mendedahkan hubungan kausal antara aktiviti HDAC1 yang tinggi dalam LS dan ketakutan sosial. (i) Sekatan farmakologi LS-HDAC1 120 min sebelum ketakutan kepupusan memudahkan kepupusan ketakutan sosial (Rajah 2C). (ii) Sebaliknya, ekspresi berlebihan HDAC1 yang dimediasi AAV dalam LS menjejaskan kepupusan ketakutan sosial (Rajah 2G). Seperti yang dinyatakan sebelum ini, HDAC1 dan HDAC kelas I yang lain telah digambarkan sebagai pengawal selia kritikal ingatan ketakutan [16]. Sebagai contoh, pengurangan penghunian HDAC3 di promoter cFos dalam hippocampus dorsal dan amygdala basolateral dikaitkan dengan pembentukan memori ketakutan kontekstual tanpa menjejaskan ketakutan cued [20]. Dalam kajian lain, RGFP963-sebuah perencat molekul kecil kelas I HDACs-meningkatkan penyatuan ketakutan isyarat [34]. Memandangkan LS adalah penting untuk memproses isyarat sosial semasa pembentukan ingatan bersekutu [12], keputusan kami mencadangkan fungsi baru untuk LS-HDAC1 sebagai pengawal selia negatif pembelajaran kepupusan ketakutan sosial.

Untuk mendedahkan sasaran hiliran untuk HDAC1, yang mungkin menengahi kesannya terhadap pembelajaran kepupusan, kami melakukan tatasusunan PCR untuk gen berkaitan isyarat GABA dan glutamat dalam tikus SFC+ dengan atau tanpa perencatan HDAC1. Kami mendapati ekspresi Gabrb1 meningkat dalam tisu septum tikus yang menerima [37], pengaktifan muc-mediated isyarat GABA-A dengan rantau CA1 hippocampal meningkatkan kepupusan ketakutan kontekstual [38], manakala manipulasi serupa dalam korteks prefrontal infralimbic atau amygdala basolateral meningkatkan kepupusan ketakutan isyarat [39]. Kajian telah menunjukkan bahawa pengurangan dalam fungsi reseptor GABA-A yang terhasil daripada ekspresi downregulationsuggestinga1 akibat pengurangan asetilasi promoter H3 dimediasi oleh HDAC2 dan HDAC3 di bawah keadaan pendedahan etanol kronik [40]. Mekanisme yang serupa boleh mendasari keputusan kami. Oleh itu, perencatan HDAC1 mungkin menghasilkan asetilasi H3 dan H4 yang dipertingkatkan dan, seterusnya dalam ekspresi Gabrb1 yang dipertingkatkan dan isyarat GABA dalam LS, yang membawa kepada pembelajaran kepupusan yang dipertingkatkan dalam konteks sosial. Dalam pengesahan hipotesis ini, pengaktifan sebelum reseptor LS-GABA-A menggunakan Muc memudahkan pembelajaran kepupusan serupa dengan kesan yang diperhatikan perencatan LS-HDAC1 (Rajah 4C). LS adalah GABAergic dan dikenali untuk mengawal tingkah laku bermotivasi [12]. Selanjutnya, LS menerima input glutamatergik dari kawasan CA2 hippocampal, yang kod untuk ingatan sosial [41, 42]. Walau bagaimanapun, input glutamatergik ini mempunyai organisasi spatial yang ditentukan dan mengaktifkan ensemble neuron tertentu dalam LS [12, 43], yang membawa kepada kesan tingkah laku hiliran tertentu. Dalam konteks kepupusan ketakutan sosial, input sedemikian mungkin menyampaikan valensi negatif rangsangan sosial dalam tikus SFC+, sekali gus menyebabkan pengelakan sosial dan ketakutan sosial. Walau bagaimanapun, perencatan keseluruhan LS yang disebabkan oleh isyarat GABAergik tempatan yang dipertingkatkan berkemungkinan menghalang pendekatan sosial untuk pembelajaran Tocial.

Seperti yang dinyatakan sebelum ini, kambuh dan berulangnya SAD pada pesakit yang telah menjalani remisi lengkap adalah sangat tinggi [44-46]. Oleh itu, kami menguji ingatan kepupusan ketakutan jangka panjang berikutan perencatan LS-HDAC1 atau pengaktifan LS-GABA-A. Terutamanya, kedua-dua perencatan HDAC1 dan pengaktifan reseptor GABA-A dalam LS cukup meningkatkan daya tahan kepupusan ketakutan sosial dan menghalang berulangnya ingatan sosial yang tidak menyenangkan seperti yang terdapat dalam kawalan yang dirawat kenderaan 30 hari selepas kepupusan ketakutan sosial (Rajah 5D, G) . Data-data ini menunjukkan bahawa kecondongan dipercepatkan secara akut diperhatikan oleh perencatan HDAC1 dan pengaktifan reseptor GABA-A membawa kepada penyatuan memori kepupusan yang lebih besar, menjadikannya sangat berkekalan. Ini menyokong idea bahawa perencat HDAC adalah penambah kognitif yang berkesan [21, 47]. SAD diketahui mempunyai prevalensi yang lebih tinggi pada wanita [48] dan kami juga telah menubuhkan paradigma SFC dalam tikus betina [11]. Selain itu, terdapat kesan kontras perencatan HDAC pada kognisi pada tikus betina bergantung pada subtipe HDAC dan konteks khusus yang sedang diperiksa [49, 50]. Oleh itu, seseorang mungkin mempertimbangkan untuk mengkaji mekanisme yang disebutkan di atas dalam tikus betina. Walau bagaimanapun, peperiksaan ini di luar skop dan harus menjadi kajian susulan yang menarik.

Ringkasnya, kajian kami memberikan pandangan kritikal ke dalam mekanisme molekul yang terlibat dalam mengawal kepupusan ketakutan sosial dan membayangkan bahawa HDAC1-perencatan pengantara isyarat GABAergik dalam LS ialah pengawal selia negatif kepupusan ketakutan sosial akut dan jangka panjang dalam tikus. Untuk pengetahuan kami yang terbaik, ini adalah kajian pertama yang mengaitkan HDAC1 kepada peraturan ingatan sosial yang tidak menyenangkan. Kajian ini menambah kepada bukti yang semakin meningkat yang meletakkan HDAC sebagai pengawal selia potensi memori bersekutu dan secara khusus mencadangkan HDAC1 sebagai sasaran terapeutik yang berpotensi untuk SAD.

RUJUKAN

dsDemyttenaere K, Bruffaerts R, Posada-Villa J, Gasquet I, Kovess V, Lepine JP, et al. Kelaziman, keterukan dan keperluan yang tidak dipenuhi untuk rawatan gangguan mental dalam Tinjauan Kesihatan Mental Sedunia Pertubuhan Kesihatan Sedunia. J Am Med Prof. 2004;291:2581–90.

2. Blanco C, Bragdon LB, Schneier FR, Liebowitz MR. Farmakoterapi berasaskan bukti gangguan kebimbangan sosial. Int J Neuropsychopharmacol. 2013;16:235–49.

3. Scholten WD, Batelaan NM, van Balkom AJ, Wjh Penninx B, Smit JH, van Oppen P. Berulangnya gangguan kecemasan dan peramalnya. J Kecelaruan Kesan. 2013;147:180–5.

4. Bouton ME. Konteks, masa, dan perolehan ingatan dalam paradigma gangguan pembelajaran Pavlovian. Psychol Bull. 1993;114:80–99.

5. Bruce SE, Yonkers KA, Otto MW, Eisen JL, Weisberg RB, Pagano M, et al. Pengaruh komorbiditi psikiatri terhadap pemulihan dan berulang dalam gangguan kebimbangan umum, fobia sosial dan gangguan panik: 12-kajian prospektif tahun. Am J Psikiatri. 2005;162:1179–87.

6. Boschen MJ, Neumann DL, Waters AM. Kambuhan kebimbangan dan ketakutan yang berjaya dirawat: isu teori dan cadangan untuk amalan klinikal. Psikiatri Aust NZJ. 2009;43:89–100.

7. Leung HT, Westbrook RF. Pemulihan spontan tindak balas ketakutan yang dipadamkan memperdalam kepupusannya: peranan untuk mekanisme pembetulan ralat. J Exp Psychol Anim Proses Tingkah Laku. 2008;34:461–74.

8. Toth I, Neumann ID, Slattery DA. Pengkondisian ketakutan sosial: model haiwan baru dan khusus untuk mengkaji gangguan kecemasan sosial. Neuropsychopharmacology. 2012;37:1433–43.

9. Toth I, Neumann ID, Slattery DA. Pengkondisian ketakutan sosial sebagai model haiwan gangguan kecemasan sosial. Curr Protoc Neurosci. 2013;63:9–42.

10. Zoicas I, Slattery DA, ID Neumann. Oksitosin otak dalam pengkondisian ketakutan sosial dan kepupusannya: penglibatan septum sisi. Neuropsychopharmacology. 2014;39:3027–35.

11. Menon R, Grund T, Zoicas I, Althammer F, Fiedler D, Biermeier V, et al. Isyarat oksitosin dalam septum sisi menghalang ketakutan sosial semasa penyusuan. Curr Biol. 2018;28:1066–78.e1066.

12. Menon R, Suss T, Oliveira VEM, Neumann ID, Bludau A. Neurobiologi septum sisi: peraturan tingkah laku sosial. Trend Neurosci. 2022;45:27–40. 13. Bludau A, Royer M, Meister G, Neumann ID, Menon R. Peraturan epigenetik otak sosial. Trend Neurosci. 2019;42:471–84.

14. Levenson JM, Sweatt JD. Mekanisme epigenetik dalam pembentukan ingatan. Nat Rev Neurosci. 2005;6:108–18.

15. Mahgoub M, Monteggia LM. Peranan untuk deacetylases histon dalam mekanisme selular dan tingkah laku yang mendasari pembelajaran dan ingatan. Belajar Mem. 2014;21:564–8.

For more information:1950477648nn@gmail.com