Gossypitrin, Flavonoid yang berlaku secara semula jadi, melemahkan kerosakan neuron dan mitokondrial yang disebabkan oleh besi Bahagian 3

Sila hubungioscar.xiao@wecistanche.comuntuk maklumat lanjut

4. Bahan dan Kaedah 4.1.Reagen

Semua reagen diperolehi daripada Sigma-Aldrich Corp. (St. Louis, MO, Amerika Syarikat). Penyelesaian stok Gos disediakan dalam DMSO dan ditambah kepada kultur sel atau persediaan mitokondria pada 1/1000 (o/o) pencairan.

Sila klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

4.2. Bahan Tumbuhan

Bahan tumbuhan (bunga) dari Talipariti elatum (Sw.)(Syn. Hisbiscus elatus Sw.) (Malvaceae) dikumpulkan pada bulan Mac 2020 dari kawasan sekitar Pusat Penyelidikan dan Penilaian Biologi, Institut Farmaseutikal dan Sains Makanan, La Lisa, Havana, Cuba. Mereka disahkan oleh pakar herbaria Universiti Camagüey"Ignacio Agramonte Loynaz", di mana spesimen baucar disimpan: G. Pardo., HPC-12 520 (HIPC).

Cistanche boleh meningkatkan imuniti

4.3. Penyediaan Ekstrak dan Sampel

Theethanolic[29] • Selepas rotoevaporation, pepejal telah disucikan oleh prosedur penghabluran semula[29]. Sebatian terpencil dicirikan dengan cara 1D 'H(400 MHz) dan 13C (100 MHz) NMR. Pemprosesan data NMR dilakukan dengan perisian MestReNova versi 6.1.0-6224 untuk Windows (Bahan Tambahan, Angka S1-S3). Data NMR yang dikumpulkan daripada Gos dibandingkan dengan keputusan sebelumnya [56].

4.4. Kajian Spektroskopi UV/Vis dan IR

Spektra UV/Vis dilakukan dalam kavet kuarza panjang laluan optik 10 mm dan penyerapan direkodkan dalam UV-VisspectrophotometerUltrospec 2100 Pro dari Amersham BioSci (Little Chalfont, UK) digandingkan dengan komputer dengan Perisian Imbasan Gelombang (SWIFT I, 1.2) pada suhu bilik. Interaksi antara Gos dan ion ferus diukur dengan memantau perubahan dalam spektrum UV/Vis. Kaedah Job digunakan untuk menentukan nisbah stoichiometric antara Gos dan ion Fe(II). Penyelesaian stok Gos dan Fe(lI) disediakan setiap hari dalam penimbal metanol dan fosfat, masing-masing. Spektra IR direkodkan pada spektrometer JASCO FI / IR-440 dalam julat 4000-400 cm-I, menggunakan pelet kalium bromida untuk menyediakan sampel.

4.5. Budaya Sel

TetikushippocampalSel HT-22 (ATCC) dikulturkan dalam medium DMEM ditambah dengan 10% FCS, L-glutamine (1 mM), dan penisilin/streptomycin (1%), dan dikekalkan pada 37°C dalam inkubator 5%CO2 yang lembap. Sel-sel (2×104 sel / baik) telah dimasukkan ke dalam plat 96-baik (Nunc, Roskilde, Denmark), dalam 200 μL medium budaya untuk 24 h pada 37C.

4.6.Induksi Kerosakan dan Rawatan Oxidaticoe Sel dengan Gos

Tindakan neuroprotektif Gos (0.001-100 μM) diuji pada HT-22 melalui inkubasi bersama untuk 24 h dengan Gos atau Trolox (500 μM), FeCl2 (100μM), dan citrate (1 mM). Selepas 24 h, supernatant sel telah dikeluarkan dan daya maju sel diukur oleh [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] (MTT)colorimetric assay.

4.7. Ujian Daya Maju Sel

Selepas rawatan, sel (2× 104) diinkubasi dengan 10 uM MTT untuk 3 h at37C. Derivatif MTT berwarna kemudiannya dibubarkan dalam 50μL DMSO, dan penyerapan dikira pada 570 nm pada pembaca mikroplate (FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Jerman). Daya maju sel dinyatakan sebagai peratusan terhadap kawalan sel yang tidak dirawat.

4.8.Mitochondrial Membrane Potential (△Y)Assay in HT-22 Cell

Mitokondrialpotensi membran dinilai berdasarkan pengekalan sel dari siasatan kationik pendarfluor rhodamine 123 [57,58]. Selepas 2 h kecederaan besi/ askorbat semasa ketiadaan (kawalan) atau kehadiran Gos (0.001-100 μM) atau Trolox(500 μM), sel neuron (2×10*)diinkubasi 10 minit dengan 1 μM rhodamine 123. Selepas sentrifugasi, dan resuspension dalam 1 mL 0.1% Triton X-100, kepekatan probe ditentukan dalam supernatant menggunakan pembaca mikroplate (FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Jerman) pada pasangan 505/535 nm pengujaan/ panjang gelombang pelepasan. Data dinyatakan sebagai peratusan berbanding Kawalan sel yang tidak dirawat.

4.9.ATP Assay

ATP selular ditentukan oleh sistem ujian luciferin/luciferase kelip-kelip [59]di bawah keadaan yang sama seperti AY. Bioluminescence diukur dengan kit ujian Sigma-Aldrich mengikut arahan pengeluar, menggunakan pilihan luminescence pembaca mikroplate (FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Jerman).

4.10.Haiwan

Tikus Wistar lelaki (200 g) diperolehi dari Pusat Pengeluaran Haiwan Berpidatoium (CENPALAB mengikut akronim Sepanyolnya, Havana, Cuba) dan ditempatkan di kemudahan penjagaan haiwan selama 1 minggu sebelum eksperimen dalam persekitaran yang dikawal suhu (22-24 ° C), dengan kitaran cahaya / gelap 12-j dan dengan akses ke libitum iklan makanan dan air.

4.11.Pengasingan Mitokondrial

Tikus forebrain mitokondria diasingkan oleh sentrifugasi pembezaan seperti yang diterangkan sebelum ini [60]. Digitonin 10%, digunakan untuk mengganggu sinaptosomes dan menghasilkan campuran mitokondria bukan sinaptosomal ditambah sinaptosomal. Seluruh prosedur dijalankan pada 4 ° C. Nisbah kawalan pernafasan (negeri 3/negeri 4 kadar pernafasan) sentiasa dalam julat 4.5 hingga 6.0, diukur menggunakan 5 mM succinate sebagai substrat.

4.12. Ujian Mitokondria Pemantauan Berterusan

Potensi membran mitokondria ditentukan secara spektrofluorimetrik menggunakan 10 μM safranine O sebagai siasatan 【58,61】 dalam pembaca mikroplate (FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Jerman) pada 495/586 nm pengujaan / panjang gelombang pelepasan; ujian ini dilakukan di hadapan EGTA EGTA 0.1 mM dan 2 mM K, HPOA. Bengkak mitokondrial dianggarkan secara spektrofotometrik daripada penurunan penyerapan yang jelas pada 540 nm. Untuk ujian, mitokondria bertenaga dengan 5 mM kalium succinate (tambah 2.5 uM rotenone)dalam medium standard yang terdiri daripada 125 mM sukrosa, 65 mM KC, dan 10 mM HEPES-KOH, pH 7.4, pada 30 °C.

4.13.Lipid Peroksidasi Assays

Peroksidasi lipid diperkirakan dari generasi malondialdehid (MDA) [28.62]. Mitochondria(1 mg/mL)telah terdedah kepada 4 mM tert-butylhydroperoxide atau 50uM Fe(II)tambah 1 mM natrium citrate pada kepekatan 37 °CC.MDA dikira dengan menggunakan pekali extinc-tion (c =1.56×105 M-1.cm-1).

4.14. Penentuan Kepekatan Fe(II)

Kepekatan Fe(II.I) ditentukan dalam 10 mM fosfat buffer pH 6.5(2 mL)oleh pembentukan kompleks merah dengan 1,10-phenanthroline (5 mM), seperti yang diterangkan sebelum ini [24,28].

4.15.Pemantauan Penggunaan Oksigen

Penggunaan O, yang berkaitan dengan pengoksidaan Fe(II.I) diukur dengan elektrod jenis Clark (Hansatech Instruments, Pentney, King's Lynn, UK) dalam ruang kaca 1.3-ml yang dilengkapi dengan pengacau magnetik, pada suhu 30°C. Kadar penggunaan oksigen (ROC) dinyatakan sebagai nmol O2/mL per min.

4.16.2-Deoxyribose Pengoksidaan Assaly

Pembentukan radikal hydroxyl ("OH) dianggarkan dengan mengikuti degradasi 2-deoxyribose kepada MDA, yang dikira dari pekali kepupusannya (e = 1.56×10 ° M-1 ·cm-) seperti yang dilaporkan sebelumnya [26,27].

4.17. Pengesanan Kompleks Gos-Fe(II)

Fe(II.I)(FeCl,0.4-1.6 μM)telah ditambah kepada 2 mL(10 mM)fosfat buffer(pH 6.5)mengandungi 2 mM citrate dan 1.6 μM Gos. Imbasan panjang gelombang dari 200-600 nm telah dilakukan dalam spektrofotoometer Hitachi 2001 (Hitachi, Tokyo), pada 28°C.

4.18. Analisis Statistik

GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA)telah digunakan. Analisis statistik dilakukan menggunakan ANOVA sehala, diikuti dengan ujian posthoc Pelajar-Newman-Keuls untuk perbandingan pasangan-bijak. Keputusan dengan p<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" the="" half-effective="" or="" inhibitory="" concentrations="" were="" estimated="" following="" a="" non-linear="" regression="">

Bahan Tambahan: Perkara berikut boleh didapati dalam talian. Rajah S1:lH-NMR(400 MHz)spektrum gossypitrin dalam DMSO-do, Rajah S2:13C-NMR(101 MHz)spektrum gossypitrin dalam DMSO-d, Rajah S3: HSQCspectrum gossypitrin dalam DMSO-dg. Jadual S1:'H (400 MHz) dan 13C (100 MHz) data gossypitrin berbanding laporan sebelumnya.

Sumbangan Pengarang:Konseptualisasi, G.LP.-A.; metodologi, M.A.B.-V., R.F.D., Y.M.-P.dan G.L.P.-A.; pengesahan, M.A.B.-V., J.M.-P., Y.M.-P, dan R.F.D.; analisis formal, Y.M-P, J.M.-P, R.F.-A. dan G.L.P-A.; penyiasatan, M.A.B.-V, A.A.-L., D.A.-A., Y.M.-P., R.F.D.dan G.L.P-A.; Data curation, M.A.B.-V.YM.-P.J.M.-P.dan R.F-A.; menulis—penyediaan draf asal, M.A.B.-V.; menulis—semakan dan penyuntingan, IM.-P, R.F-A., Y.M.-P dan G.L.P.-A.; visualisasi, Y.M.-P., dan G.L.P-A.; penyeliaan, G.L.P.-A.; pemerolehan pembiayaan, G.L.P.-A.Semua penulis telah membaca dan bersetuju dengan versi manuskrip yang diterbitkan.

Pembiayaan: Penyelidikan ini dibiayai oleh VLIR(Belgium); nombor geran CU2018TEA457A103, dan oleh Ministerio de Ciencia Tecnologia y Medio Ambiente (Cuba); nombor geran PN223LH010-035. APC dibiayai oleh VLIR (Belgium); nombor geran CU2018TEA457A103.

Penyata Lembaga Kajian Institusi:Kajian ini dijalankan mengikut garis panduan Deklarasi Helsinki, dan diluluskan oleh Jawatankuasa Etika Institusi dari Institut Sains Farmaseutikal dan Makanan, University of Havana, Cuba (Kod protokol IFAL-CEI 087-2019, Oktober 2019).

Penyata Persetujuan Yang Dimaklumkan: Tidak berkenaan. Penyata Ketersediaan Data: Tidak berkenaan.

Pengakuan:Kerja ini sebahagiannya disokong oleh Vlaamse Interuniversitaire Raad (VLIR)-Belgium/Ministerio de Educacion Superior (MES)-Cuba Project CU2018TEA457A103, yang juga merangkumi yuran pemprosesan artikel, dan oleh projek PN223LH010-035 dari"Ministerialio de Ciencia Tecnologia y Medio Ambiente (Cuba), Programa de Ciencias Basicas y Naturales". Konflik Kepentingan: Penulis mengisytiharkan tiada konflik kepentingan.

Sampel Ketersediaan: Sampel sebatian boleh didapati dari pengarang yang sepadan.