Metabolisme Glutathione Menyumbang Kepada Induksi Imuniti Terlatih

Abstrak:

Sistem imun semula jadi memaparkan ciri ingatan heterolog, yang dicirikan oleh tindak balas yang lebih kuat terhadap cabaran sekunder. Fenomena yang dipanggil imuniti terlatih ini bergantung pada pendawaian semula epigenetik dan metabolik sel imun semula jadi. Oleh kerana pengeluaran spesies oksigen reaktif (ROS) telah dikaitkan dengan fenotip imuniti terlatih, kami membuat hipotesis bahawa peningkatan tahap ROS dan glutation molekul redoks intraselular utama memainkan peranan dalam induksi imuniti terlatih. Di sini kami menunjukkan bahawa perencatan farmakologi ROS dalam model in vitro imuniti terlatih tidak mempengaruhi tindak balas sel; modulasi tahap glutation mengurangkan pengeluaran sitokin pro-radang dalam monosit manusia. Polimorfisme nukleotida tunggal (SNP) dalam gen yang terlibat dalam metabolisme glutation didapati dikaitkan dengan perubahan dalam kapasiti pengeluaran sitokin proinflamasi apabila imuniti terlatih.

Selain itu, kepekatan glutation plasma dikaitkan secara positif dengan pengeluaran ex vivo IL-1, penanda bio imuniti terlatih, yang dihasilkan oleh monosit individu yang divaksin BCG. Kesimpulannya, metabolisme glutation terlibat dalam induksi imuniti terlatih, dan kajian masa depan adalah wajar untuk meneroka akibat fungsinya dalam penyakit manusia.

Kekebalan manusia sangat penting kerana ia melindungi kita daripada penyakit dan jangkitan. Sistem imun ialah sistem kompleks yang terdiri daripada pelbagai sel, tisu, dan organ. Mereka bekerjasama untuk menangani pelbagai patogen di dalam dan di luar. Dalam penyelidikan, kami mendapati bahawa Cistanche deserticola polysaccharide dan verbascoside boleh meningkatkan aktiviti enzim jantung dan tisu otak dan menguatkan rongga perut. Fungsi fagositik sel dan tindak balas percambahan limfosit mempunyai kesan yang jelas untuk meningkatkan imuniti.

Klik produk suplemen cistanche deserticola

Kata kunci:

glutation; imuniti terlatih; makrofaj; metabolisme; ingatan imun semula jadi.

1. Pengenalan

Sehingga baru-baru ini, imuniti adaptif dianggap sebagai satu-satunya komponen pertahanan perumah yang dicirikan oleh kapasiti untuk mengekalkan ingatan, menyesuaikan tindak balas sel T dan B kepada antigen tertentu.

Walau bagaimanapun, badan penyelidikan baru-baru ini yang semakin meningkat juga telah mengaitkan ciri-ciri ingatan heterolog kepada sistem imun semula jadi, satu proses yang dipanggil imuniti terlatih [1]. Monosit yang terdedah untuk tempoh yang singkat kepada Candida albicans, komponen dinding sel kulat -glukan, atau rangsangan steril sebagai lipoprotein berketumpatan rendah teroksida (ox-LDL), menunjukkan peningkatan pengeluaran sitokin pro-radang apabila rangsangan sekunder yang tidak berkaitan lama selepas rangsangan awal telah dikeluarkan [2,3].

Di samping itu, kajian epidemiologi telah menunjukkan bahawa vaksinasi Bacillus Calmette-Guérin (BCG) terhadap tuberkulosis meningkatkan fungsi antimikrob sel imun semula jadi, seterusnya mendorong perlindungan tidak spesifik terhadap jangkitan yang tidak berkaitan dan mengurangkan kematian semua punca [4].

Imuniti terlatih berakar umbi dalam perubahan epigenetik yang memodulasi kebolehcapaian gen tindak balas pro-radang untuk jentera transkrip sel. Pendawaian semula epigenetik dalam sel imun semula jadi yang terlatih disertai dengan perubahan metabolik yang menggalakkan laluan seperti glikolisis, fosforilasi oksidatif, dan biosintesis kolesterol [5,6]. Metabolit yang diperoleh daripada laluan ini adalah molekul isyarat dan kofaktor yang seterusnya boleh memodulasi aktiviti enzim pengubahsuai kromatin. Glutathione (GSH) adalah antioksidan utama yang memelihara keseimbangan redoks intraselular dan telah dicadangkan untuk menyumbang kepada perubahan epigenetik [7].

Di samping itu, rangsangan yang mendorong imuniti terlatih, seperti BCG dan oxLDL, meningkatkan pengeluaran spesies oksigen reaktif (ROS) makrofaj apabila rangsangan sekunder [8-10]. Kami membuat hipotesis bahawa peningkatan aktiviti metabolik makrofaj terlatih juga akan meningkatkan tahap ROS dan memodulasi GSH, yang seterusnya akan mempengaruhi kekuatan tindak balas imuniti terlatih.

2. Bahan-bahan dan cara-cara

2.1. Pengasingan Sel Mononuklear Darah Periferal Manusia (PBMC) dan Monosit

Kot buffy daripada penderma yang sihat diperolehi selepas persetujuan bertulis secara bertulis (Sanquin Blood Bank, Nijmegen, Belanda). Kelulusan etika diperoleh daripada CMO Arnhem-Nijmegen (NL32 357.091.10). Pengasingan dilakukan dengan sentrifugasi ketumpatan pembezaan ke atas Ficoll-Paque (GE Healthcare, Chalfont St Giles, UK). Selepas itu, pengasingan monosit dilakukan dengan sentrifugasi kecerunan ketumpatan hyper-osmotic Percoll (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) dan dibasuh sekali dengan salin penampan fosfat sejuk (PBS) tanpa pyrogen. Sel telah digantung semula dan kemudian dibiakkan dalam medium ubah suai Belanda RPMI 1640 (Invitrogen, Waltham, MA, USA) ditambah dengan 5 µg/mL gentamicin (Centraform, Etten-Leur, Belanda), 2 mM Glutamax (Gibco, Waltham, MA, Amerika Syarikat). ), dan 1 mM piruvat (Gibco). Untuk memastikan ketulenan maksimum, monosit terpencil Percoll dibiarkan melekat pada plat bawah rata polistirena (Corning, Sigma-Aldrish, New York, NY, USA) selama 1 jam pada 37 ◦C 5 peratus CO2 dan kemudian dibasuh sekali dengan PBS hangat.

2.2. Model Imuniti Terlatih In Vitro

Monosit yang melekat telah dibiakkan seperti yang diterangkan sebelum ini [11]. Secara ringkasnya, 105 monosit telah disemai pada plat telaga 96-bawah rata (Greiner, Kremsmünster, Austria) dan diinkubasi dengan 1 µg/mL -glucan atau 5 µg/mL vaksin BCG (InterVax, Toronto, ON, Kanada) dalam RPMI dengan 10 peratus serum terkumpul manusia. -1,3-(D)-glucan ( -glucan) daripada Candida albicans telah disediakan oleh Profesor David Williams (Kolej Perubatan, Johnson City, TN, Amerika Syarikat).

Apabila ditunjukkan, sel telah diinkubasi dengan {{0}}.5µM diphenyleneiodonium (DPI), 50 µM a-tocopherol (AT) (Sigma-Aldrich), 0.5 µM ascorbic acid (AA), 1 mM N-acetyl sistein (NAC) (Sigma-Aldrich), atau 100 µM DL-buthionine sulfoximine (BSO) (Sigma-Aldrich) selama 1 jam sebelum penambahan -glucan. Selepas 24 jam, sel dibasuh sekali dengan PBS hangat dan dibiarkan untuk membezakan dalam RPMI ditambah dengan 10 peratus serum manusia terkumpul selama 5 hari. Medium telah disegarkan pada hari ke-3 budaya. Pada hari ke-6, makrofaj telah dirangsang semula dengan 10 ng / mL Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS; serotype 055: B5, Sigma-Aldrich) untuk tambahan 24 jam.

2.3. Kuantifikasi Spesies Oksigen Reaktif (ROS).

Monosit/makrofaj dibiakkan selama 2 jam, 24 jam atau 6 hari, dibasuh, ditanggalkan dengan PBS sejuk dan diinkubasi dengan 5 µM H2DCFDA (Life Technologies, Waltham, MA, USA) dalam PBS selama 3{12}} min pada 37 ◦C. Sel dianalisis oleh sitometri aliran (CytoFlex, Beckman Coulter, Brea, CA, Amerika Syarikat). Analisis data dilakukan menggunakan perisian Kaluza 2.1. Agregat sel telah berpagar berdasarkan ketinggian serakan ke hadapan (FSC) berbanding plot kawasan FSC dan populasi monosit/makrofaj telah berpagar mengikut FSC dan serakan sisi (SSC). Data dibentangkan sebagai min ± SEM dan dianalisis dengan ujian Friedman diikuti dengan ujian perbandingan berbilang Dunn. Nilai p di bawah 0.05 dianggap signifikan secara statistik, seperti yang ditunjukkan oleh asterisk (* p < 0.05).

2.4. Data Penjujukan RNA Monosit Manusia Dirangsang Secara In Vitro

Analisis ekspresi gen monosit yang terdedah secara in vitro kepada -glucan dilakukan menggunakan data RNA-seq yang diterbitkan sebelum ini [12]. Secara ringkas, PBMC telah diasingkan dengan sentrifugasi dalam Ficoll-Paque (GE Healthcare). Monosit telah disucikan menggunakan pemilihan negatif dengan manik untuk CD3 plus (sel T), CD19 plus (sel B), dan CD56 plus (sel NK) sel positif (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Jerman). Sel telah dibiakkan mengikut model imuniti terlatih in vitro yang diterangkan dan terdedah kepada 5 µg/mL -glucan. Monosit dikumpulkan pada 4 jam dan 24 jam selepas pendedahan. Gen yang berkaitan dengan tindak balas antioksidan dan metabolisme glutation telah diekstrak daripada senarai gen yang sangat dinamik (p < 0.05, FC > 2.5, RPKM > 1) dalam model imuniti terlatih monosit-ke-makrofaj in vitro. Data dibentangkan sebagai log10 nisbah antara monosit yang dirawat dengan -glukan dan monosit tidak dirangsang.

2.5. Kuantifikasi Glutathione

Analisis kuantitatif glutation terkurang intraselular (GSH) dan teroksida (GSSG) dilakukan menggunakan spektroskopi resonans magnetik nuklear (NMR) seperti yang diterangkan sebelum ini [13].

Secara ringkas, medium pertumbuhan telah dikeluarkan dan sel yang dikultur dibasuh dengan PBS hangat (37 ◦C) dan dipadamkan dengan nitrogen cecair untuk menghentikan metabolisme. Sel-sel itu kemudiannya dikikis dari plat dan diekstrak menggunakan larutan sejuk (−80 ◦C) metanol/kloroform/air, 8.1:0.9:1 (vol/vol/vol) . Ekstrak disimpan beku di atas ais kering selama sekurang-kurangnya 30 min dan kemudiannya disentrifugasi selama 20 min pada 18,{{1{{30}}}} × g pada −4 ◦C. Pelet protein disimpan untuk pengkuantifikasian protein manakala supernatan yang mengandungi metabolit intrasel telah dikeringkan di bawah aliran nitrogen yang lembut dan sampel NMR disediakan dengan melarutkan bahan kering dengan 0.22 mL penimbal fosfat 0.15 M (pH 7.4) dalam air terdeuterasi yang mengandungi 0.05 mM trimethylsilyl propionic-d4-garam natrium sebagai standard dalaman untuk rujukan dan kuantifikasi NMR. Spektrum NMR 1D 1H dikumpul untuk setiap sampel pada 14.1 T (600 MHz untuk 1H) Bruker Avance II NMR, menggunakan urutan nadi noesygppr1d (Topspin v3.0, Bruker Biospin Ltd, Karlsruhe, Jerman). Semua spektrum telah diproses dan diimport dalam Chenomx NMR suite 8.4 (Chenomx NMR suite, v8.0, Edmonton, AB, Kanada) untuk kuantifikasi glutation.

Semua kepekatan telah dinormalkan kepada jumlah jisim protein setiap sampel. Yang terakhir dikira dengan melarutkan pelet protein dalam penimbal (1:1, 1 peratus SDS: 8M Urea (0.25M Tris pH:8)) dengan sonikasi. Kepekatan protein kemudiannya diukur menggunakan kit ujian protein PierceTM BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) mengikut manualnya.

2.6. Model Imuniti Terlatih In Vitro dan In Vivo untuk Analisis Genetik dan Metabolik

Dalam model in vitro, monosit yang melekat diinkubasi sama ada dengan medium kultur sahaja sebagai kawalan negatif, 2 µg/mL -1,3-(D)-glucan atau 5 µg/mL BCG (300BCG kohort : strain BCG-Bulgaria, Intervax, Kanada), selama 24 jam pada suhu 37 ◦C dengan kehadiran 10 peratus serum manusia terkumpul. Pada hari ke-6, sel telah dirangsang semula selama 24 jam dengan sama ada 200 µL RPMI atau LPS 10 ng/mL (serotype 055: B5; Sigma-Aldrich).

Dalam model in vivo, orang dewasa yang sihat telah divaksinasi dengan dos standard 0.1 mL BCG secara intradermal di lengan atas kiri, dan darah dikumpulkan sebelum dan 14, dan 90 hari selepas vaksinasi. Dalam setiap lawatan, 5 × 105 PBMC telah dirangsang dengan Staphylococcus aureus yang dibunuh haba (106 CFU/mL) atau dibiarkan tanpa rangsangan pada suhu 37 ◦C dengan 5 peratus CO2. Sitokin yang dirembeskan diukur dalam kedua-dua model selepas 24 jam rangsangan, dan peningkatan tindak balas sitokin lipatan yang disebabkan oleh rangsangan latihan digunakan sebagai ukuran untuk imuniti terlatih [14].

2.7. Analisis Genetik

Analisis genetik dilakukan menggunakan kohort individu yang sihat berketurunan Eropah Barat dari Projek Genomik Fungsian Manusia [15]. Kohort 300BCG terdiri daripada 325 orang dewasa dari Belanda (44 peratus lelaki dan 56 peratus perempuan, lingkungan umur 18–71 tahun). Kajian itu telah diluluskan oleh jawatankuasa etika tempatan CMO rantau Arnhem-Nijmegen, NL58553.091.16. Sampel DNA individu (n=325) telah digenotip menggunakan cip SNP yang tersedia secara komersial, Infinium Global Screening Array MD v1.0 daripada Illumina. Optik 0.7.0 dengan tetapan lalai telah digunakan untuk panggilan genotip [16]. Sampel dengan kadar panggilan Kurang daripada atau sama dengan 0.99 telah dikecualikan, begitu juga dengan varian dengan keseimbangan Hardy-Weinberg (HWE) Kurang daripada atau sama dengan 0.0001 dan frekuensi alel kecil (MAF) Kurang daripada atau sama kepada 0.001. Helaian varian telah diselaraskan dan dikenal pasti terhadap panel rujukan 1000 Genom menggunakan Genotype Harmonizer [17]. Kami kemudiannya mengaitkan sampel pada pelayan imputasi Michigan menggunakan konsortium rujukan manusia (HRC r1.1 2016) sebagai panel rujukan dan kami menapis keluar varian genetik dengan R2 < 0.3 untuk kualiti imputasi dan MAF < 5 peratus [18], menghasilkan kira-kira 4 juta polimorfisme nukleotida tunggal (SNP) untuk pemetaan QTL susulan. Kedua-dua data genotip dan sitokin pada tindak balas imuniti terlatih in vitro diperolehi untuk sejumlah 267 individu daripada kohort 300 BCG. Tiga sampel telah dikecualikan kerana penggunaan ubat-ubatan (yang mana satu telah dikenal pasti sebagai outlier genetik), dan satu sampel adalah disebabkan oleh permulaan diabetes jenis 1 semasa kajian.

Pertama, perubahan lipatan pengeluaran sitokin antara sel terlatih dan tidak terlatih diambil sebagai ukuran untuk magnitud tindak balas imuniti terlatih. Berikutan pemeriksaan kualiti untuk pengedaran sitokin dan selepas mengecualikan penyimpangan genetik, kami memetakan perubahan lipatan yang diubah suai log pengeluaran sitokin kepada data genotip menggunakan model regresi linear dengan umur dan jantina sebagai kovariat untuk membetulkan taburan perubahan lipatan pengeluaran sitokin. Kami menggunakan potongan p <9.99 × 10−3 untuk mengenal pasti perkaitan lokus sifat kuantitatif (QTL) yang mempengaruhi tindak balas imuniti terlatih. Menggunakan model imuniti terlatih in vivo, kedua-dua data genotip dan sitokin diperoleh untuk sejumlah 296 individu.

Sebagai tambahan kepada penyimpangan yang diterangkan untuk pemetaan in vitro QTL, 18 individu yang divaksinasi malam telah dikecualikan, menghasilkan 278 sampel sebelum pemetaan QTL. Pertama, tahap sitokin mentah telah diubah log dan nisbah pengeluaran sitokin antara lawatan diambil sebagai perubahan lipatan pengeluaran sitokin. Perubahan lipatan pengeluaran sitokin dipetakan kepada data genotip menggunakan model regresi linear dengan umur dan jantina sebagai kovariat. Kami menggunakan potongan p <9.99 × 10−3 untuk mengenal pasti persatuan QTL yang tidak senonoh yang mempengaruhi tindak balas imuniti terlatih. R-package Matrix-eQTL telah digunakan untuk pemetaan QTL sitokin [19].

2.8. Analisis Metabolomik

Tahap metabolit individu daripada kohort 300 BCG diukur sebelum vaksinasi BCG. Ciri-ciri metabolik diukur dan diberi penjelasan oleh Metabolik Am (Zurich, Switzerland) menggunakan spektrometri jisim masa penerbangan suntikan aliran (suntikan aliran TOF-M) [20]. Metabolit tidak disasarkan telah dijelaskan mengikut pangkalan data metabolit manusia (HMDB). Semua pengukuran metabolomik dilakukan dalam pendua, dan nilai purata dikira untuk setiap sampel setiap metabolit. Analisis korelasi Spearman dilakukan pada metabolit dan perubahan lipatan sitokin ex vivo mengenai tindak balas sebelum vaksinasi. Untuk menguji hubungan antara tahap glutation dan SNP kepentingan yang dikenal pasti dalam analisis genetik, analisis regresi linear dengan umur dan jantina dimasukkan sebagai kovariat dilakukan untuk setiap SNP.

2.9. Kuantifikasi dan Analisis Sitokin

Pengeluaran sitokin ditentukan menggunakan kit ELISA komersial untuk IL{{0}} , IL-6 dan TNF (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) mengikut arahan pengeluar. Data dibentangkan sebagai min ± SEM dan dianalisis dengan ukuran berulang dua hala ANOVA diikuti dengan ujian perbandingan berbilang Sidak. Nilai-p di bawah 0.05 dianggap signifikan secara statistik, seperti yang ditunjukkan oleh asterisk (* p < 0.05).

3. Keputusan

3.1. -Imuniti Terlatih Glucan- dan BCG-Induced Mencetuskan Pengeluaran Spesies Oksigen Reaktif Berkekalan

Peningkatan pelepasan ROS sebelum ini telah digambarkan sebagai ciri fenotip imuniti terlatih [21]. Monosit yang terdedah kepada -glucan atau BCG selama 2 jam dan 24 jam mempamerkan peningkatan ROS. Menariknya, peningkatan ini dikekalkan dan hadir selepas 5 hari berehat dalam media kultur (Rajah 1A). Tahap ROS yang dipertingkatkan disertai dengan perubahan transkrip gen antioksidan yang berbeza dalam monosit yang terdedah kepada -glucan selama 24 jam (Rajah 1B). Mitokondria superoksida dismutase SOD2 dan molekul yang mengandungi tiol berbeza dikawal, iaitu reduktase peroksida yang bergantung kepada thioredoxin 1-6 (PRDX 1-6) dan sulfiredoxin 1 (SRXN1). Ekspresi thioredoxin (TXN) dan thioredoxin reductase (TXNRD), pemulung ROS yang mengandungi tiol yang berkaitan, juga ditambah.

Rajah 1. Peningkatan tahap ROS bagi monosit terlatih tidak menyumbang kepada peningkatan pengeluaran sitokin proinflamasi mereka. (A) Tahap ROS pada 2 jam, 24 jam dan 6 hari selepas pendedahan monosit kepada -glucan dan BCG (n=6/9 penderma, dikumpulkan daripada 2/3 eksperimen bebas. Fridman menguji ujian perbandingan berbilang Dunn) . (B) Tahap ekspresi gen yang terlibat dalam pertahanan antioksidan dalam monosit yang terdedah kepada -glukan selama 24 jam berbanding dengan sel yang tidak dirangsang. Ungkapan dibentangkan sebagai log10(nisbah). TNF dan IL-6 dihasilkan oleh makrofaj terlatih -glucan selepas prarawatan selama 1 jam dengan (C) 0.5µM DPI (n=6 penderma, dikumpulkan daripada 2 eksperimen bebas) dan (D ) 1 mM NAC, 50 µM AT atau 0.5 µM AA (n=6 penderma, dikumpulkan daripada dua eksperimen bebas, ANOVA dua hala, ujian perbandingan berbilang Sidak). (min ± SEM, * p < 0.05).

Walau bagaimanapun, perencatan pengeluar ROS utama NADPH oksidase dengan diphenyleneiodonium (DPI) mahupun penambahan molekul antioksidan -tokoferol (AT) dan asid askorbik (AA) sebelum pengeraman dengan -glucan, tidak memodulasi tindak balas makrofaj yang meningkat. Dalam makrofaj yang terdedah kepada rembesan -glucan, TNF, dan IL-6 24 jam selepas rangsangan semula LPS tidak diubah suai oleh pendekatan farmakologi ini (Rajah 1C, D).

Walau bagaimanapun, pendedahan kepada DPI sahaja meningkatkan pengeluaran IL-6 apabila rangsangan LPS. (Rajah 1C). Prarawatan dengan N-acetyl cysteine ​​(NAC) scavenger ROS am menyebabkan penurunan dalam pengeluaran TNF dan IL-6 jika dibandingkan dengan sel yang terdedah kepada glucan sahaja (Rajah 1D). Secara keseluruhan, kami menunjukkan bahawa peningkatan pengeluaran ROS memainkan peranan kecil dalam peningkatan pengeluaran sitokin imuniti terlatih yang disebabkan oleh -glucan. Di samping itu, imuniti terlatih yang mengekalkan tahap ROS yang meningkat boleh dikaitkan dengan modulasi glutation antioksidan selular, kerana NAC bukan sahaja pemulung ROS tetapi juga boleh bertindak sebagai pendahulu untuk sintesis glutation.

3.2. Metabolisme Glutathione Mempengaruhi Tindak Balas Kekebalan Terlatih

Monosit yang terdedah kepada -glucan selama 24 jam menunjukkan tahap yang lebih tinggi bagi bentuk teroksida glutation (GSSG), iaitu dengan tahap ROS yang lebih tinggi yang terdapat pada titik masa ini (Rajah 2A). Selepas tempoh rehat, bentuk terkurang glutation (GSH) cenderung meningkat dalam makrofaj terlatih, tanpa perubahan kepekatan bentuk teroksida.

Rajah 2. Tahap glutation dimodulasi apabila pendedahan -glucan. (A) Tahap intraselular glutation dikurangkan dan teroksida dalam monosit selepas pendedahan 24 jam dengan 1 µg/mL -glukan dan 5 hari selepas tempoh rehat (n=4 penderma, dikumpulkan daripada dua eksperimen bebas). (B) Ekspresi gen yang terlibat dalam metabolisme glutation dalam monosit yang terdedah kepada -glucan selama 4 jam dan 24 jam. Ungkapan dibentangkan sebagai log10(nisbah). (C) TNF dan IL-6 dihasilkan oleh makrofaj terlatih -glucan selepas prarawatan selama 1 jam dengan 100 µM BSO (n=9 penderma, dikumpulkan daripada tiga eksperimen bebas, * p < 0.05 ANOVA dua hala , ujian perbandingan berbilang Sidak) (min ± SEM).

Gen yang mengekod untuk subunit enzim glutamat sistein ligase yang mengehadkan kadar (GCLC dan GCLM) menunjukkan peningkatan ekspresi pada 4 jam selepas rangsangan -glucan berbanding monosit kawalan. Glutathione reductase (GSR), glutathione peroxidase 7 (GPX7), dan enzim keluarga glutaredoxin (GLRX, 2, 5) juga dikawal selia pada titik masa 24 jam (Rajah 2B), mencadangkan bukan sahaja peningkatan dalam sintesis tetapi juga lebih tinggi. kadar kitar semula glutation. Menghalang aktiviti GCL secara farmakologi dengan buthionine sulfoximine (BSO) sebelum pendedahan -glucan membawa kepada penurunan dalam pengeluaran IL-6 selepas rangsangan semula LPS (Rajah 2C). Oleh itu, modulasi eksogen tahap glutation, sama ada suplemen dengan penambahan prekursor NAC, atau penurunannya dengan menyekat enzim GCL dengan BSO, melembapkan peningkatan tindak balas -glukan kepada rangsangan sekunder.

Untuk menyiasat lebih lanjut sama ada variasi genetik dalam gen yang terlibat dalam metabolisme glutation mempengaruhi imuniti terlatih, pemetaan QTL dilakukan menggunakan kohort 325 individu yang sihat. Kami menguji sama ada SNP biasa dengan kekerapan alel kecil (MAF) > 0.05 dalam gen yang berkaitan untuk metabolisme glutation dikaitkan dengan perubahan dalam kapasiti pengeluaran sitokin proinflamasi monosit apabila latihan in vitro -glucan dan BCG (Rajah 3A, C).

Begitu juga, kami juga menilai kesan varian genetik ini pada imuniti terlatih in vivo yang disebabkan oleh vaksinasi BCG terhadap 278 individu yang sihat (Rajah 3B, C). Beberapa SNP dalam tetingkap 250 kb gen yang terlibat dalam metabolisme glutation dikaitkan secara sugestif (nilai p < 9.99 × 10−3 ) dengan pengawalan rembesan IL-1, TNF, dan IL-6 selepas latihan (Rajah 3A, B).

Dalam kohort yang sama, kami mengukur metabolit plasma yang terlibat dalam metabolisme glutation sebelum vaksinasi BCG. SNP yang dikenal pasti dalam analisis in vitro dan in vivo dikaitkan dengan ketara dengan kepekatan glutation yang beredar (nilai p < 0.05) (Rajah 3D). Di samping itu, kami mendapati perkaitan positif antara kepekatan glutation plasma dan pengeluaran ex vivo IL-1 90 hari selepas vaksinasi BCG selepas pendedahan in vitro kepada rangsangan heterologus Staphylococcus aureus (Rajah 3E). Kawal selia pengeluaran IL-1 oleh vaksinasi BCG juga dikaitkan secara positif dengan kepekatan beredar metabolit lain yang terlibat dalam metabolisme glutation, seperti metionin, sistein, glutamat dan glisin (Rajah 3E). Secara keseluruhannya, gen yang terlibat dalam metabolisme glutation yang mengandungi QTL untuk tindak balas heterolog semula jadi, kepada LPS (Rajah 3A) atau kepada S. aureus (Rajah 3B), dan korelasi antara tahap serum glutathione dan pengeluaran ex vivo IL-1, kedua-duanya menunjukkan kepada peranan laluan ini dalam pembentukan imuniti terlatih.

Rajah 3. Glutathione dikaitkan dengan ciri imuniti terlatih. Peta haba bagi nilai-p perkaitan (p < 9.99 × 10−3 ) antara SNP dipetakan kepada gen yang terlibat dalam metabolisme glutation dan magnitud kapasiti pengeluaran sitokin oleh monosit yang dilatih secara in vitro dengan (A) -glucan dan BCG (n=251 sukarelawan sihat untuk IL-6 dan n=238 sukarelawan sihat untuk TNF ) dan (B) respons latihan BCG in vivo (n {{10}} sukarelawan yang sihat). (C) Boxplot bagi SNP nilai p terendah setiap analisis (rs7768134, rs35568915). (D) Boxplot menunjukkan paras plasma glutation (diperbetulkan untuk umur dan jantina) berstrata mengikut genotip untuk rs2233294 (GPX3) dan rs10136944 (GLRX5, n=302). Nilai p bagi setiap SNP diperoleh daripada model regresi linear dengan SNP kepentingan sebagai pembolehubah bebas dan glutation (dibetulkan untuk umur dan jantina) sebagai pembolehubah bersandar. (E) Korelasi Spearman antara metabolit yang beredar pada garis dasar yang terlibat dalam metabolisme glutation berbanding perubahan lipatan IL-6, IL-1 dan TNF yang berasal dari PBMC yang diukur pada 14 atau 90 hari selepas Pemvaksinan BCG berbanding dengan garis dasar (n=297 sukarelawan yang sihat). Jadual menunjukkan rho Spearman untuk setiap korelasi, dan korelasi dalam warna merah menyerlahkan korelasi positif yang ketara (* p < 0.05, ** p < 0.01). Korelasi antara kepekatan glutation dan perubahan lipatan pengeluaran IL-1 pada 90 hari berbanding hari 0 diberikan sebagai contoh dalam plot serakan.

4. Perbincangan

Makrofaj ialah sel plastik yang menyesuaikan fenotipnya kepada rangsangan persekitaran yang berbeza. Makrofaj terlatih bergantung pada metabolisme tenaga yang tinggi, dengan peningkatan glikolisis, kitaran TCA, dan fosforilasi oksidatif, untuk melancarkan tindak balas dengan peningkatan pengeluaran sitokin pro-radang [6,22].

Sebagai tambahan kepada pengeluaran sitokin, pecah oksidatif dengan pengeluaran ROS yang cepat meningkat dalam makrofaj terlatih BCG yang dirangsang semula [8]. Neutrofil splenik yang diasingkan daripada tikus yang dirawat BCG juga menunjukkan peningkatan pengeluaran ROS [23]. Selaras dengan kadar metabolik yang dipertingkatkan dan peningkatan kapasiti untuk melancarkan letupan oksidatif, kami mendapati bahawa monosit dan makrofaj yang terdedah kepada -glucan atau BCG mempamerkan peningkatan dalam pengeluaran ROS basal. Peningkatan yang sama dalam pelepasan ROS sebelum ini dilaporkan dalam monosit terlatih oxLDL [9]. ROS mempunyai fungsi effector dalam pembersihan patogen tetapi juga boleh mengantara transduksi isyarat [24]. Perencatan farmakologi enzim penghasil ROS NOX atau rawatan dengan molekul antioksidan -tokoferol dan asid askorbik tidak mengurangkan pengeluaran sitokin -glucan yang meningkat. Walau bagaimanapun, NAC scavenger ROS menghalang pengeluaran TNF yang dipertingkatkan oleh -glucan, menunjukkan kemungkinan peranan ROS dalam imuniti terlatih.

Menariknya, NAC bukan sahaja molekul antioksidan, tetapi ia juga bertindak sebagai prekursor glutathione, molekul antioksidan endogen utama. Terdapat dua sistem redoks selular utama, nukleotida piridin, seperti NAD tambah /NADH, dan sistem tiol, yang termasuk glutation dan thioredoxin. Nisbah NAD plus /NADH dinaikkan dalam monosit terdedah glukan secara berterusan selepas tempoh pembezaan dalam makrofaj terlatih [22], sama seperti yang kami laporkan untuk tahap ROS. Di sini kami menunjukkan bahawa kepekatan GSH juga dimodulasi dalam imuniti terlatih.

Paling menarik, kepekatan bentuk terkurang GSH hanya dipertingkatkan dalam makrofaj terlatih yang dibezakan, manakala tahap GSSG teroksida adalah stabil. Ini menunjukkan bahawa makrofaj terlatih telah meningkatkan stor GSH, yang berbeza dengan NAD plus /NADH tidak bekerjasama dengan pengeluaran ROS yang berterusan. Sumbangan metabolisme glutation kepada imuniti terlatih diperkukuh lagi dengan analisis genetik dan metabolik bagi kohort individu yang sihat (300BCG). Polimorfisme genetik biasa dalam gen berkaitan GSH didapati mempengaruhi magnitud pengeluaran sitokin pada imuniti terlatih in vitro dan in vivo (p <9.99 × 10−3). Di samping itu, dua lokus QTL ini, GPX3 pada chr5 dan GLRX5 pada chr14, didapati dikaitkan dengan kepekatan plasma GSH (p <0.05).

GSH ialah molekul antioksidan, tetapi ia juga dikenali untuk mengawal ekspresi gen melalui mekanisme epigenetik yang berbeza. GSH mengambil bahagian dalam pengubahsuaian pasca translasi, seperti yang diperhatikan dalam S-glutationilation protein nukleosom histon H3, dan dikuasakan oleh laluan metionin yang akhirnya membawa kepada pengeluaran s-adenosyl methionine (SAM). Sebaliknya, SAM ialah penderma metil utama yang digunakan untuk metilasi DNA dan histon [7]. Metabolit fumarat kitaran TCA terkumpul dalam makrofaj terlatih, dan monometil fumarat terbitannya mendorong fenotip imuniti terlatih [5]. Dalam astrosit, pendedahan akut kepada derivatif dimetil fumarat menghabiskan GSH intraselular tetapi meningkatkan jumlah GSH pada titik masa kemudian [25]. Imuniti terlatih berlabuh oleh pengubahsuaian epigenetik yang memberikan ingatan jangka panjang [26]. Kandungan GSH yang meningkat dalam makrofaj terlatih yang diperhatikan di sini mungkin memudahkan pendawaian semula epigenetik yang diperlukan untuk penubuhan memori imun semula jadi.

Di sini, kami menunjukkan bahawa modulasi farmakologi glutation dan status redoks sel mengurangkan tindak balas heterologus makrofaj, seperti yang dilihat oleh kesan BSO atau NAC pada pengeluaran sitokin yang dipertingkatkan -glucan. Di samping itu, dalam kohort individu yang sihat, metabolisme GSH dikaitkan dengan ciri imuniti yang terlatih. Mekanisme imuniti terlatih yang dibentuk oleh metabolisme GSH masih perlu diterokai dengan lebih lanjut, tetapi potensi penglibatan kedua-dua landskap metabolik dan epigenetik menjadikan hab metabolik ini sebagai jalan yang menarik untuk disiasat dalam kajian masa depan. Cerapan ini menyumbang kepada pembongkaran pendawaian metabolik dan epigenetik imuniti terlatih, membolehkan pemahaman yang lebih baik tentang kesan imun semula jadi terhadap kesihatan dan penyakit. Akhirnya, pemahaman yang lebih baik akan membantu mengenal pasti sasaran baru terapi dalam penyakit yang dicirikan oleh disregulasi proses imun semula jadi.

Sumbangan Pengarang:

Pengkonsepan: AVF dan JD-A.; metodologi: AVF, VACMK, VM dan JCA-B., MAG; analisis formal: AVF, VACMK, VM dan JCA-B.; penyiasatan AVF, JCA-B., SK, LCJdB, SJCFMM, VPM dan BN; penyusunan data: AVF, VACMK, VM dan BN; penulisan—penyediaan draf asal, AVF; menulis—menyemak dan menyunting: semua pengarang bersama; penyeliaan: MAG, MGN, dan JD-A.; pemerolehan pembiayaan: MAG dan MGN Semua pengarang telah membaca dan bersetuju dengan versi manuskrip yang diterbitkan.

Pembiayaan:

JD-A. disokong oleh Pertubuhan Penyelidikan Saintifik Belanda (Geran VENI 09150161910024). MGN. disokong oleh Geran Lanjutan ERC (833247) dan Geran Spinoza dari Organisasi Penyelidikan Saintifik Belanda. AVF disokong oleh Fundação para a Ciência ea Tecnologia (Geran FCT, Ph.D. PD/BD/135449/2017). JCAB disokong oleh geran daripada Jabatan Pentadbiran Sains, Teknologi dan Inovasi, COLCIENCIAS, di Colombia (Panggilan 756/2016). BN disokong oleh Geran Penyiasat NHMRC (Australia) (APP1173314).

Penyata Lembaga Semakan Institusi:

Kajian 300BCG telah diluluskan oleh jawatankuasa etika tempatan CMO rantau Arnhem- Nijmegen, NL58553.091.16.

Kenyataan Persetujuan Termaklum:

Persetujuan termaklum diperoleh daripada semua subjek yang terlibat dalam kajian, menurut kelulusan jawatankuasa etika Arnhem-Nijmegen (nr. 2010-104).

Penyata Ketersediaan Data:

Data penjujukan RNA yang dibentangkan dalam kajian ini boleh didapati dalam Omnibus Ekspresi Gen NCBI di bawah nombor penyertaan GSE85243.

Penghargaan:

Penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada semua sukarelawan kerana mengambil bahagian dalam kajian 300BCG.

Konflik Kepentingan:

MGN ialah pengasas saintifik TTxD. Pengarang selebihnya mengisytiharkan tiada konflik kepentingan. Pembiaya tidak mempunyai peranan dalam reka bentuk kajian; dalam pengumpulan, analisis, atau tafsiran data; dalam penulisan manuskrip, atau dalam keputusan untuk menerbitkan hasilnya.

Rujukan

1. Netea, MG; Dominguez-Andrés, J.; Barreiro, LB; Chavakis, T.; Divangahi, M.; Fuchs, E.; Joosten, LAB; van der Meer, JWM; Mhlanga, MM; Mulder, WJM; et al. Mentakrifkan imuniti terlatih dan peranannya dalam kesihatan dan penyakit. Nat. Rev. Immunol. 2020, 20, 375–388. [CrossRef]

2. Quintin, J.; Saeed, S.; Martens, JHA; Giamarellos-Bourboulis, EJ; Ifrim, DC; Logie, C.; Jacobs, L.; Jansen, T.; Kullberg, BJ; Wijmenga, C.; et al. Jangkitan Candida albicans memberi perlindungan terhadap jangkitan semula melalui pengaturcaraan semula fungsi monosit. Mikrob Hos Sel 2012, 12, 223–232. [CrossRef]

3. Bekkering, S.; Quintin, J.; Joosten, LA; Van Der Meer, JW; Netea, MG; Riksen, Lipoprotein Ketumpatan Rendah Teroksida NP Menginduksi Pengeluaran Sitokin Proinflamasi Jangka Panjang dan Pembentukan Sel Buih melalui Pemrograman Semula Epigenetik Monosit. Arter. debaran. Vasc. biol. 2014, 34, 1731–1738. [CrossRef] [PubMed]

4. Benn, CS; Netea, MG; Selin, LK; Aaby, P. A Small Jab-A Big Effect: Nonspecific Immunomodulation By Vaccines. Trend Immunol. 2013, 34, 431–439. [CrossRef]

5. Seni, RJW; Novakovic, B.; ter Horst, R.; Carvalho, A.; Bekkering, S.; Lachmandas, E.; Rodrigues, F.; Silvestre, R.; Cheng, SC; Wang, SY; et al. Glutaminolisis dan Pengumpulan Fumarat Mengintegrasikan Program Imunometabolik dan Epigenetik dalam Imuniti Terlatih. Metab Sel. 2016, 24, 807–819. [CrossRef] [PubMed]

6. Keating, S.; Groh, L.; van der Heijden, C.; Rodriguez, H.; Dos Santos, J.; Fanucchi, S.; Okabe, J.; Kn, H.; van Puffelen, J.; Helder, L.; et al. Set7 Lysine Methyltransferase Mengatur Keplastikan dalam Fosforilasi Oksidatif yang Diperlukan untuk Kekebalan Terlatih yang Disebabkan oleh Beta-Glucan. Rep. Sel. 2020, 31, 107548. [CrossRef] [PubMed]

7. García-Giménez, JL; Romá-Mateo, C.; Pérez-Machado, G.; Peiró-Chova, L.; Pallardó, FV Peranan glutation dalam pengawalan mekanisme epigenetik dalam penyakit. Radic Percuma. biol. Med. 2017, 112, 36–48. [CrossRef] [PubMed]

8. Bekkering, S.; Blok, BA; Joosten, LAB; Riksen, NP; Van Crevel, R.; Netea, MG In Vitro Model Eksperimen Imuniti Semula Jadi Terlatih dalam Manusia. Clin. Vaksin Immunol. 2016, 23, 926–933. [CrossRef]

9. Sohrabi, Y.; Lagache, SMM; Schnack, L.; Godfrey, R.; Kahles, F.; Bruemmer, D.; Waltenberger, J.; Findeisen, HM mTORTekanan Oksidatif Bergantung Kawal Selia Imuniti Semula Jadi Terlatih Berpengaruh oxLDL dalam Monosit Manusia. Depan. Immunol. 2019, 9, 3155. [CrossRef] [PubMed]

10. Van Der Heijden, CDCC; Keating, ST; Groh, L.; Joosten, LAB; Netea, MG; Riksen, NP Aldosteron mendorong imuniti terlatih: Peranan sintesis asid lemak. Cardiovasc. Res. 2020, 116, 317–328. [CrossRef]

11. Dominguez-Andrés, J.; Seni, RJW; Bekkering, S.; Bahrur, H.; Blok, BA; de Bree, LCJ; Bruno, M.; Bulut, Ö.; Debisarun, PA; Dijkstra, H.; et al. Induksi in vitro imuniti terlatih dalam monosit manusia yang mematuhi. Protokok STAR. 2021, 2, 100365. [CrossRef] [PubMed]

12. Novakovic, B.; Habibi, E.; Wang, S.-Y.; Seni, RJW; Davar, R.; Megchelenbrink, W.; Kim, B.; Kuznetsova, T.; Kox, M.; Zwaag, J.; et al. -Glucan Membalikkan Keadaan Epigenetik Toleransi Imunologi Akibat LPS. Sel 2016, 167, 1354–1368.e14. [CrossRef]

13. Kostidis, S.; Addie, RD; Morreau, H.; Mayboroda, OA; Giera, M. Analisis NMR kuantitatif metabolisme intra dan ekstraselular sel mamalia: Tutorial. dubur. Chim. Acta 2017, 980, 1–24. [CrossRef]

14. Koeken, VACM; de Bree, LCJ; Mourits, VP; Moorlag, SJCFM; Berjalan, J.; Cirovic, B.; Seni, RJW; Jaeger, M.; Dijkstra, H.; Lemmers, H.; et al. Vaksinasi BCG pada manusia menghalang keradangan sistemik dengan cara yang bergantung kepada jantina. J. Clin. Menyiasat. 2020, 130, 5591–5602. [CrossRef]

15. Projek Genomik Fungsian Manusia. Tersedia dalam talian: http://www.humanfunctionalgenomics.org/site/ (diakses pada 19 April 2021).

16. Shah, TS; Liu, JZ; Floyd, JAB; Morris, JA; Wirth, N.; Barrett, JC; Anderson, CA OptiCall: Algoritma panggilan genotip yang teguh untuk varian jarang, frekuensi rendah dan biasa. Bioinformatik 2012, 28, 1598–1603. [CrossRef]

17. Deelen, P.; Bonder, MJ; Van Der Velde, KJ; Westra, HJ; Penggulung, E.; Hendriksen, D.; Franke, L.; Swertz, MA Pengharmoni genotip: Penjajaran untai automatik dan penukaran format untuk penyepaduan data genotip. BMC Res. Nota 2014, 7. [CrossRef]

18. McCarthy, S.; Das, S.; Kretzschmar, W.; Delaneau, O.; Kayu, AR; Teumer, A.; Kang, HM; Fuchsberger, C.; Danecek, P.; Sharp, K.; et al. Panel rujukan 64,976 haplotip untuk imputasi genotip. Nat. Genet. 2016, 48, 1279–1283. [CrossRef]

19. Shabalin, AA Matrix eQTL: Analisis eQTL ultra pantas melalui operasi matriks besar. Bioinformatik 2012, 28, 1353–1358. [CrossRef]

20. Fuhrer, T.; Heer, D.; Begemann, B.; Zamboni, N. Pemprofilan metabolom jisim yang tinggi dan tepat bagi ekstrak selular melalui spektrometri jisim suntikan masa-penerbangan aliran. dubur. Kimia. 2011, 83, 7074–7080. [CrossRef]

21. Kalafati, L.; Kourtzelis, I.; Schulte-schrepping, J.; Verginis, P.; Mitroulis, I. Latihan Imun Semula Jadi Granulopoiesis Menggalakkan Aktiviti Anti-tumor. Sel 2020, 183, 771–785.e12. [CrossRef]

22. Cheng, SC; Quintin, J.; Cramer, RA; Shepardson, KM; Saeed, S.; Kumar, V.; Giamarellos-Bourboulis, EJ; Martens, JHA; Rao, NA; Aghajanirefah, A.; et al. Glikolisis aerobik pengantara MTOR dan HIF-1 -sebagai asas metabolik untuk imuniti terlatih. Sains 2014, 345, 1250684. [CrossRef]

23. Moorlag, SJCFM; Rodriguez-Rosales, YA; Gillard, J.; Fanucchi, S.; Theunissen, K.; Novakovic, B.; de Bont, CM; Negishi, Y.; Fok, ET; Kalafati, L.; et al. Vaksinasi BCG Mendorong Pemrograman Semula Fungsi Jangka Panjang Neutrofil Manusia. Rep. Sel. 2020, 33. [CrossRef]

24. Forrester, SJ; Kikuchi, DS; Hernandes, MS; Xu, Q.; Griendling, KK Spesies oksigen reaktif dalam isyarat metabolik dan keradangan. Circ. Res. 2018, 122, 877–902. [CrossRef]

25. Brennan, MS; Matos, MF; Li, B.; Hronowski, X.; Gao, B.; Juhasz, P.; Rhodes, KJ; Scannevin, RH Dimethyl fumarate dan monoethyl fumarate mempamerkan kesan pembezaan pada KEAP1, pengaktifan NRF2, dan pengurangan glutation secara in vitro. PLoS ONE 2015, 10, e0120254. [CrossRef]

26. Kaufmann, E.; Sanz, J.; Dunn, JL; Khan, N.; Mendonça, LE; Pacis, A.; Tzelepis, F.; Pernet, E.; Dumaine, A.; Grenier, J.-C.; et al. BCG Mendidik Sel Stem Hematopoetik untuk Menjana Imuniti Semula Jadi Pelindung terhadap Tuberkulosis. Sel 2018, 172, 176–190.e19. [CrossRef]

Anaisa V. Ferreira 1,2,* , Valerie ACM Koeken 1,3,4 , Vasiliki Matzaraki 1 , Sarantos Kostidis 5 , Juan Carlos Alarcon-Barrera 5 , L. Charlotte J. de Bree 1 , Simone JCFM Moorlag 1 , Vera P Mourits 1, Boris Novakovic 6,7, Martin A. Giera 5, Mihai G. Netea 1,8 dan Jorge Domínguez-Andrés.

1 Jabatan Perubatan Dalaman dan Pusat Radboud untuk Penyakit Berjangkit (RCI), Pusat Perubatan Nijmegen Universiti Radboud, 6500 HB Nijmegen, Belanda;

Valerie.Koeken@radboudumc.nl (VACMK); Vasiliki.Matzaraki@radboudumc.nl (VM);

Charlotte.deBree@radboudumc.nl (LCJdB); Simone.Moorlag@radboudumc.nl (SJCFMM);

Vera.Mourits@radboudumc.nl (VPM); Mihai.Netea@radboudumc.nl (MGN).

2 Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar (ICBAS), Universidade do Porto, 4050-313 Porto, Portugal.

3 TWINCORE, usaha sama antara Helmholtz-Centre for Infection Research (HZI) dan Hannover Medical School (MHH), 30625 Hannover, Jerman.

4 Centre for Individualized Infection Medicine (CiiM), Department of Computational Biology for Individualized Infection Medicine, sebuah usaha sama antara Helmholtz-Centre for Infection Research (HZI) dan Hannover Medical School (MHH), 30625 Hannover, Jerman.

5 Pusat Proteomik dan Metabolomik, Pusat Perubatan Universiti Leiden (LUMC),2333 ZA Leiden, Belanda; s.kostidis@lumc.nl (SK); jcalarcon_barrera@lumc.nl (JCA-B.);m.a.giera@lumc.nl (MAG)

6 Penyelidikan Epigenetik, Institut Penyelidikan Kanak-Kanak Murdoch, Parkville, VIC 3052, Australia;boris.novakovic@mcri.edu.au.

7 Jabatan Pediatrik, Universiti Melbourne, Melbourne, VIC 3052, Australia.

8 Jabatan Genomik & Imunoregulasi, Institut Sains Hayat dan Perubatan (LIMES), Universiti Bonn, 53115 Bonn, Jerman.

* Surat-menyurat: anaisa.validoferreira@radboudumc.nl (AVF); Jorge.dominguezandres@radboudumc.nl (JD-A.); Tel.: tambah 31-2436-16636 (JD-A.).

For more information:1950477648nn@gmail.com