Protein Pengaktifan Rho-GTPase Myosin MYO9A Dikenalpasti Sebagai Gen Calon Novel Untuk Glomerulosklerosis Segmental Fokus Monogenik

joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Qi Li1 , Ashima Gulati2,6 , Mathieu Lemaire3,7 , Timothy Nottoli4 , Allen Bale3 dan Alda Tufro1,5

1 Jabatan Pediatrik, Bahagian Nefrologi, Sekolah Perubatan Yale, New Haven, Connecticut, Amerika Syarikat; 2 Jabatan Perubatan Dalaman, Bahagian Nefrologi, Sekolah Perubatan Yale, New Haven, Connecticut, Amerika Syarikat; 3 Jabatan Genetik, Sekolah Perubatan Yale, New Haven, Connecticut, Amerika Syarikat; 4 Pusat Penyuntingan Yale Gene, Sekolah Perubatan Yale, New Haven, Connecticut, Amerika Syarikat; dan 5 Jabatan Fisiologi Sel dan Molekul, Sekolah Perubatan Yale, New Haven, Connecticut, Amerika Syarikat

KATA KUNCI: FSGS; Interaksi Myo9A-actin-calmodulin; varian MYO9A; aktiviti RhoA

Glomerulosklerosis segmental fokus(FSGS) ialah podocytopathy yang membawa kepada kegagalan buah pinggang, yang punca molekulnya selalunya tidak dapat diselesaikan. Di sini, kami menerangkan kehilangan fungsi MYO9A yang jarang berlaku mutasi heterozigot karut (p.Arg701*) sebagai kemungkinan penyumbang kepada penyakit dalam pasangan adik-beradik dengan keluarga.FSGS/proteinuria. Varian MYO9A dengan kepentingan yang tidak pasti telah dikenal pasti oleh penjujukan keseluruhan exome dalam kohort 94 pesakit yang terbukti biopsi dengan FSGS. MYO9A ialah myosin tidak konvensional dengan domain Rho-GAP yang mengawal pemasangan simpang sel epitelium, pautan silang dan berkas aktin serta menyahaktifkan protein GTPase kecil yang dikodkan oleh gen RHOA. Aktiviti RhoA dikaitkan dengan peraturan sitoskeleton pembentukan gentian tekanan aktin dan penguncupan actomyosin. Myo9A dikesan dalam tetikus dan podosit manusia secara in vitro dan in vivo. Tikus knockin yang membawa p.Arg701* MYO9A (Myo9AR701X) yang dihasilkan oleh penyuntingan gen yang dibangunkan

proteinuria, penyingkiran podosit, danFSGS. Buah pinggang dan podosit daripada tikus mutan Myo9AR701X/D mendedahkan haploinsufisiensi Myo9A, peningkatan aktiviti RhoA, mengurangkan interaksi Myo9A-actin-calmodulin, perlekatan podosit terjejas, dan penghijrahan. Keputusan kami menunjukkan bahawa Myo9A adalah komponen baru dari radas sitoskeletal podocyte yang mengawal aktiviti RhoA dan fungsi podocyte. Oleh itu, Myo9AR701X/þ knock-in tikus menyusun semula fenotip FSGS proband, menunjukkan bahawa p.R701X Myo9A ialah mutasi yang menyebabkan FSGS pada tikus, dan mencadangkan bahawa mutasi MYO9A kehilangan fungsi heterozigot boleh menyebabkan bentuk novel dominan autosomal manusia. FSGS. Oleh itu, pengenalpastian MYO9A patogenik

varian dalam individu tambahan dengan kekeluargaan atau sporadisFSGSdiperlukan untuk memastikan sumbangan gen kepada penyakit.

Pernyataan Terjemahan

Kerja ini mengenal pasti mutasi kehilangan fungsi myosin 9A (MYO9A) dalam keluarga dengan proteinuria dan focal segmental glomerular sclerosis (FSGS) danVarian MYO9Akepentingan yang tidak pasti dalam kohort FSGS. Myo9A tikus ketuk-masuk yang melindungi p.Arg701* mutasi menghasilkan proteinuria danFSGS, menghasilkan semula fenotip proband. Model haiwan baharu ini memberikan cerapan mekanistik baharu tentang fungsi Myo9A dalam podosit dan membolehkan untuk menguji terapi eksperimen untuk FSGS. Data mencadangkan bahawa mutasi MYO9A kehilangan fungsi heterozigot mungkin menyumbang kepadaFSGSpatogenesis. Kami mencadangkan untuk memasukkan MYO9A dalam panel ujian genetik FSGS.

Glomerulosklerosis segmental fokus(FSGS) ialah lesi histologi yang boleh membawa kepada penyakit buah pinggang peringkat akhir.1 Kajian genetik menunjukkan bahawa FSGS sebahagian besarnya adalah podocytopati, kerana podosit mengekspresikan kebanyakan gen mutan penyebab.2,3 Walau bagaimanapun, punca molekul FSGS tidak diketahui. dalam lebih separuh daripada kes.3 Oleh itu, pengenalpastian gen tambahan yang menyebabkan FSGS dan patogenesis molekulnya adalah berkaitan secara klinikal. Di sini kami mengenal pasti myosin 9A (MYO9A) sebagai gen calon novel untuk FSGS manusia dengan penjujukan keseluruhan exome (WES). Matlamat keseluruhan kajian ini adalah untuk menentukan sama ada varian MYO9A yang jarang dikenal pasti dalam pesakit mengubah fungsi podocyte dan menyebabkan FSGS dalam vivo. MYO9A mengekodkan myosin bukan otot yang tidak konvensional yang sebelum ini tidak dikaitkan dengan penyakit buah pinggang manusia.4 Mutasi MYO9A telah dilaporkan dalam arthrogryposis dan pesakit sindrom myasthenic kongenital.5,6 Myosin ialah keluarga motor molekul yang mengikat aktin untuk menjana daya dan pergerakan serta melayani pelbagai sel. fungsi, termasuk motilitas dan peraturan bentuk, pemerdagangan organel dan isyarat.7–9 Mutasi Myosin IIA (MYH9) dan myosin 1E (MYO1E) telah dilaporkan menyebabkan penyakit glomerular dan FSGS resesif autosomal.10–12 Kelas-9 myosin terdiri daripada MYO9A dan MYO9B yang diekspresikan oleh sel epitelium dan sel imun, masing-masing.9,13 Ciri tersendiri mereka ialah kepala tunggal proses yang bergerak pada F-actin dan domain ekor protein pengaktif Rho-guanosine triphosphatase (Rho-GAP) yang menyahaktifkan RhoA. MRNA Myo9A dinyatakan dalam epitelium ependymal otak dan dalam epitelium testis, paru-paru dan buah pinggang.4 Tikus kalah mati Myo9A mengalami hidrosefalus progresif, hidronefrosis ringan dan tubulopati.14,15 In vitro Myo9A mengawal pemasangan simpang sel epitelium dan penghijrahan sel kolektif. 9 Yang penting, Myo9A mencukupi untuk memaut silang dan mengikat filamen aktin yang mendorong pembentukan rangkaian aktin.16

RhoA memodulasi dinamik aktin podosit dan mengekalkan kebolehtelapan glomerular.17 Gangguan aktiviti Rho-guanosine triphosphatase (Rho-GTPase) dalam podosit membawa kepada penyakit glomerular (disemak dalam Mouawad et al.18). Mutasi pengesan hiliran (INF2)19 dan pengawal selia Rho guanosine diphosphate dissociation–inhibitor alpha (ARHGDIA)3 dan Rho-GAP24 (ARHGAP24) 20 menyebabkan proteinuria dan FSGS. Oleh itu, penalaan halusAktiviti Rho-GTPaseadalah penting untuk mengekalkan fenotip podosit normal dalam vivo. 18

Di sini kami melaporkan bahawa MYO9A ialah protein podocyte novel, yang apabila bermutasi pada tikus membawa kepada proteinuria, penyingkiran proses kaki (FPE), dan FSGS, mereplikasi fenotip manusia yang dikaitkan dengan varian p.Arg701* MYO9A. Penemuan kami mendedahkan kaitan Myo9A dalam podosit, menunjukkan bahawa Myo9A mengawal selia podosit RhoA, dan memberikan bukti pertama bahawa p.Arg701* Myo9A menyebabkan disfungsi podosit dengan gagal mengawal selia RhoA secara negatif dan mengurangkan interaksi Myo9A-actin-calmodulin.

cistanchebolehmerawat penyakit buah pinggangbertambah baikfungsi buah pinggang

KAEDAH

WES

WES sampel DNA daripada 2 adik beradik yang terjejas dan 94 subjek kohort daripada Percubaan Klinikal Glomerulosclerosis Segmental Focal (FSGS-CT; NCT00135811) telah dilakukan di Pusat Yale untuk Analisis Genom dan makmal Klinikal DNA Yale pada platform Illumina.21–26 FSGS- Set data WES kohort CT telah disoal siasat untuk mengenal pastiVarian MYO9Adengan potongan frekuensi alel kecil #{{0}}.01 peratus untuk varian heterozigot dan #0.1 peratus untuk varian heterozigot homozigot dan kompaun, dinilai menggunakan skor MetaSVM,27 SIFT,28 dan CADD29 bioinformatik. Varian MYO9A telah disahkan oleh penjujukan Sanger. Panel gen 64 gen penyebab FSGS berdasarkan OMIM, Warisan Mendelian Dalam Talian dalam Manusia, pangkalan data (omim.org), dan kesusasteraan yang dikaitkan dengan "FSGS," "proteinuria glomerular" atau "sindrom nefrotik" (atau gabungan istilah ini) digunakan untuk mengenal pasti varian yang berkaitan.

Penjanaan tikus knockin Myo9AR701X

Kami menjana tetikus ketuk Myo9AR701X melalui pengeditan gen pengantara CRISPR/Cas9-.30 Kaedah lengkap disertakan dalam Kaedah Tambahan. Myo9AR701X knockin dan pasangan sampah jenis liar, lelaki dan perempuan, telah digunakan mengikut protokol yang diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Pusat Penyelidikan Haiwan Yale.

Histologi/JIKA

Biopsi buah pinggang manusia dan buah pinggang tetikus telah diproses untuk histologi, imunofluoresensi (IF), dan mikroskop elektron penghantaran (TEM) seperti yang diterangkan.31,32 IF telah dilakukan dalam bahagian beku buah pinggang tetikus dan podosit kultur. Antibodi utama ialah anti-MYO9A tikus (klon 4C11; Abnova, Taipei, Taiwan), anti-podocin arnab (P0372; Sigma, St. Louis, MO), anti-laminin arnab (L9393; Sigma), anti-aquaporin2 (PAS) arnab -78809; Invitrogen, Carlsbad, CA) dan anti-megalin arnab;33 antibodi sekunder ialah Alexa Fluor-488 dan 594-terkonjugasi (Invitrogen). Imej diperoleh menggunakan mikroskop confocal Olympus IX71 (Olympus Corp, Shinjuku, Jepun) atau Leica SP{18}}Spectral (Leica Camera, Wetzlar, Jerman).

Immunoblot/immunoprecipitation

Protein telah diselesaikan oleh elektroforesis gel natrium dodecyl sulfate-polyacrylamide dan diimunoblot seperti yang diterangkan sebelum ini;31,32 dengan anti-MYO9A (klon 4C11), aktin (A2066; Sigma), calmodulin (EP799Y; Abcam, Cambridge, UK), gliseraldehid{{ 9}}fosfat dehidrogenase (6C5; Millipore Corp, Burlington, MA), RhoA (67B9; Teknologi Isyarat Sel, Beverly, MA) antibodi utama. Coimmunoprecipitation dilakukan seperti yang diterangkan,34,35 dengan antibodi poliklonal arnab anti-MYO9A (A305-702AM; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX), diikuti dengan immunoblotting

cistanche untuk Focal segmental glomerulosclerosis

PCR kuantitatif

Jumlah RNA telah ditranskripsi terbalik menggunakan kit Sintesis cDNA iScript (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), dikuatkan dengan primer iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) dan Myo9A polymerase chain reaction (PCR): 50 TCTGAGAAGTAGCAGGAATGC-30 dan 50- AGCAACCACAGCTCTGAAA-30 menggunakan CFX96-Sentuh-Masa-Sebenar-PCR (Bio-Rad). MRNA Myo9a telah dinormalkan kepada mRNA GAPDH dengan kaedah 2-DDCt, seperti yang diterangkan.36

Mikroskopi TEM/imunoelektron

TEM telah dilakukan seperti yang diterangkan.32 Untuk immunogold EM, buah pinggang tikus jenis liar telah diperbaiki, cryosections ultrathin dipadamkan, disekat dan diinkubasi dengan antibodi primer anti-MYO9A (klon 4C11) tikus. Antibodi sekunder ialah IgG anti-tikus arnab, konjugat emas ialah emas 10 nm kambing-anti-arnab. Bahagian telah dipasang, diwarnakan dan diperiksa pada FEI Tecnai Biotwin (LaB6, 80 kV) TEM.

Pengasingan podosit utama dan ujian berfungsi

Podosit telah diasingkan daripada buah pinggang jenis liar dan Myo9AR701X/þ seperti yang diterangkan34 dengan sedikit pengubahsuaian. 37,38 Ujian lekatan dilakukan seperti yang diterangkan dan dikira menggunakan pewarnaan kristal violet.37

Myo9A knockdown

Ketukan Myo9A (Myo9AKD) telah diinduksi dalam podosit tetikus diabadikan jenis liar menggunakan RNA (siRNA) gangguan kecil Myo9A (L-006539-ON-TARGETplus, Dharmacon; Horizon Discovery, Cambridge, UK) mengikut arahan pengilang. Podosit dan podosit yang tidak ditransfeksi yang ditransfeksi dengan siRNA tidak disasarkan (D-001810-10-ON-TARGETplus Non-Targeting-control, Dharmacon) berfungsi sebagai kawalan.

Figure 1 | Heterozygous nonsense MYO9A mutation in a family with focal segmental glomerular sclerosis (FSGS)/proteinuria. (a) A novel heterozygous single base-pair mutation that leads to a stop codon in exon 14 of MYO9A c.C2101T: p.R701X (p.Arg701*) in a patient with proteinuria and FSGS. Nucleotide sequence traces show the C>Mutasi T yang dikongsi oleh proband, kakak dan ibu (atas, ditunjukkan oleh *) dan jujukan jenis liar (WT) daripada bapa (bawah), berdasarkan jujukan rujukan MYO9A manusia NM_006901.4. (b) Biopsi buah pinggang daripada proband menunjukkan FSGS dan infiltrat interstisial ringan (asid berkala-noda Schiff, pembesaran asal X 400). (c) Silsilah keluarga menunjukkan pengasingan genotip-fenotip: individu dengan varian proteinuria/FSGS dan MYO9A p.R701X (simbol pepejal), jenis liar (simbol kosong), atau genotip MYO9A yang tidak diketahui (ditunjukkan oleh #). (d) MYO9A jenis liar (NP_008832.2) domain protein: domain motor (kelabu) termasuk gelung 2 (kuning) dan tapak pengikat calmodulin (merah), domain leher (biru), domain ekor (merah jambu ) termasuk domain protein pengaktif Rho-guanosine triphosphatase (Rho-GAP) (hijau); sempadan domain ditunjukkan oleh nombor sisa asid amino; ramalan p.R701X MYO9A tamat dalam tapak pengikat calmodulin dalam gelung 2, tanpa domain leher dan ekor, asterisk menunjukkan lokasi missenseVarian MYO9Akepentingan yang tidak diketahui dikenal pasti. (e) Pemuliharaan evolusi sisa asid amino yang diubah oleh missense MYO9A (bersambung)

Rajah 1|(bersambung) mutasi yang dikenal pasti pada pesakit dengan FSGS: MYO9A sisa diubah p.D156G (p.Asp156) dan p.E765D (p.Glu765) (anak panah merah) sangat dipelihara melalui filogeni. Nombor penyertaan: H. sapiens (NP_008832.2), M. musculus (NP_766606.2), R. norvegicus (NP_599162.1), G. gallus (XP _015134553.1), D. rerio (E7EZG2.1) dan X. tropicalis (XP_002934596.2) telah digunakan untuk penjajaran jujukan berbilang MYO9A dengan Clustal Omega, EMBL-EBI (European Molecular Biology Laboratory–European Bioinformatics Institute, https://www.ebi.ac.uk/ Tools/MSA/clustalo/). Untuk mengoptimumkan paparan imej ini, sila lihat versi dalam talian artikel ini di www.kidney-international.org.

aktiviti RhoA

RhoA aktif diukur dengan ujian pulldown pengaktifan Rho (Millipore) mengikut arahan pengilang.39 RhoA aktif dikesan melalui immunoblotting.40

Analisis statistik

Data dianalisis menggunakan perisian GraphPad Prism 8 (San Diego, CA) dengan ujian t Pelajar tidak berpasangan dengan pembetulan Welch atau analisis varians Welch, mengikut kesesuaian. P < 0.05="" telah="" dianggap="" signifikan="" secara="">

KEPUTUSAN

Pengenalpastian varian MYO9A pada pesakit dengan proteinuria dan FSGS

WES21 identified a rare truncating MYO9A mutation in 2 siblings diagnosed with FSGS/proteinuria at 15 and 14 years of age (Figure 1a), presenting with asymptomatic proteinuria w1 to 2 g/d, normal blood pressure, normal renal ultra-sounds, and estimated glomerular filtration rate of 72 and 96 ml/min per 1.73 m2, respectively. Renal biopsy performed on the index case showed FSGS, mild interstitial fifibrosis, and no tubular abnormalities (Figure 1b). The proband's disease progressed over 3 years: estimated glomerular filtration rate decreased to 46 ml/min per 1.73 m2 and proteinuria >2 g/ d while his sister's estimated glomerular filtration rate and proteinuria remained stable. Relevant family history includes a maternal uncle with chronic kidney disease of unknown etiology, a mother with a history of proteinuria and a healthy father, and no consanguinity (Figure 1c). WES revealed a shared nonsense heterozygous MYO9A (NM_006901 c.2101C>T, p.Arg701* ) in the siblings (Figure 1a). This rare MYO9A variant was identified in 1 of 113,632 alleles tested in the Genome Aggregation Database, or gnomAD (http://gnomad. broadinstitute.org), the allele frequency of 8.8 X 10–6. The parents' genotype revealed that only the mother is heterozygous for c.2101C>T, p.Arg701* varian MYO9A, menunjukkan pewarisan dominan autosomal mutasi (Rajah 1c). Genotip daripada bapa saudara ibu dengan penyakit buah pinggang kronik tidak tersedia. MYO9A p.Arg701* (p.R701X) dijangka mengakibatkan kehilangan fungsi disebabkan oleh pereputan mRNA yang dimediasi karut atau pemotongan dalam gelung 2 domain kepala MYO9A (Rajah 1d) yang diperlukan untuk Myo9A untuk memaut silang aktin .16 Jadual Tambahan S1 menunjukkan semua varian yang dikongsi oleh adik-beradik. Tiada mutasi dalam FSGS atau gen penyebab sindrom nefrotik yang dilaporkan setakat ini dikesan dalam kedua-dua adik-beradik (Jadual Tambahan S2). Untuk pengetahuan kami, ini adalah laporan pertama yang menghubungkan kehilangan fungsi MYO9A mutasi kepada penyakit buah pinggang manusia.

Analysis of WES data from 94 FSGS patients (from the FSGS-CT cohort)41 identifified 5 unrelated individuals with heterozygous MYO9A missense variants (Table 1) meeting a minor allele frequency cutoff #0.01%; 2 of these individuals' MYO9A variants, p.Asp156Gly and p.Glu765Asp (Figure 1d), are predicted to be deleterious by at least 2 bioinformatics scores: MetaSVM, SIFT, and CADD >18;27–29 3 lagi varian missense dianggap jinak berdasarkan 3 skor ramalan bioinformatik. Asid amino yang digantikan dalam varian p.Asp156Gly dan p.Glu765Asp berkemungkinan mempunyai fungsi yang relevan kerana sisa-sisa ini dipelihara melalui evolusi (Rajah 1e). Kami juga mengenal pasti 1 pesakit yang membawa varian MYO9A (p.Arg2283His) yang tidak memenuhi kriteria kekerapan alel kecil kami yang dilaporkan sebelum ini dalam sindrom myasthenia kongenital.6 Tiada mutasi patogen atau varian yang merosakkan dalam gen penyebab FSGS/NS/proteinuria (Jadual Tambahan S2 ) telah dikenal pasti dalam 5 individu dengan varian MYO9A.

Ekspresi MYO9A dalam podosit dan penyakit glomerular

Ekspresi protein Myo9A dikesan oleh immunoblotting dalam buah pinggang tikus dan podosit tetikus dan manusia (Rajah 2a). Immunocytochemistry mengesahkan ekspresi sitoplasma MYO9A dalam podosit manusia (Rajah 2b). Myo9A imunoreaktif dikesan oleh mikroskop IF dalam glomeruli tetikus, di mana ia sebahagiannya berkolokalisasi dengan podocin (Rajah 2c). Pelabelan dua kali dan mikroskopi confocal menggambarkan penyetempatan Myo9A di sepanjang aspek luaran membran bawah tanah glomerular (GBM) bersambung rapat atau dikolokalisasikan dengan podocin (Rajah 2d) dan laminin (Rajah 2e). Immunogold EM menunjukkan penyetempatan tepat Myo9A. Zarah emas diedarkan dalam sitoplasma proses kaki dan badan sel podosit (Rajah 2f dan g, Rajah Tambahan S1B dan D). Diafragma celah tidak dilabel secara seragam. Sel mesangial dan endothelial tidak menunjukkan pelabelan yang ketara. Zarah emas juga dikesan dalam sel tubul proksimal (Rajah Tambahan S1C).

Untuk menilai sama ada ekspresi Myo9A terganggu dalam penyakit glomerular, kami memeriksa 2 model tetikus yang dikaitkan dengan proteinuria julat nefrotik.31,32 Membangunkan tikus dengan sindrom nefrotik yang disebabkan oleh overexpression31 Vegfa menunjukkan penurunan Myo9A glomerular (Rajah 3a). Begitu juga, Myo9A glomerular berkurangan pada tikus dengan glomerulosklerosis diabetes lanjutan pengantaraan streptozotocin yang disebabkan oleh overexpression Vegfa,32 berbanding Myo9A yang dikesan dalam tikus diabetes yang tidak mengekspresikan Vegfa (Rajah 3b) dan tikus bukan diabetes (Rajah 2c). Penyetempatan proses kaki podosit Myo9A dan penurunan Myo9A glomerular dalam kedua-dua model penyakit proteinurik menunjukkan bahawa Myo9A mungkin memainkan peranan dalam fungsi penghalang penapisan glomerular.

Jadual 1|Varian Missense MYO9A dikenal pasti dalam kohort pesakit FSGS-CT

p.D156G, p.Asp156Gly; p.E765D, Glu765Asp; p.M2384V, p.Met2384Val; p.P1704S, p.Pro1704Ser; p.T389M, Thr389Met. Varian ditapis pada frekuensi alel kecil #0.01 peratus , n ¼ 94 sampel berikutan anotasi ANNOVAR.

Tikus MYO9AR701X yang diedit gen untuk membangunkan FSGS

Untuk menentukan sama ada mutasi karut p.Arg701* (p.R701X) MYO9A menyebabkan penyakit glomerular pada tikus, kami menghasilkan tikus knock-in p.Arg701* (di sini dipanggil Myo9AR701X) oleh CRISPR/Cas9-pengeditan gen pengantara.30 Heterozigot Tikus mutan Myo9AR701X/þ (Rajah 4a) menghasilkan anak mutan yang berdaya maju dalam fesyen Mendelian, menunjukkan bahawa mutasi itu tidak membawa maut secara embrio. Mutan homozigot membina hidrosefalus progresif (Tambahan Rajah S2), ataxia, dan sawan dan hampir kesemuanya mati sebelum umur 3 minggu, mengingatkan tikus Myo9A-null.14 Mutan Heterozigot Myo9AR701X/þ tidak mempunyai fenotip yang jelas semasa lahir, subur, dan bertahan. hingga dewasa.

Semua tikus mutan Myo9AR701X mengembangkan FPE dan proteinuria, walaupun pada usia yang berbeza. Mutan Myo9AR701X/R701X Homozigot menunjukkan glomeruli dismorfik, dilatasi tiub, dan lemparan protein pada mikroskop cahaya pada usia 2 minggu (Rajah 4b, Rajah Tambahan S3A). TEM bagi 2-buah pinggang mutan Myo9AR701X/R701X yang berusia seminggu mendedahkan FPE yang meluas, GBM tebal dan tidak sekata serta kekurangan diafragma celah, digantikan dengan simpang adheren (Rajah 4d). Sebaliknya, 2-mutant Myo9AR701X/þ heterozigot heterozigot berusia seminggu menunjukkan histologi renal normal dan ultrastruktur penghalang penapisan glomerular (Rajah 4c dan e), tidak dapat dibezakan daripada sampah jenis liar (Rajah 4f), seperti yang disahkan oleh kuantiti proses kaki (FP/mm GBM) (Rajah 4g). Albuminuria dikesan dalam sampel air kencing daripada tikus mutan Myo9AR701X heterozigot dan homozigot oleh elektroforesis gel sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide (Rajah 4h) pada usia 2 minggu.

Pada usia 4 bulan, tikus heterozigot Myo9AR701X/þ menunjukkan FSGS pada mikroskop cahaya (Rajah 5a dan g) dan TEM mendedahkan FPE (anak panah putih), diafragma celah yang tidak normal (anak panah hitam pendek), GBM yang tidak teratur dan pengembangan mesangial (Rajah 5b) . Kuantiti proses kaki menunjukkan FPE yang ketara dalam Myo9AR701X/þ berbanding buah pinggang dewasa jenis liar (Rajah 5c). Fenotip glomerular ini sangat serupa dengan yang diperhatikan dalam biopsi buah pinggang proband (Rajah 1b). Tikus mutan Myo9AR701X/þ heterozigot dewasa mempunyai nisbah albumin-kreatinin air kencing yang jauh lebih tinggi daripada tikus jenis liar yang dipadankan dengan umur (Rajah 5d) dan tidak menunjukkan bukti poliuria atau penurunan berat badan (Rajah 5e dan f). Pada pemeriksaan asid-Schiff berkala, buah pinggang Myo9AR701X/þ dewasa menunjukkan FSGS pelbagai keterukan (anak panah, Rajah 5g) dan ketiadaan atrofi tiub dan dilatasi atau infiltrat interstisial. Pelabelan dwi dan mikroskop confocal mengesan Myo9A dalam tubul proksimal, secara persisian kepada megalin (anak panah, Rajah 5h, dan k), manakala Myo9A tidak dikesan dalam segmen nefron distal yang menyatakan aquaporin2 (Rajah 5h dan i). Pelabelan kedua-dua penanda tiub dalam Myo9AR701X/þ dewasa tidak dapat dibezakan daripada buah pinggang jenis liar dengan mikroskop confocal (Rajah 5h dan k dan i dan l). Sebaliknya, pewarnaan Myo9A dalam tubul proksimal dan dalam glomeruli berkurangan dalam Myo9AR701X/þ (Rajah 5h dan i) berbanding buah pinggang jenis liar (Rajah 5k dan l). Bersama-sama penemuan ini menunjukkan bahawa p.Arg701* ialah mutasi Myo9A yang menyebabkan FSGS pada tikus, yang menyusun semula fenotip dan warisan dominan autosomal bagi varian MYO9A p.Arg701* heterozigot yang dikenal pasti dalam proband.

Bagaimanakah p . Arg701* Mutasi Myo9A mendorong FSGS?

Kami menggunakan Myo9AR701X tikus knock-in untuk memeriksa patogenesis molekul FSGS yang disebabkan oleh mutasi p.Arg701* MYO9A. Ekspresi Myo9A dalam buah pinggang knockin Myo9AR701X berkurangan dengan ketara dalam heterozigot dan tidak dapat dikesan dalam homozigot oleh IF (Rajah 6a) dan immunoblotting (Rajah 6b dan c). Kami melakukan PCR kuantitatif untuk menilai sama ada haploinsufficiency yang dimediasi oleh pereputan mRNA yang tidak masuk akal42 berlaku dalam mutan Myo9AR701X / þ. Ekspresi mRNA Myo9A dalam buah pinggang Myo9AR701X/þ adalah w50 peratus lebih rendah daripada buah pinggang jenis liar (48.3 ± 5.6 peratus; P <0.0001) (rajah="" 6d),="" yang="" konsisten="" dengan="">

Penurunan Myo9A mengurangkan interaksinya dengan aktin dan calmodulin

Kami memeriksa sama ada haploinsufficiency Myo9A mengubah interaksi Myo9A-actin-calmodulin. Eksperimen Coimmunoprecipitation membandingkan buah pinggang jenis liar dan Myo9AR701X/þ dan podosit mengesahkan interaksi Myo9A dengan aktin dan dengan calmodulin dan menunjukkan bahawa interaksi Myo9A dengan kedua-dua protein berkurangan sebanyak w50 peratus dalam buah pinggang dan podosit mutan Myo9AR701X/þ (Rajah 6e dan f), serupa dengan Myo9A penuh. Sebaliknya, tahap ekspresi aktin dan calmodulin kekal utuh (input, Rajah 6e, dan f). Untuk menganalisis interaksi Myo9A dalam penetapan ekspresi yang dikurangkan, kami mendorong w50 peratus Myo9AKD dalam podosit tikus jenis liar yang diabadikan menggunakan siRNA, dinilai oleh PCR kuantitatif dan immunoblotting (Rajah 7a dan b), kemudian melakukan eksperimen coimmunoprecipitation. Myo9AKD mengurangkan interaksi Myo9A-actin-calmodulin secara berkadar dengan ekspresi Myo9A (Rajah 7c). Bersama-sama, penemuan coimmunoprecipitation menunjukkan bahawa heterozigot p.Arg701* Mutasi Myo9A dan Myo9AKD mengurangkan kelimpahan Myo9A dan dengan itu interaksinya dengan aktin dan calmodulin. Oleh kerana aktin pautan silang Myo9A pada nisbah molar 1:1,16 data kami mencadangkan bahawa penurunan Myo9A dalam podosit Myo9AR701X/þ heterozigot boleh menjejaskan hubungan silang dan penggabungan aktin yang dimediasi Myo9A.

Rajah 2|(bersambung) kepada podocin (hijau) di sebelah GBMnya (anak panah). Inset menunjukkan pembesaran yang lebih tinggi. Bar=25 mm. (e) Mikroskopi konfokal menunjukkan pewarnaan Myo9A berdekatan atau dikolokkan dengan laminin (hijau) di sepanjang aspek luar GBM (inset dan kepala anak panah). Bar=25 mm. (f, g) Penyetempatan mikroskop elektron imunogold Myo9A dalam glomeruli buah pinggang tikus jenis liar: zarah emas (anak panah hitam) diperhatikan dalam badan sel podosit (POD) dan kaki memproses sitoplasma (FP), beberapa zarah emas dilihat di pangkalan FP bersebelahan membran bawah tanah glomerular tetapi tidak pada diafragma celah. Bar ¼ 500 nm. Untuk mengoptimumkan paparan imej ini, sila lihat versi dalam talian artikel ini di www.kidney-international.org.

Mutasi Myo9AR701X meningkatkan aktiviti Rho-A

Kami mengukur aktiviti RhoA menggunakan ujian tarik ke bawah dalam tikus jenis mutan dan liar Myo9AR701X, memfokuskan pada Myo9AR701X/þ heterozigot untuk memberikan cerapan mekanistik ke dalam fenotip p.Arg701* MYO9A manusia. RhoA aktif meningkat dengan ketara dalam keseluruhan buah pinggang Myo9AR701X/þ (Rajah 8a), glomeruli terpencil (Rajah 8b), dan podosit primer (Rajah 8c), berbanding dengan sampel kawalan jenis liar yang sepadan. Magnitud peningkatan GTP-RhoA dalam sampel Myo9AR701X/þ berjulat daripada w60 peratus dalam glomeruli terpencil hingga w2-kali ganda dalam seluruh buah pinggang dan dalam podosit (Rajah 8a–c). RhoA aktif sedikit lebih tinggi dalam homozigot daripada dalam buah pinggang mutan heterozigot tetapi perbezaannya tidak ketara (Rajah 8a). Bersama-sama, eksperimen ini menunjukkan bahawa Myo9AR701X menyebabkan peningkatan aktiviti RhoA

Mutasi Myo9AR701X/D dan Myo9AKD mengubah tingkah laku podosit

Untuk menilai kesan interaksi Myo9A-actin terjejas dan peningkatan aktiviti RhoA yang dikesan dalam podosit mutan Myo9AR701X/þ pada fungsinya, kami mengukur lekatan dan motilitas podosit menggunakan ujian lampiran dan migrasi, membandingkan jenis liar kepada podosit primer mutan dalam keadaan kawalan dan pada Perencatan isyarat RhoA dengan perencat kinase berkaitan Rho Y27632. Eksperimen ini dengan jelas menunjukkan bahawa Myo9AR701X/þ merosakkan motilitas podosit (Rajah 8d; Rajah Tambahan S4) dan lampiran podosit (Rajah 8e) dalam cara yang bergantung kepada aktiviti RhoA. Untuk menilai secara langsung kesan haploinsufficiency Myo9A pada fungsi podocyte, kami melakukan ujian lampiran dan migrasi membandingkan podosit tikus jenis liar kepada podosit Myo9AKD yang menyatakan w50 peratus mRNA dan protein Myo9A (Rajah 7a dan b). Podosit yang dirawat siRNA yang tidak disasarkan berfungsi sebagai kawalan tambahan. Myo9AKD mengurangkan lampiran dan penghijrahan podosit dengan ketara, kecacatan yang sama diperhatikan dalam podosit Myo9AR701X/þ (Rajah 8f dan g). Secara kolektif, data mekanistik menunjukkan bahawa mutasi heterozigot p.Arg701* Myo9A mengakibatkan haploinsufficiency Myo9A yang membawa kepada penurunan interaksi Myo9A-actin-calmodulin dan peningkatan RhoA aktif dalam buah pinggang, khususnya dalam podosit. Kami mentafsirkan bahawa bersama-sama, mekanisme ini mengganggu fungsi podocyte, yang ditunjukkan oleh penurunan lampiran dan motilitas in vitro dan oleh kehadiran proteinuria dalam vivo.

PERBINCANGAN

Kajian ini mengenal pasti Myo9A sebagai komponen baru bagi radas sitoskeletal podocyte yang mempengaruhi fungsi podosit dengan mengawal aktiviti RhoA secara negatif. Kami menerangkan mutasi MYO9A karut yang jarang berlaku (p.Arg701*) yang dikaitkan dengan

FSGS/proteinuria keluarga dan menunjukkan bahawa mutasi ini menyebabkan lesi seperti FSGS pada tikus, memberikan gambaran tentang mekanisme penyakit.

Penemuan kami menyokong tanggapan bahawa MYO9A ialah gen calon FSGS dan p.Arg701* MYO9A ialah varian yang terlibat dalam FSGS manusia, berdasarkan garis panduan American College of Medical Genetics untuk mengaitkan kausalitas menggunakan algoritma ramalan gen, frekuensi alel, model haiwan eksperimen. , dan ujian kefungsian.43,44 Adik beradik proband yang menyimpan p.Arg701* MYO9A tidak mempunyai mutasi dalam gen penyebab FSGS yang diketahui setakat ini dan tidak memaparkan bukti yang mencadangkan punca sekunder untuk FSGS. Varian ini diasingkan bersama dalam keluarga kecil mengikut corak pewarisan dominan autosomal dengan ekspresitiviti berubah-ubah. MYO9A p.Arg701* diramalkan sebagai varian kehilangan fungsi, tiada dalam exomes kawalan dan mempunyai frekuensi alel<0.0001 in="" population="" databases,="" in="" compliance="" with="" american="" college="" of="" medical="" genetics="" standards="" to="" support="" pathogenicity="" and="" consistent="" with="" parameters="" used="" in="" a="" recent="" comprehensive="" report="" on="" genetic="" contributions="" to="" fsgs.43–45="" moreover,="" loss-of-function="" observed/expected="" upper="" bound="" fraction="" for="" myo9a="" is="" 0.3,="" suggestive="" of="" low="" tolerance="" to="" gene="" inactivation="" with="" a="" constraint="" similar="" to="" genes="" known="" to="" cause="" autosomal="" dominant="" fsgs="" (e.g.,="" wt1,="" 0.25="" or="" inf2,="">

Pemeriksaan WES bagi kohort besar kanak-kanak FSGS yang tidak berkaitan dan dewasa muda41 mengenal pasti 2 pesakit dengan varian missense MYO9A heterozigot yang jarang berlaku (p.Asp156Gly dan p.Glu765Asp). Kedua-dua varian missense MYO9A melibatkan sisa yang sangat terpelihara, mempunyai frekuensi alel kecil<0.01%, are="" predicted="" to="" be="" deleterious="" and="" have="" not="" previously="" been="" associated="" with="" human="" disease.="" three="" additional="" myo9a="" missense="" variants="" (thr389met,="" p.pro1704ser,="" p.met2384val)="" identified="" in="" this="" fsgs="" cohort="" were="" deemed="" benign="" by="" bioinformatics="" scores.="" these="" 5="" individuals="" do="" not="" carry="" mutations="" in="" known="" fsgs-causing="" genes.="" for="" clinical="" purposes,="" these="" missense="" variants="" should="" be="" considered="" variants="" of="" unknown="" significance="" given="" the="" absence="" of="" experimental="" data="" evaluating="" how="" they="" impact="" myo9a="" function.43,44="" to="" our="" knowledge,="" no="" myo9a="" mutation="" has="" been="" proven="" to="" cause="" a="" specific="" human="" disease="" by="" american="" college="" of="" medical="" genetics="" guidelines.43,44="" association="" of="" compound="" heterozygote="" missense="" myo9a="" variants="" (p.g2282e="" and="" p.y203c)="" with="" arthrogryposis="" was="" reported="" in="" 1="" patient,5="" and="" compound="" heterozygote="" or="" homozygote="" missense="" myo9a="" variants="" (p.r1517h/p.r2283h="" and="" p.d1698g,="" respectively)="" were="" described="" in="" association="" with="" congenital="" myasthenia="" syndrome.6="" a="" nonsense="" homozygous="" myo9a="" (p.r513x)="" was="" associated="" with="" severe="" ventriculomegaly="" and="" fetal="" demise.47="" elegant="" expression="" studies="" support="" a="" role="" for="" myo9a="" at="" the="" neuromuscular="" junction="" and="" its="" intriguing="" regulation="" of="" agrin="" secretion="" and="" actin="">

Rajah 3|Ekspresi Glomerular Myo9A dalam model tetikus penyakit glomerular. (a) Sindrom nefrotik perkembangan yang disebabkan oleh ekspresi berlebihan Vegfa31: imunofluoresensi menunjukkan Myo9A (merah) dalam glomeruli daripada tikus berusia 2-yang normal, tidak terpengaruh dan jelas menurunkan ekspresi Myo9A dalam glomeruli daripada tikus nefrotik yang mengekspresikan Vegfa secara berlebihan, manakala podosin (hijau) tidak berubah. (b) Diabetes yang disebabkan oleh Streptozotocin dengan atau tanpa ekspresi berlebihan Vegfa32: imunofluoresensi mengesan Myo9A (hijau) dalam glomeruli daripada buah pinggang kencing manis yang tidak diinduksi (kawalan DM) dan Myo9A imunoreaktif yang berkurangan dengan ketara dalam glomeruli daripada tikus diabetes yang mengekspresikan Vegfa secara berlebihan yang menyebabkan DN glomerulosklerosis diabetik 40,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (biru) menunjukkan nukleus daripada kedua-dua bahagian dengan glomeruli bergaris (garis putih menetas). Bar=50 mm. Untuk mengoptimumkan paparan imej ini, sila lihat versi dalam talian artikel ini di www. buah pinggang-antarabangsa.

Figure 4 | Genotype and phenotype analysis of knockin Myo9AR701X mice at 2 weeks of age. (a) Sanger sequencing traces and deduced amino acid sequences from exon 14 are shown from mutant mice: heterozygous (Het) Myo9AR701X/þ (top), homozygous (Hom) Myo9AR701X/R701X (middle), and wild-type (WT) littermate (bottom). C>Mutasi T menggantikan pengekodan CGA Arg (R) dengan TGA, kodon hentian yang meramalkan penamatan terjemahan pada asid amino 701. (b) Mewakili asid berkala–Schiff pewarnaan daripada 2-buah pinggang mutan Myo9AR701X/R701X homozigot homozigot berusia seminggu menunjukkan glomeruli yang tidak normal, dilatasi tiub dan tuangan protein. Bar=20 mm. (c) Representative periodic acid–Schiff stain daripada 2-mingguan heterozigot Myo9AR701X/þ buah pinggang menunjukkan histologi normal. Bar{11}}mm. (d) Mikroskopi elektron penghantaran perwakilan daripada 2-glomerulus Myo9AR701X/R701X yang berumur seminggu menunjukkan penyingkiran proses kaki secara besar-besaran (anak panah putih), ketiadaan diafragma celah, digantikan dengan simpang adheren (anak panah hitam), dan ruang bawah tanah glomerular yang menebal dan tidak teratur membran (GBM). Bar =1mm. (e) Mikroskopi elektron penghantaran perwakilan daripada 2-glomerulus heterozigot Myo9AR701X/þ mingguan menunjukkan proses kaki normal (anak panah hitam nipis) dan diafragma celah biasa (anak panah putih nipis). Bar =1mm. (f) Mikroskopi elektron penghantaran daripada 2-mingguan WT littermate menunjukkan halangan penapisan glomerular normal: proses kaki nipis yang dipautkan oleh celah diafragma, sel endothelial (EC) terfenestrasi dan GBM nipis. Bar =1mm. (g) Kuantiti pencairan proses kaki pada umur 2 minggu: buah pinggang Myo9AR701X/R701X homozigot menunjukkan proses kurang daripada setengah kaki (FPs)/mm GBM daripada WT atau rakan serakan Myo9AR701X/þ heterozigot, menunjukkan pencairan proses kaki yang teruk. P < 0.0001="" (analisis="" varians).="" (h)="" coomassie="" pewarna="" biru="" elektroforesis="" gel="" natrium="" dodesil="" sulfat-poliakrilamida="" yang="" diselesaikan="" sampel="" air="" kencing="" menunjukkan="" albuminuria="" (alb)="" dalam="" kedua-dua="" myo9ar701x/r701x="" (tambah="" )="" dan="" myo9ar701x/þ="" (þ/="" tambah="" ),="" manakala="" air="" kencing="" wt="" bebas="" albumin.="" albumin="" serum="" lembu="" (10="" mg)="" berfungsi="" sebagai="" kawalan="" berat="" molekul.="" pod,="" podosit.="" untuk="" mengoptimumkan="" paparan="" imej="" ini,="" sila="" lihat="" versi="" dalam="" talian="" artikel="" ini="" di="">

Rajah 5|Myo9AR7 heterozigot dewasa{{20}}Analisis fenotip tikus knockin 1X/D. (a) Pewarnaan asid berkala-Schiff (PAS) perwakilan daripada buah pinggang Myo9AR701X/þ 4-bulan menunjukkan glomerulus dengan sklerosis glomerular segmental fokus yang meluas dan percambahan mesangial. Bar=50 mm (b) Mikroskopi elektron penghantaran perwakilan daripada 4-buah pinggang Myo9AR701X/þ bulan menunjukkan penyingkiran proses kaki yang meluas (anak panah putih), penggantian separa diafragma celah (anak panah hitam nipis) oleh persimpangan adherens (anak panah hitam tebal). Bar =2 mm (c) Kuantiti penyingkiran proses kaki dalam tikus mutan Myo9AR701X/þ dewasa: umur 4 bulan heterozigot (Het) Myo9AR701X/ þ menunjukkan 2.2±0.06 FP/mm, berbanding jenis liar (WT ) 3.7±0.13 FP/mm. ****P<0.0001. (d)="" urine="" (u)="" albumin/creatinine="" (creat)="">

Figure 5 | (continued) ratio at 4 months of age is higher in Myo9AR701X/þ (Het, red dots) than in WT mice (black dots). ***P>0.001. (e) Isipadu air kencing (24 jam) dan (f) berat badan tidak berbeza dalam tikus WT (n=18) dan Myo9AR701X/þ (Het, n=16). (g,j) Pewarnaan PAS wakil dari Myo9AR701X/þ (g) dan WT (j) buah pinggang: (g) menunjukkan sklerosis fokus awal (anak panah) dan percambahan mesangial dalam 2 glomeruli, tubul belakang ke belakang normal dan tiada infiltrat; (j) menunjukkan glomeruli dan tubul normal dalam buah pinggang WT. Bar{10}} mm. (h, k) Mikroskopi konfokal bagi imunofluoresensi Myo9A/ Megalin: (h) Myo9AR701X/þ buah pinggang menunjukkan isyarat Myo9A (merah) terhad (kepala anak panah) dalam sel tubular proksimal yang dilabelkan dengan megalin (hijau), tubul proksimal tidak diluaskan; (k) Buah pinggang WT menunjukkan lebih banyak Myo9A (anak panah) bersebelahan dengan megalin dalam sel tubul proksimal. Bar{16}} mm. (i, l) Mikroskopi konfokal imunofluoresensi Myo9A/Aquaporin2 (AQP2): (i) Myo9AR701X/þ buah pinggang menunjukkan Myo9A (merah) terhad dalam glomerulus (anak panah), Myo9A tidak dikesan dalam segmen nefron distal berlabel AQP2 (hijau) , yang tidak diluaskan; (l) Buah pinggang WT menunjukkan pewarnaan Myo9A dalam glomerulus dan pewarnaan AQP2 dalam segmen nefron distal. Bar{27}} mm. EC, sel endothelial; FP, kaki memproses sitoplasma; GBM, membran bawah tanah glomerular. Untuk mengoptimumkan paparan imej ini, sila lihat versi dalam talian artikel ini di www.kidney-international.org.

Rajah 6|Ekspresi Myo9A dan interaksi Myo9A-actin-calmodulin dalam buah pinggang dan podosit ketukan Myo9AR701X. (a) Imunofluoresensi mengesan glomerular Myo9A dan podocin: Myo9A glomerular immunostaining (merah) adalah kuat dalam buah pinggang jenis liar (WT), berkurangan dengan ketara dalam Myo9AR701X/þ glomeruli, dan tidak dikesan dalam glomeruli Myo9AR701X/R701X; podocin (hijau) menyetempat kepada podosit dalam semua tikus; kolokalisasi separa podocyte-Myo9A ditunjukkan dengan gabungan (kuning). Bar{18}} mm. (b) Immunoblotting: ekspresi Myo9A (280 kDa) utuh berkurangan kepada kira-kira separuh dalam buah pinggang Myo9AR701X/þ (heterozigot [Het]) dan tidak dikesan dalam Myo9AR701X/R701X (homozigot [Hom]) buah pinggang ( *jalur yang lebih kecil<75 kda)="" are="" considered="" nonspecific,="" w50="" kda="" bands="" correspond="" to="" igg="" heavy="" chain="" in="" all="" genotypes.="" (c)="" myo9a/actin="" quantification="" (mean±sd),="" n="3" independent="" experiments,="" pool="" from="" 3="" mice="" each.=""><0.001. (d)="" quantitative="" polymerase="" chain="" reaction="" (qpcr):="" myo9a="" mrna="" expression="" normalized="" to="" gapdh="" mrna,="" fold="" change="" (mean±sd),="" n="3" independent="" experiments,="" n="3" individual="" mice="" each.="">< 0.0001.="" (e,f)="" coimmunoprecipitation="" (ip)="" of="" kidney="" lysates="" (e)="" and="" primary="" podocytes="" (f)="" show="" decreased="" myo9a-actin-calmodulin="" interaction="" in="" myo9ar701x/þ="" (het)="" proportionally="" to="" the="" reduced="" myo9a="" expression="" (input);="" note="" input="" of="" actin="" and="" calmodulin="" is="" equal="" in="" both="" genotypes.="" ab,="" antibody.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">

We demonstrate Myo9A protein expression in podocyte cell lines and mouse kidney glomeruli and Myo9A subcellular localization in podocytes. Dual immunolabeling and confocal microscopy localized Myo9A along the external aspect of the GBM stained by laminin, tightly contiguous to podocin. Immunogold EM determined precisely Myo9A localization to the cytoplasm of foot processes and podocyte cell bodies, leaving slit diaphragms unlabeled. The apparent Myo9A mesangial localization in nonconfocal IF images was not confirmed by immunogold EM. Our findings are consistent with glomerular MYO9A immunohistochemical localization in human renal biopsies (www.proteinatlas.org/ ENSG00000066933-MYO9A/tissue/kidney). Myo9A was also detected in proximal tubules by IF and immunogold-EM, extending a previous report that did not detect Myo9A in glomeruli.15 The discrepancy in Myo9A tissue localization is probably due to different affinities of the primary antibodies used by Thelen et al.15 and in this study. Similar discrepancies in glomerular MYO9A staining of the same human renal biopsies were noticed using 2 affinity-purified polyclonal antibodies, the higher specificity antibody by protein array resulting in the stronger glomerular signal. Localization of Myo9A mRNA in the kidney by in situ hybridization has also been discrepant;4,15 Myo9A developmental regulation might be involved. RNA-sequencing data suggest Myo9A expression along with most nephron segments in mice and humans, raising the possibility that loss-of-function mutations may lead to phenotypes involving several cell types. Interestingly, we observed a clear decrease in glomerular Myo9A expression in 2 mouse models of proteinuria: developmental nephrotic syndrome and advanced diabetic disease. The latter is consistent with a >2-penurunan kali ganda ekspresi Myo9A oleh tatasusunan DNA yang dilaporkan dalam tikus Zucker diabetes.49 Bersama-sama, data ekspresi Myo9A mencadangkan bahawa Myo9A mungkin memainkan peranan dalam halangan penapisan glomerular.

Untuk memahami perkaitan mutasi karut p.Arg701* MYO9A dalam vivo kami menjana tikus masuk Myo9AR701X melalui penyuntingan gen. Mutan Myo9AR701X/R701X homozigot membina hidrosefalus progresif, mengakibatkan kematian pada umur 3 minggu serupa dengan tikus Myo9A-null.14 Pada usia 2 minggu, buah pinggang Myo9AR701X/R701X homozigot mendedahkan fenotip glomerulo-tubular yang teruk, FENotip, GBM yang meluas. dan kekurangan slit-diafragma dan tubul yang diluaskan, dikaitkan dengan albuminuria. Tikus Myo9A-null dewasa telah menunjukkan tubulopati proksimal, poliuria dan proteinuria berat molekul rendah.15 Malangnya, tiada data ultrastruktur glomerular dimasukkan dalam laporan;15 secara mengejutkan 3- kepada 6-Myo9A yang berusia sebulan. -tikus nol tidak tunduk kepada hidrosefalus progresif seperti yang diterangkan sebelum ini.14 Oleh kerana mutan Myo9AR701X/R701X homozigot tidak dapat bertahan sehingga dewasa, kita hanya boleh memastikan fenotip glomerular awal yang diterangkan di sini. Pengembangan tiub yang diperhatikan dalam 2-mutan Myo9AR701X/R701X yang berumur seminggu mungkin mewakili bukti awal tubulopati yang diterangkan dalam tikus Myo9A-null dewasa.

Figure 8 | RhoA activity and podocyte function in Myo9AR701X kidneys and Myo9A knockdown (Myo9AKD) podocytes. (a–c) Active RhoA (guanosine triphosphate [GTP]–RhoA) is increased in Myo9A R701X mutants versus wild-type (WT): >2-fold in whole kidneys (a), w60% in isolated glomeruli (b), >2-lipat dalam podosit primer (c), tompok Barat mewakili n=3 kepada 4 eksperimen bebas, lisat dikumpulkan daripada 3 tikus setiap satu, kuantiti (min±SD), analisis varians (ANOVA) (a ) atau ujian-t tidak berpasangan (b,c). *P<0.05,><0.001. (d)="" podocyte="" migration="" assay="" (wound="" assay)57:="" quantification="" of="" the="" migration="" area="" shows="" that="" myo9ar701x/þ="" (heterozygous="" [het])="" podocyte="" migration="" is="" decreased;="" preincubation="" with="" y26732="" partially="" abrogates="" the="" migration="" defect.="" ***p="" <="" 0.0005="" (anova),=""><0.0001 (unpaired="" student's="" t-test).="" (e)="" podocyte="" attachment="" assay="" shows="" decreased="" attachment="" of="" myo9ar701x/þ="" (het)="" podocytes;="" preincubation="" with="" y26732="" corrects="" the="" attachment="" defect.=""><0.0005 (anova).="" (d,e)="" data="" are="" mean±sd,="" n="3" to="" 4="" independent="" experiments,="" n="" ¼="" 3="" mice="" per="" genotype="" per="" experiment.="" (f)="" podocyte="" migration="" assay:="" small="" interfering="" rna="" (sirna)–mediated="" myo9akd="" decreases="" immortalized="" mouse="" podocytes="" migration=""><0.05, anova;=""><0.01, unpaired="" t-test),="" whereas="" migration="" of="" nontargeting="" (n-t)="" sirna-treated="" podocytes="" is="" not="" different="" from="" normal="" podocytes="" (wt).="" (g)="" attachment="" assay:="" myo9akd="" decreases="" immortalized="" mouse="" podocytes="" attachment,="" as="" compared="" to="" podocytes="" treated="" with="" nontargeting="" sirna="" and="" untreated="" wt="" podocytes.="" myo9akd="" data="" are="" mean±sd,="" n="" >="" 3="" independent="" experiments.=""><0.05,><0.01. hom,="" homozygous;="" ns,="" not="" significant;="" od,="" optical="">

Penemuan utama kajian ini ialah tikus ketukan Myo9AR701X/þ heterozigot adalah fenotip normal semasa lahir tetapi mengembangkan albuminuria, FSGS, dan podosit FPE pada usia 4 bulan, menunjukkan bahawa p.Arg701* Myo9A ialah mutasi yang menyebabkan FSGS dalam tikus dewasa. Hebatnya, perubahan histologi dan ultrastruktur buah pinggang mutan Myo9AR701X/þ menggambarkan semula ciri-ciri diagnostik biopsi buah pinggang proband. Lebih-lebih lagi, tikus mutan Myo9AR701X/þ mengembangkan albuminuria yang ketara dan bukannya albuminuria besar-besaran, menghasilkan semula proteinuria bukan nefrotik yang diperhatikan dalam adik-beradik proband dan dalam kebanyakan pesakit FSGS dewasa dewasa.50 Telah dicadangkan bahawa penghapusan Myo9A boleh menyebabkan sklerosis glomerular sekunder kepada tubulopati poliurik. .15 Myosin yang tidak konvensional telah terlibat dalam penyerapan semula albumin oleh tubul proksimal melalui interaksi mereka dengan Dab2 dan cubilin, tetapi penglibatan Myo9A dalam proses ini tidak ditunjukkan.51 Kami tidak mengesan sebarang bukti tauopati, seperti poliuria, dilatasi tiub, atrofi , atau pengedaran abnormal penanda tiub proksimal atau distal dalam tikus Myo9AR701X/þ heterozigot dewasa. Data ini tidak menyokong hipotesis bahawa FSGS yang diperhatikan dalam Myo9AR701X/þ tikus terhasil daripada halangan atau kecacatan tiub.

Secara mekanis, kami menentukan bahawa mRNA Myo9A dan protein Myo9A penuh dikurangkan sebanyak w50 peratus , menunjukkan dengan kuat bahawa mutasi membawa kepada ketidakcukupan Myo9A disebabkan oleh pereputan mRNA pengantara yang tidak masuk akal.42 Kerana mutasi titik Myo9AR701X menyetempat kepada exon 14 daripada RNA, Myo9A2. peraturan mengikut peraturan pereputan mRNA yang dimediasi karut standard untuk memotong mutasi yang terletak di hulu sebelum exon terakhir.42,52 Selaras dengan ini, hidrosefalus dan kematian pramatang diperhatikan dalam mutan Myo9AR701X/R701X homozigot meniru tikus null Myo9A.14 Kami menentukan bahawa w50 peratus pengurangan ekspresi protein Myo9A dalam buah pinggang mutan Myo9AR701X/þ dan podosit primer serta dalam podosit yang diabadikan Myo9AKD mengurangkan secara berkadar interaksi antara Myo9A, aktin, dan calmodulin. Penemuan ini menyokong tafsiran bahawa haploinsufficiency Myo9A adalah asas untuk mengurangkan interaksi Myo9A-actin-calmodulin yang diperhatikan dalam mutan Myo9AR701X/þ.

Penemuan kritikal kerja ini ialah p.Arg701* Myo9A mendorong kehilangan fungsi Rho-GAP yang mengakibatkan peningkatan RhoA aktif dalam seluruh buah pinggang Myo9AR701X, glomeruli terpencil dan podosit primer. Selain itu, podosit mutan Myo9AR701X/þ menunjukkan perlekatan dan motilitas yang bergantung kepada RhoA. Isyarat Myo9A-GAP mengurangkan RhoA aktif dan mempunyai sedikit kesan pada peningkatan kehilangan fungsi Rac1 dan Cdc42.9,53 Rho-GAPAktiviti Rho-GTPasedan membawa kepada kecederaan podosit, proteinuria dan FSGS.3,18,20 Oleh itu, tingkah laku abnormal podosit mutan Myo9AR701X/þ boleh menyumbang kepada pembangunan FPE dan FSGS dari semasa ke semasa dalam tikus Myo9AR701X/þ. Data kami konsisten dengan kesan disregulasi RhoA yang dilaporkan pada fungsi podosit dalam vivo dan in vitro. 54–56

Oleh kerana Myo9A memautkan aktin dan mendorong pembentukan berkas aktin secara in vitro pada selang 36-nm tetap dengan berinteraksi secara kooperatif dengan aktin dan calmodulin, stoikiometri interaksi mereka dianggap penting.16 Oleh itu, haploinsufficiency Myo9A berkemungkinan besar. untuk mengurangkan pautan silang dan berkas aktin pengantaraan Myo9A, menyediakan lebih sedikit tapak di sepanjang filamen aktin di mana penyahaktifan RhoA berlaku, sekali gus mengubah dinamik aktin dalam persekitaran terdekat dan tingkah laku podosit pada peringkat selular. Perencat kinase berkaitan Rho Y27632 sebahagiannya memulihkan lampiran dan kecacatan penghijrahan yang disebabkan oleh Myo9AR701X/þ, menunjukkan bahawa pengesan RhoA hiliran tambahan, seperti mDia1, terlibat. Sebagai alternatif, pengurangan pautan silang aktin dalam Myo9AR701X/þ boleh secara langsung menyumbang kepada menjejaskan perlekatan dan penghijrahan podosit. Haploinsufficiency Myo9A mungkin juga memberi kesan kepada mekanisme pemerdagangan.7–9 Mekanisme molekul yang tepat di mana Myo9A mengawal dinamik aktin podosit masih perlu dijelaskan. Ringkasnya, kami mengenal pasti Myo9A sebagai komponen baru bagi radas sitoskeletal podocyte dan mutasi MYO9A yang mengarut yang melibatkan MYO9A sebagai gen calon untuk FSGS manusia, dengan menghasilkan semula fenotip proteinuria manusia / FSGS dalam tikus ketukan Myo9AR701X/þ dan oleh autosomal. pengasingan kosegregasi dominan fenotip dalam keluarga kecil. Secara kolektif, data sangat mencadangkan bahawa haploinsufficiency Myo9A adalah asas molekul untuk fenotip yang diperhatikan pada tikus dewasa Myo9AR701X/þ. Kami menunjukkan bahawa lampiran dan penghijrahan terjejas dalam podosit Myo9AR701X/þ mutan knockin, yang melibatkan kedua-dua peningkatan aktiviti RhoA dan penurunan interaksi Myo9A-actin-calmodulin. Memandangkan Myo9A mendorong pemautan silang dan penggabungan aktin pada nisbah 1:1 molar16 dan pemerhatian kami bahawa Myo9AR701X/þ membawa kepada haploinsufficiency, penyingkiran podosit dan FSGS lebih masa, kami membuat spekulasi bahawa Myo9A mungkin kritikal untuk dinamika aktin podosit biasa, sama seperti dinamik lain. protein pengikat aktin (ACTN4, INF2) diketahui menyebabkan FSGS dominan secara autosom pada orang dewasa apabila bermutasi. Kajian tambahan adalah wajar untuk menjelaskan bagaimana Myo9A berinteraksi dengan protein RhoA, sitoskeletal dan celah podosit, dan sama ada kecacatan pengantaraan Myo9A dalam pautan silang dan pembentukan berkas aktin secara langsung mengubah struktur sitoskeleton podocyte. Batasan kajian ini untuk mewujudkan penyebab termasuk ketidakupayaan untuk melanjutkan silsilah genotip proband dan kekurangan keluarga tambahan dengan mutasi yang sama. Kajian lanjut diperlukan untuk mengesahkan penemuan WES kami dalam pesakit tambahan dengan FSGS keluarga atau sporadis sebelum p.Arg701*Varian MYO9Aboleh dianggap sebagai penyebab penyakit dan maklumat ini boleh digunakan untuk membuat keputusan klinikal.

PENDEDAHAN

Semua pengarang mengisytiharkan tiada kepentingan bersaing.

PENGHARGAAN

Kerja ini disokong oleh geran Institut Kesihatan Kebangsaan kepada AT (NIH-RO1DK109434) dan Pusat Yale untuk Genom Mendelian (NIH-U54-HG006504).

Kami berterima kasih kepada M. Saleem (University of Bristol, UK) kerana menyediakan podosit manusia yang diabadikan, G. Moeckel (Sekolah Perubatan Yale, Jabatan Patologi) kerana menyediakan imej biopsi, S. Ishibe Lab (Sekolah Perubatan Yale, Jabatan Perubatan/ Nefrologi) untuk mendapatkan nasihat tentang pengasingan podocyte dan ujian lekatan, T. Ardito (Sekolah Perubatan Yale, Jabatan Patologi) dan V. Kakade (Sekolah Perubatan Yale, Jabatan Perubatan/Nefrologi) untuk sumbangan kepada IF

dan pengimejan confocal, SueAnn Mentone (Sekolah Perubatan Yale, Jabatan Sel dan Fisiologi Molekul) untuk sumbangan kepada kajian EM,glomerulosklerosis segmental fokuspesakit dan keluarga, dan repositori Institut Diabetes dan Pencernaan dan Penyakit Ginjal Kebangsaan (FSGS-CT, NCT00135811) untuk menyediakan sampel DNA.

BAHAN TAMBAHAN

Fail Tambahan (PDF)

Kaedah Tambahan. Analisis data WES dan bioinformatik, penjanaan tikus Myo9AR701X knockin, dan kaedah terperinci lain.

Rajah S1. Immuno-EM menyetempatkan ekspresi Myo9A kepada podosit glomerular tikus dan epithelia tiub.

Rajah S2. Myo9AR701X/R701X menyebabkan hidrosefalus progresif neonatal.

Rajah S3. Histologi buah pinggang selepas bersalin dalam tikus mutan Myo9AR701X.

Rajah S4. Ujian migrasi podocyte (ujian luka).

Jadual S1. Senarai semua varian yang dikongsi oleh adik beradik proband.

Jadual S2. Senarai 64 gen FSGS-proteinuria-NS yang disoal siasat dalam kohort FSGS-CT. Rujukan Tambahan.

RUJUKAN

1. Wiggins RC. Spektrum podocytopathies: pandangan penyatuan penyakit glomerular. Buah Pinggang Int. 2007;71:1205–1214.

2. Sadowski CE, Lovric S, Ashraf S, et al. Penyebab gen tunggal dalam 29.5 peratus kes sindrom nefrotik tahan steroid. J Am Soc Nephrol. 2015;26: 1279–1289.

3. Gee HY, Saisawat P, Ashraf S, et al. Mutasi ARHGDIA menyebabkan sindrom nefrotik melalui isyarat RHO GTPase yang rosak. J Clin Invest. 2013;123: 3243–3253.

4. Gorman SW, Haider NB, Grieshammer U, et al. Pengklonan dan ekspresi perkembangan myosin IXA (MYO9A) bukan konvensional gen dalam rantau sindrom Bardet-Biedl (BBS4) pada kromosom 15q22- q23. Genomik. 1999;59:150–160.

5. Bayram Y, Karaca E, Coban Akdemir Z, et al. Etiologi molekular arthrogryposis dalam pelbagai keluarga yang kebanyakannya berasal dari Turki. J Clin Invest. 2016;126:762–778.

6. O'Connor E, Töpf A, Müller JS, et al. Pengenalpastian mutasi dalam gen MYO9A pada pesakit dengan sindrom myasthenic kongenital. Otak. 2016;139:2143–2153.

7. Sarjana TA, Kendrick-Jones J, Buss F. Myosins: organisasi domain, sifat motor, peranan fisiologi dan fungsi selular. Handb Exp Pharmacol. 2017;235:77–122.

8. Liu KC, Cheney RE. Myosin dalam persimpangan sel. Bioarchitecture. 2012;2:158–170.

9. Omelchenko T, Hall A. Myosin-IXA mengawal migrasi sel epitelium kolektif dengan menyasarkan aktiviti RhoGAP ke persimpangan sel-sel. Curr Biol. 2012;22:278–288.

10. Sekine T, Konno M, Sasaki S, et al. Pesakit dengan sindrom Epstein-Fechtner akibat mutasi MYH9 R702 mengembangkan penyakit buah pinggang proteinurik yang progresif. Buah Pinggang Int. 2010;78:207–214.

11. Mele C, Iatropoulos P, Donatelli R, et al. Mutasi MYO1E dan glomerulosklerosis segmen fokus keluarga kanak-kanak. N Engl J Med. 2011;365:295–306.

12. Krendel M, Kim SV, Willinger T, et al. Gangguan Myosin 1e menggalakkan kecederaan podosit. J Am Soc Nephrol. 2009;20:86–94.

13. Bähler M, Elfrink K, Hanley PJ, et al. Fungsi selular myosin kelas IX dalam epithelia dan sel imun. Biochem Soc Trans. 2011;39:1166–1168.

14. Abouhamed M, Grobe K, San IV, et al. Myosin IXa mengawal pembezaan epitelium, dan kekurangannya mengakibatkan hidrosefalus. Sel Biol Mol. 2009;20:5074–5085.

15. Thelen S, AbouhamedM, Ciarimboli G, et al. RhoGAPmyosin IXa ialah pengawal selia fungsi tubul buah pinggang. Am J Physiol Fisiol Renal. 2015;309:F501–F513.

16. Saczko-Brack D, Warchol E, Rogez B, et al. Penyusunan sendiri rangkaian aktin oleh myosin monomerik. Proc Natl Acad Med US A. 2016;113: E8387–E8395.

17. Asanuma K, Yanagida-Asanuma E, Faul C, et al. Synaptopodin mengatur organisasi aktin dan motilitas sel melalui peraturan isyarat RhoA. Nat Cell Biol. 2006;8:485–491.

18. Mouawad F, Tsui H, Takano T. Peranan Rho-GTPases dan protein pengawalseliaannya dalam fungsi podosit glomerular. Bolehkah J Physiol Pharmacol. 2013;91:773–782.

19. Brown EJ, Schlöndorff JS, Becker DJ, et al. Mutasi dalam gen formin INF2 menyebabkan glomerulosklerosis segmental fokus. Nat Genet. 2010;42:72–76.

20. Akilesh S, Suleiman H, Yu H, et al. Arhgap24 menyahaktifkan Rac1 dalam podosit tetikus, dan bentuk mutan dikaitkan dengan glomerulosklerosis segmental fokus keluarga. J Clin Invest. 2011;121:4127–4137.

21. Choi M, Scholl I, Ji W, et al. Diagnosis genetik melalui tangkapan keseluruhan exome dan penjujukan DNA selari secara besar-besaran. Proc Natl Acad Sci US A. 2009;106:19096–19101.

22. Choi M, UI Scholl, Yue P, et al. Mutasi saluran K dalam adenoma penghasil aldosteron adrenal dan hipertensi keturunan. Sains. 2011;331:768–772.

23. Bamshad MJ, Shendure JA, Valle D, et al. Pusat Genomik Mendelian: inisiatif berskala besar baharu untuk mengenal pasti gen yang mendasari keadaan Mendelian yang jarang berlaku. Am J Med Gen. 2012;158A:1523–1525.

24. Li H, Durbin R. Penjajaran bacaan pendek yang cepat dan tepat dengan transformasi Burrows-Wheeler. Bioinformatik. 2009;25:1754–1760.

25. McKenna A, Hanna M, Banks E, et al. Kit Alat Analisis Genom: rangka kerja MapReduce untuk menganalisis data penjujukan DNA generasi akan datang. Genome Res. 2010;20:1297–1303.

26. Yang H, Wang K. Anotasi varian genomik dan keutamaan dengan ANNOVAR dan wANNOVAR. Nat Protoc. 2015;10:1556–1566.

27. Dong C, Wei P, Jian X, et al. Perbandingan integrasi kaedah ramalan keburukan untuk SNV bukan sinonim dalam kajian penjujukan keseluruhan exome. Hum Mol Genet. 2015;24:2125–2137.

28. Sim NL, Kumar P, Hu J, et al. Pelayan web SIFT: meramalkan kesan penggantian asid amino pada protein. Asid Nukleik Res. 2012;40:W452–W457.

29. Rentzsch P, Witten D, Cooper GM, et al. CADD: meramalkan kerosakan varian di seluruh genom manusia. Asid Nukleik Res. 2019;47:D886–D894.

30. Yang H, Wang H, Jaenisch R. Menjana tikus yang diubah suai secara genetik menggunakan kejuruteraan genom pengantara CRISPR/Cas. Nat Protoc. 2014;9:1956–1968.

31. Veron D, Bertuccio CA, Marlier A, et al. Faktor pertumbuhan endothelial vaskular podocyte (Vegf₁₆₄) berlebihan menyebabkan glomerulosklerosis nodular yang teruk dalam model tetikus diabetes jenis 1. Diabetologia. 2011;54:1227–1241.

32. Veron D, Reidy K, Marlier A, et al. Induksi ekspresi berlebihan podosit VEGF164 pada peringkat perkembangan yang berbeza menyebabkan nefrosis kongenital atau sindrom nefrotik tahan steroid. Am J Pathol. 2010;177:2225–2233.

33. Zou Z, Chung B, Nguyen T, et al. Menghubungkan endositosis pengantara reseptor dan isyarat sel: bukti untuk proteolisis intramembran terkawal megalin dalam tubul proksimal. J Biol Chem. 2004;279:34302–34310.

34. Bertuccio C, Veron D, Aggarwal PK, et al. Reseptor faktor pertumbuhan endothelial vaskular 2 interaksi langsung dengan nefrin menghubungkan isyarat VEGF-A kepada aktin dalam podosit buah pinggang. J Biol Chem. 2011;286:39933–39944.

35. Veron D, Aggarwal PK, Velazquez H, et al. VEGF khusus podocyte-pertambahan fungsi mendorong glomerulosklerosis nodular dalam tikus nol eNOS. J Am Soc Nephrol. 2014;25:1814–1824.

36. Reidy KJ, Aggarwal PK, Jimenez JJ, et al. Lebihan podosit semaphorin-3A membawa kepada penyakit glomerular yang melibatkan interaksi plexinA1-nephrin. Am J Pathol. 2013;183:1156–1168.

37. Tian X, Kim JJ, Monkley SM, et al. Talin1 yang berkaitan dengan podocyte adalah penting untuk penyelenggaraan penghalang penapisan glomerular. J Clin Invest. 2014;124:1098–1113.

38. Ni L, Saleem M, Mathieson PW. Budaya podocyte: helah perdagangan. Nefrologi (Carlton). 2012;17:525–531.

39. Ren XD, Kiosses WB, Schwartz MA. Peraturan protein kecil pengikat GTP Rho oleh lekatan sel dan sitoskeleton. EMBO J. 1999;18:578–585.

40. Duvall L, Rashmi P, Lopez-Rivera E, et al. Degradasi proteasomal Nck1 tetapi bukan Nck2 mengawal pengaktifan RhoA dan dinamik aktin. Nat Commun. 2013;4:2863.

41. Kopp JB, Winkler CA, Zhao X, et al. Ciri klinikal dan histologi apolipoprotein l1-nefropati yang berkaitan dalam Percubaan Klinikal FSGS. J Am Soc Nephrol. 2015;26:1443–1448.

42. Kurosaki T, Maquat LE. Pereputan mRNA yang dimediasi karut pada manusia sepintas lalu. J Sel Sci. 2016;129:461–467.

43. MacArthur DG, Manolio TA, Dimmock DP, et al. Garis panduan untuk menyiasat kausalitas varian urutan dalam penyakit manusia. alam semula jadi. 2014;508:469–476.

44. Richards S, Aziz N, Bale S, et al. Piawaian dan garis panduan untuk tafsiran varian jujukan: cadangan konsensus bersama Kolej Genetik dan Genomik Perubatan Amerika dan Persatuan Patologi Molekul. Genet Med. 2015;17:405–424.

45. Wang M, Chun J, Genovese G, et al. Sumbangan varian gen jarang kepada FSGS keluarga dan sporadis. J Am Soc Nephrol. 2019;30:1625–1640.

46. ​​Karczewski KJ, Francioli LC, Tiao G, et al. Spektrum kekangan mutasi dikira daripada variasi dalam 141,456 manusia. alam semula jadi. 2020;581:434–443.

47. Maddirevula S, Alzahrani F, Al-Owain M, et al. Autozigome dan pengesahan throughput tinggi bagi pencalonan gen penyakit. Genet Med. 2019;21:736–742.

48. O'Connor E, Phan V, Cordts I, et al. Kekurangan MYO9A dalam neuron motor dikaitkan dengan pengurangan rembesan agrin neuromuskular. Hum Mol Genet. 2018;27:1434–1446.

49. Sárközy M, Zvara A, Gyémánt N, et al. Sindrom metabolik mempengaruhi corak ekspresi gen jantung pada tahap transkrip dalam tikus ZDF lelaki. Cardiovasc Diabetol. 2013;12:16.

50. Lepori N, Zand L, Sethi S, et al. Fenotip klinikal dan patologi penyebab genetik glomerulosklerosis segmental fokus pada orang dewasa. Clin Kidney J. 2018;11:179–190.

51. Eshbach ML, Weisz OA. Endositosis pengantara reseptor dalam tubul proksimal. Annu Rev Physiol. 2017;79:425–448.

52. Bouligand J, Delmer B, Heart AC, et al. Haploinsufficiency reseptor glukokortikoid keluarga oleh pereputan mRNA yang dimediasi tanpa rasa, hiperplasia adrenal dan lebihan mineralokortikoid yang jelas. PLoS One. 2010;5. e13563.

53. Yi F, Kong R, Ren J, et al. Myo9b-RhoGAP bukan kanonikal mempercepatkan hidrolisis RhoA GTP dengan mekanisme dwi-arginine-jari. J Mol Biol. 2016;428: 3043–3057.

54. Tian D, Jacobo SM, Pengebilan D, et al. Peraturan antagonis dinamik aktin dan motilitas sel oleh saluran TRPC5 dan TRPC6. Isyarat Sains. 2010;26:3. ra77.

55. Wang L, Ellis MJ, Gomez JA, et al. Mekanisme proteinuria yang disebabkan oleh Rho GTPases. Buah Pinggang Int. 2012;81:1075–1085.

56. Kistler AD, Altintas MM, Reiser J. Podocyte GTPases mengawal dinamik penapis buah pinggang. Buah Pinggang Int. 2012;81:1053–1055.

57. Cory G. Ujian luka calar. Kaedah Mol Biol. 2011;769:25–30.

Buah Pinggang Antarabangsa (2021) 99, 1102–1117; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2020.12.022

Hak Cipta ª 2021, International Society of Nephrology. Diterbitkan oleh Elsevier Inc. Ini ialah artikel akses terbuka di bawah lesen CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Surat-menyurat: Alda Tufro, Jabatan Pediatrik/Nefrologi, Sekolah Perubatan Universiti Yale, 333 Cedar Street, New Haven, Connecticut 06520, Amerika Syarikat. E-mel: alda.tufro@yale.edu 6 Gabungan semasa: Nefrologi, Hospital Kebangsaan Kanak-kanak, Washington, DC, Amerika Syarikat. 7 Gabungan semasa: Nefrologi, Hospital untuk Kanak-kanak Sakit, Universiti Toronto, Toronto, Ontario, Kanada. Diterima 21 Mei 2020; disemak pada 4 Disember 2020; diterima 10 Disember 2020; diterbitkan dalam talian 4 Januari 2021